kelompok 2 kimia b (enzim retriksi)

8/17/2019 Kelompok 2 KIMIA B (Enzim Retriksi)

http://slidepdf.com/reader/full/kelompok-2-kimia-b-enzim-retriksi 1/18

BIOTEKNOLOGI MOLEKULER

Teknik Pemotongan danPenempelan DNA

KELOMPOK II:

ANDI MUSDALIFAH (F1C1 13 008)

KARTI APRIANI GIOVANA (F1C1 13 036)

TRISNAWATI SUDDIN (F1C1 13 040)

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

016



Tahapan Teknologi DNA Rekombinan



Enzim Restriksi Endonuklease

Enzim Restriksi Endonuklease merupakan enzim yangmemotong bagian internal DNA yang bekerja secara spesifik

(urutan tertentu), disebut sebagai gunting biologi.

Enzim Restriksi Endonuklease memotong DNA tepat pada

ikatan fosfodiester.

Enzimenzim ini bekerja dengan memotong DNA pada lokasi

lokasi spesifik yang mampu mengenali ! " # urutan nukleotida,

dimana urutan DNA yang dikenali tersebut bersifat

$A%&NDR'E

Enzim restriksi yang digunakan arus sama antara pemotongan

plasmid dengan pemotong DNA asing.

Enzim restriksi diisolasi dari bakteri. Enzim restriksi biasanya

terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang

melindungi DNAnya sendiri dari pemotongan, yaitu DNA

metil transferase (dnmt).



K!"!#$!%&# K!"&#'&#&# D!%*+"+

E Escericia genus

co coli species

R R*+ strain

& -rutan penemuan-rutan enzim yangditemukan pada bakteri

• $ada dasarnya, penamaan enzim restriksi diambil dari nama bakteri

yang mengasilkan enzim tersebut.

• eperti contonya yang memiliki enzim EcoR&

Penamaan Enzim Retriksi

!#,+- E./RI



Enzim Restriksi dengan Sekuens Pengenalnya



1 U'# -!#&#2#

. Enzim ini memotong secara asimetris pada situs pemotongan dan

mengasilkan asil pemotongan memanjang pada ujung /0.

. 1onto enzim yang mengasilkan ujung menggantung /0 adala 2am3&

Pembagian Enzim



U'# -!#&#2# 3

• Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan,

namun mengasilkan asil pemotongan memanjang pada ujung 0.

• 1onto enzim yang mengasilkan pola seperti ini adala K"#I

Pembagian Enzim



3 U'# 2-"5

Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA seingga

mengasilkan ujung tumpul.

1onto enzim yang mengasilkan pola seperti ini adala S-&I

Pembagian Enzim



$emotongan enzim restriksi akan mengasilkan potongan yaitu ujung koesif

(sticky end) dan ujung rata (blunt end).

Hasil Pemotongan

Sticky end : !*+7&2

5!#%!2 -$& #2%

$+&-#

Blunt end : !*+7&2

2-"5 $&# 5+2 #2%

$+&-#



Cara Kera Enzim Restriksi

• Enzim restriksi mengidrolisis ikatan fosfodiester yang mengasilkan gugus 0 idroksil ('3) dan

gugus /0 fosfat ($'!) yang berbentuk asimetris atau sticky ends dan bentuk simetris atau blunt ends

• Enzim restriksi dapat melakukan scanning pada untaian molekul DNA. 4ika tidak menemukan

restriction sites yang spesifik (mekanisme slidding), maka enzim akan melakukan pergerakan di

sepanjang lekukan DNA. Namun, enzim restriksi endonuklease akan menguba konformasinya ketika

mengenali daera restriction sites yang spesifik dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan

fosfodiester

• Enzim retriksi bekerja dengan bantuan kofaktor , conto g 56, seingga dalam prosedur percobaannya

sekuens DNA terkadang diberi g1l. 7ation bi8alen g56 dari g1l tersebut berfungsi dalam proses

pemotongan plasmid yang dibutukan untuk meningkatkan akti8itas enzim restriksi



Sebagian besar enzim endonuklease restriksi memiliki suu optimum sekitar 9:1.

2eberapa enzim restriksi yang diperole dari bakteri termofilik memiliki akti8itas

pemotongan optimum pada suu tinggi

"H3ampir semua enzim restriksi bekerja dengan baik pada kisaran p3 9.5#.;

K!%&2&# +/#+%

3ampir semua enzim restriksi dapat menerima kekuatan ionik dari Na1l (/; +/;

m) maupun 71l (+;+/; m), namun beberapa enzim restriksi anya aktif pada

kekuatan ionik yang diberikan ole 71l, seperti enzim ma&

P!#&* %&2+/#&on g56 diduga berperan sebagai akti8ator molekul air untuk membentuk

nukleofil yang dibutukan atau untuk menyebabkan polarisasi ikatan fosfodiester yang

akan dipotong

W&%2 *!&%+%amanya <aktu reaksi enzim ditentukan ole unit akti8itas enzim. Enzim yang

memiliki unit akti8itas tinggi tidak membutukan <aktu reaksi yang terlalu lama.

!aktor yang "empengaruhu Kera Enzim Restriksi

($ingoud et al., +==).



Enzim ligase adala enzim yang berfungsi untuk

menyambung dua ujung potongan DNA

engkatalisis pembentukan ikatan antara 0'3

dari satu untai dan /0$'! dari untai DNA lain

%igase bekerja lebi efisien pada ujung lancipdibanding dengan ujung tumpul.

Enzim DNA ligase bekerja dengan bantuan

kofaktor, yaitu NAD9 atau ATP. 4enis kedua enzim

tersebut memerlukan kofaktor yang berbeda, tetapi

memiliki mekanisme katalitik yang sama.

Enzim ligase yang sering digunakan adala DNA

ligase dari E. Coli dan DNA ligase dari Fage T4

Enzim DNA #igase



$enis%$enis DNA #ig se

DNA ligase yang umum adala >! DNA ligase dan >9 DNA ligase

Enzim yang dapat mengkatalisis ikatan fosfodiester . >idak seperti enzim >!,

blunt end ligation tidak efektif dikatalisis ole >9 DNA ligase. Enzim ini

diasilkan ole strain rekombinan bakteri E.coli yang mengandung gen penkode

>9 DNA %igase.

>! DNA ligase berasal dari >! bakteriofage. Enzim ini akan meligasi fragmen

DNA yang menggantung, memiliki ujung koesif maupun ujung tumpul.-ntukmeligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi

enzim yang lebi besar.

T4 DNA 5+&!

T DNA 5+&!



Penyambungan DNA

Enzim DNA ligase bekerja dengan menyambungkan utas DNA yang memilikiujung /?$'! dengan ujung ?'3 pada utas lain. ekanismenya bisa 5 cara,

sesuai asil pemotongannya

DNA dengan ujung

sticky

DNA dengan ujung

blunt



Cara Kera Enzim #igase

1 DNA $!#&# '# 2+.%;

-jung overhang ini arus saling komplemen agar dapat menempel dengan

baik. -jung overhang pada utas sense akan berpasangan dengan ujung

overhang utas antisense. %alu DNA %igase tinggal membentuk ikatan

pospodiester seingga kedua utas kini suda menjadi satu dengan ikatan

yang sangat kuat. ekanisme ini cenderung lebi muda karena keduaujung o8erang dapat menempel lebi dulu



Cara Kera Enzim #igase

DNA $!#&# '# 5#2

enyambungkan utasutas DNA yang samasama memiliki ujung blunt asil

pemotongan enzim restriksi atau asil blunt $1R. DNA dengan ujung blunt lebi

sulit untuk @dilem0 dengan enzim DNA %igase karena tidak ada ujung o8erang

yang membantu kedua utas untuk saling menempel terlebi dulu sebelum@dilem0.



"ekanisme Enzim DNA #igase

ekanisme DNA ligase dimulai dariidrolisis kofaktor, yaitu NAD6 atau A>$.

Dan mengasilkan kompleks enzim

adenylate A$ yang berikatan ko8alen

dengan grup amino residu lysin pada

sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat

inorganik ($$i), jika kofaktor berupa A>$

atau nicotinamide mononucleotide

(NN), jika kofaktor berupa NAD6

7emudian sebagian A$ akan berpinda

dari sisi aktif lysin ke ujung bebas /0

fosfat yang berada pada nick utas DNA.

$ada akirnya, iktan fosfodiester akan

terbentuk antara ujung 0'3 yang

berada di ujung nick dengan /0fosfat dan

melepaskan A$ dan enzim adenylate



>ER&A 7A&3

kelompok 2 kimia b (enzim retriksi)

Documents