♠ Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase. Fase diam (padat dan cair) dan fase bergerak (gas dan cair).

♠ Pemisahan secara kromatografi berhubungan dengan beberapa sifat fisika umum dari molekul, antara lain: a. Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan). b. Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, peneyrapan), dan c. Kecenderungan molekul untuk menguap dan berubah kekeadaan uap (keatsirian).

♠ Bila fase diam berupa zat padat yang aktif maka dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorbtion chromatography). Bila fase diam berupa zat cair yang aktif maka teknik ini disebut kromatografi pembagian (partition chromatography).

♠ Berdasarkan fase bergerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu gas

chromatography dan liquid chromatography.

♠ Secara umum kromatografi dikelompokkan atas: kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi gas (KGC), kromatografi cair kinerja tinggi

(KCKT).

♠ Pemilihan teknik kromatografi tergantung pada sifat kelarutan

dan keatsirian senyawa yang akan dipisah.

♠ Kkt terutama digunakan untuk kandungan yang mudah larut dalam

air (karbohidrat, asam amino dan senyawa fenolat), KLT terutama

untuk pemisahan semua kandungan yang larut lipid (lipid, steroid,

karetoneid, klorofil), KGC terutama untuk senyawa atsiri (asam

lemak, hidrokarbon dan belerang), dan KCKT terutama untuk

memisahkan senyawa yang keatsiriannya kecil.

KKt dan KLT

Kedua cara ini serupa dalam fase diamnya berupa lapisan tipis dan fase geraknya mengalir karena kerja kapiler. Perbedaannya terletak dalam sifat dan fungsi fase diamnya.

Proses isolasi terjadi berdasarkan adsorpsi dan partisi. Adsorpsi adalah senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan eluen disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda yang menyebabkan terjadinya pemisahan.

Kromatografi Gas

Kromatografi gas adalah teknik kromatografi yang biasa digunakan untuk memisahkan senyawa organik yang mudah menguap dan stabil pada temperatur pengujian, biasanya 50-300 C. Jika senyawa tidak mudah menguap dan tidak stabil maka senyawa tersebut dapat diderivatisasi agar dapat dianalisa dengan GC.

Fase bergerak adalah gas, umumnya adalah helium, hidrogen atau nitrogen tergantung pada jenis detektornya. Nitrogen adalah yang terbaik sebagai gas pembawa meski untuk pemisahan yang benar-benar sulit sekalipun.

Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solut dengan fase diam. Fase diam berupa gas akan mengelusi solut dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke detektor.

Ada dua jenis kromatografi gas:1. Kromatografi gas cair (KGC)

Fase diam yang digunakan adalah cairan yang diikatkan pada suatu pendukung sehingga solut akan terlarut dalam fase diam. Mekanisme sorpsinya adalah partisi.

2. Kromatografi gas padat (KGP)Fase diam yang digunakan adalah padatan (polimerik). Mekanisme

sorpsinya adalah adsorpsi.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

KCKT (HPLC) merupakan teknik analisa yang paling cepat berkembang dala kimia analitik. Penggunaannya yang sangat banyak terdiri atas berbagai metode dalam kromatografi cair.

KCKT dapat disamakan dengan KGC dalam hal kepekaan dan kemampuan menghasilkan data kualitatif dan kuantitatif dengan sekali kerja saja. Perbedaannya adalah fase diam yang terikat pada polimer berpori terdapat pada kolom baja tahan karat yang bergaris tengah kecil dan fase gerak cair mengalir akibat tekanan yang besar.

Berdasarkan metodenya, KCKT dibagi atas: Kromatografi Cair Retensif

Pemisahan dicapai melalui interaksi antara zat terlarut dengan fase diam. Kromatografi Cair Non-retensif

Keuntungan penggunaan HPLC:1. Waktu analisis cepat.

Waktu yang diperlukan biasanya kurang dari satu jam, seringkalihanya 15-30 menit.

2. Daya pisahnya baik.3. Kepekaan tinggi.

Kepekaan sangat tergantung pada jenis detektor dan eluen yang digunakan.

4. Pemilihan kolom dan eluen sangat bervariasi.5. Kolom dapat dipakai kembali.6. Dapat digunakan untuk molekul besar dan kecil.

Tidak seperti kebanyakan detektor dalam kromatografi gas, detektor tidak merusak komponen zat yang dianalisis, sehingga zatyang telah dielusi dapat dikumpulkan dengan mudah setelah melewati detektor.

7. Dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah.HPLC dapat mendeteksi zat sampai dengan kadar ppt (part pertrillion), walaupun masih tergantung pada jenis detektor yang digunakan.

☻ Sampel dilarutkan dalam fase bergerak (gas, cair). ☻ Fase bergerak dengan kecepatan tertentu melewati fase

tidak bergerak (stationary phase). ☻ Setiap komponen dalam sampel berbeda kelarutannya

dalam tiap fase. Komponen yang sangat larut dalam fase diam akan

melewati kolom dengan waktu yang lebih lama dibandingkan

komponen yang kurang larut dalam fase diam tetapi lebih larut dalam fase

bergerak, sehingga komponen dalam sampel dapat dipisahkan.☻ Rata-rata kecepatan analit melewati kolom dihitung

berdasarkan waktu, yang ditentukan oleh fase bergerak.

Prinsip Kerja Alat Kromatografi

GC & HPLC

Retention Timeadalah waktu yang diperlukan oleh sebuah komponen sampel untuk melintasi kolom sepanjang L atau waktu yang diperlukan oleh sampelmulai dari saat injeksi sampai timbulnya pek maksimal.

Retension Volume.Bila kecepatan dari fase gerak konstan, maka volum dari fase gerak yangdiperlukan untuk memisahkan suatu komponen campuran dari kolomdapat dihitung dengan rumus sebagai berikut.Volum = waktu x kecepatan aliran

Relative Retention (selektivitas, α)yaitu perbandingan antara retention time sampel dengan retention time standar yang diperoleh dari kolom yang sama dengan kondisi percobaan yang sama. Nilai ini menunjukkan seberapa baik sistem kromatografi memisahkan dua komponen.

Retention time dan retention volume kurang tepat jika digunakan untukidentifikasi dengan membandingkan data-data lainnya karena harga-harga ini sangat tergantung dari cara pembuatan kolom dan kondisi percobaan. Untuk menghilangkan efek dari operasional variabel, maka lebih baik digunakan harga relative retention.

Resolusi (R)merupakan ukuran apakah suatu senyawa terpisah secara baik atau tidak dengan senyawa lain. Resolusi didefenisikan sebagai jarak ( t) antara dua puncak dibagi rata-rata lebar (w) dua puncak yang diukurpada alas puncak. Bila resolusi dari 1.5 maka pemisahan yang dihasilkanbaik atau lebih dari 99.7% dan bila nilai resolusi lebih kecil dari 1.5 makapemisahan yang dihasilkan tidak baik.