KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA

GENOM JAGUNG (Zea mays (L.)) UNTUK

SEKUENSING GENOM TOTAL

SYAHDAN SAYIDAH ULFAH

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi dan

Analisis Kualitas Pustaka Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing

Genom Total adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan

belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber

informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak

diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam

Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Oktober 2014

Syahdan Sayidah Ulfah

NIM G84100059

2

ABSTRAK

SYAHDAN SAYIDAH ULFAH. Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka

Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total. Dibimbing oleh I

MADE ARTIKA dan I MADE TASMA.

Sekuensing genom total dan analisis genom jagung merupakan salah satu

cara untuk mempercepat peningkatan pemuliaan jagung serta untuk meningkatkan

pemahaman mengenai informasi genetik dan genomik jagung. Tujuan penelitian

ini adalah mengkonstruksi pustaka genom dari empat genotipe jagung di

Indonesia (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50

(pulut)) dan menganalisis kualitas pustaka genom hasil sekuensing genom total.

Konstruksi pustaka genom dilakukan secara in vitro dengan menempelkan adapter

pada ujung fragmen DNA. Pustaka genom selanjutnya diklasterisasi dan

disekuensing menggunakan CBOT claster generation dan Next Generation

Sequencing HiSeq2000. Jumlah basa yang dihasilkan selama proses sekuensing

yaitu sebanyak 287.1 Gbp. Klaster pustaka genom yang dihasilkan dengan nilai Q

scores di atas 30 berkisar antara 80.8 – 87.9%. Tingkat kesalahan pembacaan basa

selama proses sekuensing berkisar antara 0.32 – 0.51%. Secara keseluruhan hasil

sekuensing menunjukkan bahwa kualitas klaster pustaka genom termasuk kategori

ideal.

Kata kunci: jagung, pustaka genom, sekuensing genom total, Next Generation

Sequencing

ABSTRACT

SYAHDAN SAYIDAH ULFAH. Construction and Quality Analysis of Maize

(Zea mays (L.)) Genomic Library for Whole Genome Sequencing. Supervised by I

MADE ARTIKA and I MADE TASMA.

Whole genome sequencing and analysis of the maize genome is one of the

ways to accelerate the increase in corn breeding and to improve the understanding

of the genetic and genomic information maize. The purpose of this study is to

construct genomic libraries of four maize genotypes in Indonesia (Sp010BB-3-2-

2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (early maturing) and LBP54-50 (pulut)) and analyze the

quality of the results of genomic libraries total genome sequencing. Genomic

library construction performed in vitro by attaching adapters to the ends of DNA

fragments. Clasterization and sequencing of genomic library in this research were

conducted by using cBOT claster generation and Next Generation Sequencing

HiSeq2000. The amount of base produced during the sequencing process as many

as 287.1 Gbp. Cluster genomic library generated with Q values above 30 scores

ranged from 80.8 – 87.9%. Base reading error rate during the sequencing process

was 0.32 – 0.51%. Over all sequencing results showed that quality of the genomic

library cluster was belong to the ideal category. Keywords: Maize (Zea mays (L.)), Genomic Library, Whole Genome Sequencing,

Next Generation Sequencing (NGS).

3

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Departemen Biokimia

KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA

GENOM JAGUNG (Zea mays (L.)) UNTUK

SEKUENSING GENOM TOTAL

SYAHDAN SAYIDAH ULFAH

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

4

5

Judul Skripsi : Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Jagung (Zea

mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total

Nama : Syahdan Sayidah Ulfah

NIM : G84100059

Disetujui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc

Pembimbing I

Dr Ir I Made Tasma, MSc

Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc

Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

6

PRAKATA

Puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya

sehingga penelitian yang berjudul Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka

Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total ini dapat

diselesaikan dengan baik. Penelitian ini dilaksanakan selama enam bulan sejak

bulan Desember 2013 sampai Mei 2014, bertempat di Laboratorium Biologi

Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber

Daya Genetik Pertanian (BB Biogen), Cimanggu, Bogor.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada kedua pembimbing penelitian

yaitu Dr Ir I Made Artika MAppSc dan Dr Ir I Made Tasma MSc yang telah

memberikan saran serta kritik yang membangun demi kelancaran penelitian ini.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ida Rosdianti MSi, Habib Rizjaani

MSi, Titin MSi, Fajar MSi serta Ihsan Mentaya SSi yang bersedia mendampingi

selama kegiatan penelitian serta memberikan masukan. Ucapan terima kasih juga

penulis sampaikan kepada kedua orang tua yang senantiasa memberikan motivasi

serta saran yang baik sehingga usulan penelitian ini dapat terselesaikan dengan

baik. Rekan-rekan terutama Yuliana dan Asep yang telah menjadi partner yang

baik selama kegiatan penelitian berlangsung serta Biokimia 47 yang telah

membantu serta memberikan motivasi, penulis juga mengucapkan terima kasih.

Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih banyak kekurangan. Oleh

karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk

memperbaiki tulisan ini. Atas kritik dan saran yang diberikan, penulis ucapkan

terima kasih. Semoga tulisan ini bermanfaat dalam bidang ilmu pengetahuan

khususnya biokimia.

Bogor, Oktober 2014

Syahdan Sayidah Ulfah

7

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL xi

DAFTAR GAMBAR xi

DAFTAR LAMPIRAN xi

PENDAHULUAN 1

METODE 2

Bahan 2

Alat 3

Prosedur Penelitian 3

HASIL 8

Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif 8

Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif 8

Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung 9

Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung 10

Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End

Repair) 10

Kuantitas Hasil Ligasi Adapter DNA Genom Jagung 10

Kualitas Pustaka Genom Jagung 11

Sekuensing Pustaka Genom Jagung 12

PEMBAHASAN 16

Isolasi DNA Genom Jagung 16

Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif 16

Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif 17

Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung 18

Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung 18

Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End

Repair) 19

Kuantitas Hasil Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adapter DNA Genom

Jagung 20

Kualitas Pustaka Genom Jagung 21

Kuantitas Pustaka Genom Jagung 21

Klasterisasi dan Hasil Sekuensing Genom Total DNA Jagung 22

Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom Secara Umum 22

8

Densitas dan Kualitas Pustaka Genom pada Setiap Lajur dalam Flow Cell 23

Tingkat Kesalahan (error rate) dan Intensitas Basa Hasil Sekuensing 24

SIMPULAN DAN SARAN 24

Simpulan 24

Saran 25

DAFTAR PUSTAKA 25

LAMPIRAN 28

RIWAYAT HIDUP 36

9

DAFTAR TABEL

1 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom total jagung menggunakan

spektrofotometer nanodrop thermoscientific 9

2 Kuantitas double stranded DNA genom total jagung menggunakan Qubit

2.0 fluorometer 9

3 Volume DNA genom jagung yang digunakan untuk uji pustaka genomik 9

4 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom jagung hasil fragmentasi 10

5 Kuantitas dan rasio kemurnian fragmen DNA setelah tahapan modifikasi

ujung fragmen DNA pada preparasi konstruksi pustaka genom jagung 10

6 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA cetakan setelah tahapan ligasi

adapter 11

7 Ukuran fragmen dan konsentrasi DNA hasil pustaka genom untuk

sekuensing 11

8 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing secara

umum 12

9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing 13

10 Tingkat kesalahan (error rate) dan intensitas basa hasil sekuensing 16

DAFTAR GAMBAR

1 Elektroforegram DNA genom total jagung 8 2 Elektroforegram hasil pustaka genom jagung menggunakan agilent

bioanalyzer genotipe LK2-45 dan PSG59-8 (genjah) 11 3 Elektroforegram hasil pustaka genom yang sudah di qPCR genotipe

Sp010BB-3-2-2-1-B dan LBP54-50 (pulut) 12

4 Histrogram jumlah klaster genotipe Sp010BB-3-2-2-1 berdasarkan kualitas

sekuen yang dihasilkan 13 5 Histogram jumlah klaster genotipe LK2-45 berdasarkan kualitas sekuen

yang dihasilkan 13 6 Histogram jumlah klaster genotipe PSG59-8 (genjah) berdasarkan kualitas

sekuen yang dihasilkan 14 7 Histogram jumlah klaster genotipe LBP54-50 (pulut) berdasarkan kualitas

sekuen yang dihasilkan 14 8 Intensitas banyaknya larutan sekuensing yang tersisa selama proses

sekuensing berlangsung 14

9 Presentase basa-basa nitrogen selama proses sekuensing 15

DAFTAR LAMPIRAN

1 Strategi penelitian 28

2 Hasil analisis pustaka genom secara kuantitatif dengan qPCR 29

3 Tahapan klasterisasi pustaka genom (Illumina 2011) 31

4 Flow cell Illumina HiSeq2000 (Swiss Federal Institute of Technology

Zurich 2012) 32

5 Regenerasi Next Generation Sequencing HiSeq2000 33

10

6 Prinsip sekuensing menggunakan Next Generation Sequencing

HiSeq2000 34

7 Grafik jumlah densitas klaster setiap lajur 35

1

PENDAHULUAN

Jagung (Zea mays L.) merupakan salah satu tanaman serealia penting yang

tumbuh hampir di seluruh dunia dan digunakan sebagai bahan makanan. Di negara

maju, jagung banyak digunakan untuk pati sebagai bahan pemanis, sirup dan

produk fermentasi, termasuk alkohol. Jagung banyak digunakan untuk bahan baku

pakan di Amerika (Prasanna et al. 2001). Jagung dibutuhkan masyarakat

Indonesia dalam jumlah besar dan terus meningkat, namun tidak diikuti oleh

peningkatan produksi, sehingga terjadi kekurangan sekitar 1,3 juta ton setiap

tahun dan harus dipenuhi melalui import. Menutupi ketersediaan jagung perlu

diupayakan melalui peningkatan produksi. Perakitan varietas unggul baru, berdaya

hasil dan berkualitas tinggi merupakan salah satu upaya untuk mendorong

peningkatan produksi (Azrai 2004).

Produksi tanaman pangan jagung disajikan dalam Berita Resmi Statistik

(BRS) terdiri dari luas panen, produktivitas dan angka produksi jagung. Produksi

jagung pada tahun 2012 mengalami peningkatan sebesar 1,74 juta ton

dibandingkan tahun 2011. Produksi jagung pada tahun 2013 mengalami

penurunan sebesar 0,55 juta ton dibandingkan tahun 2012. Penurunan produksi

diperkirakan terjadi karena penurunan luas panen seluas 66,62 ribu hektar dan

penurunan produktivitas sebesar 0,57 kuintal/hektar (BPS 2013).

Ciri penting ketahanan genetik tanaman jagung terhadap suatu hama atau

penyakit adalah kestabilannya dalam berproduksi, baik pada saat ada hama atau

penyakit maupun pada saat tidak ada hama atau penyakit. Ketahanan genetik

harus dapat memberikan perlindungan yang baik dan menyeluruh dari

kemungkinan kerusakan yang dapat disebabkan oleh suatu penyakit. Penyakit

yang paling banyak menimbulkan kerusakan tanaman jagung di Indonesia adalah

penyakit bulai yang disebabkan oleh strain Peronosclerospora maydis. Penyakit

bulai menyerang di Indonesia secara khusus dan di Asia pada umumnya karena

kondisinya yang tropis (Yen et al. 2004).

Berbagai usaha telah dilakukan untuk meningkatkan produktivitas jagung.

Salah satu cara untuk meningkatkan produktivitas jagung nasional adalah dengan

perbaikan genetik tanaman. Perbaikan genetik tanaman dipengaruhi oleh isolasi

dan karakterisasi gen. Tahapan tersebut dapat dilakukan dengan memanfaatkan

informasi genomik dan genetik jagung yang diperoleh melalui sekuensing genom

total. Produksi pangan pada masa mendatang akan lebih banyak bergantung pada

penerapan teknologi daripada peningkatan luas lahan pertanian.

Sekuensing genom total (whole genome sequencing) merupakan proses

penentuan urutan genom suatu organisme yang dilakukan dalam satu waktu.

Sekuensing genom total digunakan untuk mengetahui informasi genomik dan

genetik suatu organisme secara menyeluruh. Instrumen NGS yang digunakan

dalam penelitian ini yaitu HiSeq 2000 yang dikembangkan oleh Illumina Metode

yang digunakan pada HiSeq 2000 sama seperti pada instrumen NGS yang lainnya

yaitu dengan menggunakan metode sequencing by synthesis. HiSeq 2000

mempunyai kemampuan mengurutkan lebih dari lima genom manusia dalam 30

kali cakupan secara bersamaan, serta mengurutkan lebih dari 192 ekspresi gen.

Instrumen ini menghasilkan 540-600 Gb dengan panjang fragmen 2 x 100 bp

selama 11 hari. Secara umum, terdapat empat tahapan yang dilakukan dalam

sekuensing DNA menggunakan HiSeq 2000 adalah preparasi sampel pustaka

2

DNA, klasterisasi cetakan DNA, sekuensing dan analisis data sekuens (Illumina

2010).

Sekuensing genom total jagung diawali dengan mengkonstruksi pustaka

genom kentang menggunakan Low Throughput Protocol dari illumina dan

disekuensing menggunakan NGS Illumina Hiseq 2000. Konstruksi pustaka ini

relatif sangat mudah dan singkat karena tidak membutuhkan vektor untuk

menyisipkan fragmen DNA dan juga tidak membutuhkan ruangan khusus untuk

penyimpanan serta tidak membutuhkan DNA dalam jumlah banyak, namun DNA

yang digunakan merupakan DNA double stranded (dsDNA) dengan konsentrasi

rendah (20 ng/uL). Metode konstruksi yang digunakan memiliki prinsip yang

sama dengan konstruksi genom menggunakan metode shotgun sequencing yaitu

fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan DNA genom tidak disisipkan

dalam suatu vektor pada sel inang, namun tahapan setelah fragmentasi DNA

berbeda. Metode shotgun sequencing, DNA yang telah difragmentasi tidak

dilakukan ligasi adapter tetapi langsung dilakukan sekuensing. Fragmen DNA

yang dihasilkan sebelum disekuens, dipreparasi dengan menempelkan adapter

pada ujung fragmen DNA. adapter tersebut pada tahapan selanjutnya (klasterisasi)

akan menempel pada flow cell untuk amplifikasi fragmen DNA melalui metode

bridge amplification (Mardis 2008, Metzker 2010, Commins et al. 2011).

Penelitian ini bertujuan mengkontruksi dan menganalisis kualitas pustaka

genom tanaman jagung empat genotipe yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45,

PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) yang pada tahapan selanjutnya dapat

digunakan untuk pemetaan genom jagung melalui sekuensing dengan

menggunakan NGS (Next Generation Sequencing) HiSeq 2000. Hipotesis

penelitian ini adalah dapat mengkonstruksi pustaka genom jagung empat genotipe

yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut),

kemudian disekuensing menggunakan NGS (Next Generation Sequencing) HiSeq

2000. Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini yaitu diperoleh informasi genetika

dan studi tentang keseluruhan genom jagung. Manfaat lain yaitu urutan DNA yang

dihasilkan diharapkan mampu untuk pemetaan gen secara fisik pada tahapan

selanjutnya.

METODE

Bahan

Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah daun jagung empat

genotipe (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50

(pulut)), es batu, etanol teknis, nitrogen cair, bufer ekstraksi CTAB (Cetil Trimetil

Amonium Bromida), NaOAc (natrium asetat), Chisam (kloroform : isoamil

alkohol dengan perbandingan 24 : 1), isopropanol, bufer TE, etanol absolut dan

etanol 70%, 0.2 % beta merkaptoetanol dan natrium bisulfit. Bahan-bahan yang

digunakan untuk elektroforesis adalah serbuk agarosa, 1 x TAE, SyBr Gold,

loading dye dan DNA ladder. Bahan-bahan yang digunakan untuk fragmentasi

adalah isolat DNA dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk

modifikasi ujung fragmen DNA adalah end repair control, end repair mix, Sample

Purification Beads, etanol 80 % dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang

3

digunakan untuk adenilasi ujung 3’ DNA adalah A-tailing control dan A-tailing

mix. Bahan-bahan yang digunakan untuk penempelan adapter adalah ligase

control, DNA ligase mix, DNA adapter index, stop ligase mix, Sample Purification

Beads, etanol 80 %, dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk

uji kualitas pustaka genom dengan agilent 2100 bioanalyzer adalah sampel DNA

yang sudah dipustaka, dye mix dan ladder. Bahan-bahan yang digunakan untuk uji

kualitas pustaka genom menggunakan qPCR adalah sampel yang sudah dipustaka,

buffer qPCR, reagen qPCR dan larutan standar. Bahan-bahan yang digunakan

untuk klasterisasi dan sekuensing genom jagung adalah 2 N NaOH, buffer

hibridisasi, Tris-Cl, buffer library, TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS, Truseq SBS

Kit-HS (200 cycle).

Alat

Alat-alat yang digunakan meliputi mortar, tabung 15 mL, tabung 2 mL,

tabung 1.5 mL, penangas air, inkubator thermostat, sentrifus 5810X, thermolyne

vortex mixer maxi II, mikropipet, tip pipet, nanodrop thermoscientific 2000c, qubit

2.0 fluorometer, tabung covaris AFA Fiber Snap Cap 6x16mm, Covaris M220,

microwave panasonic, microfuge, kotak es, sarung tangan karet, termos, neraca

analitik, cetakan gel, sisir, alat pengering, thermal cycler biometra T1, sudip, gelas

piala, parafilm, power supply, perangkat elektroforesis, kolom elusi gel minElute

Spin, UV Transilluminator DigiDoc-It Imaging System, magnetic stand, mesin

pendingin tropicalized Sansio, cBot Cluster Generation, Agilent 2100

Bioanalyzer, qPCR, High Sensitivity DNA Chip dan Illumina Hiseq 2000.

Prosedur Penelitian

Isolasi DNA Doyle & Doyle (1987) yang dimodifikasi

Daun jagung ditimbang 100 mg tanpa tulang daun lalu diletakkan dalam

mortar pestel dan ditambah nitrogen cair dan digerus sampai halus sempurna,

kemudian dimasukan ke dalam Eppendorf 2 ml. Ditambahkan 0,5 ml bufer

ekstraksi CTAB (CTAB: 2%, 1 M Tris-HCl pH 8, 0.5 M EDTA pH 8, NaCl 5 M,

akuades, 0,20% ß-mercaptoetanol dan natrium disulfit. Lima belas menit sebelum

proses ekstraksi, bufer dipanaskan dalam waterbath dengan suhu 65°C, lalu

contoh daun yang telah ditambah bufer ekstraksi CTAB.

Proses lisis dinding sel dilakukan dengan menginkubasi tabung berisi

contoh ke dalam waterbath suhu 65°C selama 60 menit atau sampai fase padat

terpisah dari fase cair. Selanjutnya, tabung diangkat dari waterbath dan dibiarkan

beberapa menit sampai suhu contoh menurun. Tabung berisi contoh yang telah

diinkubasi lalu ditambah khloroform: isoamil-alkohol (CIA 24:1) 500 μl. Tabung

lalu dikocok menggunakan vortex mixer sampai contoh dann CIA 24:1 tercampur,

kemudian disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Bagian atas

contoh yang berupa cairan jernih (supernatan) dipindahkan 500 μl ke dalam

tabung baru.

Supernatan yang sudah bersih dipindahkan ke tabung baru, kemudian

ditambah 500 μl isopropanol dingin. Selanjutnya tabung dibolak-balik secara hati-

hati untuk melarutkan supernatan dan isopropanol. Tabung contoh lalu disimpan

pada suhu -20°C selama semalam dan tidak boleh kena guncangan. Kemudian

tabung dibolak-balik perlahan dan disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama

4

10 menit. Fase cair dibuang secara perlahan, sedangkan pelet yang tertinggal di

dalam Eppendorf dicuci dengan 500 μl etanol absolut, kemudian dilarutkan

dengan cara membolak-balik tabung secara perlahan-lahan. Larutan kemudian

disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. Fase cair dibuang secara

perlahan, sedangkan pelet dicuci lagi dengan 200 μl etanol 70% dingin,

selanjutnya dilarutkan dengan cara membolak-balik tabung secara perlahan-lahan.

Larutan kemudian disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. DNA

dikeringkan di udara selama semalam.

Setelah cukup kering, pelet DNA dilarutkan dengan menambahkan 100 μl

bufer TE (1M Tris-HCl pH 8,0, 12,11 g Trisma Base, 0,50 M EDTA pH 8,0,

18,61 g disodium etilen diamin tetra asetat 2H2O). Larutan DNA diinkubasi 65oC

selama 15 menit. Larutan kemudian ditambahkan 2 μl RNAse pada dinding

Eppendorf dan di-spin down dan diinkubasi lagi pada suhu 37oC selama 30 menit.

Jika tidak langsung digunakan, DNA disimpan pada suhu -20°C. Penyimpanan

pada suhu -20°C ini dilakukan agar DNA tidak rusak dan dalam kualitas yang

baik.

Analisis Kualitas dan Kuantitas Isolasi DNA

Analisis kualitatif isolasi DNA (Sambrook & Russel 2001 yang

dimodifikasi). Uji ini menggunakan metode elektroforesis gel agarosa. Sampel

DNA diambil sebanyak 3 μL dan dielektroforesis dengan konsentrasi 1 % selama

30 menit pada kuat arus 100 V ke dalam bak elektroforesis yang berisi TAE 1x.

Selanjutnya dibuat loading buffer dengan campuran loading dye 6x, SyBr Gold

100x dan molecular water. Setelah itu marker dibuat dengan campuran DNA

ladder 100 bp plus dan SyBr Gold 100x. Loading buffer dan marker ini divorteks.

Kemudian diinjeksikan ke dalam sumur elektroforesis beserta sampel yang telah

diisolasi.

Analisis kuantitatif isolasi DNA (Invitrogen 2010). Uji kuantitatif ini

menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific dan Qubit 2.0

fluorometer. Metode menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific

sebanyak 1 μL sampel diambil dan dianalisis. Metode menggunakan fluorometer,

sebanyak 200 μL buffer Qubit disiapkan masing-masing untuk dua larutan standar

dan larutan yang berisi sampel. Sebanyak 190 μL working solution ditambahkan

10 μL larutan standar 0 ng, kemudian untuk larutan standar 2 sebanyak 190 μL

working solution ditambahkan 10 μL larutan standar 10 ng. Sebanyak 198 μL

working solution ditambahkan 2 μL sampel. Kemudian semua larutan divortex

selama 3 detik dan diinkubasi selama 2 menit. Larutan standar 1 dan standar 2

serta sampel dibaca pada alat fluorometer.

Konstruksi Pustaka Genom (TruSeq DNA low throughput protocol 2010)

Fragmentasi DNA. Fragmentasi DNA dilakukan dengan menggunakan

metode sonikasi DNA. DNA yang sudah dilarutkan dengan Resuspension Buffer

sampai 55 μL diletakkan dalam tabung covaris sebanyak 52.5 μL. Kemudian

difragmentasi menggunakan alat covaris. Sebanyak 50 μL sampel yang telah

difragmentasi, dipindahkan ke dalam tabung PCR 0.3 ml. Kemudian sebanyak 80

μL Sample Purification Beads yang telah divortex, ditambahkan ke dalam sampel

tersebut dan diaduk dengan pipet mikro sebanyak 10 kali. Sampel tersebut

diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan diinkubasi pada magnetic stand

5

selama 8 menit. Sampel tetap berada pada magnetic stand, kemudian buang 125

μL supernatan tanpa menggangu beads. Kemudian pencucian pelet dilakukan

secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30

detik, selanjutnya, etanol 80% dibuang. Pelet kemudian dikeringkan selama 5

menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari magnetic stand. Setelah itu,

tambahkan 52.5 μL Resuspension Buffer dan tabung PCR diangkat dari magnetic

stand. Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit dan diinkubasi pada

magnetic stand selama 5 menit. Supernatan dipindahkan sebanyak 50 μL ke dalam

tabung PCR 0.3 ml yang baru.

Modifikasi Ujung Fragmen DNA. Sebanyak 10 μL End repair control

dan 40 μL End Repair Mix ditambahkan dalam tabung hasil fragmentasi. Sampel

dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10

kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermal cycler

selama 30 menit pada suhu 30oC. Kemudian tabung diangkat dari thermal cycler.

Diluted beads mixture dibuat terlebih dahulu dengan komposisi 109.25 μL sample

purification buffer dan 74.75 μL nuclease free water untuk 1 sampel. Sebanyak

160 μL diluted beads mixture yang telah divortex ditambahkan ke dalam sampel,

kemudian diaduk dengan pipet mikro sebanyak 10 kali. Sampel tersebut

diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan diinkubasi pada magnetic stand

selama 5 menit. Sampel tetap berada pada magnetic stand, kemudian transfer 125

μL supernatan tanpa menggangu beads dan lakukan sebanyak 2 kali. Kemudian

30 μL sample purification beads yang telah divortex selama 1 menit ditambahkan

ke dalam sampel. Setelah itu diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan

diinkubasi pada magnetic stand selama 5 menit. Supernatan dibuang sebanyak

276 μL. Pencucian pelet dilakukan secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80%

ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik, selanjutnya etanol 80% dibuang.

Pelet kemudian dikeringkan selama 5 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari

magnetic stand. Kemudian tambahkan 17.5 μL Resuspension Buffer dan tabung

PCR diangkat dari magnetic stand. Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2

menit dan diinkubasi pada magnetic stand selama 5 menit. Supernatan

dipindahkan sebanyak 15 μL ke dalam tabung PCR 0.3 ml yang baru.

Adenilasi Ujung 3’ DNA. A-tailing control 2.5 μL dan A-tailing mix 12.5

μL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan

menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung

yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermal cycler selama 30 menit

pada suhu 37oC, 70

oC selama 5 menit dan 4

oC selama 5 menit.

Penempelan Adapter. Ligase control 2.5 μL, DNA Ligase Mix 2 2.5 μL

dan DNA Adapter Index 2.5 μL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel.

Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan

sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam

thermal cycler selama 10 menit pada suhu 30oC. Sebanyak 5 μL Stop Ligase Mix

ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Kemudian,sampel dicampurkan

menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Langkah

selanjutnya yaitu pemurnan sampel yang diawali dengan penambahan 42.5 μL

Sample Purification Beads yang telah divorteks ke dalam sampel. Sampel

dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10

kali. Campuran sampel dan Sample Purification Beads diinkubasi selama 5 menit

pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam

6

magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit. Sebanyak 80 μL supernatan

dibuang dengan hati-hati jangan sampai mengenai pelet yang terletak pada

dinding tabung.

Ulangi tahapan sebelumnya untuk menghilangkan supernatan yang masih

tersisa. Pencucian pelet dilakukan secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80%

ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik, selanjutnya etanol 80%. Pelet

kemudian dikeringkan selama 5 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari

magnetic stand. Resuspension buffer sebanyak 52.5 μL ditambahkan ke dalam

tabung yang berisi pelet. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan

cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Selanjutnya, sampel diinkubasi selama 2

menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam

magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit untuk memisahkan supernatan

dengan pelet. Sample purification beads ditambahkan sebanyak 50 μL dan

diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian

dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit.

Kemudian sebanyak 95 μL supernatan dibuang dengan hati-hati jangan

sampai mengenai pelet yang terletak pada dinding tabung. Pencucian pelet,

sebanyak 200 μL etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik.

Selanjutnya, etanol 80% yang telah ditambahkan dibuang dan tahapan

penambahan etanol 80% diulangi kembali satu kali. Pelet kemudian dikeringkan

selama 5 menit pada suhu ruang. Sample purification beads ditambahkan

sebanyak 22.5 μL dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tabung yang

berisi sampel kemudian dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang

selama 5 menit. Sebanyak 20 μL supernatan dipindahkan ke dalam tabung PCR

0.3 ml yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin.

Analisis Pustaka Genom Jagung

Analisis pustaka genom dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif untuk

mengecek ukuran pustaka genom dan mengetahui konsentrasi dari pustaka genom

yang dihasilkan memenuhi persyaratan untuk sekuensing menggunakan next

generation sequencing HiSeq 2000. Syarat-syarat tersebut yaitu memiliki panjang

fragmen sekitar 300-500 bp dengan konsentrasi 10 nM.

Analisis kualitas pustaka genom (Agilent Technologies 2003). Uji ini

digunakan untuk mengetahui ukuran fragmen DNA hasil pemotongan yang

dilakukan dengan mengikuti protokol Agilent High Sensitivity DNA Assay. High

Sensitivity DNA Chip diletakkan di atas priming station chip dan kemudian ke

dalam lubang berlabel G ditambahkan 9 μL dye mix kemudian ditekan

menggunakan priming station selama 1 menit. Setelah dibuka kemudian ke dalam

lubang lain yang berlabel G ditambahkan 9 μL dye mix dan marker pada masing-

masing lubang kecuali lubang ladder, kemudian ke dalam lubang ladder

ditambahkan 1 μL High Sensitivity DNA ladder. Selanjutnya 1 μL sampel

dimasukkan ke dalam lubang sampel. Chip kemudian divorteks selama 1 menit

dan kemudian di-running pada alat agilent 2100 bioanalyzer yang terhubung

dengan komputer. Kualitas ukuran pustaka juga menggunakan metode

elektroforesis agarose 2 %. Sampel yang digunakan merupakan sampel hasil dari

qPCR. Kemudian hasil elektroforegram dianalisis dengan menggunakan software

bioinformatika photocap molecule weight.

7

Analisis kuantitas pustaka genom (Sigma 2008). Tahapan ini dilakukan

untuk mengetahui jumlah atau konsentrasi pustaka genom yang mencukupi

sebagai syarat untuk proses klasterisasi. Sampel dibuat sebanyak triplo dan setiap

ulangan dibuat tiga pengenceran berbeda, yaitu 1:1000, 1:2000 dan 1:4000.

Sebanyak 1 μL sampel dilarutkan dalam 999 μL buffer qPCR, kemudian divorteks

selama 10 detik. Pada ulangan ke dua yaitu sebanyak 100 μL sampel yang telah

dilarutkan ditambahkan ke dalam 100 μL buffer qPCR dan untuk ulangan ketiga

sebanyak 100 μL sampel dari ulangan 2 ditambahkan ke dalam 100 μL buffer

qPCR. Setiap sampel yang telah diencerkan ini kemudian diambil sebanyak 4 ul

dan ditambahkan 16 ul reagen qPCR dan dimasukkan ke dalam tabung PCR.

Standar larutan juga dibuat sebanyak 3 ulangan. Kemudian tabung PCR

dimasukkan ke dalam alat qPCR dan di-running selama 2 jam. Hasil yang

diperoleh akan digunakan untuk perhitungan klasterisasi pustaka genom. Sebelum

klasterisasi pustaka terlebih dahulu dihitung konsentrasi pustaka genom yang

dibutuhkan yaitu sebanyak 2 nM yang diencerkan ke dalam buffer pustaka (Tris-

Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1 % tween 20).

Klasterisasi Pustaka Genom Jagung (cBot cluster generation protocol 2010)

Klaterisasi DNA diawali dari preparasi sampel yang terdiri dari dua

tahapan, yaitu denaturasi dengan menggunakan 2 N NaOH dan pelarutan DNA

dalam buffer hibridisasi. Denaturasi diawali dengan penambahan 17 μL Tris-Cl 10

mM, pH 8.5 dan 1 μL 2 N NaOH ke dalam 2 μL sampel DNA sehingga diperoleh

konsentrasi DNA sebesar 1 nM. Campuran tersebut kemudian divorteks sampai

homogen. Sampel diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang untuk

mendenaturasi utas ganda DNA menjadi utas tunggal. DNA yang telah

didenaturasi disimpan dalam mesin pendingin sampai proses pelarutan DNA akan

dilakukan.

Tahapan preparasi sampel selanjutnya yaitu pelarutan DNA dalam buffer

hibridisasi. Tahapan ini diawali dengan pengenceran 1 nM DNA hasil denaturasi

menjadi DNA yang memiliki konsentrasi 5 pM, 6 pM, 7 pM dan 8 pM.

Konsentrasi tersebut didapat dari pengenceran 5 μL dalam 995 μL (5 pM), 6 μL

dalam 994 μL (6 pM), 7 μL dalam 993 μL (7 pM) dan 8 μL dalam 992 μL (8 pM).

Sebanyak 120 μL control library disiapkan dalam tabung pertama dalam suatu

lajur yang memiliki 8 tabung untuk digunakan sebagai kontrol dalam flow cell.

Sampel DNA yang telah diencerkan sebelumnya kemudian dipindahkan dalam

tabung yang lain dalam lajur tersebut. Posisi sampel dicatat dan tabung disimpan

dalam mesin pendingin sampai sampel akan dimasukkan kedalam cBot Cluster

Generation.

Sekuensing Pustaka Genom Jagung (HiSeq 2000 protocol 2011) Sekuensing pustaka genom menggunakan Illumina HiSeq 2000 terdiri dari

beberapa tahap yaitu persiapan reagen, pemilihan parameter untuk sekuensing,

pemasangan flow cell, sekuensing, dan post-run sequencing (maintenance wash).

Reagen yang digunakan selama sekuensing diantaranya SBS reagen (TruSeq SBS

kit), multiplexing reagen dan paired end reagen. Reagen-reagen tersebut

dimasukkan kedalam rak reagen compartment yang terdapat dalam Illumina

Hiseq 2000. Pemilihan parameter untuk sekuensing dilakukan melalui Hiseq

control software interface. Parameter yang tersedia diantaranya flow cell ID,

8

experiment, user name, flow cell type, control lane, output folder,confirm first

base, keep intensity files, existing recipe, save image dan align lanes. Tahapan

selanjutnya yaitu pemasangan flow cell yang telah diklasterisasi melalui cBot

cluster generation pada flow cell stage. Sekuensing dilakukan selama sekitar 11

hari dengan panjang pembacaan DNA 2 x 101 siklus. Tahapan terakhir setelah

proses sekuensing selesai dilakukan yaitu dengan dipindahkannya flow cell dari

flow cell stage dan dilakukannya post-run sequencing yaitu maintenance wash.

Tahapan maintenance wash terdiri dari pembilasan dengan menggunakan air dan

NaOH.

HASIL

Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif

Isolasi DNA genom jagung empat genotipe yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B,

LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) diuji secara kualitatif

menggunakan metode elektroforesis gel agarose dengan konsentrasi 1%. Keempat

genotipe ini menunjukkan hasil yang baik. Hal ini ditunjukkan dengan intensitas

pita DNA yang jelas dan terang. Masih terdapatnya RNA ditunjukkan dengan

adanya intensitas pita DNA pada dasar sumur gel. DNA yang dihasilkan juga

merupakan DNA genom karena DNA yang dihasilkan berukuran besar, yaitu

lebih dari 1500 bp (Gambar 1).

Gambar 1 Elektroforegram DNA genom total jagung. DNA marker (a), Sp010BB-

3-2-2-1-B (b), LK2-45 (c), PSG59-8 (genjah) (d) dan LBP54-50

(pulut) (e).

Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif

Uji kuantitatif menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific

dilakukan untuk mengetahui konsentrasi DNA serta kemurnian DNA terhadap

protein dan polisakarida. Keempat genotipe jagung yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B,

LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) menunjukkan hasil yang baik

dengan konsentrasi DNA yang tinggi berkisar 745.10 ng/µL – 2547.20 ng/µL

serta rasio kemurnian A260/A280 (terhadap protein) dan A260/A230 (terhadap

polisakarida) masing-masing berkisar 1.97 – 2.03 dan 2.03 – 2.17 (Tabel 1). Rasio

kemurnian terhadap protein dan polisakarida ditunjukkan dengan hasil yang baik.

1500 bp

a b c d e

9

Tabel 1 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom total jagung menggunakan

spektrofotometer nanodrop thermoscientific Genotipe [DNA] (ng/µL) A260 A280 A260/A280 A260/A230

Sp010BB-3-2-2-1-B

LK2-45

PSG59-8 (Genjah)

LBP54-50 (Pulut)

1303.00

2547.20

1788.40

745.10

26.06

50.94

35.77

14.90

12.85

25.76

17.68

7.55

2.03

1.98

2.02

1.97

2.03

2.06

2.17

2.15

Uji kuantitas DNA menggunakan Qubit 2.0 fluorometer dilakukan untuk

mengetahui konsentrasi DNA double stranded yang menjadi tolak ukur dalam

pustaka genom dengan konsentrasi minimal 20 ng/µL. Qubit 2.0 fluorometer

berbeda dengan spektrofotometer nanodrop thermoscientific karena Qubit 2.0

fluorometer hanya menghitung double stranded DNA yang akan digunakan untuk

konstruksi pustaka genom, kemudian disekuensing. Qubit 2.0 fluorometer

memiliki akurasi yang baik karena mampu mendeteksi konsentrasi double

stranded DNA dalam konsentrasi yang rendah. Konsentrasi double stranded DNA

memenuhi prasyarat tersebut dengan kisaran 55.60 – 112.00 ng/µL (Tabel 2).

Tabel 2 Kuantitas double stranded DNA genom total jagung menggunakan Qubit

2.0 fluorometer Genotipe [DNA]

(µg/mL)

Faktor

Dilusi

[dsDNA]

(ng/µL)

Sp010BB-3-2-2-1-B

LK2-45

PSG59-8 (Genjah)

LBP54-50 (Pulut)

1.12

0.57

0.63

0.55

100.00

100.00

100.00

100.00

112.00

57.20

63.40

55.60

Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung

DNA genom yang dibutuhkan untuk konstruksi pustaka genom harus

memiliki kualitas dan kuantitas yang baik. DNA genom yang digunakan harus

utuh, sedikit mengandung fragmen DNA yang berukuran kecil serta memiliki

konsentrasi yang tinggi. Konsentrasi DNA double stranded yang telah diukur

menggunakan Qubit 2.0 fluorometer, diencerkan dengan buffer resuspensi

mencapai volume 55 µL untuk memulai proses fragmentasi. Buffer resuspensi ini

akan tetap menjaga DNA dalam kondisi yang baik dan stabil serta dapat

melarutkan kembali DNA. DNA diencerkan dengan konsentrasi 20 ng/ µL.

Volume DNA yang digunakan berkisar antara 9.82 – 19.78 µL (Tabel 3). Volume

DNA yang dibutuhkan untuk pengenceran diperoleh dengan perhitungan :

( )

Tabel 3 Volume DNA genom jagung yang digunakan untuk uji pustaka genomik Genotipe

[dsDNA]

(ng/µL)

Volume DNA

(µL)

Volume Buffer

Resuspensi (µL)

Volume Total

(µL)

Sp010BB-3-2-2-1-B

LK2-45

PSG59-8 (Genjah)

LBP54-50 (Pulut)

112.00

57.20

63.40

55.60

9.82

19.23

17.35

19.78

45.18

35.77

37.65

35.22

55.00

55.00

55.00

55.00

10

Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung

Fragmentasi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu fragmentasi secara

fisik dengan cara sonikasi menggunakan covaris M220. Covaris M220 akan

memotong dan menghasilkan fragmen double stranded DNA dengan ujung 3’

atau 5’ overhang. Setelah difragmentasi dengan teknik sonikasi menggunakan

covaris M220, kemudian dilihat kuantitas DNA dan kemurniannya menggunakan

spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Konsentrasi DNA menurun drastis

karena DNA yang sudah terpotong-potong pada proses fragmentasi ini. Hasil

fragmentasi juga memiliki konsentrasi DNA yang menurun drastis dibandingkan

dengan DNA hasil isolasi. DNA genom hasil fragmentasi memiliki rasio A260/A280

berkisar 1.86 - 2.15 dan rasio A260/A230 berkisar 1.61 – 2.03 yang menunjukkan

kemurnian yang baik (Tabel 4).

Tabel 4 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom jagung hasil fragmentasi Genotipe [DNA] (ng/µL) A260 A280 A260/A280 A260/ A230

Sp010BB-3-2-2-1-B

LK2-45

PSG59-8 (Genjah)

LBP54-50 (Pulut)

13.00

19.10

13.40

18.10

0.26

0.38

0.27

0.36

0.12

0.21

0.13

0.19

2.15

1.86

2.06

1.89

1.83

1.61

2.03

1.75

Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End

Repair)

Tahapan modifikasi ujung fragmen DNA setelah fragmentasi bertujuan

mengubah ujung lengket pada fragmen DNA menjadi ujung tumpul (blunt end).

Hasil end repair diuji secara kuantitas menggunakan spektrofotometer nanodrop

thermoscientific untuk mengetahui konsentrasi DNA dan kemurniannya.

Konsentrasi DNA meningkat drastis dari tahapan fragmentasi. Konsentrasi DNA

tahapan fragmentasi berkisar 13.00 – 19.10 ng/µL meningkat pada tahapan end

repair menjadi kisaran 562.00 – 590.00 ng/µL (Tabel 5). Konsentrasi DNA yang

meningkat dapat disebabkan karena penambahan sample purification beads

sebanyak dua kali. Sample purification beads mengandung manik-manik

paramagnetik yang akan mengikat fragmen DNA dan memisahkannya dari

kelebihan pereaksi-pereaksi yang digunakan sehingga DNA yang terjerap semakin

banyak dan konsentrasinya meningkat. Rasio A260/A280 tergolong baik karena

masih dikisaran 1.80 – 2.00.

Tabel 5 Kuantitas dan rasio kemurnian fragmen DNA setelah tahapan modifikasi

ujung fragmen DNA pada preparasi konstruksi pustaka genom jagung Genotipe [DNA] (ng/µL) A260 A280 A260/A280 A260/ A230

Sp010BB-3-2-2-1-B

LK2-45

PSG59-8 (Genjah)

LBP54-50 (Pulut)

580.00

562.00

590.00

580.70

11.60

11.24

11.80

11.61

5.28

5.08

5.38

5.36

2.20

2.21

2.19

2.39

2.36

2.38

2.36

2.39

Kuantitas Hasil Ligasi Adapter DNA Genom Jagung

Ligasi merupakan tahapan terakhir pada pustaka genom. Ligasi adapter

merupakan proses pelekatan indeks atau adapter pada ujung fragmen DNA dan

menyiapkan pengikatan pustaka untuk hibridisasi pada flow cell saat tahapan

11

klasterisasi pustaka genom. Konsentrasi DNA berkisar 4.50 – 13.00 ng/µL dengan

rasio A260/A280 dengan kisaran 1.98 – 4.54 (Tabel 6). Kemurnian yang didapat

tidak murni. Hal ini dapat dikarenakan kontaminasi protein maupun polisakarida

atau dapat dikarenakan beads masih tercampur dengan DNA ketika injeksi ke

spektrofotometer nanodrop thermoscientific.

Tabel 6 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA cetakan setelah tahapan ligasi

adapter Genotipe [DNA] (ng/µL) A260 A280 A260/A280 A260/ A230

Sp010BB-3-2-2-1-B

LK2-45

PSG59-8 (Genjah)

LBP54-50 (Pulut)

13.00

4.50

6.10

9.60

0.26

0.09

0.12

0.19

0.08

0.02

0.03

0.10

3.12

4.54

3.51

1.98

1.16

0.82

1.58

0.79

Kualitas Pustaka DNA Genom Jagung

Pustaka genom divisualisasikan melalui elektroforegram hasil pengukuran

menggunakan agilent bioanalyzer. Agilent bioanalyzer mengukur semua hasil

pustaka berdasarkan potongan fragmen yang ditempeli adaptor pada salah satu

ujungnya atau pada kedua ujungnya. Genotipe LK2-45 berukuran 638 bp

sedangkan PSG59-8 berukuran 970 bp (Gambar 2). Fragmen DNA yang

dibutuhkan untuk klasterisasi yaitu berukuran kurang dari 800 bp untuk

mendapatkan hasil sekuensing yang baik karena dapat mempengaruhi intensitas

basa yang dihasilkan. Genotipe PSG59-8 yang berukuran lebih dari 800 bp tetap

diklasterisasi untuk melihat perbandingan hasil sekuensing.

Gambar 2 Elektroforegram hasil pustaka genom jagung menggunakan agilent

bioanalyzer genotipe LK2-45 dan PSG59-8 (genjah).

Analisis kualitatif pustaka genom jagung menggunakan agilent

bioanalyzer juga menghasilkan tabel yang memuat ukuran fragmen dan molaritas

sampel hasil pustaka. Molaritas untuk genotipe LK2-45 dan PSG59-8 masing-

masing adalah 6.88 dan 10.80 nmol/L (Tabel 7).

Tabel 7 Ukuran fragmen dan konsentrasi DNA hasil pustaka genom untuk

sekuensing Genotipe Ukuran Fragmen (bp) Molaritas (nmol/L)

LK2-45

PSG59-8 (Genjah)

638.00

970.00

6.88

10.80

12

Analisis kualitatif pustaka genom juga menggunakan elektroforesis

agarose dengan konsentrasi 2 %. Setelah dilektroforesis, hasilnya dianalisis

menggunakan software bioinformatika photocap molecule weight. Kedua genotipe

ini memiliki ukuran yang sama yaitu 658 bp (Gambar 3).

Gambar 3 Elektroforegram hasil pustaka genom yang sudah di qPCR genotipe

Sp010BB-3-2-2-1-B (a) dan LBP54-50 (Pulut) (b).

Sekuensing Pustaka Genom Jagung

Jumlah basa hasil sekuensing empat genotipe jagung (Sp010BB-3-2-2-1-

B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) secara total diperoleh

sebanyak 287.1 Gbp atau 287.1 x 109

bp dan memiliki jumlah yang sama dengan

nilai yang diprediksi selama proses sekuensing (projected total yield) 287.1 Gbp

atau 287.1 x 109

bp (Tabel 8). Kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing

ditunjukkan dengan nilai yield perfect dan yield <=3 errors. Hasil yield perfect

menunjukkan sebanyak 5.1 Gbp basa yang melewati passing filter dan yield <=3

errors yang menunjukkan bahwa sebanyak 6.1 Gbp basa pada lajur kontrol

memiliki tingkat kesalahan 1-3 basa (Tabel 8). Passing filter adalah sejenis

algoritma yang dipakai oleh komputer untuk menentukan keakuratan pembacaan

basa saat sekuensing. Nilai % perfect menunjukkan presentase tingkat kesamaan

antara basa yang dihasilkan dengan sekuen PhiX dalam 99 siklus bernilai 82%.

Nilai % <=3 errors menunjukkan sebanyak 97.6% dari total basa yang dihasilkan

memiliki tingkat kesalahan kurang dari 3 basa (Tabel 8).

Tabel 8 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing secara

umum

Yield

Total

(Gbp)

Projected

Total

Yield

(Gbp)

Yield

Perfect

(Gbp)

Yield <=3

errors

(Gbp)

% Perfect

[Num

cycles]

% <=3

errors [Num

Cycles]

287.1 287.1 5.1 6.1 82 [99] 97.6 [99]

Densitas (kerapatan klaster) yang didapat untuk keempat genotipe sangat

rapat yaitu pada kisaran 673 – 875 K/mm2, sedangkan densitas yang ideal berkisar

antara 400-600 K/mm2 (Tabel 9). Klaster PF menunjukkan sebanyak 87.2 –

93.3 % jumlah klaster yang melewati passing filter. Phasing menunjukkan sekitar

0.197 – 0.208% pembacaan basa berjalan lebih lambat pada saat sekuensing,

1500 bp

a b

13

sedangkan prepashing menunjukkan 0.241 – 0.324% sekitar pembacaan basa

berjalan lebih cepat. Reads menunjukkan sebanyak 186.05 – 241.86 M urutan

basa yang terbaca pada klaster, sedangkan reads PF menunjukkan 173.12 –

210.16 M urutan basa yang berhasil melewati passing filter. Nilai %>=Q30

menunjukkan pada kisaran 80.8 – 87.8% kesalahan pembacaan hanya terjadi pada

1 basa dari 1000 basa. Nilai klaster PF, phasing, prepashing dan %>=Q30

menunjukkan hasil yang ideal. Nilai %>=Q30 dan jumlah klaster yang dihasilkan

keempat geotipe selama proses sekuensing divisualisasikan melalui histogram

untuk genotipe Sp010BB-3-2-2-1-B (Gambar 4), genotipe LK2-45 (Gambar 5),

genotipe PSG59-8 (genjah) (Gambar 6) dan LBP54-50 (pulut) (Gambar 7).

Tabel 9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing

Lajur Densitas

(K/mm2)

Klaster

PF (%)

Phasing

(%)

Prepashing

(%)

Reads

(M)

Reads

PF (M)

%>=

Q30

Sp010BB-3-2-2-1-B

LK2-45

PSG59-8 (Genjah)

LBP54-50 (Pulut)

875

855

762

673

87.2

87.5

91.2

93.3

0.208

0.206

0.209

0.197

0.318

0.324

0.265

0.241

241.86

236.38

210.61

186.05

210.16

206.17

191.50

173.12

81.8

80.8

86.3

87.9

Gambar 4 Histogram jumlah klaster genotipe Sp010BB-3-2-2-1-B berdasarkan

kualitas sekuen yang dihasilkan.

Gambar 5 Histogram jumlah klaster genotipe LK2-45 berdasarkan kualitas sekuen

yang dihasilkan.

Skor Q

Skor Q

14

.

Gambar 6 Histogram jumlah klaster genotipe PSG59-8 (genjah) berdasarkan

kualitas sekuen yang dihasilkan.

Gambar 7 Histogram jumlah klaster genotipe LBP54-50 (pulut) berdasarkan

kualitas sekuen yang dihasilkan.

Larutan sekuensing yang terpakai dapat dilihat dari grafik untuk empat

genotipe jagung (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50

(pulut)) (Gambar 8). Selama proses sekuensing, semakin banyak siklus, maka

larutan sekuensing yang dipakai semakin banyak dan stok di dalam alat

sekuensing semakin sedikit. Grafik ini membantu proses sekuensing agar berjalan

baik karena dapat mengontrol jumlah larutan yang berada di dalam alat. Jika

larutan sekuensing berada dalam keadaan kritis (stok hamper habis), maka proses

sekuensing dapat dihentikan dahulu, kemudian larutan sekuensing ditambahkan

dan proses sekuensing dapat dilanjutkan kembali.

a b

Skor Q

Skor Q

Siklus Siklus

15

Gambar 8 Intensitas banyaknya larutan sekuensing yang tersisa selama proses

sekuensing berlangsung genotipe Sp010BB-3-2-2-1-B (a), LK2-45

(b), PSG59-8 (genjah) (c) dan LBP54-50 (pulut) (d).

Jumlah basa-basa nitrogen empat genotipe jagung (Sp010BB-3-2-2-1-B,

LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) selama proses sekuensing

seperti adenin, timin, guanin dan sitosin dapat dilihat melalui grafik. Grafik

tersebut berbentuk garis lurus yang menyatakan bahwa jumlah basa-basa nitrogen

tersebut stabil selama proses sekuensing (Gambar 9).

Gambar 9 Presentase basa-basa nitrogen yang terbaca selama proses sekuensing

genotipe Sp010BB-3-2-2-1-B (a), LK2-45 (b), PSG59-8 (genjah) (c)

dan LBP54-50 (pulut) (d).

Tingkat kesalahan (error rate) yang dinyatakan dalam persen

menunjukkan presentase perbandingan kesalahan pembacaan basa antara pustaka

genom dengan kontrol. Nilai error rate yang dihasilkan berkisar 0.32 – 0.51%.

Intensitas keempat basa dideteksi melalui hasil pendaran flourescen yang

dihasilkan dari sintesis basa selama proses sekuensing (Tabel 10). Intensitas basa

yang dihasilkan pada setiap lajur flow cell pada siklus pertama memiliki nilai lebih

c d

a b

c d

Siklus Siklus

16

dari 3000 (Tabel 10). Nilai error rate dan intensitas basa yang dihasilkan pada

siklus pertama untuk empat genotipe jagung (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45,

PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) bernilai ideal.

Tabel 10 Tingkat kesalahan (error rate) dan intensitas basa hasil sekuensing

Lajur Error Rate (%) Intensity Cycle 1

Sp010BB-3-2-2-1-B

LK2-45

PSG59-8 (Genjah)

LBP54-50 (Pulut)

0.51

0.47

0.35

0.32

3695

3762

3991

4022

PEMBAHASAN

Isolasi DNA Genom Jagung

Isolasi DNA genom jagung empat genotipe yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B,

LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) menggunakan metode

Doyle&Doyle (1987) yang dimodifikasi. Cetil trimetil ammonium bromida

(CTAB) yang digunakan dalam ekstraksi DNA ini berfungsi untuk mendegradasi

senyawa-senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam tanaman. CTAB

bersifat sebagai detergen kationik akan membentuk kompleks tak larut dengan

asam nukleat sehingga dapat memisahkan kontaminan polisakarida dan polifenol

dari asam nukleat serta dapat menghambat aktivitas nuklease. Metode

Doyle&Doyle (1987) yang dimodifikasinya adalah penambahan natrium disulfit

pada buffer CTAB.

Ekstraksi DNA pada penelitian ini menggunakan nitrogen cair untuk

melisis dinding sel dapat mengeluarkan semua isi sel yang kemudian ditampung

dalam larutan penyangga yang berisi Tris HCl dan EDTA. Dinding sel juga dapat

dipecahkan dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan

penghangatan pada suhu 65°C (Subandiyah 2006). Isopropanol merupakan

alternatif dari etanol absolut. Isopropanol lebih efisien dalam persipitasi DNA

dibandingkan etanol. Namun, isopropanol kurang volatil sehingga membutuhkan

waktu yang lebih lama untuk mengeringkan pellet (Sambrook et al. 2001).

Berbagai metode telah dilakukan sebelumnya untuk mendapatkan kualitas

DNA yang diinginkan agar dapat memenuhi persyaratan untuk pustaka genom dan

metode ini yang tepat untuk menghasilkan kualitas DNA yang mengandung

double stranded DNA dengan konsentrasi yang tinggi. Banyak faktor yang

mempengaruhi keberhasilan isolasi DNA untuk menghasilkan kualitas dengan

konsentrasi double stranded DNA yang tinggi, salah satunya adalah tanaman yang

digunakan berumur tidak terlalu tua (masih muda) dan dalam keadaan yang segar.

Protokol Doyle & Doyle (1987) sering digunakan untuk ekstraksi DNA tanaman

(Ribeiro et al. 2007).

Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif

Hasil isolasi DNA divisualisasikan melalui elektroforegram yang

sebelumnya dilakukan elektroforesis terlebih dahulu (Gambar 1). Uji kualitatif

yang divisualisasikan melalui elektroforegram menggunakan elektroforesis gel

agarosa 1%. Agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang

17

ukurannya memiliki rentang beberapa ratus hingga sekitar 20000 kb. Konsentrasi

gel yang sangat encer (0.1-0.2%) dapat meningkatkan daya pisah elektroforesis

tetapi hal tersebut sulit dilakukan karena gel yang encer sangat mudah pecah. Pada

konsentrasi 1% bobot per volume, gel yang berada dalam buffer yang

mengandung air dalam kadar tinggi menghasilkan struktur serat yang baik dengan

ukuran pori besar dan tahan terhadap gesekan. Agarosa bersifat tidak toksik,

kompleks berupa bubuk yang terdiri dari campuran polimer dengan dua unit dasar

galaktosa, agarosa dan agaropektin (Bintang 2010).

Hasil isolasi DNA genom jagung dari empat genotipe jagung

menunjukkan hasil yang baik, terlihat dari intensitas pita DNA yang jelas. Terlihat

intensitas terdapat pada dasar elektroforegram empat genotipe. Intensitas tersebut

merupakan konsentrasi RNA. Hal ini dapat disebabkan karena penggunaan

RNAse yang terlalu sedikit sehingga masih terdapat RNA (Gambar 2). Hasil

elektroforesis juga menunjukkan bahwa keempat pita DNA yang dihasilkan

merupakan DNA genom, karena ukuran pita DNA yang cukup besar (lebih dari

1500 bp). Sesuai dengan pernyataan Brown (2007) bahwa elektroforesis gel akan

memisahkan molekul DNA sesuai dengan ukurannya, semakin besar molekul

DNA maka pita DNA yang dihasilkan semakin dekat dengan sumur gel.

Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif Selain diuji secara kualitatif, DNA hasil isolasi juga diuji secara

kuantitatif. Uji kuantitatif ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi DNA dan

tingkat kemurnian DNA dari kontaminan polisakarida, dan protein. Uji kuantitatif

dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific pada

panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm. Panjang gelombang 230 nm merupakan

serapan maksimum untuk polisakarida, panjang gelombang 260 nm merupakan

serapan maksimum untuk asam nukleat dan panjang gelombang 280 nm

merupakan serapan maksimum untuk protein. Kemurnian DNA ditentukan

melalui rasio A260/A280 dan A260/A230. Rasio A260/A280 menunjukkan kemurnian

DNA terhadap protein, sedangkan rasio A260/A230 menunjukkan kemurnian DNA

terhadap polisakarida. Hasil uji kuantitatif genom total DNA jagung yang

dihasilkan memiliki kisaran 745.10 – 2547.20 ng/µL dengan rasio A260/A280

berkisar antara 1.97 - 2.03 ng/µL dan rasio A260/A280 berkisar antara 2.03 – 2.17

ng/µL (Tabel 1). Menurut Walker&Wilson (2000), nilai kemurnian yang lebih

dari 2.00 menujukkan adanya kontaminasi RNA, sedangkan nilai kemurnian yang

kurang dari 1.80 menunjukkan sampel terkontaminasi polisakarida dan protein

(Yuwono 2005). Hal ini menunjukkan hasil isolasi DNA tergolong baik meskipun

ada kontaminasi RNA karena rasio lebih dari 2.00.

Uji kuantitatif juga dilakukan dengan menggunakan Qubit 2.0 fluorometer.

Uji kuantitatif ini berbeda dengan uji kuantitatif sebelumnya yang menggunakan

spektrofotometer nanodrop thermoscientific, karena Qubit 2.0 fluorometer hanya

menghitung konsentrasi double stranded DNA (dsDNA). Double stranded DNA

(dsDNA) ini dijadikan tolak ukur untuk ke tahapan selanjutnya yaitu pustaka

genom yang mempunyai persyaratan bernilai 20 ng/µL. Qubit 2.0 fluorometer

memiliki nilai ketelitian yang tinggi sehingga mampu mendeteksi konsentrasi

yang sangat rendah (Invitrogen 2010). Kosentrasi double stranded DNA berkisar

antara 55.60 – 112.00 ng/µL. Berdasarkan uji kualitatif dan kuantitatif, DNA

genom jagung yang telah diisolasi berhasil memenuhi persyaratan untuk

18

digunakan sebagai bahan konstruksi pustaka genom. DNA genom yang

dibutuhkan untuk konstruksi pustaka genom harus memiliki kualitas dan kuantitas

yang baik. DNA genom yang digunakan harus utuh dan memiliki konsentrasi

yang tinggi (Michiels et al. 2003).

Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung

Konsentrasi double stranded DNA yang didapat dari pengukuran dengan

menggunakan Qubit 2.0 fluorometer diencerkan dengan buffer resuspensi untuk

difragmentasi menggunakan covaris M220. Buffer resuspensi ini digunakan untuk

menjaga DNA agar selalu dalam kondisi yang baik dan stabil serta untuk

melarutkan kembali DNA. Sampel DNA dicairkan sampai volume 55 µL dengan

konsentrasi 20 ng/µL. Volume DNA yang akan diencerkan didapatkan dengan

cara konsentrasi minimal pustaka genom yaitu 20 ng/µL dikalikan dengan volume

55 µL dibagi dengan konsentrasi DNA double stranded dengan satuan ng/µL

sehingga didapat konsentrasi double stranded DNA yang diencerkan berkisar

antara 9.82 – 19.78 µL (Tabel 3). Semakin besar konsentrasi double stranded

DNA, maka semakin sedikit buffer resuspensi yang digunakan untuk

mengencerkan (Covaris 2012).

Kualitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung

Fragmentasi DNA genom merupakan tahapan pertama dalam konstruksi

pustaka genom. Pustaka genom merupakan kumpulan sekuens (urutan) DNA dari

suatu organisme. Bagian-bagian spesifik dari genom kemudian dapat disub-klon

untuk memperoleh pustaka sub-genom (Wulandari 2009). Pustaka genom

merupakan bagian yang sangat penting dalam program perbaikan genetika

tanaman secara molekuler maupun melalui pemuliaan konvensional karena sangat

bermanfaat dalam usaha isolasi dan karakterisasi suatu gen dan dapat digunakan

untuk pemetaan gen secara fisik (Suharsono 2003). Pustaka genom menggunakan

DNA genomik atau kromosom sebagai sumber DNA yang digunakannya. Hal

yang perlu diperhatikan ketika melakukan konstruksi suatu perpustakaan gen

adalah perpustakaan tersebut harus merepresentasikan semua gen yang ada di

dalam sumber DNA asalnya. Perpustakaan gen dikatakan representatif apabila

berisi semua sekuens aslinya. Perpustakaan genom yang representatif dapat dibuat

dengan cara memurnikan DNA genomik, kemudian dipotong secara acak menjadi

fragmen-fragmen yang ukurannya sesuai dengan keperluan kloning menggunakan

vektor yang dipilih. Pemurnian DNA genomik eukariot biasanya dilakukan

dengan terlebih dahulu mengisolasi nukleus dan menghilangkan protein, lemak,

serta makromolekul lain yang tidak diinginkan dengan memberikan protease dan

melakukan ekstraksi fenol-kloroform. Sementara itu, DNA prokariot dapat

diekstraksi langsung (Wahyudi 2001).

Menurut Wahyudi (2001), DNA genomik hasil pemurnian tersebut

selanjutnya dipotong-potong secara acak. Pada dasarnya ada dua cara

pemotongan, yaitu pemotongan fisik seperti sonikasi dan digesti menggunakan

enzim restriksi. Fragmentasi yang dilakukan dalam penelitian ini dengan cara

sonikasi dengan memotong DNA genom secara acak pada kisaran pemotongan

300-400 bp. Fragmentasi dengan teknik sonikasi ini menggunakan insrumen

covaris M220. Covaris M220 ini memiliki fokus ultrasonikator dengan proses

AFA (adaptive focused acoustic) yang memiliki kekuatan memotong DNA secara

19

hidrodinamik menjadi potongan acak. Proses ini berlangsung dalam keadaan

isothermal untuk memastikan kedua fragmen dalam potongan yang sama dan

memiliki konsentrasi double stranded DNA yang tinggi (Covaris 2012). Konstruksi pustaka genom jagung pada penelitian ini mengikuti protokol

TruSeq DNA low troughput protocol dari Illumina yang dimodifikasi pada beberapa

tahapannya. Tujuan dari protokol ini yaitu menambahkan sekuen adaptor ke dalam

ujung fragmen DNA untuk menghasilkan pembacaan ganda atau sekuen ujung

pasangan pustaka. Tahapan awal konstruksi pustaka genom jagung ini adalah isolasi

DNA genom utuh dari jagung , kemudian dilakukan pemotongan DNA pada panjang

tertentu yang diharapkan potongan tersebut telah dapat mewakilkan gen-gen penyandi

genom jagung, modifikasi ujung DNA, adenilasi ujung 3’OH dan ligasi adaptor. Hasil

konstruksi dari pustaka genom nantinya dapat dianalisis agar dapat dilanjutkan ke

tahap berikutnya (Illumina 2010c).

Selanjutnya hasil fragmentasi dengan covaris M220 diuji secara kuantitatif

dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Konsentrasi

DNA mengalami penurunan dari kisaran 55.60 – 112.00 (ng/µL) (hasil isolasi

DNA genom) menjadi kisaran 13.00 – 19.10 ng/µL (setelah dilakukan

fragmentasi) (Tabel 4). Hasil konsentrasi DNA yang mengalami penurunan

tersebut menunjukkan bahwa DNA sudah terpotong-potong. Rasio A260/A280

berkisar antara 1.85 – 2.15 menunjukkan DNA masih memiliki kemurnian yang

baik karena rasio A260/A280 masih berada dalam kisaran 1.8 – 2.0 (Walker &

Wilson 2000).

Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End

Repair)

Modifikasi ujung fragmen DNA merupakan tahapan kedua setelah

fragmentasi dalam konstruksi pustaka genom. Modifikasi ujung fragmen DNA

atau end repair memiliki tujuan untuk mengubah ujung lengket pada fragmen

DNA menjadi ujung tumpul (blunt end). Tahapan end repair ditambahkan end

repair mix yang mengandung enzim eksonuklease dan enzim polymerase. Kerja

kedua enzim ini bergantung pada letak ujung lengket. Jika ujung lengket terletak

pada 3’OH dari fragmen DNA, maka enzim eksonuklease akan memotong ujung

lengket tersebut. Tapi jika ujung lengket terletak pada ujung 5’P dari fragmen

DNA maka enzim polimerase akan membentuk utas DNA baru yang bersifat

komplemen dengan utas DNA pada ujung lengket (Illumina 2010a).

Fragmen DNA yang telah mengalami modifikasi dipurifikasi

menggunakan Sample Purification Beads. Purifikasi menggunakan Sample

Purification Beads juga dilakukan pada tahapan adenilasi ujung 3’OH dan ligasi.

Sample Purification Beads efektif dalam mengikat fragmen DNA dan

menghilangkan kelebihan pereaksi-pereaksi yang digunakan selama preparasi

konstruksi pustaka genom karena terdapat manik-manik paramagnetik. Magnetic

stand yang membantu kerja Sample Purification Beads dalam mengikat DNA

yang akan menempel pada dinding tabung saat inkubasi dan memisahkannya dari

pereaksi yang masih terlarut. Inkubasi ini dilakukan untuk mengoptimalkan

penempelan fragmen DNA pada dinding tabung yang tertarik oleh manik-manik

paramagnetic sehingga larutan menjadi jernih. Pencucian dengan etanol 80%

bertujuan untuk menghilangkan pereaksi-pereaksi yang masih tersisa setelah tahap

inkubasi, sedangkan buffer resuspensi ditambahkan untuk melarutkan fragmen-

20

fragmen DNA yang masih menempel pada dinding tabung (Agencourt Bioscience

Corp 2009).

Hasil modifikasi ujung fragmen atau end repair diuji secara kuantitatif

menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Konsentrasi DNA

pada tahapan fragmentasi berkisar antara 13.00 – 19.10 ng/µL dan pada tahapan

end repair mengalami peningkatan dengan kisaran 562 – 590 ng/µL (Tabel 5).

Peningkatan konsentrasi DNA ini dapat disebabkan karena penambahan Sample

Purification Beads sebanyak 2x. Pertama berupa dilute beads mix yang

merupakan campuran antara Sample Purification Beads dengan buffer resuspensi

dan kedua dengan Sample Purification Beads. Agencourt Bioscience Corp (2009)

menyatakan bahwa Sample Purification Beads berfungsi untuk mengikat DNA

sehingga banyak DNA yang terjerap oleh manik-manik paramagnetik dan pada

akhir tahapan end repair hanya dilarutkan dengan 17.5 µL buffer resuspensi.

Berbeda pada tahapan fragmentasi sebanyak 55 µL sehingga konsentrasi larutan

menjadi pekat. Hal ini yang dapat menyebabkan konsentrasi DNA meningkat

pada tahapan modifikasi ujung fragmen atau end repair. Rasio A260/A280 pada

tahapan end repair berkisar antara 2.19 – 2.39. Nilai Rasio A260/A280 masih

tergolong baik meskipun nilainya di atas 2, namun tidak terlalu besar nilai

selisihnya (Walker & Wilson 2000).

Kuantitas Hasil Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adapter DNA Genom

Jagung

Tahapan adenilasi ujung 3’OH dan ligase adapter, kedua ujung 3’OH pada

fragmen DNA berikatan dengan basa tunggal adenin. Tujuan dari tahapan ini

adalah mencegah ligasi antar fragmen DNA dan mempersiapkan fragmen DNA

sebelum dilakukan ligasi adapter. Basa tunggal timin pada ujung adapter berikatan

dengan basa adenin pada ujung fragmen DNA. Ligasi adapter pada preparasi

konstruksi pustaka genom bertujuan untuk membantu pengikatan pustaka genom

pada flow cell saat tahapan klasterisasi pustaka genom (Illumina 2010b). Tahap

adenilasi menggunakan a tailing mix bertujuan untuk membuat fragmen DNA

menjadi kompatibel dengan adaptor dan mencegah ligasi sendiri (self ligation)

dengan penambahan adenin tersebut pada 3’. Tahap adenilasi juga didukung

dengan pengoptimasian inkubasi menggunakan thermocycle dengan suhu dan

waktu yang telah ditentukan dalam TruSeq DNA low troughput protocol dari

Illumina (Illumina 2010c).

Indeks adaptor juga ditambahkan dengan tujuan sebagai indeks atau

adaptor penunjuk pada ujung fragmen DNA dan menyiapkan pengikatan pustaka

untuk hibridisasi pada flow cell. Salah satu contoh indeks adaptor yang digunakan

adalah indeks adaptor nomor 2 (AD002) yang berisi sekuen nukleotida CGATGT

(A) serta ligation mix ditambahkan dengan tujuan menghubungkan adaptor untuk

disisipkan (Illumina 2010c). Proses ligasi dihentikan dengan menambahkan stop

ligation buffer. Stop ligation buffer segera ditambahkan karena proses ligasi yang

masih aktif menyebabkan adanya interaksi antar nukleotida bahkan

mengakibatkan adaptor saling menempel satu sama lain sehingga tidak

menghasilkan pustaka dengan kualitas yang baik yang akan berpengaruh pada

hasil sekuensing. Uji kuantitatif dilakukan menggunakan spektrofotometer

nanodrop thermoscientific. Terjadi penurunan konsentrasi pada tahap ligasi.

21

Kualitas Pustaka Genom Jagung

Setelah konstruksi pustaka genom dilakukan, langkah selanjutnya adalah

pengujian hasil pustaka secara kuantitatif menggunakan quantitative PCR (qPCR),

sedangkan secara kualitatif menggunakan agilent bioanalyzer. qPCR memiliki

fungsi yang berbeda dengan agilent bioanalyzer, yaitu qPCR memiliki akurasi

yang lebih baik dibandingkan agilent bioanalyzer, karena qPCR hanya

menghitung pustaka yang memiliki fragmen dengan ditempeli adaptor pada kedua

ujungnya dan menggunakan dua primer sehingga konsentrasi atau molaritas yang

dihasilkan lebih sedikit. Berbeda dengan qPCR, agilent bioanalyzer mengukur

semua hasil pustaka berdasarkan potongannya meskipun fragmen hanya ditempeli

adaptor pada salah satu ujungnya sehingga konsentrasi atau molaritas yang

dihasilkan jauh lebih besar dibandingkan dengan qPCR (Sigma 2008).

Prinsip pengujian elektroforesis yang didasarkan pada prinsip gel

elektroforesis yang dipindahkan ke dalam bentuk chip atau lempengan. Bentuk

lempengan akan mengurangi penggunaan waktu dan penggunaan sampel. Untuk

pengujian kuantitas DNA dan protein dapat diselesaikan dengan bantuan “upper

marker”. Peak sampel berada dibawah daerah upper marker dan karena

konsentrasi upper marker telah diketahui maka konsentrasi tiap sampel juga dapat

dihitung (Agilent Technologies 2003). Berdasarkan (Tabel 7) yang didapat dari

agilent bioanalyzer, ukuran fragmen DNA hasil pustaka berada pada kisaran 638

dan 970 bp. Kualitas pustaka yang baik memiliki ukuran fragmen <800 bp.

Genotipe PSG59-8 (genjah) memiliki ukuran fragmen >800 bp namun memiliki

konsentrasi yang paling tinggi sebesar 10.80 (nmol/L). Meskipun genotipe

PSG59-8 (genjah) kurang memenuhi persyaratan, namun klasterisasi dan

sekuensing tetap dilakukan untuk melihat hasilnya.

Penghitungan ukuran basa juga dilakukan menggunakan elektroforesis

2 %. Sampel yang digunakan merupakan hasil dari qPCR. Genotipe yang diuji

menggunakan elektroforesis yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B dan LBP54-50 (pulut).

Kedua genotipe ini memiliki ukuran basa yang sama setelah dianalisis

menggunakan software bioinformatika yaitu photocap molecule weight, yaitu

bernilai 658 bp (Gambar 3). Kekurangan dari teknik menggunakan elektroforesis

dan dianalisis menggunakan software bioinformatika photocap adalah hasil yang

didapat kurang akurat dibandingkan dengan agilent bioanalyzer.

Kuantitas Pustaka Genom Jagung

Terdapat tiga faktor pengenceran yang berbeda, yaitu 1000, 2000 dan

4000. Tiap genotipe jagung ((Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah)

dan LBP54-50 (pulut)) dilakukan secara duplo atau triplo bertujuan untuk

menghindari pada saat pembacaan di instrumen qPCR. Konsentrasi pustaka

genom kentang yang dibutuhkan untuk klasterisasi yaitu minimal 2 nM yang

diencerkan ke dalam Tris-Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1% Tween 20 untuk mencegah

absorbsi template ke tabung saat siklus karena dapat menurunkan jumlah

klasterisasi. Genotipe PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) memenuhi

persyaratan minimal konsentrasi untuk sekuensing, edangkan untuk genotipe

Sp010BB-3-2-2-1-B dan LK2-45 memiliki konsentrasi <2 nM, namun klasterisasi

dan sekuensing tetap dilakukan, karena konsentrasi paling minimal digunakan

yaitu 0.6 nM, 2 nM merupakan syarat yang paling baik untuk dilakukan ke proses

selanjutnya yaitu klasterisasi dan sekuensing (Lampiran 2). Proses klasterisasi

22

sendiri menggunakan pustaka DNA genom dengan konsentrasi 8 pM dan 13 pM,

hasil ini bisa diperoleh dari pengenceran stok pustaka DNA 2 nM.

Klasterisasi dan Hasil Sekuensing Genom Total DNA Jagung

Konstruksi pustaka genom yang telah dilakukan serta diuji hasilnya secara

kuantitatif dengan qPCR dan agilent bioanalyzer, kemudian diklasterisasi

menggunakan cBot Cluster Generation. Klasterisasi pustaka genom terdiri dari

lima tahapan, yaitu denaturasi, immobilisasi dan perpanjangan DNA, amplifikasi,

linearisasi dan hibridisasi (Lampiran 3). Klasterisasi ini bertujuan untuk

menghasilkan klaster atau kelompok salinan dari pustaka genom yang akan

disekuen (Mardis 2008).

Sekuensing genom total menggunakan Next Generation Sequencing

(NGS) memiliki beberapa kelebihan, diantaranya memiliki akurasi yang tinggi

yaitu 99% dan biaya yang dibutuhkan juga lebih murah dibandingkan dengan

metode Sanger. Instrumen NGS yang digunakan pada penelitian ini salah satunya

adalah HiSeq2000 (Lampiran 5). Kelebihan Hiseq2000 yaitu mampu

mengurutkan lebih dari lima genom manusia dalam 30 kali cakupan secara

bersamaan, serta mengurutkan lebih dari 192 ekspresi gen. instrument ini juga

menghasilkan 540-600 Gb dengan panjang fragmen 2 x 100 bp selama kurang

lebih 11 hari. Terdapat empat tahapan secara umum dalam sekuensing DNA

menggunakan HiSeq2000, yaitu preparasi sampel pustaka genom, klasterisasi

pustaka genom, sekuensing dan analisis data sekuens (Illumina 2010a).

Prinsip sekuensing menggunakan NGS HiSeq2000 adalah Sequencing by

Synthesis (SBS) (Lampiran 6). Selama proses sekuensing berlangsung, keempat

basa nitrogen penyusun DNA (adenin, timin, guanin dan sitosin) dialirkan secara

simultan ke dalam flow cell (Lampiran 7). Kemudian akan berikatan dengan

fragmen DNA polymerase. Secara spesifik, keempat basa tersebut membawa

penanda berupa fluorescen yang akan berpendar ketika basa-basa tersebut

berikatan membentuk utas DNA yang komplemen dengan fragmen DNA pada

klaster. Gugus 3’OH pada basa-basa tersebut mengalami modifikasi sehingga

tidak dapat berikatan dengan basa penyusunnya yang lain sebelum satu siklus

sintesis telah selesai dilakukan. Satu siklus telah selesai jika pendaran fluorescen

yang dihasilkan dari basa yang telah disintesis dideteksi oleh kamera CCD.

Kamera CCD ini akan menangkap pendaran fluorescen hasil reaksi pembentukan

utas DNA dan akan menampilkan hasilnya melalui tampilan Real Time Analysis

pada monitor NGS HiSeq2000. Berakhirnya satu siklus ditandai dengan putusnya

ikatan kimia penanda fluorescen dan gugus 3’OH termdifikasi yang selama

sintesis berikatan dengan fragmen DNA dalam klaster (Mardis 2008, Ansorge

2009, Metzker 2010).

Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom Secara Umum

Jumlah basa hasil sekuensing empat genotipe jagung ((Sp010BB-3-2-2-1-

B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) secara total diperoleh

sebanyak 287.1 Gbp (Tabel 8). Hasil ini memiliki kesamaan dengan jumlah basa

pada projected total yield. Projected total yield merupakan jumlah basa yang

diprediksikan selama proses sekuensing berlangsung serta hasil ini bergantung

pada tipe pembacaan basa yang dipilih selama proses sekuensing. NGS

HiSeq2000 memiliki empat tipe pembacaan yaitu single read, paired end,

23

multiplexed single read dan multiplexed paired end. Pada penelitian ini dilakukan

tipe pembacaan paired read dengan pembacaan sebanyak 200 siklus (Illumina

2010a). Yield perfect yang diperoleh selama proses sekuensing sebesar 5.1 Gbp

(Tabel 8). Nilai yield perfect menunjukan jumlah basa yang secara akurat

melewati passing filter. Passing filter merupakan sejenis algoritma yang dipakai

oleh komputer untuk menentukan kearutan pembacaan basa saat sekuensing.

Tingkat kesalahan selama proses sekuensing berlangsung dapat dilihat dari

yield <=3 errors, % perfect dan % <=3 errors. Yield <=3 errors menunjukkan

sebanyak 6.1 Gbp basa pada lajur kontrol yang memiliki tingkat kesalahan di

bawah 3 basa. Sebanyak 82% basa yang dihasilkan memiliki kesamaan dengan

sekuen PhiX pada % perfect. Sedangkan % <=3 errors menunjukkan sebanyak

97.6% dari total basa yang dihasilkan memilliki tingka kesalahan kurang dari 3

basa.

Densitas dan Kualitas Pustaka Genom pada Setiap Lajur dalam Flow Cell

Densitas atau kerapatan klaster dan kualitas selama proses sekuensing

dihitung dari proses klaster pustaka genom. Densitas klaster pustaka genom yang

dihasilkan berkisar antara 673 – 875 K/mm2 (Tabel 9). Hasil yang didapat tidak

ideal dengan Illumina (2009) yang menyatakan bahwa densitas atau kerapatan

klaster pustaka genom memiliki nilai ideal antara 400-600 K/mm2. Densitas tinggi

yang dihasilkan dapat disebabkan karena konsentrasi pustaka genom yang

digunakan pada proses klasterisasi lebih tinggi dari konsentrasi seharusnya yaitu 7

pM atau 13 pM (Quail et al. 2008). Presentase klaster PF menunjukkan kisaran

antara 87.2 - 93.3 % klaster yang melewati passing filter. Nilai ini dikategorikan

ideal karena >70% (Illumina 2009).

Kualitas hasil sekuensing juga dapat dilihat melalui presentase phasing

dan prepashing. Nilai phasing dan prepashing ini menunjukkan pembacaan basa

dari urutan salinan klaster kehilangan sinkronisasi. Presentase phasing yang

dihasilkan selama proses sekuensing berlangsung yaitu berkisar antara 0.197 –

0.209 % yang menunjukkan pada kisaran presentase tersebut pembacaan basa

berjalan lebih lambat. Sedangkan presentase prepashing berkisar antara 0.241 –

0.324 % yang menunjukkan pada kisaran presentase tersebut pembacaan basa

berjalan lebih cepat. Terjadi pashing dan prepashing ini dapat dipengaruhi oleh

aliran fluida reagen sekuensing dan reaksi kimia yang terjadi selama proses

sekuensing (Illumina 2009). Phasing ini dapat menyebabkan pada siklus

selanjutnya tidak ada penempelan basa pada klaster tersebut sehingga pendaran

fluorescen yang terbaca bukan berasal dari siklus sintesis basa yang baru

melainkan berasal dari pendaran fuorescen hasil sintesis basa sebelumnya.

Phasing dapat disebabkan karena tidak sempurnanya pemutusan ikatan kimia

penanda fuorescen pada proses terminasi gugus 3’OH dalam satu klaster.

Sedangkan prepashing disebabkan karena proses pemblokiran yang tidak efektif

saat penempelan pada basa 3’OH yang menyebabkan terjadinya penempelan dua

basa sekaligus dalam waktu yang bersamaan.

Nilai reads menunjukkan kisaran antara 186.05 – 241.86 M urutan basa

yang terbaca dalam klaster. Sedangkan reads PF menunjukkan kisaran antara

173.12 – 210.16 M urutan basa yang berhasil melewati passing filter. Perbedaan

nilai reads dengan reads PF menunjukkan tidak semua basa yang telah terbaca

selama proses sekuensing berhasil melewati passing filter. Nilai %>=Q30

24

menunjukkan kisaran antara 80.8 – 87.9 % akurasi kesalahan pembacaan hanya

terjadi pada 1 basa dari 1000 basa (Ewing & Green 1998, Voelkerderling et al.

2009). Nilai %>=Q30 paling besar pada genotipe LBP54-50 (pulut) dan

divisualisasikan melalui histogram dalam bentuk grafik (Gambar 8).

Tingkat Kesalahan (error rate) dan Intensitas Basa Hasil Sekuensing

Selama proses sekuensing berlangsung dihitung presentase kesalahan

pembacaan basa nitrogen. Hal ini dapat dilihat dari % error rate. Nilai % error

rate berada pada kisaran 0.32 – 0.51 % yang menyatakan pada kisaran presentase

tersebut terjadi kesalahan pembacaan basa antara pustaka genom dengan kontrol

(Tabel 10). Hasil tersebut menunjukkan bahwa sekuensing berjalan baik dengan

tingkat kesalahan yang kecil. Kontrol yang digunakan adalah PhiX. Hasil

sekuensing akan dibandingkan dengan sekuen PhiX pada database. PhiX

merupakan sejenis virus yang termasuk ke dalam Group II (ssDNA), Famili

Microviridae, Genus Microvirus dan spesies Fage PhiX174. PhiX yang digunakan

sebagai kontrol memiliki beberapa keunggulan, yaitu mempunyai ukuran genom

yang kecil, mengandung komposisi basa dan penyusun genom yang beragam

(45% GC dan 55% AT) dan memiliki urutan genom yang telah diketahui secara

lengkap (Kircher et al. 2011, Illumina 2012).

Basa adenin, timin, guanin dan sitosin yang dihasilkan selama proses

sekuensing dihitung intensitas setiap siklusnya. Intensitas basa-basa nitrogen

dideteksi melalui hasil pendaran fluorescen yang dihasilkan dari sintesis basa

selama proses sekuensing berlangsung. Secara keseluruhan, intensitas basa-basa

nitrogen setiap siklus dapat dilihat pada Gambar 10. Basa-basa nitrogen memiliki

intensitas antara 3695 – 4022 basa (Tabel 10). Kisaran tersebut bernilai ideal,

karena nilai intensitas yang ideal selama proses sekuensing sebesar 1000 (Illumina

2009). Nilai intensitas basa yang kecil dapat disebabkan oleh beberapa hal,

diantaranya klaster pustaka genom yang dihasilkan selama proses bridge

amplification, ukuran pustaka genom yang terlalu panjang, penempelan primer

yang tidak efisien, aktivitas enzim polimerase yang tidak optimal dan terjadi

gangguan dalam pendeteksian pendaran fluorescen (Kircher et al. 2011).

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Pada penelitian ini, pustaka genom empat genotipe jagung (Sp010BB-3-2-

2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) berhasil dikonstruksi

dan telah memenuhi persyaratan untuk sekuensing genom total menggunakan

Next Generation Sequencing HiSeq2000. Jumlah basa yang dihasilkan selama

proses sekuensing yaitu sebanyak 287.1 Gbp. Klaster pustaka genom yang

dihasilkan dengan nilai Q scores di atas 30 berkisar antara 80.8 – 87.9 %. Tingkat

kesalahan pembacaan basa selama proses sekuensing berkisar antara 0.32 –

0.51%. Nilai densitas, klaster, % klaster PF, intensitas basa, % phasing dan %

prepashing yang dihasilkan selama proses sekuensing menunjukkan bahwa

kualitas klaster pustaka genom termasuk kategori ideal.

25

Saran

Pada penelitian selanjutnya, analisis bioinformatika perlu dilakukan untuk

menyusun basa-basa hasil sekuensing pustaka genom menjadi urutan basa genom

jagung yang utuh dan runut.

DAFTAR PUSTAKA

Agilent Technologies. 2003. Agilent 2100 Bioanalyzer 2100 expert user’s guide.

Deutchland (US): Agilent Technologies Inc.

Azrai M. 2004. Penampilan Varietas Jagung Unggul Baru Bermutu Protein Tinggi

di Jawa dan Bali. Buletin Plasma Nutfah. 10:49-50.

Badan Pusat Statistik. 2013. Produksi Padi, Jagung dan Kedelai (Angka Ramalan

I Tahun 2013). No. 45/07/ Th. XVI

Bintang M. 2010. Teknik Penelitian Biokimia. Jakarta: Erlangga.

Brown TA. 2007. Gene Cloning and DNA Analysis : An Introduction. Sixth

Edition. New York: John Wiley and Sons.

CABI. 2004. Crop protection compendium. 2004 edition

Clark W, Chistopher K. 2008. An Introduction to DNA: Spectrophotometry,

Degradation, and the 'Frankengel' Experiment. Tested studies for

laboratory teaching (22): 81-99.

Commins et al. 2011. Computational biology methods and their application to the

comparative genomics of endocellular symbiotic bacteria of insect.

Biological Procedures Online 11(1): 52-78.

Covaris. 2012. DNA-RNA shearing for Nex-Gen Sequencing.

http://covarisinc.com/applications/dnarna-shearing-for-NGS[I [Internet].

Akses 01 Juli 2014.

Doyle J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small

quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19: 11-15

Franca Lilian TC, Carrilho Emanuel, Kist Tarso BL. 2002. A review of DNA

sequencing techniques. Quaterly Reviews of Biophysics 35(2) : 169-200.

Illumina. 2009. Sequencing Analysis Software : User Guide. San Diego : Illumina

Inc.

Illumina. 2010a. HiSeq Sequencing Systems. San Diego : Illumina Inc.

Illumina. 2010b. cBot Quick Reference Guide. San Diego : Illumina Inc.

Illumina. 2010c. TruSeq DNA-Sample Preparation Low Throughput (LT

Protocol). San Diego (US) : Illumina Inc.

Illumina. 2011. HiSeq 2000 Quick Reference Guide. San Diego : Illumina Inc.

26

Illumina. 2012. Using PhiX Control for HiSeq® Sequencing Runs. San Diego

(US) : Illumina Inc.

Invitrogen. 2010. Qubit 2.0 Fluorometer-Catalog no. Q32866. California (US):

Invitrogen Life Technologies.

Kircher M, Heyn P, Kelso J. 2011. Addressing challanges in the production and

analysis of illumina sequencing data. BMC Genomics 12: 382-396.

Kosasih A. 2012. Konstruksi Dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kedelai

(Glycine Max (L.) Merr.) untuk Sekuensing Genom Total [Skripsi]. Bogor

(ID), Institut Pertanian Bogor.

Mardis ER. 2008. Next generation DNA sequencing methods. The Annual Review

of Genomics and Human Genetics 9 :387- 402.

Margulies M, Egholm M, Altman WE et al.2005. Genome sequencing in open

microfabricated high density picoliter reactors. Nature 437(7057) : 376-

380.

Metzker ML. 2010. Sequencing technologies the next generation. Nature Review

11. 31- 46.

Michiels AN, Ende WVD, Tucker M, Riet L, Laere V. 2003. Extraction of high

quality genomic DNA from latex containing plants. Analytical

Biochemistry 315 : 85-89.

Poirel L. Naas T. Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a rapid tool for

identification of GES-Type Extended-Spectrum lactamase. J.Clin

Microbiol 44(8) :3008-3011.

Prasanna B. M., S. K. Vasal. B. Kassahun dan N. N. Singh. 2001. Quality Protein

Maize. Current Science. 81: 1308-1319.

Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Edisi

ke-3. New York: Cold-Spring Harbor Laboratory Pr.

Schuster Stephan C. 2008. Next generation sequencing transform today’s biology.

Nature Method 5(1) : 16-18.

Sigma. 2008. qPCR Technical Guide. St. Louis (US): Sigma-aldrich, Inc.

Subandiyah S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi

Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan

Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 43-50.

Suharsono. 2002. Konstruksi Pustaka Genom Kedelai Kultivar Slamet. Hayati 9

(2): 67-70.

Telle S., R.G. Shivas, M.J. Ryley, and M. Thines. 2011. Molecular phylogenetic

analysis of Peronosclerospora (Oomycetes) reveals cryptic species and

genetically distinct species parasitic to maize. Eur. J. Plant Pathol.

130:521-528.

Voelkerding KV, Dames SH, Durtschi JD. 2009. Next generation sequencing :

from basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55: 41-47.

27

Wahyudi AT. 2001. Perpustakaan gen : Bagaimana mengontruksinya? [ulasan].

Hayati 8: 27-30.

Wakman W. dan A. Hasanuddin. 2003. Penyakit bulai (Peronosclerospora

sorghi) pada jagung di dataran tinggi Karo Sumatera Utara. Makalah

disajikan pada Seminar Nasional Perhimpunan Fitopatologi Indonesia

(PFI) di Bandung.

Wakman W. 2004. Penyakit bulai pada tanaman jagung di Indonesia: masalah,

penelitian dan cara mengatasinya. Prosiding Seminar Tahunan PFI Komda

Sulsel.

Walker JM, Wilson K. 2000. Principles and Techniques of Practical

Biochemistry. UK: Cambridge University Press.

Westermeier. 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice.

New Jersey: John Wiley & Sons inc.

Wulandari YRE. 2009. Konstruksi pustaka genom Tibouchina langsdorffiana

Baill [Tesis]. Bogor : Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Yen TTO, BM Prasanna, TAS Setty dan R.S. Rathore. 2004. Genetic variability

for resistance to sorghum downy mildew (Peronosclerospora sorghi) and

Rajasthan downy mildew (P.heteropogoni) in the tropical/sub-tropical

Asian maize germplasm. Euphytica 138:23-31.

28

Lampiran 1 Strategi penelitian

Isolasi DNA Jagung

Konstruksi genom jagung

(covaris, fragmentasi DNA, preparasi fragmen DNA cetakan, modifikasi ujung

fragmen DNA, adenilasi ujung 3’ DNA, penempelan adaptor, amplifikasi fragmen

DNA, Analisis pustaka genom)

Klaterisasi DNA

Sekuensing DNA

Analisis Sekuensing

29 Lampiran 2 Hasil Analisis pustaka genom secara kuantitatif dengan qPCR

Genotipe Ct

Qty

[Ukuran [Stok Pustaka

StdDev Rerata StdDev Faktor Ukuran Kesesuaian] tanpa [Stok

Ct Qty Qty Pengenceran fragmen (pM) pengenceran] rerata]

(nM) (nM)

JagungSp010-R1 15.58 0.062 7.63E-01 7.87E-01 3.35E-02 1000 658 0.39 0.39

0.39

JagungSp010-R1 15.49 0.062 8.10E-01 7.87E-01 3.35E-02

JagungSp010-R2 16.38 0.102 4.41E-01 4.21E-01 2.94E-02 2000 658 0.21 0.42

JagungSp010-R2 16.53 0.102 4.00E-01 4.21E-01 2.94E-02

JagungSp010-R3 17.82 0.139 1.66E-01 1.78E-01 1.68E-02 4000 658 0.09 0.35

JagungSp010-R3 17.62 0.139 1.89E-01 1.78E-01 1.68E-02

JagungLK2-45-R1 15.3 0.077 9.21E-01 9.57E-01 4.99E-02 1000 638 0.46 0.46

0.45

JagungLK2-45-R1 15.2 0.077 9.92E-01 9.57E-01 4.99E-02

JagungLK2-45-R2 16.12 0.135 5.27E-01 4.80E-01 4.45E-02 2000 638 0.23 0.46

JagungLK2-45-R2 16.27 0.135 4.75E-01 4.80E-01 4.45E-02

JagungLK2-45-R2 16.39 0.135 4.38E-01 4.80E-01 4.45E-02

JagungLK2-45-R3 17.44 0.026 2.14E-01 2.18E-01 3.87E-03 4000 638 0.1 0.42

JagungLK2-45-R3 17.42 0.026 2.18E-01 2.18E-01 3.87E-03

JagungLK2-45-R3 17.39 0.026 2.22E-01 2.18E-01 3.87E-03

JagungPSG-R1 12.21 0.269 7.6 9.24 1.69 1000 970 4.31 4.31

4.12

JagungPSG-R1 11.67 0.269 10.98 9.24 1.69

JagungPSG-R1 11.94 0.269 9.14 9.24 1.69

JagungPSG-R2 12.94 0.103 4.62 4.34 3.04E-01 2000 970 2.02 4.04

JagungPSG-R2 13.02 0.103 4.38 4.34 3.04E-01

JagungPSG-R2 13.14 0.103 4.02 4.34 3.04E-01

29

30

JagungPSG-R3 14.12 0.069 2.06 2.15 1.02E-01 4000 970 1 4.01

JagungPSG-R3 13.99 0.069 2.26 2.15 1.02E-01

JagungPSG-R3 14.08 0.069 2.13 2.15 1.02E-01

LPB54-R1 12.62 0.284 8.61 8.85 1.782 1000 658 6.08 6.08

5.77

LPB54-R1 12.88 0.284 7.19 8.85 1.782

LPB54-R1 12.31 0.284 10.73 8.85 1.782

LPB54-R2 13.8 0.101 3.76 3.98

2.88E-

001 2000 658 2.73 5.47

LPB54-R2 13.76 0.101 3.86 3.98

2.88E-

001

LPB54-R2 13.6 0.101 4.3 3.98

2.88E-

001

30

31

Lampiran 3 Tahapan klasterisasi pustaka genom (Illumina 2010)

Proses klasterisasi pustaka genom yang terjadi pada permukaan flow cell: (a) Immobilisasi dan perpanjangan DNA, (b) amplifikasi DNA

dengan prinsip bridge amplification, (c) liniearisasi dan hibridiasi

31

32

Lampiran 4 Flow cell Illumina HiSeq2000 (Swiss Federal Institute of Technology

Zurich 2012)

32

33

Lampiran 5 Regenerasi Next Generation Sequencing

34

Lampiran 6 Prinsip Sekuensing menggunakan Next Generation Sequencing

HiSeq2000

34

35

Lampiran 7 Grafik jumlah densitas klaster setiap lajur

Keterangan:

: Densitas klaster

: Klaster PF (passing filter)

: Median klaster

36

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bekasi pada tanggal 27 Juli 1993 dari ayah Herman Kiki

Ahyad dan ibu Jamilah. Penulis merupakan putri pertama dari ketiga bersaudara.

Penulis sekolah di SMA Negeri 1 Cikarang Utara dan lulus dari SMA

tersebut pada tahun 2010 dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB

melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih mayor

Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam dan minor Komunikasi, Departemen Sains dan Komunikasi Pengembangan

Masyarakat, Fakultas Ekologi Manusia.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum

Biokimia Umum untuk mahasiswa Biologi 2013/2014 pada semester ganjil dan

mahasiswa Kedokteran Hewan 2013/2014 pada semester genap. Penulis juga aktif

dalam kegiatan kemahasiswaan di IPB, seperti mengikuti Unit Kegiatan

Mahasiswa (UKM) Agriaswara sebagai anggota dan pengurus serta aktif dalam

Himpunan Profesi Community of Research and Education in Biochemistry

(CREBs) sebagai staf divisi Creativity Core pada tahun 2011/2012 serta sebagai

staf Biro Fundrising pada tahun 2012/2013.

Penulis juga pernah aktif dalam berbagai kegiatan di kampus, diantaranya

menjadi Ketua Divisi Acara Biochemistry Champion League di Departemen

Biokimia Tahun 2012. Penulis juga aktif menjadi Steering Committee di beberapa

kegiatan kemahasiswaan, seperti SPIRIT pada tahun 2011, Seminar Nasional

Kesehatan pada tahun 2012, Masa Perkenalan Departemen Biokimia 2012.

Penulis juga beberapa kali menjadi Master of Ceremony pada Masa Perkenalan

Departemen Biokimia 2012, Lomba Karya Ilmiah Pelajar pada tahun 2012 dan

2013 dan Siang Keakraban Biokimia pada tahun 2014. Penulis pernah melakukan

Praktik Lapangan (PL) di Balai Besar Pasca Panen Jl. Tentara Pelajar no 12A,

Cimanggu, Bogor dengan judul Pembuatan dan Karakterisasi Sifat Fisikokimia

Gelatin dari Kulit Kaki Ayam.