Kromatografi : Metode fisik untuk pemisahan dengan senyawa yang akan dipisahkah terdistribusi diantara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak dengan arah yang pasti.Kromatografi : Adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia yang berdasar pada perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran yang terpisah pada fase diam di bawah pengaruh pergerakan fase gerak.Tujuan kromatografi : Analitik : menentukan komposisi senyawa kimia dalam sampelPreparatif : memurnikan dan mengumpulkan satu atau lebih komponen dalam suatu sampel

Klasifikasi kromatografi1. Kromatografi Adsorpsi : interaksi yang terjadi via ikatan hidrogen atau interaksi dipo-ldipol komponen polar non ionic contohnya: silika gel, alumina teraktivasi2. Kromatografi partisi molekul akan tertahan oleh fase diam cair yang melapisi atau terikat pada kolom Seluruh tipe interaksi antara solute dan pelarut dimungkinkan tipe fase normal: analit molekul organik non polar, fase diam lebih polar dibandingkan fase gerak tipe fase terbalik: analit molekul organik polar, fase diam lebih non polar dibandingkan fase gerak contohnya: kolom C183. Kromatografi pertukaran ion fase diamnya berupa ion yang berasosiasi dengan ion (analit) lawannya yang dapat ditukar sangat penting dalam purifikasi air dan pemisahan preparative4. Kromatografi eksklusi fase diam mempunyai pori ukuran dimensi molecular penyaring makromolekul

Asas dan Dasar-dasar Kromatografi1. Kromatografi dengan asas adsorpsi, memakai fase diam padat dan fase gerak cair atau gas2. Kromatografi dengan asas partisi, memakai fase diam cair dan fase gerak cair3. Kromatografi dengan asas fitrasi, memakai fase diam padat yang mempunyai sifat fitrasi dan fase gerak cairan4. Kromatografi dengan asas suhu kritik, memakai CO2 dalam keadaan superkritik

Kromatografi Kertas Prinsip sama dengan KLT Fase diam adalah air yang didukung oleh pelat serat selulosa, fase mobil air dicampur pelarut organik Lebih banyak digunakan untuk pemisahan senyawam non polar, karena selulosa (kertas) bersifat polar Banyak digunakan untuk pemisahan senyawa bahan alam Kekurangan : lebih lama karena panjang kertas bisa sampai 50 cm.Kromatografi Lapis TipisKeuntungan : Digunakan untuk tujuan analitik Identifikasi komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi atau pemadaman fluoresensi, radiasi UV Dapat dilakukan elusi dengan mekanik (ascending) atau menurun (descending) atau dengan cara elusi 2 dimensi Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang ditentukan merupakan noda yang tidak bergerak Identitas komponen dijabarkan dalam harga Rf (retardation factor) yang dalam penentuan kualitatif dibandingkan dengan standar Untuk tujuan kuantitatif digunakan KLT preparatif (dikerok lalu senyawa diisolasi dalam pelarutnya)

Kromatografi Kolom Digunakan untuk isolasi senyawa dari sample Merupakan kelanjutan dari KLT Prinsip pemisahan, fase diam dan fase gerak sama dengan KLTTeori Kromatografi Kolom : Eluen fase gerak, larutan yang berfungsi mengelusi sampel Eluat spesi yang terelusi masuknya eluen dan sampel kolom keluarnya eluat

Ikhtisar proses kromatografi (kolom kemas): injeksi saat t0 pemisahan antara t1 sampai t3 Deteksi saat t4 Kromatogram Plot sinyal dari detektor sebagai fungsi waktu elusi/volume Profil konsentrasi dari pita solut A dan B pada dua waktu yang berbeda dalam migrasinya melewati kolom

Teori Kromatografi KolomMigrasi solutKromatogram dari dua komponen yang dipisahkan yang mengilustrasikan dua metode dalam meningkatkan pemisahan: Kromatogram asli dengan pita yang tumpang tindih (a) Perbaikan dengan meningkatkan keterpisahan spektra (b) Perbaikan dengan menurunkan lebar pita (c)

Kromatografi didasarkan pada partisi komponen-komponen yang merupakan suatu tipe kesetimbangan dimana komponen-komponen akan terbagi diantara fase diam dan fase gerak

K = koefisien partisi/distribusiCS= konsentrasi analit dalam fase diamCM = konsentrasi analit pada fase gerak

K diinginkan konstan pada berbagai konsentrasi, jika tidak konstan kita dapat bekerja pada kisaran yang lebih sempit saat K konstan kromatografi linier Pada kromatografi linier laju alir yang tetap dari fase gerak bergerak sepanjang kolom K cenderung konstan Elusi: proses dimana analit akan melewati kolom dibawa oleh fase gerak (dapat cair atau gas)

Terminologi pada Kromatogramwaktu retensi/retention time (tR): waktu yang dibutuhkan molekul yang tertahan pada fase diam untuk mencapai detektorwaktu mati/dead time (tM): waktu yang dibutuhkan molekul yang tak tertahan pada fase diam untuk mencapai detektorvolume retensi: volume fase gerak yang dibutuhkan untuk menggerakkan molekul dari saat injeksi hinggamencapai detektorBaseline width (w): lebar pita senyawa yang terukur pada garis dasarAplikasi KromatografiAnalisis kualitatifwaktu retensiAnalisis kuantitatifSinyal yang diukur tinggi pita atau lebar pitaMacamnya: Kalibrasi eksternal satu standar atau multistandar Metode adisi standar Metode standar internal

Tipe KromatografiKromatografi Gas Fase gerak = gas (umumnya He) Fase diam = kolom yang dilapisi atau dikemas oleh suatu bahan (umumnya partisi)Macamnya : Kromatografi gas padat : fase diam adalah butiran-butiran adsorben dan fase gerak adalah gas Kromatografi gas cair : fase diam adalah cairan yang disalutkan pada permukaan tipis butiran padat dan fase gerak adalah gas Sampel berupa gas. Untuk senyawa yang bukan gas dibuat turunan esternya. Gas pembawa : He, Ar, N2 atau campuran He dan CH4 Detektor terdiri dari berbagai macam tergantung keperluan diantaranya : TCD, FID,ECD, NPD, FPD, IRD, TID, dll. Analisis kualitatif dibandingkan terhadap BANK DATA

Kromatografi Cair (KC atau KCKT) Fase gerak = pelarut (air atau pelarut organik) Fase diam = kolom lapis kemas (partisi, prtukaran ion, dan size exclusion)Kromatografi Cair Superkritis Fase gerak = cairan superkritis (CO2) Fase diam = kolom lapis kemasKromatografi Cair Kinerja Tinggi Dimaksudkan untuk mendapatkan pemisahan dan hasil analisa kuantitatif yang baik dengan waktu singkat Pelarut pengembang harus dipilih dengan seksama Kolom harus sesuai Detektor harus memadai Sample berupa larutan

Kromatografi GasSuatu teknik kromatografi dengan sampel dapat diuapkan (umumnya komponen volatil) saat diinjeksikan dalam suatu sistem pemanas dan terelusi pada kolom kemas atau kapiler oleh fase gerak lembamTerdapat dua tipe KG yaitu:1. Kromatografi Gas-Padat2. Kromatografi Gas-Cair Keuntungan Kromatografi Gas:1. Analisisnya cepat (umumnya dapat dilakukan dalam beberapa menit saja)2. Resolusinya tinggi3. Detektornya sensitif4. Akurasi dalam analisis kuantitatif tinggi (% SBR 1-5%)5. Sistemnya otomatis6. Non-destruktif/non destruktif7. Sampel yang diperlukan kecil (l)8. Hasil analisis terpercaya dan relatif sederhanaKelemahan Kromatografi Gas:1. Hanya untuk komponen volatil atau yang dapat diuapkan2. Tidak baik untuk komponen yang labil akibat suhu yang tinggi3. Beberapa komponen dalam sampel mungkin membutuhkan preparasiyang rumit seperti analisis asam lemak

Fase Gerak- Tidak berinteraksi dengan sampel- Pemilhannya bergantung pada detektor yang digunakan konduktivitas thermal Heionisasi nyala He atau N2Penangkapan elektron tidak terdapat udara, O2, N2 bebas atau Ar + 5 % CH4- Harus murniPengontrol Laju Gas Pembawa (Fase Gerak)

Kontrol laju 10 to 50 psi dengan regulator Regulator bervariasi dalam kualitas, material dan proses kontrolnya. Umumnya digunakan 2 regulator dengan material dari stainless steel Laju alir dicek oleh soap bubble meter agar dihasilkan laju yang akurat Laju gas pembawa : 25-150 ml/menit untuk kolom terkemas 1-25 ml/menit untuk kolom open tubular

Injektor Bagian alat KG yang berfungsi sebagai tempat untuk memasukkan sampel Menguapkan sampel agar dapat dibawa oleh gas pembawa ke dalam kolom pemisahan T injektor > 500C diatas TkolomSeptum haruslah:- stabil pada suhu injektor- diganti secara regulerLinerSebagai tempat untuk menguapkan sampel, umumnya dibuat dari gelas

Metode injeksi Split injection teknik injeksi sampel ke dalam kolom dimana hanya sedikit (0,1-1%) sampel yang masuk ke dalam kolom Splitless injection teknik injeksi sampel ke dalam kolom dengan jumlah sampel yang masuk ke kelom lebih banyak On-column injection injeksi dilakukan langsung ke dalam kolom, umumnya digunakan untuk senyawa yang tak stabil secara thermal

Syringe digunakan untuk memasukkan sampel cair atau gas dengan volume diketahui adapter dapat digunakan untuk mengontrol volume yang dinjeksikan

Tersedia dalam beberapa tipe:- jarum yang tetap (fixed needle)- jarum yang dapat digerakkan (removable needle)- Panjang dan sudut jarumnya

Kromatografi Gas Teknik injeksi yang tidak tepat dapat menyebabkan ketidakakuratan hasil analisis Langkah pertama yaitu syringe terisi hanya oleh sampel (tanpa gelembung udara) dan diinjeksikan secara cepat dan konsisten agar menghasilkan ketelitian yang baik

Metode pemasukan sampel pada syringe Ukuran sampel :Cair umumnya antara 0,1-10 l Gas umumnya 0,5-5 ml Presisi injeksi dengan menggunakan syringe 1%

KolomKolom pada kromatografi gas di tempatkan pada oven agar suhu selama proses pemisahan tetap konstan.Tipe kolom: Kemas : tabung dari baja, kaca, silika, atau teflon yang didalamnya diisi dengan fase diam (umumnya tanah diatomae) Open tubular : fase diam melapisi dinding kolom saja Kapiler : fase diam melapisi dinding kolom dan panjang kolom antara 2-50 m, yang umum dipakai panjangnya 30 m

Kromatografi Gas Selektivitas pada KG bergantung kepada jenis fase diam yang digunakan Elusi dalam KG terutama ditentukan lewat titik didih senyawa yang akan dipisahkan sehingga senyawa dalam sampel dengan perbedaan titik didih yang besar akan mudah untuk dipisahkan. Akan tetapi jika pebedaannya kecil maka perlu juga memilih fase diam yang selektif untuk salah satu senyawa dalam memisahkannya selain sistem elusinya Secara umum senyawa nonpolar akan mudah dipisahkan dengan fase diam nonpolar demikian pula untuk yang polar Kriteria utama dalam pemilihan fase diam yaitu secara kimia inert, stabil terhadap perbedaan suhu, volatilitas rendah, dan polaritas yang sesuai dengan senyawa yang akan dipisahkan, Suhu terprogram Kontrol dalam suhu kolom sangat penting untuk diperhatikan untuk memperoleh pemisahan yang baik pada KG sehingga untuk alasan ini kolom ditempatkan pada oven termostat Jika suhu oven dibuat konstan selama analisis maka sering disebut sebagai pemisahan isothermal. Secara normal, suhu diset sedikit dibawah titik didih senyawa yang mempunyai titik didih terendah untuk meningkatkan interaksinya dengan fase diam Salah satu kesulitan dalam pemisahan menggunakan suhu oven yang konstan adalah pemisahan untuk komponen yang mempunyai titik didih tinggi dapat menyebabkan waktu retensi menjadi lebih lama Suhu terprogram dapat mengatasi masalah ini. Suhu awal diset dibawah titik didih senyawa yang memiliki titik didih terendah dan setelah itu suhu dinaikkan secara perlahan dengan kenaikan yang seragam atau dibuat berseri beberapa tahap.

DetektorDetektor yang ideal mempunyai karakteristik:- Limit deteksi yang rendah- Reprodusibel (akurasinya baik)- Memberikan respon yang linear dengan kisaran yang lebar dalam penentuan konsentrasi analit- responsif terhadap semua senyawa kimia atau sebagian (kelas senyawa)- insensitif pada perubahan laju alir, tekanan, dan temperatur- Nondestruktif- Stabil terhadap pengaruh derau dan driftMacamnya: - Detektor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector) Detektor konduktivitas termal (Thermal conductivity detector) Detektor elektrotermal (Electrothermal Detector) detektor fotometrik nyala (Flame photometric detector) detektor nitrogen fosfor (Nitrogen phosphorus detector) FTIR dan MS (hyphenated technique/teknik gabungan)Detektor Ionisasi Nyala (FID) Detektor yang paling umum digunakan pada KG Mempunyai sensitivitas yang baik untuk hampir semua senyawa organik Spesifik untuk sampel (komponen) yang mudah terbakar Destruktif Limit deteksi 5 pg/detik dan kisaran linear 107Cara deteksi: Produksi ion pada nyala akan menghasilkan arus yang kemudian diukurKomponen yang memberikan respon atau tidak sama sekali pada FID yaitu:gas mulia, NH3, CS2, NOx, CO, O2, H2O, CO2, N2, komponen perhalogenasi, asam format, dan formaldehida

Cara kerja: efluen kolom akan bercampur dengan udara dan terbakar pada nyala hidrogen dan akan memproduksi ion dan electron yang akan menghasilkan arus listrik potensial beberapa ratus volt diberikan diantara burner tip dan collector electrode yang terletak di atas nyala yang akan menghasilkan arus (10 - 12 ). arus yang dihasilkan kemudian diperkuat dan diukur sinyal yang terbaca kira-kira proporsional terhadap jumlah atom karbon yang tereduksi pada nyala karena FID hanya berespon terhadap jumlah atom karbon yang masuk ke dalam detektor per unit waktu maka detektor ini lebih sensitif terhadap massa dibandingkan konsentrasi Respon didasarkan kepada jumlah atom karbon dan jika dalam senyawa yang dipisahkan terdapat halogen atau oksigen maka akan mereduksi pembakaran

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Cakupan KCKT teknik separasi analitis yang paling banyak digunakan analisis kualitatif maupun kuantitatif Sensitivitas baik, dapat digunakan untuk analat yang nonvolatile hingga yang mudah terdekomposisi Contoh analat: asam amino, protein, asam nukleat, hidrokarbon, karbohidrat, obat,pestisida, antibiotik, metabolit sekunder (alkaloid, flavonoid, terpenoid, steroid dsb), spesi organologam, senyawaan anorganik.Kromatografi cair konvensional (KK) Menggunakan material pendukung nonrigid dan lebih besar Ukuran partikel dp: > 150 m, ukuran kolom dc: 10 ~ 50 mm, panjang kolom L: 50 ~ 500 cm, laju alir F: < 1mL/min Gravitasi, H , N Efisiensi sistem yang kurang baik

KCKT Menggunakan material pendukung yang kecil, uniform, dan rigid Ukuran partikel dp < 40 m, umumnya 3-10 m dalam praktiknya Good system efficiencies and small plate heights, narrow peaks, shorter separation times

Reservoir fase gerak Umumnya dilengkapi oleh instrumen untuk menghilangkan gas yang terlarut dalam fase gerak (sistem pompa vakum, penyaringan vakum, distilasi, pemanasan, pengadukan, sonikasi atau pemercikan/sparging (gas menjalar jauh dengan adanya gas lembam dan solubilitasnya rendah seperti He) Penghilangan debu: mengganggu deteksi, penyumbatan kolom, merusak sistem pompa - penyaringan Millipore dengan vakum Gas perlu dihilangkan karena dapat membentuk gelembung pada kolom, menyebabkan pelebaran pita, dan mengganggu kinerja detektor.

Sistem elusiElusi gradientElusi isokratikEluen campuran dengan rasio komposisi Eluen tunggal atau campuran denganberubah untuk mendapatkan gradien kepolaran komposisi konstan

Sistem pompaSyarat-syarat yang harus dipenuhi sistem pompa KCKT: Tekanan yang dihasilkan tinggi Keluaran tekanan bebas dari pulsa/ pulse-free output Laju alir berada pada kisaran 0,1-10 mL/menit Kontrol laju alir dan keterulangan laju alir baik Komponen instrumen yang tahan korosiTerdapat 3 jenis sistem pompa:1. Pompa piston timbal-balik eluen dipompa dengan gerakan timbal-balik (mundurmaju) oleh piston Keuntungan pompa piston timbal-balik: tekanan yang dihasilkan tinggi, dapat digunakan pada elusi gradien, laju alir yang dihasilkan konstan serta independen dari viskositas eluen dan tekanan balik kolom Kerugian pompa piston timbal-balik : menghasilkan aliran yang memiliki pulsa

2. Displacement pump/pompa pergeseranpompa menyerupai semprit (syringe) besar yang terdir atas bejana dan alat penyedot, menghasilkan aliran yang bebas dari viskositas eluen

3. Pneumatic pump/pompa pneumatik eluen dalam kontainer didorong oleh tekanan gas/udara Pompa jenis ini bebas dari pengaruh viskositas eluen dan tekanan balik kolom, namun tidak dapat digunakan untuk elusi gradien dan tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000 psi.Saat ini ketiga sistem pompa tersebut dikontrol dengan komputer dalam pengoperasiannya

Sistem Injeksi sampel Pada awalnya injeksi dilakukan dengan sistem sederhana berupa semprit (syringe) yang menginjeksikan sampel ke dalam kolom melalui septum elastomerik, namun keterulangannya sangat buruk Saat ini yang banyak digunakan ialah sistem injeksi dengan menggunakan simpal pencuplikan (sampling loop). Sistem ini terintegrasi dalam instrumen KCKT KolomKolom KCKT dapat dikemas dalam bentuk koil ataupun tidak. Beberapa buah kolom dapat digabung (coupling column)Secara mendasar, jenis kolom untuk KCKT dikategorikan sebagai: Kolom kemas, (packed column) Kolom kapiler (open tubular/capillary column) Kolom preparatifIngat kembali teori PELAT !!! N = L/H Kolom penjaga (Guard column), berfungsi menyingkirkan kontaminan dalam eluen dan matriks sampel yang terikat tidak reversibel pada kolom. Bertujuan memperpanjang umur kolom Thermostat kolom, menjaga suhu operasi kolom. Keberadaannya tidak mutlak, tapi sangat berguna untuk analisis senyawa yang memerlukan suhu tertentu yang konstan saat dipisahkan.

Koloma. Kolom umum terbuat dari tabung bajab. Panjang antara 10 - 30 cmc. Diameter dalam umumnya 4 - 40 mm; untuk generasi terbaru kolom KCKT saat ini antara1 4,6 mm d. Ukuran partikel partikulat (fase diam)umumnya adalah 5 - 10 mikrometer

Detektor Sifat limbak (bulk property): membandingkan perubahan keseluruhan perubahan fisis fase gerak dengan dan tanpa zat yang dielusi- relatif insensitif- perlu kontrol suhu yang baik- contoh: detektor indeks refraksi (refractive index detector, RID) Sifat solut (solute property): respon terhadap sifat fisis solut yang tidak ditunjukkan oleh fase gerak 1000 kali lebih sensitif dari bulk property, bisa mendeteksi dalam jumlah ng

1. Detektor fluoresens: radiasi datang-fluoresens lurus/900 senyawa: aromatik polinuklir, steroid, pigmen tumbuhan, vitamin, alkaloid dsb2. Detektor elektrokimia: karakteristik voltametri molekul dalam fase gerak polar aq atau alkohol aq pada permukaan electrode senyawa: amina aromatik, asam askorbat, asam urat, sistein dsb3. Detektor fotometri absorpsi UV-Vis; UV 254/280 nm; sensitivitas tinggi (ng), tidak sensitif terhadap perubahan suhu, laju alir, komposisi fase gerak senyawa kimia/biologis: aromatik, senyawa yang mengandung karbonil, tiokarbonil, nitroso, azo4. Detektor UV- Paling umum digunakan- Sistem sederhana: emisi 254 nm yang kuat dari lampu mer kuri- Detektor kualitas tinggi kisara n skala penuh absorbansnya 0.0005-3 unit absorbans dengan tingkat derau dekat 1% dariskala penuh- Baik untuk elusi gradien deng an pelarut non-penyerap

KCKT PartisiFase diam : cair (disangga dengan pengisi kolom)Fase gerak : airSistem :Fase normal fase diam polar (mis: trietilena glikol, air); fase gerak nonpolar (mis: heksana, propileter) kepolaran komponen tR kepolaran fase gerak waktu elusi Fase terbalik fase diam nonpolar (mis: hidrokarbon); fase gerak polar (mis: air,metanol, asetonitril) kepolaran komponen tR kepolaran fase gerak waktu elusi