KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

*Jika saya ingin memisahkan suatu senyawa Mana yg harus saya pilih?? Kromatografi gas atau KCKT?

Perbandingan HPLC dan GC

Kromatografi GasKromatografi Cair Kinerja TinggiHanya dapat dipakai untuk senyawa atsiridapat dipakai untuk senyawa tak atsiri dan senyawa berbobot molekul tinggiDipakai untuk senyawa organik dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg sebagian besar tidak atsiriMenggunakan pemanasan sehingga tidak aman bagi senyawa yg mudah terurai oleh panasbiasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga aman bagi senyawa yg tidak tahan panas

Fase gerak tidak dapt diubahFase gerak pada KCKT dapat diubah dengan mencampur pelarut dalam berbagai landaian tidak dapat dilakukan pada KGKromatogram pada KCKT dapat dihentikan selama beberapa hari dan dijalankan lagi tanpa terlihat pelebaran pita

KCKT dan KG saling melengkapi;KCKT dapat dipakai untuk senyawa tak atsiri dan senyawa berbobot molekul tinggi.KCKT dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg sebagian besar tidak atsiri.KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga aman bagi senyawa yg tidak tahan panasPerbedaan penting lain yang menyebabkan KCKT lebih penting: pada KG antaraksi kimia antara fase gerak (gas) dan cuplikan kecil. Pada KCKT kemungkikan antaraksi antara fase gerak dan linarut besar sekali (mencakup antarakasi ikt hidrogen dan reaksi ion)Fase gerak pada KCKT dapat diubah dengan mencampur pelarut dalam berbagai landaian

Jumlah perubah pada KCKT lebih banyak lebih rumit lebih mahalmetode pemisahan lebih kuat

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.

Peralatan

Picture of HPLC instrument

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerakWadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2)Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi)

2. Pompa Pompa yang cocok digunakan untukHPLC adalah pompa yang mempunyai syarat : inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalamHPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

3. Tempat penyuntikan sampel Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

4. Kolom dan Fase diamAda 2 jenis kolom padaHPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Kebanyakan fase diam padaHPLC berupa silika Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

Picture of an HPLC column

5. Detektor HPLC Detektor padaHPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Memilih Sistem Tiga perubah utama pada KCKT yg harus diperhatikan adalah:DetektorKemasan kolomFase gerak

Tingkat kerumitan

DetektorUmumnya detektor yg digunakan pada KCKT adalah:Detektor UVDetektor ini bekerja pada tertentu dimana pelarut tidak menyerap sinar pada tersebut sedangkan cuplikan menyerap dengan kuat.Ada dua jenis detektor UV : detektor dengan satu panjang gelombang (254 nm) dan detektor dengan yg dapat diubah ubah antara 200-700 nmDetektor mempunyai jangka kepekaan yg lebarDetektor ini hanya bekerja jika senyawa mempunyai kromofor

b. Detektor fluorisensiMerupakan detektor yg paling peka, tetapi hanya dapat dipakai untuk senyawa yg bisa berfluorisensi, karna itu kadang2 linarut diubah menjadi turunan senyawa yg berfluorisensi sebelum dikromatografi

c. Detektor Indeks biasIndeks bias linarut dan pelarut harus berbedaDetektor mengukur perbedaan antara indeks bias pelarut murni dan indeks bias pelaut yg keluar dari kolom, perbedaan ini disebabkan oleh adanya linarut.Detektor ini tidak dapat dipakai untuk pelarut landaian karena ndeks bias sistem berubah selama kromatografi

d. Detektor elektrokimiaDetektor ini menggunakan sifat redoks linarutuntuk mengukur kehadiran linarut tersebut.

ParameterUV-VisFluorisensiIndeks BiasElektrokimiaKeselektifanselektifselektiflebarselektifDipakai landaianyayatidakTidakKepekaan pada derau0,0020,0052x10-62x10-9Kepekaan thd cuplikan2x10-10 g/ml10-11 g/ml1x10-7 g/ml10-12g/ml

Memilih KolomKromatogafi normal (fase diam lebih polar) dan kromatografi balik (fase diam kurang polar)Kemasan kolom tak terikat. Permukaan silika berkelakuan seperti alkohol diam dan berantaraksi dengan fase gerak dan linarut melalui ikatan hidrogen (kromatografi penjerapan fase normal). Ukuran partikel 3-10mKemasan kolom terikat, gugus -OH pada permukaan silika dimodifikasi secara kimia

Fase diam untuk KCKT:

Permukaan Tak terikat, polarStrukturSilika---Si-OHAlumina---Al-OHPermukaan terikat , non polarOktadesil---Si-O-Si(CH2)12CH3 (CH3)2Oktil---Si-O-Si(CH)7CH3 (CH3)2Metil---Si-O-Si(CH3)3Fenil---Si-O-Si(CH2)3C6H5 (CH3)2

Pemilihan kemasan kolom didasarkan pada sifat kimia cuplikan, kelarutannya dan ukurannya.Jika cuplikan polar dan larut dlm pelarut organik dapat dipakai KCKT fase terikatJika cuplikan tidak larut dlm pelarut organik dan larut dlm air, dipakai kromatografi pasangan ion fase balikJika cuplikan non polar dipisahkan pada kolom silika spt halnya KLT

Penuntun pemilihan kolom/fase gerak

Kelarutan cuplikan dlmKepolaranKolomSistem

Pelarut OrganikRendahSilikaSianoAminoMetilFenilFase normal

Fase balikTinggiSianoMetilFenilOktilOktadekil

Fase balik

AirNon Ion

MetilFenilOktilFase balikAminoMetilOktilDidaparmodifikasi

Memilih Fase GerakPelarut sebagai fase gerak untuk KCKT:Harus murni secara kimiaHarus bebas partikel yg dapat menyumbat pipa atau katup sistem atau frit kolom (cakram logam yg berfungsi menahan kemasan)Pelarut harus bebas gas yang terlarutFase gerak harus dicampur dengan benar atau taat asas jika memakai campuranUntuk mendapatkan hasil pemisahan yang baik, perlu diketahui ukuran kepolaran pelarut murni dan menggunakan angka tersebut untuk menentukan pelarut atau campuran pelarut terbaik untuk cuplikan

Angka untuk mengukur dan memperkirakan kepolaran pelarut disebut angka P

Pelarut ini tidak menyerap sinar UV secara berarti sehingga dapat dipakai dengan detektor UV

Fase NormalFase balikPelarutHeksana1-klorobutanaIsopropileterMetilenkloridaKloroformEtanoletilasetatP0,11,02,43,14,14,34,4PelarutAirDMSOEtilenglikolAsetonitrilMetanolAsetonEtanolP10,27,26,95,85,15,14,3

Untuk menghitung kepolaran campuran dua pelarut, gunakan persamaan:P = a.Pa + b.Pba dan b = fraksi volum pelarut a dan b dalam campuranPa dan Pb adalah nilai P pelarut murniJika campuran mengandung 80% heksana dan 20% metilenklorida makan kepolaran campuran pelarut adalah: P = a.Pa + b.PbP = 0,8x0,1 + 0,2x3,1 = 0,08+0,62 = 0,70

Elusi landaian atau elusi memakai pelarut yang memaki pelarut yang susunananya berubah-ubah lazim dipakai dlm KCKTElusi landaian akan mengurangi pelebaran pita, cara ini kadang disebut memampatkan pita atau menfokuskan pelarutUntuk menghilangkan partikel, pelarut harus disaring melalui corong 2m, corong dpt dipasang setelah ruang suntik dan sebelum kolomGas yang terlarut dalam pelarut harus dihilangkan sebab jika tidak, akan menimbulkan sinyal palsu

DERIVATISASI PADA HPLC Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi padaHPLC adalah untuk:Meningkatkan deteksiMerubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baikMerubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baikMenstabilkan analit yang sensitif.

Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar UV-Vis atau membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi.

Gugus fungsionalReagen untuk dapat dideteksi dengan UV-VisReagen untuk dapat dideteksi dengan FluoresenAsam-asam kaboksilat; asam-asam lemak;asam-asam fosfatp-nitrobenzil-N,N-diisopropilisourea (PNBDI); 3,5-dinitrobenzil-N,N-diisopropilisourea (DNBDI); p-bromofenasil bromida (PBPB)4-bromometil-7-asetoksikumarin; 4-bromometil-7-metoksikumarin;Aldehid; ketonp-nitrobenziloksiamin hidroklorida (PNBA); 3,5-dinitrobenziloksiamin hidroklorida (DNBA);Dansil hidrazinAmin primerFluoresamino-ftalaldehid (OPA)Amin primer (1o) dan sekunder (2o)3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); N-suksinimidil-p-nitrofenilasetat (SNPA); N-suksinimidil-3,5-dinitrofenilasetat (SDNPA); 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F); Dansil kloridaAsam-asam amino (peptida)4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsil-Cl)Fluoresamino-ftalaldehid (OPA)7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F);

*Penggunaan HPLC

**