KAJIAN AKTIVITAS HAMBAT BAKTERIOSIN DARI

BAKTERI ASAM LAKTAT GALUR SCG 1223

Oleh

Triahmadi Januarsyah

F34103111

2007

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

Triahmadi Januarsyah. F34103111. Kajian Aktivitas Hambat Bakteriosin Dari Bakteri Asam Laktat Galur SCG 1223. Dibawah bimbingan Purwoko dan Tri Marwati. 2007.

RINGKASAN

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri anaerob fakultatif yang mampu hidup pada berbagai habitat yang cukup luas di alam seperti pada tanaman, saluran pencernaan baik hewan maupun manusia, berbagai produk makanan fermentasi seperti yogurt, minuman fermentasi, mentega fermentasi, keju, saos, kedelai, dan sake. Bakteri asam laktat dapat menjaga atau mempertahankan mutu makanan karena dapat mengendalikan pertumbuhan bakteri pengganggu dan pembusuk dengan memproduksi asam organik, hidrogen peroksida, diasetil, dan bakteriosin.

Bakteriosin merupakan suatu senyawa protein yang memiliki sifat bakterisidal terhadap bakteri gram positif dan gram negatif dengan spektrum yang luas dengan bakteri target memiliki sifat pengikatan spesifik (specific binding site). Bakteriosin aman digunakan sebagai pengawet makanan karena dapat didegradasi oleh enzim protease yang terdapat dalam tubuh hewan maupun manusia. Bakteri asam laktat penghasil bakteriosin mempunyai gen pengkode bakteriosin berada dalam plasmid dan tidak membunuh bakteri penghasilnya.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri hasil metabolisme bakteri asam laktat, yaitu bakteriosin. Penelitian ini terdiri dari dua tahap, tahap pertama yaitu penentuan fase pertumbuhan bakteri penghasil bakteriosin galur SCG 1223 dengan media MRS broth. Pada tahap kedua dilakukan produksi antibakteri pada media MRS broth dengan perlakuan pH awal media 4 dan 6, suhu inkubasi 27ºC dan 40ºC, waktu inkubasi 4 jam, 10 jam dan 14 jam, serta persentase inokulum 5% dan 10%. Uji aktivitas supernatan asam dan supernatan pH netral untuk mendeteksi aktivitas bakteriosin hasil pertumbuhan bakteri asam laktat SCG 1223 dilakukan terhadap bakteri Escherchia coli, Salmonella thypimurium dan Listeria monocytogenes

Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri asam laktat galur SCG 1223 mampu memproduksi bakteriosin. Bakteriosin yang dihasilkan memiliki spektrum penghambatan yang luas terhadap bakteri gram positif (Listeria monocytogenes) dan bakteri gram negatif (Salmonella thypimuruim dan Escherchia coli).

Pada persentase inokulum 10 %, terdapat aktivitas bakteriosin dengan aktivitas hambat yang dihasilkan 311.49 AU/ml hingga 1178.13 AU/ml. Aktivitas tertinggi terhadap Escherchia coli 1085,81 AU/ml pada pH media 6, suhu inkubasi 40ºC dan waktu inkubasi 14 jam. Aktivitas tertinggi terhadap Salmonella thypimurium adalah 816,40 AU/ml dicapai pada pH media 6, suhu inkubasi 27ºC dan waktu inkubasi 14 jam. Sedangkan aktivitas tertinggi pada Listeria monocytogenes adalah sebesar 1178,13 AU/ml yang dicapai pada pH media 6, suhu inkubasi 40ºC dan waktu inkubasi 14 jam.

Triahmadi Januarsyah. F34103111.Study of Inhibitory Activity Bacteriocin Produced from SCG 1223 Lactic Acid Bacteria Metabolism. Supervised by Purwoko and Tri Marwati. 2007.

SUMMARY

Lactic acid bacteria is an anaerobic facultative bacteria which is able to live in vairous habitats such as vegetation. Their habitats in human, animal digestion system, and in fermented food products such as yogurt, fermented beverage, cheese, ketchup, and soybean. Lactic acid bacteria is able to preserve food from degrading bacteria by producing organic acid, hydrogen peroxide, diacetyl and bacteriosin.

Bacteriosin is a protein compound which has bacterisidal ability toward gram positive and gram negative bacteria that is filogenically close to bacteriosin producing bacteria. Several characteristic of bacteriosin are mode of protein, has bacterisidal ability, the target bacteria have specity binding site, its coding gene is in plasmid and harmless to its producing bacteria. Bacteriosin is aproteatic degradable protein, so it is safe for human body.

The aim of this research was studyng natural antibacterial activity (bacteriosin) produced from Lactic acid bacteria metabolism. This research consist of two steps, the first was determining the SCG 1223 bacteria growth phase in MRS Brothmedia. The second step was producing the bacteriocins in the MRS Broth media with initial pH 4 and 6, incubation temperature 27ºC dan 40ºC, incubation time 4, 10 and 14 hours, and inoculum 5% and 10%. Analysis of acid and neutral supernatant activities to defect the bacteriosin activity was carried toward E.coli, S. thypimurium dan L. monocytogenes.

SCG 1223 lactic acid bacteria was able to produce antibacterial substance. This bacteria had wide spectrum toward gram positive bacteria (Listeria monocytogenes) and gram negative bacteria (Salmonella thypimuruim dan Escherchia coli).

At 10 % inoculum, there was bacteriosin activity with activity 311.49 AU/ml up to 1178.13 AU/ml. The highest activity for E. coli was 1085,81 AU/ml at media pH 6, incubation temperature 40˚C and incubation time 14 hour.

The highest activity for Listeria monocytogenes was 1178,13 AU/ml at media pH 6, incubation temperature 27˚C and incubation time 14 hour. And the highest activity for Salmonella thypimurium was 816,40 AU/ml at media pH 6, incubation temperature 27˚C and incubation time 14 hour. And the highest activity for Listeria monocytogenes was 1178,13 AU/ml at media pH 6, incubation temperature 40˚C and 14 hour incubation.

KAJIAN AKTIVITAS HAMBAT BAKTERIOSIN DARI

BAKTERI ASAM LAKTAT GALUR SCG 1223

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

Pada Departemen Teknologi Industri Pertanian

Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

Oleh

Triahmadi Januarsyah

F34103111

2007

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

KAJIAN AKTIVITAS HAMBAT BAKTERIOSIN DARI

BAKTERI ASAM LAKTAT GALUR SCG 1223

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

Pada Departemen Teknologi Industri Pertanian

Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

Oleh

Triahmadi Januarsyah

F34103111

Dilahirkan pada tanggal 1 Januari 1986

Di Jakarta

Tanggal lulus : 2007

Menyetujui,

Bogor, 2007

Drs. Purwoko, M.Si Ir. Tri Marwati, M.Si Dosen Pembimbing I Dosen Pembimbing II

SURAT PERNYATAAN

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul: “Kajian

Aktivitas Hambat Bakteriosin Dari Bakteri Asam Laktat Galur SCG 1223 ”

adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan dosen Pembimbing Akademik,

kecuali yang dengan jelas ditunjukkan rujukannya.

Bogor, 2007

Yang membuat pernyataan,

Triahmadi Januarsyah

F34103111

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta, pada tanggal 1 Januari

1986. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara,

putra dari pasangan Usman suharto dan Sri astuti.

Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SDN

Parung IV Bogor Tahun 1991 – 1997, SLTPN 6 Jakarta

Tahun 1997-2000, dan SMUN 12 Jakarta Tahun 2000 –

2003. Pada tahun 2003 penulis melanjutkan pendidikan tinggi di Departemen

Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian

Bogor melalui jalur SPMB (Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru). Selama

menjadi mahasiswa Institut Pertanian Bogor, penulis pernah menjadi asisten

praktikum untuk mata kuliah Gambar teknik, Analisis bahan dan penganganan

agro serta mata kuliah Bioproses.

Penulis melaksanakan praktek lapang pada Tahun 2006 dengan topik

“Mempelajari tata letak mesin dan peralatan pengolahan gula di PG. Redjosarie

Magetan, Jawa timur”. Untuk menyelesaikan studi di fakultas Teknologi Pertanian

penulis melakukan penelitian dengan judul “Kajian Aktivitas Hambat Bakteriosin

Dari Bakteri Asam Laktat SCG 1223”. Alhamdulillah, pada tahun 2007 penulis

menyelesaikan pendidikan strata-1 dengan gelar Sarjana Teknologi Pertanian.

KATA PENGANTAR

Syukur alhamdulillah kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat,

dan hidayah-NYA kepada penulis, sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian dengan judul “Kajian Aktivitas Hambat Bakteriosin Dari Bakteri Asam

Laktat Galur SCG 1223”, dan dapat menyusun serta menyelesaikan skripsi. Karya

ilmiah ini ditujukan untuk mendapatkan gelar sarjana teknologi pertanian pada

Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-

besarnya kepada :

1. Drs. Purwoko, M.Si selaku dosen pembimbing akademik yang telah

mengarahkan dan membimbing penulis baik selama penelitian dan penulisan

skripsi.

2. Ir. Tri Marwati, M.Si selaku dosen Pembimbing II yang telah membantu

selama penelitian dan penulisan skripsi.

3. Ir. Muslich, M.Si selaku dosen penguji yang telah memberikan saran untuk

penyempurnaan skripsi ini.

4. Ibu, Bapak dan kakak-kakakku tercinta atas pengertian, dukungan, semangat,

dan doa-doanya.

5. Teman-teman TIN 40, Umi Hartatik sebagai teman satu bimbingan akademik

yang telah banyak memberikan banyak bantuan, dukungan, semangat dan doa.

6. Laboran di Departemen Teknologi Industri Pertanian dan Besar Pasca Panen

Pertanian pertanian atas segala bantuan selama penulis melaksanakan

penelitian.

7. Semua pihak yang telah memberi dukungan dan bantuan yang tidak dapat

penulis sebutkan satu persatu.

Penulis berharap, semoga karya ini dapat bermanfaat untuk pengembangan

ilmu pengetahuan terutama bagi rekan sejawat.

Bogor, Oktober 2007

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ................................................................................... i

DAFTAR ISI.................................................................................................. ii

DAFTAR TABEL ......................................................................................... iv

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... v

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. vi

I. PENDAHULUAN .................................................................................... 1

A. LATAR BELAKANG ....................................................................... 1

B. TUJUAN.............................................................................................. 2

C. RUANG LINGKUP............................................................................ 3

II. TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 4

A. BAKTERI ASAM LAKTAT.............................................................. 4

B. PERTUMBUHAN BAKTERI ASAM LAKTAT .............................. 6

C. BAKTERIOSIN .................................................................................. 6

D. KEGUNAAN BAKTERIOSIN .......................................................... 8

E. BAKTERI INDIKATOR .................................................................... 10

F. MEKANISME KERJA ANTIBAKTERI ........................................... 13

III. METODOLOGI ..................................................................................... 15

A. ALAT .................................................................................................. 15

B. BAHAN .............................................................................................. 15

C. MIKROORGANISME........................................................................ 15

D. METODA PENELITIAN ................................................................... 15

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................... 21

A. PENENTUAN FASE PERTUMBUHAN BAKTERI......................... 21

B. AKTIVITAS HAMBAT BAKTERI ASAM LAKTAT SCG 1223.... 22

V. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 37

A. ...................................................................................................KESI

MPULAN............................................................................................ 36

B. ...................................................................................................SARA

N.......................................................................................................... 36

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 37

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Tabel perbandingan bakteriosin dengan antibiotik alamiah............. 9

Tabel 2. Tabel rancangan produksi antibakteri ............................................... 20

Tabel 3. Tabel rancangan faktor...................................................................... 23

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Mekanisme pertumbuhan bakteri asam laktat yang menghasilkan berbagai macam produk metabolit.............................................. 5

Gambar 2. Mekanisme sintesis bakteriosin yang dihasilkan dari metabolisme sel bakteri asam laktat................................................................. 8

Gambar 3. Mekanisme aksi Bakteriosin merusak membran sel bakteri patogen......................................................................................... 13

Gambar 4. Diagram alir penelitian utama...................................................... 18

Gambar 5. Grafik pertumbuhan Bakteri asam laktat galur SCG 1223.......... 21

Gambar 6. Grafik aktivitas hambat supernatan asam pada persentase inokulum 5% terhadap Escherchia coli....................................... 24

Gambar 7. Grafik pertumbuhan BAL galur SCG 1223 dengan pengaruh berbagai perlakuan ..................................................................... 25

Gambar 8. Grafik aktivitas hambat supernatan asam pada persentase inokulum 10% terhadap Escherchia coli ................................... 27

Gambar 9. Grafik aktifitas hambat supernatan netral pada persentase inokulum 10% terhadap Escherchia coli................................... 27

Gambar 10. Grafik aktivitas hambat supernatan asam pada persentase

inokulum 5% terhadap Salmonella Thypimurium..................... 29 Gambar 11. Grafik aktivitas hambataupernatan asam pada persentase

inokulum 10% terhadap Salmonella Thypimurium..................... 30

Gambar 12. Grafik aktifitas hambat supernatan netral pada persentase inokulum 10% terhadap Salmonella Thypimurium..................... 31

Gambar 13. Grafik aktivitas hambat supernatan asam pada persentase inokulum 5% terhadap Listeria Monocytogenes ........................ 32

Gambar 14. Grafik aktivitas hambat supernatan asam pada persentase inokulum 10% terhadap Listeria Monocytogenes ...................... 33

Gambar 15. Grafik aktifitas hambat supernatan netral pada persentase inokulum 10% terhadap Listeria Monocytogenes....................................... 34

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Diagram alir peremajaan inokulum ............................................ 41

Lampiran 2. Diagram alir pembuatan kurva pertumbuhan.............................. 42

Lampiran 3. Diagram alir uji daya hambat…................................................... 43

Lampiran 4. Hasil pengamatan Kurva pertumbuhan....................................... 44

Lampiran 5. Hasil pengamatan pada perlakuan supernatant yang tidak dinetralkan................................................................................... 45

Lampiran 6. Hasil pengamatan pada perlakuan supernatant netral................ 46

Lampiran 7. Gambar-gambar penelitian......................................................... 47

I. PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Bakteri merupakan mikroorganisme yang dapat bersifat merugikan

dan menguntungkan bagi manusia. Bakteri dapat mengkontaminasi produk

pangan selama pengolahan, transportasi dan penyimpanan, sehingga

menimbulkan keracunan, infeksi penyakit dan pembusukan makanan. Hal ini

menjadi permasalahan penting di dunia industri karena mengakibatkan

kerugian yang sangat besar. Salah satu cara untuk mengatasi hal tersebut yaitu

dengan penggunaan pengawet sebagai bahan tambahan pada makanan.

Bakteri selain merugikanterdapat pula yang menguntungkan, salah

satunya bakteri asam lakatat. Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang

tidak bersifat membehayakan dan penggunaannya sudah dilakukan sejak lama

oleh manusia. Bakteri asam laktat dapat memproduksi substansi antibakteri

yang dapat memperpanjang umur simpan dari produk.

Adanya paradigma bahwa konsumen semakin menyadari pentingnya

kesehatan, maka lebih tertarik pada makanan yang tidak mengandung bahan

pengawet terutama yang berasal dari bahan non pangan. Dengan demikian

maka perusahaan makanan harus mempertimbangkan secara hati-hati bahkan

harus sekecil mungkin menggunakan bahan tambahan non makanan dan

sintetis. Fakta tersebut mendorong orientasi pencarian bahan pengawet adalah

yang dapat diterima konsumen dan secara alami ada dalam makanan, misalnya

berasal dari tanaman, hewan atau dihasilkan oleh mikroorganisme yang

disebut biopreservatif. Salah satu bahan alami yang telah digunakan dan diuji

aman yaitu bakteriosin yang berasal dari berbagai bakteri asam laktat (BAL)

(Ray, 1992).

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri yang terdapat pada

bahan seperti susu, daging atau bahan lain yang mudah rusak dan digunakan

untuk memproduksi bahan pangan olahan (Rodriguez et al., 2000). Bakteri

asam laktat dapat menjaga atau mempertahankan mutu makanan dari bakteri

pengganggu dan bakteri pembusuk dengan memproduksi asam organik,

hidrogen peroksida, diasetil, asam lemak dan bakteriosin (Navaro et al., 2000).

BAL yang meliputi genus Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus,

Pediococcus dan lain-lain mampu konversi glukosa menjadi asam laktat dan

hasil samping (Deegan et al., 2005).

Bakteriosin merupakan suatu senyawa protein yang memiliki sifat

bakterisidal terhadap bakteri gram positif dan gram negatif. Pada awalnya

bakteriosin diketahui hanya menghambat pertumbuhan bakteri yang

berkerabat dekat dengan sel produser (filogenik), tetapi pada saat ini beberapa

jenis bakeriosin menunjukkan spektrum yang lebih luas. Bakteriosin yang

dihasilkan oleh bakteri asam laktat sangat menguntungkan bagi industri

pangan karena aktivitasnya mampu menghambat pertumbuhan bakteri

pembawa penyakit yang biasanya terdapat pada makanan (Gonzales et al.,

1996)

Bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat dapat

mengalami degradasi oleh enzim proteolitik dalam pencernaan manusia dan

tidak membahayakan bagi kesehatan manusia. Selain itu, bakteriosin juga

memiliki kestabilan terhadap pengaruh pH dan suhu. Bakteriosin tetap

menunjukkan aktivitas yang stabil pada kondisi asam maupun basa, sehingga

sangat potensial dimanfaatkan oleh industri yang dalam prosesnya melibatkan

kondisi asam maupun basa. Pengaruh suhu, bakteriosin tetap menunjukkan

aktivitas yang stabil setelah diberikan perlakuan pada suhu -20˚C sampai

100˚C sehingga sangat baik jika digunakan pada industri yang melibatkan

kondisi panas maupun dingin pada proses produksinya sehingga dapat

digunakan dalam proses di industri pangan yang biasanya melibatkan

pengaturan suhu dan pH (Nurhasanah, 2004).

B. TUJUAN

Tujuan penelitian ini adalah mengetahui aktivitas hambat antibakteri

alamiah (bakteriosin) yang terbentuk sebagai hasil metabolisme bakteri asam

laktat SCG 1223.

C. RUANG LINGKUP

Pada penelitian ini, dilakukan penentuan fase pertumbuhan bakteri

asam laktat SCG 1223. Selama produksi antibakteri perlakuan yang diberikan

yaitu persentase inokulum, suhu inkubasi, pH awal media serta waktu

inkubasi. Untuk menguji aktivitas hambat, dilakukan uji aktivitas dengan

metode sumur agar terhadap bakteri indikator Escherchia coli, Salmonella

thypimurium dan Listeria monocytogenes.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. BAKTERI ASAM LAKTAT

Bakteri asam laktat (BAL) berbentuk batang, panjang dan berbentuk

bulat, anaerob fakultatif (Fardiaz, 1992). BAL mampu hidup pada berbagai

habitat yang cukup luas di alam seperti pada tanaman, pada saluran

pencernaan baik hewan maupun manusia, juga pada berbagai produk makanan

fermentasi seperti : yogurt, minuman fermentasi, keju, saos, kedelai. Sifat

terpenting dari BAL adalah kemampuannya untuk memfermentasi gula

menjadi asam laktat. BAL dapat memproduksi asam laktat dan metabolit lain

yang bersifat antibakteri sehingga pertumbuhan mokroorganisme lain dapat

dihambat (Savadogo et al., 2000).

Terdapat 8 genus bakteri asam laktat, yaitu : Lactobacillus,

Bifidobacterium, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Lactococcus,

Pediococcus dan Corinebacterium. Berdasarkan tipe fermentasi, BAL

dikelompokan menjadi 2, yaitu homofermentative dan heterofermentative

(Davidson dan Braner, 1983). Kelompok homofermentative menghasilkan

asam laktat sebagai produk utama dari fermentasi gula. Kelompok

homofermentatif selama metabolisme sel yang difermentasi adalah gula

pentosa dan yang dihasilkan adalah asam laktat dan asam asetat. BAL

homofermentative membentuk 90% atau lebih asam laktat murni. BAL

homofermentative sering digunakan dalam pengawetan makanan, karena

produksi asam laktat dalam jumlah tinggi dalam makanan sehingga dapat

menghambat pertumbuhan bakteri lain yang dapat merusak makanan. Spesies

yang termasuk homofermentative diantaranya Streptococcus, Pediococcus dan

beberapa Lactobacillus (Fardiaz, 1992). Fermentasi oleh bakteri

heterofermentative akan memecah glukosa menjadi asam laktat dan senyawa

lain seperti CO2, etanol, asetaldehid, diasetil serta senyawa lainnya. BAL

sangat penting dalam memfermentasi makanan karena banyak menghasilkan

komponen antimikroba, yaitu asam laktat, asam asetat, diasetil, hidrogen

peroksida, CO2 dan bakteriosin. Bakteri asam laktat mampu menghasilkan

berbagai metabolit yang bersifat antibakteri seperti ditunjukkan pada

Gambar 1.

Gambar 1. Mekanisme pertumbuhan bakteri asam laktat yang menghasilkan

berbagai macam produk metabolit (Lucy et al., 2005)

Bakteri asam laktat telah dimanfaatkan oleh manusia sejak lama.

Saat ini bakteri asam laktat dalam industri pangan dikenal luas karena

potensinya sebagai penghasil berbagai asam organik dan secara umum

sifatnya bukan sebagai patogen (Dick, 1994). Peranan bakteri asam laktat

dalam bahan pangan lebih banyak menguntungkan daripada merugikan.

Bakteri asam laktat yang aktif dalam fermentasi makanan, akan memberikan

daya simpan produk yang lebih lama dibandingkan tanpa bakteri asam laktat.

Daya simpan produk ini disebabkan oleh asam laktat khususnya dan senyawa

asam lain yang diproduksi sebagai hasil metabolisme bakteri asam laktat.

Senyawa tersebut disebut juga antimikroba yang dapat menghambat

pertumbuhan bakteri pembusuk maupun patogen makanan. Selain

menghasilkan senyawa-senyawa organik beberapa galur bakteri asam laktat

Nutrisi

Asam

H2O2

Diasetil CO2

Bakteri produsen Bacteriosin

Bakteri target

juga menghasilkan senyawa protein yang bersifat bakterisidal terhadap bakteri

gram positif dan gram negatif yang disebut bakteriosin (Tahara et al., 1996).

B. PERTUMBUHAN BAKTERI ASAM LAKTAT

Pertumbuhan bakteri asam laktat akan mengalami peningkatan

dengan meningkatnya waktu inkubasi. Peningkatan ini berlangsung secara

logaritma. Meningkatnya jumlah biomassa akan menyebabkan jumlah

bakteriosin yang dihasilkan juga akan meningkat kemudian turun setelah

mencapai fase stasioner (Boe, 1996).

Faktor pH media akan mempengaruhi pertumbuhan sel bakteri

selanjutnya akan mempengaruhi produksi bakteriosin. Produksi bakteriosin

akan meningkat dengan meningkatnya pH sampai pH optimum dan kemudian

akan mengalami penurunan. pH optimum untuk produksi bakteriosin dari

isolat Lactobacillus lactis adalah 6.5. Sementara itu faktor suhu mempunyai

dua pengaruh yang bertentangan yaitu meningkatkan produksi bakteriosin

tetapi juga dapat membunuh bakteri asam laktat penghasil bakteriosin. Suhu

optimum merupakan batas keduanya (Caldera-olivera, 2004). Peningkatan

suhu sebelum mencapai suhu optimum akan meningkatkan pertumbuhan

bakteri dan produksi bakteriosin.

C. BAKTERIOSIN

Bakteriosin merupakan senyawa protein yang mudah didegradasi

oleh enzim proteolitik dan memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan

mikroorganisme yang secara filogenik dekat dengan bakteri penghasil

bakteriosin (Jack et al., 1995). Beberapa kriteria bakteriosin antara lain berupa

protein, bersifat bakterisidal, bakteri target memiliki sifat pengikatan spesifik

(specific binding site), gen pengkode bakteriosin berada dalam plasmid, aktif

terhadap bakteri yang dekat secara filogenik (Tagg et al., 1976). Berdasarkan

hasil penelitian yang muncul belakangan ini, terdapat ketidaksesuaian dengan

kriteria tersebut, maka saat ini hanya ada dua persyaratan tentang bakteriosin,

yaitu sebagai protein dan tidak membunuh bakteri penghasilnya. Bakteriosin

merupakan produk ekstraseluler berupa protein yang sintesisnya langsung dari

ribosom, memiliki aktivitas antibakteri dengan spektrum yang relatif sempit

(Jack et al., 1995).

Menurut Klaenhammer (1988) bakteriosin yang dihasilkan oleh

beberapa galur BAL telah diketahui mempunyai aktivitas hambat terhadap

bakteri pembusuk dan patogen makanan yang dapat meningkatkan keamanan

dan daya simpan pangan. Klaenhammer (1988) mengelompokkan bekteriosin

menjadi empat, yaitu :

1. Lantibiotik, merupakan bakteriosin yang mengandung cincin lantionin

dalam molekulnya, contohnya nisin, Lacticin 481, Lactacin S,

Streptococcin SA-FF22.

2. Bakteriosin kecil (< 10 kDa), relatif tahan panas, peptide pada sisi aktifnya

tidak mengandung lantionin. Kelompok kedua ini dibagi lagi dalam tiga

sub kelas. Kelas IIa mempunyai peptide listria-active dengan sekumpulan

sekuen N-terminal. Kelas IIb adalah kelompok bakteriosin yang biasanya

membentuk komplek berpori dengan aktifitas dua peptida yang berbeda.

Kelas IIc adalah bakteriosin yang memerlukan peptide teraktifasi-tiol

untuk mengurangi residu sistein dalam aktivitasnya.

3. Bakteriosin bermolekul protein besar (>30 kDa) dengan protein tidak

tahan panas, contoh Helvetion J dan Brevicin 27.

4. Bakteriosin yang mengandung protein kompleks, terdiri atas komponen

karbohidrat maupun lipid, contoh plantarisin S yang mengandung

glikoprotein (Jimenez-Diaz et al., 1993).

Schnell (1998) mengemukakan bahwa sintesis bakteriosin oleh sel

galur produsen terjadi selama pertumbuhan fase eksponensial. Kemampuan

aktivitas bakterisidal dari nisin terjadi karena adanya depolarisasi membran

sitoplasmik. Gangguan pada membran diawali dengan pembentukan lubang

yang menyebabkan molekul kecil dibebaskan keluar sel (Engelkel et al.,1992).

Menurut Ray (1992) mengemukakan bahwa, pediosin AcH yang diproduksi

oleh P. Acidilactic seperti halnhya nisin dan bakteriosin lain dari bakteri asam

laktat, memiliki aktivitas bakterisidal terhadap bakteri gram positif dan gram

negaif.

Pada umumnya bakteriosin sensitif terhadap protease (Ahn dan

Stiles, 1990). Pada nisin hanya sensitive terhadap ∝-khimotripsin (Hurst,

1981). Bakteriosin biasanya tahan terhadap panas dan dalam lingkungan asam

aktivitasnya masih tetap ada seperti pada suhu 100˚C atau 121˚C selama 15

menit (Bhunia et al., 1988). Demikian pula suhu yang sangat rendah dalam

penyimpanan tidak mempengaruhi aktivitas bakteriosin (Davey dan

Richardson, 1981). Mekanisme biosintesis bakteriosin dapat dilihat pada

Gambar 2.

Gambar 2. Mekanisme sintesis bakteriosin yang dihasilkan selama

metabolisme sel bakteri asam laktat (Drider et al., 2006)

Bacteriocin

Pre-bakteriosin Pre-inducer Peptide

Inducer Peptide Leader peptide

Histidine Kinase ABC-Transporter

Respon regulatorGen aktivasiAktivasi gen pengkode Bakteriosin, protein immunity dan regulasi protein

Protein immunity

D. KEGUNAAN BAKTERIOSIN

Bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat telah menarik

banyak perhatian pada beberapa tahun terakhir ini karena senyawa tersebut

potensial digunakan sebagai pengawet makanan. Substansi ini merupakan

protein sehingga dapat terdegradasi pada pencernaan manusia dan hewan.

Bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat ada yang telah digunakan

sebagai pengawet makanan terutama dalam keju dan susu dan berbagai produk

makanan lainnya (Jimenez Diaz et al., 1993). Bakteriosin asal bakteri asam

laktat mudah diterima sebagai bahan tambahan oleh para ahli kesehatan dan

lebih penting oleh konsumen karena bakteri asam laktat biasanya secara alami

memang berada dalam proses fermentasi makanan (Gonzales et al., 1996).

Salah satu contoh bakteriosin adalah nisin yang merupakan

bakteriosin polipeptida yang diproduksi oleh Lactococcus lactis dan telah

dikenal secara umum aman untuk mengontrol bakteri patogen dan pembusuk

makanan. Beberapa bakteriosin dari bakteri asam laktat lain telah diusulkan

dan diuji sebagai pengawet dalam berbagai produk makanan. Bakteriosin

tersebut diproduksi Lactoccus, Lactobacillus dan Pediococcus yang berasal

dari berbagai bahan makanan. Nisin merupakan penghambat pertumbuhan

yang efektif terhadap bakteri gram positif telah dipakai secara komersial di 40

negara sejak 1983 (Martirani et al., 2002). Nisin bersifat nontoksik dan

nonantogonik terhadap manusia, dapat dicerna dalam jumlah sampai 3,3 x 107

U/kg dari berat tubuh tanpa efek merugikan, dapat didegradasi oleh enzim

proteolitik dalam saluran pencernaan, karenanya aman untuk digunakan

sebagai pengawet makanan (Bower et al., 1995). Nisin adalah antibiotik

paling penting yang telah digunakan sebagai bahan pengawet makanan karena

efektifitasnya tinggi terhadap bakteri gram positif tertentu seperti

Staphylococcus, Streptococcus dan Clostrida (Engelke et al., 1992). Selain

nisin, pediosin telah diketahui efektif untuk mengontrol bakteri gram positif

pembusuk dan patogen dalam susu cair, es krim, keju. daging segar, daging

giling dan produk daging (Bruno et al., 1992).

Tabel 1. Tabel perbandingan bakteriosin dengan antibiotik alamiah

Karakteristik Bakteriosin Antibiotik Aplikasi Makanan Clinical Sintesis Ribosomal Metabolisme

sekunder Aktivitas Umumnya sempit, tetapi terdapat

beberapa jenis yang menunjukkan spectrum yang luas

Bermacam-macam

Sel immunity Ya tidak Mode of action Umumnya membentuk lubang pada

membrane sel yang mengakibatkan kematian sel

Membrane sel target intraseluler

Efek toxic Belum diketahui ada ya (Cleveland et al., 2001)

Bakteriosin dapat digunakan dalam makanan untuk mengurangi

pertumbuhan bakteri gram positif sehingga dapat meningkatkan keamanan dan

daya tahan makanan. Bakteriosin sebagai biopreservatif makanan harus

memenuhi kriteria seperti halnya pengawet maupun bahan tambahan

makanan, antara lain aman bagi konsumen, mempunyai aktivitas bakterisidal

terhadap berbagai kelompok bakteri gram posistif dalam sistem makanan,

stabil, terdistribusi merata dalam sistem makanan, dan ekonomis (Ray, 1992).

E. BAKTERI INDIKATOR

Bakteri merupakan kelompok terbesar diantara berbagai kelompok

mikroba dalam makanan, karena dapat hidup di berbagai tempat dan

pertumbuhannya cepat walaupun berada pada kondisi yang tidak

memungkinkan untuk pertumbuhan khamir dan jamur. Bakteri merupakan

mikroba penyebab pembusukan makanan dan penyakit yang menular melalui

makanan. Oleh karena itu, menjadi penting dalam pengembangan metode

untuk mengontrol mikroorganisme dalam makanan (Ray, 1996).

Makanan tertentu seperti makanan segar, makanan yang tidak diolah

secara intensif, yang dikemas dalam kantung hampa udara dan kemudian

semua makanan tersebut disimpan dalam alat pendingin ternyata tidak dapat

terhindar dari pertumbuhan bakteri gram positif aerob dan anaerob fakultatif

baik pembusuk maupun patogen. Produk-produk tersebut masih menjadi

tempat tumbuh beberapa patogen gram positif seperti Listeria monocytogenes.

Bakteri gram positif lainnya yang merupakan mikroba penyebab

pembusukan dan patogen makanan yaitu Staphylococcus aureus dan beberapa

spesies Bacillus. Salmonella dan Escherichia, adalah bakteri gram negatif

yang sebagian spesiesnya adalah penyebab penyakit saluran pencernaan.

Escherichia coli ditemukan dalam usus manusia dan hewan. Beberapa galur

merupakan patogen tehadap manusia dan hewan yang terlibat dalam penyakit

menular melalui makanan. Salmonella ditemukan dalam usus manusia, burung

dan serangga. Spesies yang menyebabkan penyakit terutama adalah

Salmonella typhimurium (Ray, 1996).

Berikut ini beberapa bakteri indikator yang digunakan dalam

penelitian :

1. Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes adalah bakteri patogen yang menular

melalui makanan. Hal ini penting dan menjadi perhatian terutama bagi

industri makanan karena terjangkitnya listeriosis dapat berasal dari

makanan (Faber dan Peterkin, 1991). Listeria monocytogenes tersebar luas

di alam dapat diisolasi dari tanah, tanaman, rumput dan air serta mampu

tumbuh pada kondisi alat pendingin, resisten terhadap kadar garam

natrium klorida yang relative tinggi, dapat hidup pada pH rendah, mampu

hidup dalam jangka waktu lama dibawah kondisi kering dan merupakan

sel vegetatif yang paling tahan panas (Corner et al., 1986).

Listeria monocytogenes ditemukan pada berbagai tipe

lingkungan pengolahan makanan dan mampu melekat pada berbagai

permukaan makanan (Herald dan Zottola, 1988). Hal tersebut

menimbulkan masalah selama pengolahan makanan karena

mikroorganisme yang melekat menjadi semakin sulit dikontrol dengan

sarana pembersih dan antibakeri. Dalam kondisi yang cocok, sel-sel

bakteri yang mampu berkembang biak, kemudian menghasilkan

polisakarida ekstraseluler yang akhirnya akan membentuk selaput.

Akumulasi selaput tersebut mengakibatkan berbagai masalah dalam

pengolahan makanan, antara lain menghambat proses pencairan dan

menurunkan efisiensi selama pemanasan (Le Chevallier et al., 1998).

Selain itu, menyebabkan kontaminasi pada produk makanan dan sangat

merugikan (Bower et al., 1995).

2. Escherchia coli

Escherchia coli adalah bakteri gram negatif, sebagian spesiesnya

menyebabkan penyakit saluran pencernaan. Escherchia coli ditemukan

dalam usus manusia dan hewan. Beberapa galurnya merupakan patogen

terhadap manusia dan hewan. Escherchia coli termasuk dalam famili

Enterobacteriaceae. Bakteri ini merupakan bakteri gram negatif, bersifat

anaerobik fakultatif, memiliki flagela peritrikat, berukuran 1,1-1,5 μm x 2-

6 μm, tersusun tunggal atau berpasangan, bersifat motil atau non motil dan

banyak galurnya yang memiliki kapsul dan mikrokapsul. Escherchia coli

mempunyai tipe respirasi dan fermentasi dengan suhu optimum 37ºC, Aw

optimum 0,96 dan pH optimum 7-7,5 (Masduki, 1996).

Escherciha coli termasuk mikroorganisme yang tidak berbahaya,

namun juga tidak menguntungkan dalam keadaan normal. Bakteri ini

dapat bersifat patogen dengan tingkat bahaya yang sedang dan tingkat

penyebaran yang cepat (Fardiaz, 1992). Menurut Gorbach (2001) bakteri

ini termasuk bakteri enterotoksigenik yang dapat menyebabkan penyakit

diare. Strain bakteri ini memproduksi dua tipe enterotoksin, yaitu toksin

yang tidak tahan panas dan tipe kedua adalah toksin yang stabil pada suhu

tinggi. Gorbach (2001), menemukan bahwa bakteri ini juga dapat

membunuh sel-sel kelenjar susu. Escherchia coli juga dapat

mengakibatkan pritonitis pada ternak.

3. Salmonella sp.

Salmonella sp. termasuk dalam famili enterobacteriaceae.

Bakteri ini berbentuk batang pendek, bersifat gram negatif, tidak

membentuk spora, anaerob fakultatif dan memiliki flagela peritrikat

(Gaman dan Sherington, 1992). Bakteri ini merupakan bakteri patogen

yang berbahaya. Selain dapat menyebabkan gejala kelainan

gastrointestina, Salmonella sp. juga dapat demam tifus dan paratifus

(Fardiaz, 1992). Salmonella typhimurium merupakan bakteri gram negatif,

menyebabkan gastro enteric atau keracunan makanan (Duerden et al.,

1993). Bakteri patogen ini apabila terdapat dalam makanan sulit dikontrol

karena sifat-sifat biologisnya.

Salmonellosis merupakan penyakit yang disebabkan salmonella,

dapat terjadi pada ternak maupun manusia. Serotipe bakteri ini potensial

bersifat patogen, juga merupakan kontaminan bagi produk ternak seperti

daging, telur dan susu. Salmonellosis yang merupakan penyakit zoonose

ini juga disebut “Food Borne Disease” karena penularannya terjadi

malalui makanan dan minuman. Salmonella sp. banyak ditemukan pada

saluran pencernaan vertebrata maupun invertebrata dan juga terdapat

dalam feses ternak. Bakteri ini juga terdapat pada tembolok broiler

sehingga dapat mengkontaminasi karkas (Sutherland, 1997).

F. MEKANISME KERJA ANTIBAKTERI

Dinding sel bakteri merupakan kerangka kaku di luar membran sel

bakteri. Membran sel bakteri membungkus suatu massa yang bertekanan

tinggi mencapai 20 atm karena mengandung metabolit yang tekananya lebih

tinggi dari tekanan sekitar sel. Bila tidak ada dinding sel maka membran sel

tidak mampu untuk menahan tekanan osmotik di dalam sel bakteri sehingga

sel akan pecah (Bintang, 1995).

Target kerja bakteriosin asal bakteri asam laktat adalah membran

sitoplasma sel bakteri sensitif (Venema et al., 1993) sehingga dapat

menimbulkan akibat fatal bagi kelangsungan hidup sel tersebut. Semua sel

hidup dibatasi oleh membran sitoplasma yang bersifat selektifpermeable,

melakukan pengangkutan aktif, sehingga berperan dalam mengendalikan

komponen dalam sel. Apabila integritas fungsi sel sitoplasma terganggu maka

substansi yang terdapat di dalam sel akan lolos dari sel sehingga menimbulkan

kerusakan atau kematian sel (Drider et al.,, 2006). Mekanisme aksi

penghambatan bakteriosin terhadap bakteri target dapat dilihat pada

Gambar 3.

Gambar 3. Mekanisme aksi Bakteriosin merusak membran sel bakteri patogen

(Drider et al., 2006)

Bacteriosin

Interaksi dengan sitolpasma

Pembentukan pori

Beberapa cara antimikroba dalam aksinya melawan mikroorganisme,

yaitu efek bakterisidal, bakteriostatik ataupun bakteriolisis. Secara umum

bakteriosin asal BAL memiliki kemampuan melawan bakteri lain dengan efek

bakterisidal. Mekanisme aktivitas bakterisidal beberapa bakteriosin secara

umum sebagai berikut : (1) molekul bakteriosin mengalami kontak langsung

dengan membran sel, (2) proses kontak ini mampu mengganggu potensial

membran berupa destabilitas membran sitoplasma sehingga sel menjadi tidak

kuat, (3) ketidakstabilan membran mampu memberikan dampak pembentukan

lubang atau poti pada membran sel melalui proses gangguan terhadap PMF

(Proton Motive Force) (Gonzalez et al., 1996). Kebocoran yang terjadi akibat

pembentukan lubang pada membran sitoplasma ditunjukkan oleh adanya

aktivtas keluar masuknya molekul-molekul seluler. Kebocoran yang terjadi

berdampak pada penurunan gradient pH seluler. Secara umum, pengaruh

pembentukan lubang sitoplasma sebagai dampak adanya bakteriosin,

menyebabkan terjadinya perubahan gradient potensial membrane (∆P) dan

pelepasan melekul intraseluler maupun masuknya substansi ekstraseluler

(lingkungan). Efeknya menyebabkan pertumbuhan sel terhambat dan

menghasilkan proses kematian pada sel yang sensitif terhadap bakteriosin

(Drider et al., 2006).

III. METODOLOGI

A. ALAT

Peralatan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah inkubator

shaker (orbital incubator SI 50, Stuart Scientific), laminar flow, sentrifuse

micro (TOMMY), spectrofotometer (U-2010), autoclaf (Hirayama). Alat

lainnya yang digunakan antara lain micropipette, Vortex mixer, gelas piala,

tabung reaksi, tabung ulir, neraca analitik (Precisa), pipet, pH meter, holder

milipore dan milipore 0,22 μm.

B. BAHAN

Media pertumbuhan bakteri yang digunakan adalah MRS (De Man

Rogrosa and Sharpe) broth (Oxoid), MRS agar (Oxoid), yeast extrac (Difco),

Muller Hinton Agar (Oxoid) dan Nutrient agar serta Nutrient broth (Oxoid).

Bahan kimia yang digunakan adalah NaCl pa, NaOH pa dan HCl pa 32%

(MERCK).

C. MIKROORGANISME

Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri asam laktat

(BAL) galur SCG 1223 yang digunakan sebagai produsen bakteriosin. Isolat

tersebut merupakan koleksi dari laboratorium bakteriologi Balai Besar

Sumberdaya Genetika, yang merupakan hasil isolasi dari produk peternakan

yang diambil di wilayah Bogor. Bakteri indikator yang digunakan adalah

Listeria monocytogenes (bakteri gram positif), Salmonella thyphimurium,

Escherchia coli (bakteri gram negatif) merupakan koleksi labolatorium

Enterobactericeae Balai Besar Penelitian Veteriner Bogor.

D. METODA PENELITIAN

Penelitian yang dilakukan terdiri dari dua tahap yaitu penelitian tahap.

Penelitian tahap pertama bertujuan untuk peremajaan isolat dan memperoleh

fase pertumbuhan bakteri. Pada penelitian tahap kedua menumbuhkan bakteri

terpilih pada media MRS broth dengan berbagai pengaruh pH, suhu, waktu

serta persentase inokulum.

1. Penelitian Tahap Pertama

a. Peremajaan Biakan dan Persiapan Inokulum

Isolat BAL yang digunakan dalam bentuk kultur stok pada agar

miring. Sebelum digunakan isolat harus diremajakan atau diaktifkan

terlebih dahulu. Untuk meremajakan kultur stok sebanyak 1 ose kutur

bakteri ditumbuhkan pada 10 ml MRS broth yang diinkubasi pada

suhu 37ºC selama 24 jam dilakukan beberapa kali dan dengan

penambahan yeast extract hingga bakteri yang digunakan tumbuh

dengan baik. Peremajaan bakteri juga dilakukan pada bakteri indikator

dengan menggunakan media nutrien agar. Diagram alir proses

peremajaan bakteri disajikan pada Lampiran 1.

b. Kurva Pertumbuhan Bakteri

Tahap ini bertujuan untuk mengetahui kurva pertumbuhan

bakteri SCG 1223 dan fase pertumbuhannya. Kurva pertumbuhan

bakteri dilakukan selama 20 jam inkubasi dan untuk mengetahui fase-

fase yang ada dilakukan sampling setiap 1 jam. Fase-fase yang

terbentuk akan berguna untuk menentukan waktu generasi bakteri,

khususnya fase eksponensial yang erat hubungannya dengan sekresi

substansi antimikroba.

Sebanyak 5 % dari kultur segar ditanam dalam MRS broth

dan diinkubasi pada suhu 37ºC. pertumbuhan bakteri diikuti setiap jam

dengan mengamati nilai kerapatan optik atau optical density (OD) dari

starter pada media MRS dengan metode turbidimetrik dengan panjang

gelombang 620 nm (Hadioetomo, 1990).

2. Penelitian Tahap Kedua

a. Perlakuan

Pada penelitian ini dilakukan produksi bakteriosin dengan

perlakuan persentase inokulum, suhu, pH awal media dan waktu

inkubasi. Persentase inokulum yang digunakan sebesar 5 % dan 10 %,

pH media yang digunakan pH 4 dan pH 6, suhu 27ºC dan 40ºC,

sedangkan waktu inkubasi yang digunakan selama 4 jam, 10 jam dan

14 jam.

b. Produksi Bakteriosin

Tahap penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan bakteriosin

yang merupkan protein yang memiliki aktifitas paling tinggi terhadap

bakteri indikator. Produksi bakteriosin menggunakan erlenmeyer 1000

ml dengan volume kerja (working volume) 400 ml. Sebelum produksi

bakteriosin dilakukan, terlebih dahulu dibuat medium propagasi.

Kultur hasil propagasi diinokulasi pada media MRS broth yang di beri

perlakuan pH awal 4 dan 6 dengan persentase inokulum 5% (v/v) dan

10% (v/v). Lalu inkubasi selama 4 sampai 14 jam dengan suhu 27ºC

dan 40ºC. Selanjutnya kultur hasil produksi yang diperoleh

disentrifugasi pada 10.000 rpm, 4˚C selama 15 menit sehingga

menghasilkan supernatan. Supernatan dibagi menjadi dua. Yang

pertama supernatan disaring dengan menggunakan milipore 0,22 μm

untuk menghasilkan supernatan bebas sel. Kedua, supernatan

dinetralkan pH nya dengan menggunakan NaOH untuk menghilangkan

pengaruh asam yang dihasilkan. Selanjutnya, supernatan bebas sel dan

supernatan netral bebas sel diuji aktivitas dengan metode sumur agar

(Delgado et al., 2001). Diagram alir produksi bakteriosin dapat dilihat

pada Gambar 4.

Gambar 4. Diagram Alir Produksi Bakteriosin

3. Uji Aktivitas Bakteriosin

Bakteri indikator diremajakan pada cawan agar lalu diinkubasi

pada 37ºC selama 24 jam. Setelah inokulum berumur 24 jam, koloni di

pindahkan dalam 5 ml garam fisiologis lalu dibandingkan kekeruhannya

dengan Mcfarland No. 3 dengan OD 0,755 atau setara dengan kekeruhan

109 inokulum bakteri. Setelah didapatkan suspensi bakteri indikator,

dilakukan pengenceran hingga 106. Suspensi bakteri indikator yang

diperoleh diinokulasi sebanyak 1 ml kedalam cawan agar berisi media

muller hinton agar setelah media cairan inokulum berdifusi dibuat sumur

dengan diameter 6 mm dengan mengunakan alat sumuran.

Sampel yang akan diuji, diambil sebanyak 50 μl dan dimasukkan

kedalam sumur pada media uji dan dibiarkan selama bebeapa menit pada

suhu kamar, kemudian di inkubasi 37ºC selama 24 jam dan diamati

aktivitasnya. Aktivitas hambatan supernatan terhadap bakteri indikator

akan terlihat dengan munculnya zona bening disekitar sumur. Unit

aktivitas bakteriosin di definisikan sebagai AU (Activity Unit), 1 AU

merupakan luas daerah hambatan per satuan volum contoh bakteriosin

yang diuji (mm2/mL).

Aktivitas bakteriosin dapat dihitung dengan menggunakan

persamaan berikut :

Aktivitas bakteriosin (mm2/mL) = Lz - LsV

Lz : Luas zona bening (mm2).

Ls : Luas sumur (mm2).

V : Volume contoh (ml).

4. Rancangan perlakuan

Pada penelitian tahap dua terdiri dari empat faktor yaitu faktor

persentase inokulum yang terdiri dari dua taraf yaitu 5% dan 10%; faktor

pH media terdiri dari dua faktor yaitu pH 4 dan pH 6; faktor suhu yaitu

27ºC dan 40ºC; faktor waktu inkubasi terdiri dari tiga taraf yaitu 4 jam, 10

jam dan 14 jam. Rancangan produksi antibaktgeri dalam penelitian ini

secara lengkap disajikan pada Tabel 2.

Tabel 2. Tabel rancangan produksi antibakteri

Kode Run Inokulum (%) pH Suhu (ºC) Waktu (Jam)

1 5 4 27 4 2 5 6 27 4 3 5 4 40 4 4 5 6 40 4 5 5 4 27 10 6 5 6 27 10 7 5 4 40 10 8 5 6 40 10 9 5 4 27 14 10 5 6 27 14 11 5 4 40 14 12 5 6 40 14 13 10 4 27 4 14 10 6 27 4 15 10 4 40 4 16 10 6 40 4 17 10 4 27 10 18 10 6 27 10 19 10 4 40 10 20 10 6 40 10 21 10 4 27 14 22 10 6 27 14 23 10 4 40 14 24 10 6 40 14

VI. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. FASE PERTUMBUHAN BAKTERI ASAM LAKTAT SCG 1223

Fase pertumbuhan bakteri asam laktat SCG 1223 digunakan untuk

menentukan waktu inkubasi selama produksi senyawa antibakteri. Grafik

pertumbuhan bakteri asam laktat SCG 1223 dapat dilihat pada Gambar 5.

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 1314 1516 17 1819 20

Jam

OD

1.00E+001.00E+011.00E+021.00E+031.00E+041.00E+051.00E+061.00E+071.00E+081.00E+091.00E+101.00E+111.00E+121.00E+13

TPC

ODTPC

I : Fase lagII : Fase eksponensialIII : Fase StasionerIV : Fase kemastian

Gambar 5. Grafik pertumbuhan Bakteri asam laktat galur SCG 1223

Fase pertumbuhan bakteri asam laktat (BAL) galur SCG 1223 terdiri

dari fase lag, fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian. Pada fase lag

bakteri melakukan proses aklimatisasi terhadap kondisi lingkungannya (seperti

pH, suhu, nutrisi dan lain sebagainya), pada fase ini peningkatan jumlah sel

bakteri berlangsung lambat. Pada fase lag pada bakteri asam laktat SCG 1223

terjadi selama jam ke-0 sampai jam ke-3. Fase kedua adalah fase eksponensial

yang merupakan fase dimana pertumbuhan bakteri berlangsung sangat cepat.

Pada pertumbuhan bakteri BAL galur SCG 1223 fase eksponensial terjadi

pada jam ke-4 sampai jam ke-10. Fase berikutnya adalah fase stasioner, pada

II III IV I

fase ini tidak terjadi penambahan jumlah bakteri karena jumlah sel yang

tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Pada pertumbuhan bakteri asam

laktat galur SCG 1223 fase stasioner ini terjadi mulai jam ke-11 hingga jam

ke-14. Fase terakhir adalah fase kematian, fase kematian pada pertumbuhan

bakteri SCG 1223 terjadi mulai jam ke-15 pada fase ini jumlah sel bakteri

mulai menurun karena nutrien dalam media dan cadangan energi dalam sel

mulai menipis.

Bakteriosin merupakan substansi antibakteri yang disintesis langsung

di ribosom selama pertumbuhan bakteri asam laktat, produksi maksimum

terjadi pada fase eksponensial sampai awal fase stasioner. Menurut Jimenez

Diaz (1993) produksi bakteriosin terbaik pada saat mencapai akhir fase

eksponensial atau awal fase stasioner.

Antibiotik yang diproduksi oleh bakteri merupakan metabolit

sekunder yang disintesis selama fase stasioner dalam pertumbuhan bakteri.

Bakteriosin merupakan antibakteri yang diproduksi mengikuti pola metabolit

primer. Bakteriosin diproduksi selama fase stsioner dalam pertumbuhan

bakteri asam laktat seperti Plantaricin F, Pediocin N5p, Plantaricin. Pada

produksi bakteriosin Pediocon PD-1 disintesis selama fase eksponensial dan

dicapai produksi maksimum pada fase stasioner (Navaro et al., 2000).

B. AKTIFITAS HAMBAT ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT 1223

Pada pengujian antibakteri, hasil zona hambat yang diperoleh pada

supernatan yang tidak dinetralkan terhadap tiga bakteri indikator (Escherchia

coli, Salmonella thypimurium dan Listeria monocytogenes) semua perlakuan

menghasilkan zona hambat antara 392,50 AU/ml sampai 5338,00 AU/ml.

Hasil pengamatan aktifitas penghambatan terhadap bakteri indikator

Escherchia coli, Salmonella thypimurium dan listeria monocytogenes

disajikan pada Tabel 3. Berdasarkan hasil tersebut, bakteri asam laktat SCG

1223 menghasilkan metabolit yang bersifat antimikroba yang antara lain asam

laktat yang dihasilkan sebagai produk metabolit primer, hidrogen peroksida,

diasetil maupun bakteriosin (Navaro et al., 2000). Aktifitas hambat yang

dihasilkan tersebut, sebagian besar merupakan pengaruh dari aktifitas asam

laktat, selain itu aktifitas tersebut dapat juga di sebabkan hasil metabolisme

lain dari bakteri asam laktat SCG 1223 seperti bakteriosin.

Tabel 3. Hasil uji aktifitas supernatan asam (tidak dinetralkan)

Aktifitas hambat (AU/ml) Kode run E.coli S. thypimurium L. monocytogenes 1 816,40 816,40 816,40 2 816,40 1271,70 392,50 3 816,40 816,40 816,40 4 1758,40 3587,29 816,40 5 392,50 816,40 392,50 6 1559,95 2492,53 1758,40 7 994,75 1559,95 1178,13 8 1859,51 1758,40 2276,50 9 816,40 1758,40 4019,20 10 1271,70 5338,00 816,40 11 1758,40 1758,40 1758,40 12 2826,00 1758,40 1758,40 13 729,11 1758,40 816,40 14 729,11 1559,95 643,07 15 904,95 2602,43 994,75 16 1758,40 2276,50 1758,40 17 1271,70 1085,81 643,07 18 1085,81 1758,40 1559,95 19 474,77 1178,13 994,75 20 1178,13 1462,61 816,40 21 1085,81 1961,87 1559,95 22 1178,13 4145,43 2826,00 23 643,07 1758,40 816,40 24 2826,00 1961,87 2170,37

Berikut aktifitas hambat terhadap Escherchia coli, Salmonella

thypimurium dan Listeria monocytogenes :

1. Aktifitas Hambat Terhadap E. coli

Escherchia coli merupkan bakteri yang dapat bersifat patogen

yang dapat menyebabkan penyakit diare. Bakteri Escherchia coli memiliki

daya tahan hidup yang tinggi. Pada pengujian aktivitas dengan Escherchia

coli sebagai bakteri indikator, semua perlakuan pada supernatan dengan

pH yang tidak dinetralkan (supernatan asam) menghasilkan aktifitas

hambat 392,50 AU/ml hingga 2826,00 AU/ml. Perbedaan tinggi aktifitas

ini terkait dengan produk metabolit yang dihasilkan yang memiliki sifat

antagonis terhadap bakteri indikator. Gambar 6 menunjukkan tinggi

aktifitas hambat supenatan asam pada persentase inokulum 5% terhadap

Escherchia coli.

0.00

500.00

1000.00

1500.00

2000.00

2500.00

3000.00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

kode run

Aktiv

itas

ham

bat (

AU/m

l)

Gambar 6. Grafik aktifitas hambat supernatan asam pada persentse

inokulum 5% terhadap Escherchia coli

Berdasarkan Gambar 6, pada persentase inokulum 5% aktifitas

tertinggi diperoleh pada perlakuan pH awal media 6, suhu 40˚C dan waktu

inkubasi 14 jam (Run ke-12) dengan aktifitas hambat 2826,00 AU/ml. Jika

dibandingkan pada pH media yang sama (pH 6) dan suhu inkubasi yang

sama (40ºC) yaitu pada kode run 4, 8 dan 12, aktifitas hambat yang

dihasilkan dari metabolit dengan waktu inkubasi 14 jam (kode run-12)

lebih tinggi dibandingkan dengan waktu inkubasi 10 jam dan 4 jam.

Bakteri asam laktat galur SCG 1223 menghasilkan antibakteri yang

memiliki aktifitas tertinggi pada fase stasioner. Aktifitas antibakteri yang

dihasilkan oleh bakteri asam laktat SCG 1223 dapat dipengaruhi oleh

asam laktat ataupun produk metabolit sekunder. Pada beberapa bakteri

asam laktat produk metabolit sekunder terutama bakteriosin diproduksi

selama fase stasioner dimana pada fase ini di produksi metabolit sekunder

dari pertumbuhan bakteri asam laktat (Navaro et al., 2000).

Gambar 6 menunjukkan pada persentase inokulum 5% aktifitas

hambat dari metabolit yang dihasilkan dari pH awal media 6 lebih tinggi

dibandingkan dengan metabolit yang dihasilkan dari pH awal media 4.

Suhu inkubasi 40ºC menghasilkan metabolit yang memiliki aktifitas lebih

tinggi dibandingkan dengan metabolit yang dihasilkan dari suhu inkubasi

27ºC. Aktifitas antibakteri yang dihasilkan memiliki kaitan dengan

pertumbuhan sel. Pertumbuhan sel yang semakin baik akan meningkatkan

jumlah sel dan akan semakin meningkatkan produksi bakteriosin (Boe,

1996). Grafik pertumbuhan sel bakteri SCG 1223 dengan pengaruh

berbagai faktor yang digunakan selama produksi antibakteri dapat dilihat

pada Gambar 7.

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

kode run

OD

Gambar 7. Grafik pertumbuhan BAL galur SCG 1223 dengan pengaruh

berbagai perlakuan

Berdasarkan pertumbuhan sel bakteri, bakteri asam laktat SCG

1223 memiliki pertumbuhan sel yang lebih baik pada pH 6 dibandingkan

pH 4. Suhu merupakan salah satu faktor penting dalam pertumbuhan

bakteri. Pertumbuhan sel bakteri asam laktat SCG 1223 pada suhu

inkubasi 40ºC lebih baik sehingga diperoleh hasil akhir jumlah bakteri

yang lebih banyak dibandingkan pertumbuhan pada suhu inkubasi 27ºC.

Peningkatan pertumbuhan sel bakteri yang dipengaruhi oleh peningkatan

suhu hingga titik optimum (Caldera, 2004).

Berdasarkan Gambar 6 dan Gambar 7, semakin baik

pertumbuhan bakteri penghasil maka substansi antibakteri yang dihasilkan

akan semakin tinggi aktifitasnya. Pada perlakuan supernatan yang tidak

dinetralkan ini, aktifitas tertinggi dipengaruhi oleh asam laktat. Asam

laktat merupakan produk metabolit primer sehingga produksinya akan

semakin tinggi dengan semakin meningkatnya pertumbuhan sel.

Pengujian pada supernatan supernatan asam menghasilkan

aktifitas hambat yang sebagian besar dipengaruhi oleh aktifitas asam

laktat. Penetralan supernatan dimaksudkan untuk meghilangkan pengaruh

asam laktat yang dihasilkan sehingga pada pengujian daya hambat aktifitas

hambat terhadap bakteri indikator terjadi karena senyawa antagonis lain

selain asam laktat yang dalam hal ini berupa bakteriosin.

BAL menghasilkan senyawa-senyawa antimikroba antara lain

asam laktat, hidrogen peroksida, diasetil dan bakteriosin. Hidrogen

peroksida bersifat bakterisidal pada konsenrasi 20-22 μg/ml, sedangkan

produksinya pada media pepton hanya 8-9 μg/ml setelah diinkubasi

selama 2 hari pada suhu 30˚C (Deaschel, 1989).

Diasetil memiliki sifat antimikroba hanya pada konsentrasi yang

tinggi, sedangkan pada konsentrasi rendah tidak efektif karena dapat

dihancurkan beberapa mikroorganisme (Ray, 1992). BAL dapat

menghasilkan diasetil kurang dari 2,8 μg/ml pada media produksinya

(Kuoila dan Rangganatan, 1987) Diasetil akan memiliki efek antibakteri

apabila dipekatkan hingga konsentrasi 500-2500 μg/ml. Pada konsentrasi

150 μg/ml diasetil memiliki efek bakteriostatik (Elliker, 1945).

Dengan penetralan pH supernatan, perlakuan dengan persentase

inokulum 5% tidak memiliki aktifitas hambat terhadap E. coli (Lampiran

6). Tidak adanya aktifitas supernatan setelah dinetralkan menunjukkan

dengan persentase inokulum 5% substansi antimikroba selain asam laktat

sedikit atau tidak diproduksi. Grafik aktifitas hambat terhadap E.coli pada

persentase inokulum 10% dapat dilihat pada Gambar 8.

0.00

500.00

1000.00

1500.00

2000.00

2500.00

3000.00

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Kode run

Aktiv

ias

ham

bat (

AU/m

l)

Gambar 8. Grafik aktifitas hambat supernatan asam pada persentase

inokulum 10% terhadap Escherchia coli

Setiap perlakuan pada persentase inokulum 10% menghasilkan

aktifitas hambat terhadap E.coli. Aktifitas hambat tertinggi didapatkan

pada pH media 6, suhu 40ºC dan waktu inkubasi 14 jam. Hasil aktifitas

tertinggi ini sama seperti pada persentase inokulum 5% dimana pada fase

stasioner dihasilkan aktifitas paling tinggi dengan nilai aktifitas 2826,0

AU/ml. Pada fase stasioner dihasilkan produk metabolit antibakteri yang

lebih aktif dibandingkan dengan produk metabolit yang dihasilkan pada

fase eksponensial. Grafik aktifitas hambat terhadap E. coli pada persentase

inokulum 10% dengan supernatan yang dinetralkan dapat dilihat pada

Gambar 9.

0.00

200.00

400.00

600.00

800.00

1000.00

1200.00

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Akt

ivita

s ha

mba

t (AU

/ml)

Gambar 9. Grafik aktifitas hambat supernatan netral pada persentase

inokulum 10% terhadap Escherchia coli

Berdasarkan Gambar 9 tersebut, setiap perlakuan menghasilkan

aktifitas hambat pada rentang aktifitas 311,49 AU/ml sampai 1085,81

AU/ml. Aktifitas pada supernatan netral ini disebabkan oleh pengaruh

substansi antibakteri selain asam laktat, dalam hal ini berupa bakteriosin.

Bakteriosin merupakan antimikroba alamiah yang merupakan produk

metabolit sekunder yang biasanya mengikuti pola metabolit primer

(Dimov et al., 2005).

Bakteri asam laktat SCG 1223 menghasilkan bakteriosin dengan

aktifitas tertinggi didapatkan pada perlakuan dengan pH media 6, suhu

40˚C dan waktu inkubasi 14 jam dengan tinggi aktifitas 1085,81 AU/ml

terhadap Escherchia coli. Berdasarkan hasil tersebut produksi bakteriosin

yang memiliki aktifitas antibakteri tertinggi terhadap bakteri indikator E.

coli terjadi selama fase stasioner.

Pada fase eksponensial baik diawal fase eksponensial dan di

puncak fase eksponensial terdeteksi aktifitas bakteriosin walaupun dalam

jumlah yang lebih rendah dibandingkan fase stasioner. Pada fase stasioner

bakteriosin yang merupakan protein mulai di produksi dimana pada fase

ini terjadi proses metabolit primer. Pada fase stasioner bakteriosin yang

dihasilkan selama fase eksponensial semakin aktif dengan adanya proses

pasca translasi yang diperlukan untuk mengubah prebakteriosin menjadi

bakteriosin yang aktif. Bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam

laktat akan memiliki aktifitas setelah melewati proses pasca translasi yang

akan mengubah pre bakteriosin yang belum aktif menjadi bakteriosin yang

aktif (Drider, 2006).

2. Aktifitas Hambat Terhadap Salmonella thypimurium

Salmonella thypimurium merupakan bakteri patogen yang dapat

menyebabkan penyakit. Bakteri ini merupakan bakteri berbahaya yang

dapat menyebabkan gejala kelainan gastrointestinal. Grafik aktifitas

hambat terhadap Salmonella thypimurium pada persentase inokulum 5%

dapat dilihat pada Gambar 10.

0.00

1000.00

2000.00

3000.00

4000.00

5000.00

6000.00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Kode run

Akt

ivita

s ha

mba

t (AU

/ml)

Gambar 10. Grafik aktifitas hambat pada persentase inokulum 5%

terhadap Salmonella thypimurium

Gambar 10 menunjukkan Setiap perlakuan pada persentase

inokulum 5% yang diujikan terhadap Salmonella thypimurium sebagai

bakteri indikator menghasilkan aktifitas hambat. Hasil uji aktifitas

tertinggi didapatkan adalah 5338,0 AU/ml yang diperoleh pada pH 6, suhu

27˚C dan waktu inkubasi 14 jam (Run ke-10).

Hasil aktfitas tertinggi ini berbeda jika dibandingkan pada hasil

pengujian dengan menggunakan Escherchia coli sebagai bakteri indikator.

Hal ini dikarenakan setiap bakteri indikator memiliki sifat spesifik yang

berhubungan dengan daya tahan hidup pada berbagai faktor lingkungan

dan serangan dari senyawa yang bersifat antagonis. Selain itu produk

metabolit yang dihasilkan selama pertumbuhan bakteri asam laktat

memiliki sifat antagonis yang tidak sama untuk setiap perlakuan hal ini

disebabkan sintesis senyawa antibakteri yang aktif dipengaruhi oleh faktor

lingkungan dimana bakteri penghasil tumbuh.

Penetralan pH yang dilakukan untuk mengetahui pengaruh

aktifitas bakteriosin yang merupakan antibakteri selain asam laktat, setiap

perlakuan dengan persentase inokulum awal 5% tidak memiliki aktifitas

hambat terhadap Salmonella thypimurium (Lampiran 6). Pada persentase

inokulum awal 5%, substansi antibakteri aktif yang diproduksi selama

metabolisme sel bakteri BAL galur SCG 1223 adalah asam laktat. Grafik

aktifitas hambat supernatan asam persentase inokulum 10% terhadap

Salmonella thypimurium dapat dilihat pada Gambar 11.

0.00

500.00

1000.00

1500.00

2000.00

2500.00

3000.00

3500.00

4000.00

4500.00

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Kode run

Akt

ivita

s ha

mba

t (AU

/ml)

Gambar 11. Grafik aktifitas hambat supernatan asam pada persentase

inokulum 10% terhadap Salmonella thypimurium

Berdasarkan gambar 11, setiap perlakuan pada persentase

inokulum 10% dengan supernatan asam (pH<7) menghasilkan aktifitas

hambat terhadap Salmonella thypimurium. Aktifitas hambat tertinggi pada

persentase inokulum 10 % dihasilkan pada pH media 6, suhu inkubasi

27ºC dan waktu inkubasi 14 jam (Run ke-22) yang memiliki aktifitas

hambat sebesar 4145,43 AU/ml.

Pada persentase inokulum awal 10 % setiap perlakuan

menghasilkan aktifitas hambat yang lebih tinggi dibandingkan pada

persentase inokulum awal 5%. Semakin banyak jumlah sel yang

digunakan akan semakin meningkatkan produksi metabolit primer maupun

metabolit sekunder (Boe, 1996). Bakteri asam laktat merupakan bakteri

yang menghasilkan asam laktat sebagai produk metabolit primer dan juga

menghasilkan substansi antibakteri lain seperti hydrogen peroksida,

diasetil dan bakteriosin yang bersifat antibakteri (Tagg et al., 1992)

Penetralan pH supernatan pada persentase inokulum 10%, setiap

perlakuan menghasilkan aktifitas hambat terhadap Salmonella

thypimurium. Grafik aktifitas hambat supernatan netral terhadap

Salmonella thypimurium disajikan pada Gambar 12.

0.00100.00200.00300.00400.00500.00600.00700.00800.00900.00

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Kode run

Aktiv

itas

ham

bat (

AU/m

l)

Gambar 12. Grafik aktifitas hambat supernatan netral pada persentase

inokulum 10% terhadap Salmonella thypimurium

Berdasarkan Gambar 12, daya hambat terbesar diperoleh pada

perlakuan pH 6, suhu 40˚C, dan 10 jam (kode Run 20). Hal ini berbeda

dari yang dihasilkan pada supernatan yang tidak dinetralkan. Hal ini

menunjukan, pada pengujian supernatan yang tidak dinetralkan aktifitas

tertinggi yang terjadi sebagian besar terjadi karena aktifitas asam laktat.

Asam laktat merupakan produk metabolit primer yang diproduksi dalam

jumlah yang besar pada pertumbuhan bakteri asam laktat. Asam laktat

memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen.

Aktifitas yang terjadi pada uji aktifitas dengan supernatan pH

netral disebabkan pengaruh aktifitas bakteriosin yang dihasilkan selama

pertumbuhan bakteri asam laktat galur SCG 1223. Pada persentase

inokulum 10% menghasilkan bakteriosin yang aktif, sedangkan pada

persentase inokulum 5% tidak menghasilkan bakteriosin yang aktif.

Berdasarkan hasil tersebut dengan semakin banyaknya sel yang

diinokulasikan ke dalam media produksi, bakteriosin yang merupakan

metabolit sekunder yang di sintesis melalui jalur ribosomal lebih aktif dan

lebih banyak diproduksi. Menurut Boe (1996), meningkatnya jumlah

biomassa sel dari bakteri asam laktat akan menyebabkan jumlah

bakteriosin yang dihasilkan juga akan meningkat.

3. Aktifitas Hambat Terhadap Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes merupakan bakteri patogen yang dapat

mengakibatkan listeriosis yang memiliki sifat yang sangat merugikan bagi

kesehatan manusia. Pada pengujian aktifitas pH supernatan yang tidak

dinetralkan setiap perlakuan pada persentase inokulum 5% menghasilkan

aktifitas hambat terhadap Listeria monocytogenes. Grafik aktifitas hambat

pada persentase inokulum 5% terhadap Listeria monocytogenes dapat

dilihat pada Gambar 13.

0.00

500.00

1000.00

1500.00

2000.00

2500.00

3000.00

3500.00

4000.00

4500.00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Kode run

Aktiv

itas

ham

bat (

AU/m

l)

Gambar 13. Grafik aktifitas hambat supernatan asam pada persentase

inokulum 5% terhadap Listeria Monocytogenes Berdasarkan Gambar 13, aktifitas tertinggi pada kondisi pH

media 4 suhu inkubasi 27ºC dan waktu inkubasi 14 jam (run ke-9).

Aktifitas substansi antibakteri yang dihasilkan selama pertumbuhan

bakteri asam laktat galur SCG 1223 tedeteksi paling tinggi pada fase

stasioner.

Berdasarkan hasil yang didapatkan melalui uji aktifitas, pada

waktu inkubasi selama 4 jam aktifitas yang dihasilkan lebih rendah bila

dibandingkan dengan aktifitas pada waktu inkubasi 10 jam dan 14 jam.

Hal ini dikarenakan pada waktu inkubasi 4 jam pertumbuhan bakteri baru

memasuki awal fase eksponensial dimana pertumbuhan sel bakeri baru

mulai mengalami peningkatan. Pada supernatan yang tidak dinetralkan

aktifitas hambat sebagian besar dipengaruhi oleh asam laktat yang

dihasilkan. Asam laktat merupakan produk metabolit primer yang

diproduksi oleh bakteri asam laktat selama fase eksponensial. Pada masa

inkubasi 4 jam asam laktat dan metabolit lain yang dihasilkan belum

sebanyak pada masa inkubasi 10 dan 14 jam sehingga aktifitas yang

dihasilkan lebih rendah.

Pada persentase inokulum 5%, dengan penetralan pH supernatan

setiap perlakuan dengan persentase inokulum awal 5% tidak memiliki

aktifitas hambat terhadap Listeria Monocytogenes (Lampiran 6). Pada

persentase inokulum awal 5% dengan penetralan pH supernatan tidak ada

aktifitas hambat yang dihasilkan terhadap ketiga bakteri indikator yang

digunakan dalam uji aktifitas. Pada produksi antibakteri dengan persentase

awal 5% aktifitas hambat yang terjadi merupakan pengaruh asam laktat.

Bakteriosin yang merupakan metabolit sekunder yang diproduksi melaui

jalur ribosomal tidak diproduksi atau diproduksi dalam jumlah yang

sedikait namun tidak aktif. Bakteriosin akan memiliki aktifitas hambat

setelah melewati proses yang akan mengubah prebakteriosin menjadi

bakteriosin yang aktif dan setelah melewati proses pasca translasi (Jonson

et al., 1992). Grafik aktifitas hambat terhadap Listeria monocytogenes

pada persentase inokulum awal 10% dapat dilihat pada Gambar 14.

0.00

500.00

1000.00

1500.00

2000.00

2500.00

3000.00

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Kode run

Aktiv

itas

ham

bat (

AU/m

l)

Gambar 14. Grafik aktifitas hambat supernatan asam pada persentase

inokulum 10% terhadap Listeria Monocytogenes

Berdasarkan Gambar 14 tersebut, aktifitas antibakteri yang

tertinggi diperoleh pada perlakuan pH awal media 6, suhu inkubasi 27ºC

dan waktu inkubasi 14 jam (kode run 22). Bakteri asam laktat SCG 1223

menghasilkan metabolit yang aktif menghambat bakteri indikator yang

digunakan pada fase stasioner. Grafik hasil uji aktifitas supernatant netral

terhadap Listeria monocytogenes dapat dilihat pada Gambar 15.

0.00

200.00

400.00

600.00

800.00

1000.00

1200.00

1400.00

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Kode run

Aktiv

itas

ham

bat (

AU/m

l)

Gambar 15. Grafik aktifitas hambat supernatan netral pada persentase

inokulum 10% terhadap Listeria monocytogenes

Berdasarkan Gambar 15 pada persentase inokulum 10%

supernatan yang telah dinetralkan pH nya setiap perlakuan menghasilkan

aktifitas hambat dengan aktifitas tertinggi pada perlakuan pH 6, suhu 40˚C

dan waktu inkubasi 14 jam (kode run 24). Perlakuan yang menghasilkan

aktifitas tertinggi pada uji aktifitas supernatan netral berbeda dengan

perlakuan yang menghasilkan aktifitas hambat tertinggi pada supernatan

asam. Hal ini dikarenakan pada uji aktifitas supernatan asam pengaruh

terbesar dihasilkan oleh asam laktat. Berdasarkan pengukuran pH

supernatan, pada kode run 22 memiliki pH supernatan yang lebih rendah

dibandingkan dengan pH supernatan pada kode run 24. Hasil pengukuran

pH supernatan selama produksi antibakteri tersaji pada Lampiran 5.

Bakteriosin mulai terdeteksi pada awal fase eksponensial hingga

fase stasioner. Hasil terbaik didapatkan pada waktu inkubasi 14 jam

dimana fase pertumbuhan sudah memasuki fase stasioner. Hal ini

menunjukkan pada bakteri asam laktat galur SCG 1223 memproduksi

bakteriosin aktif paling baik pada fase stasioner dimana pada fase ini laju

pertumbuhan bakteri sama dengan laju kematian. Pada fase stasioner

produksi asam laktat sebagai produk utama metabolisme sel bakteri asam

laktat mulai menurun seiring dengan penurunan laju pertumbuhan. Pada

kondisi seperti ini diduga proses pasca translasi dalam sel bakteri asam

laktat. Proses pasca translasi ini akan mempengaruhi aktifitas bakteriosin

yang dihasilkan. Menurut Jonson (1992) aktifitas bakteriosin dipengaruhi

oleh modofikasi enzimatis pada tahap pasca translasi yang akan merubah

prebakteriosin menjadi bakteriosin yang aktif.

Pada fase eksponensial bakteri SCG 1223 sudah memproduksi

bakteriosin yang merupakan protein alamiah yang bersifat antibakteri, hal

ini di tunjukkan pada uji supernatan netral memiliki aktifitas hambat

terbesar pada uji aktifitas dengan Salmonella thypimurium sebagai bakteri

indikator. Sintesis bakteriosin oleh bakteri penghasil terjadi selama

perjalanan fase ekponensial (Samelis et al., 1994) yang biasanya

mengikuti pola sintesis metabolit primer. Sistem produksi ini diatur oleh

plasmid ekstrakromosom (Ennahar et al., 1996). Bakteriosin yang

terbentuk selama fase eksponensial belum memiliki aktifitas yang cukup

tinggi dan cukup luas terhadap ketiga bakteri indikator. Hal ini

dikarenakan proses pasca translasi belum selesai terjadi dimana pada tahap

ini terjadi pengaktifan prebakteriosin menjadi bakteriosin yang aktif.

V. KESIMPULAN DAN SARAN A. KESIMPULAN

Bakteri asam laktat SCG 1223 menghasilkan produk metabolit

bersifat antibakteri yang memiliki spektrum hambat yang luas terhadap bakteri

gram positif Listeria monocytogenes dengan aktivitas 392.50 AU/ml hingga

2826.00 AU/ml dan bakteri gram negatif Salmonella thypimurium dengan

aktivitas 816.40 AU/ml hingga 5338.00 AU/ml dan Escherchia coli dengan

aktivitas hambat 392.50 AU/ml hingga 2826.00 AU/ml.

Pada persentase inokulum 10 %, bakteriosin memiliki aktivitas

hambat terhadap Escherchia coli, Salmonella thypimuruim dan Listeria

monocytogenes. Bakteriosin yang dihasilkan bakteri SCG 1223 memiliki

aktivitas hambat terhadap ketiga bakteri indokator yang digunakan dengan

aktivitas tertinggi terhadap E. coli 1085,81 AU/ml pada perlakuan pH awal

media 6, suhu inkubasi 40ºC dan waktu inkubasi 14 jam. Aktivitas tertinggi

terhadap Salmonella thypimurium adalah 816,40 AU/ml dicapai pada

perlakuan pH awal media 6, suhu inkubasi 27ºC dan waktu inkubasi 14 jam.

Aktivitas tertinggi pada Listeria monocytogenes adalah sebesar 1178,13

AU/ml yang di dapat pada perlakuan pH awal media 6, suhu inkubasi 40ºC

dan waktu inkubasi 14 jam.

B. SARAN

Dari hasil penelitian ini hal-hal yang perlu disarankan adalah :

1. Perlunya dikaji lebih dalam mengenai pengaruh aerasi dan agitasi yang

dapat mempengaruhi kestabilan aktivitas dari bakteriosin.

2. Perlunya dikaji metode pemurnian atau ekstraksi bakteriosin dengan

memperhatikan stabilitas bakteriosin.

DAFTAR PUSTAKA

Ahn C., M.E. Stiles dan T.R. Klaenhammer. 1990. Genetic organization of Lactacin F Operon and Expression of the bacteriocin in other lactic acid bakteria. Environmental. J Diary

Bhunia, A.K., M.C. Jhonson dan B. Ray. 1988. Direct Detection of an Antimicrobial Peptide of Pediococcus acidilactici in Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis. J Indust Microbial 2: 319-322.

Bintang, M. 1995. Studi Antimikroba dari Streptococcus Lactis [disertasi]. Bandung : Institut Teknologi Bandung.

Bower, C.K., Mc Guire dan M.A. Daechel. 1995. Supression of Listeria monocytogenes Colonization Following Adsorbtion of lisin into Silica Surface. Appl Environ Microbiol 61(3): 992-997.

Boe, Joe Young. 1996. Evaliation of optimum Production for Bacteriocin from Lactobacillus sp JB 42 Isolation from Kimichi. J Microbiol Biotech 6: 63-67.

Bruno, M.E., A. Kaise dan T.J.Montville. 1992. Depletion of Proton Motive Force by Nisin in Listeria monocytogenes cell. Appl Environ Microbiol 58: 2255-2259.

Caldera-olivera, F., Caron, G. R., dan A. Brandelli. 2003. Bacteriocins Production by Bacillus licheniformis P40 in Cheese Whey Using response Surface Methodology. Boichemical Engineering Journal (21):53-58.

Cleveland, J., Montville, T., Nes, I. F., dan M.L. Chikindas. 2001. Bacteriocins : Safe Natural Antimikrobial For Food Preservation. International Journal of Food microbial & (2001): 1-20.

Corner, D.E., R.E. Brackett dan L.R. Beuchat. 1986. Effect of Temperature, Sodium Clorida and pH on Growth of Listeria monocytogen in Cabbage Juice. Appl Environ Microbiol 52: 59-63.

Davey, G.P. dan B.C. Richardson. 1981. Purification and some Proerties of Diplococcin from Streptococcus cremoris 346. Appl Environ Microbiol 41: 84-89.

Davidson, P.M. dan A.L. Braner. 1983. Antimicrobials in Food. 2nd Ed. New York, Marcel Dekker Inc.

Daeschel, A.M. 1989. Antimicrobial Substance From Lactic Acid Bacteria For Use as Food Preservatives. J Food Technology 43(1) : 164-169.

Deegan, L.H., D.C. Paul, H. Colin, dan R. Paul. 2005. Bacteriocins : Bioligical Tools for Biopreservatios and Shelf-life extension. International diary Journal.

Dick, L.M.T. 1994. Biotechnology in feed Industry. England, Farnham Royal Bucks.

Domiv, S., Ivanova, P. dan N. Harizanova,. 2005. Genetics of bacteriocins Biosynthesis by Lactic Acid Bacteria. General and Applied Geneticd, Biotechnol.

Drider, D., Fimland, G., Hechard, Y., McMullen, dan H. Prevost,. 2006. The continuing Story of Class IIa Bacteriosins. Microbiology and molecilar Biology Reviews : 562-582.

Duerden, B.I., I.M.S. Reid, dan J.M. Jewsburg. 1993. Microbial and Parasitic Infection. Butler and Tanner Limited, Frome, Somerser, Great Britain.

Elliker, P.R. 1945. Effect of Varios Bacteria of Diacetil Content and Flavour of Butter, In Ray B and M Deaschel ads Food Biopreservatives of Microbial Origin. CRC Press. Tokyo.

Engelkel, G., Z. Gutowski-Eckel, P. Kiesau, K. Siegers, M. Hammelmannl dan K.D. Entian. 1992. Biosynthesis of the Antibiotic Nisin, Genomic Organization and Membrane Localozation of the Nis B Protein. Appl Environ Microbiol 58: 3730-3734.

Ennahar S, D. Aoude-werner, D. Sorokine, A. Van Dorsselaer, F. Bringel, J.C. Hubert dan C. Hesselmen. 1996. Production of Pediocin AcH by Lactobacillus plantarum WHE 92. Appl. Environ Microbiol 62:4381-4387.

Faber, J.M. dan P.I. Peterkin. 1991. Listeria monocytogen, a Food Borne Pathogen. Appl Environ Microbiol 55: 476-511.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Jakata, Gramedia.

Gonzales, B.E., E. Glaasker, E.R.S. Kunji, A.J.M. Driessen, J.E. Suarez dan W.N. K. Onings. 1996. Bactericidal mode of Action of Plantaricin S. Appl Environ Microbiol 62 : 2701-2709.

Hadioetomo, R.S. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.

Herald, P.J. dan E.A. Zottola. 1988. Attachment of Listeria monocytogen to Stainless Stell Surface at Various Temperature and pH Values. J Food Sci 53: 1549-1552.

Hurst, A. 1981. Nisin. Appl Microbiol. 27: 85-123.

Jack, R.W., J.R. Tagg dan B. Ray. 1995. Bacteriocin of Gram Positive Bacteria. Appl Environ microbial 59: 171-200.

Jimenez Diaz, R. 1993. Plantaricin S and two New Bacteriocins Produced by Lactobacillus plantarum LPC010 Isolated From a Green Olive Fermentation. Appl Environ Microbiol 59: 1416-1429.

Jonson, M.C., R. Yang dan B. Ray. 1992. Novel methods to Extract Large Amounts of Bacteriocins Lactic acid Bacteria. Apllied and Environmental Microbiology 58:3355-3359.

Klaenhammer, T.R. 1988. Bacteriocin of Lactic Acid Bacteria. Biochenie 70: 337-349.

Kuoila, R..K. dan B. Rangganatan. 1987. Ultra violet Ligh Induced Mutants of Sertococcus lactis subsp Diacetyl lactis wahite Enhance acid or Flavour Producing Abilities. Journal Diary Science 61:379.

Le Chevallier, M.W., C.C. Cawthon dan R.G. Lee. 1998. Inactivation of Biofilm Bacteria. Appl Environ Microbiol 54: 2492-2499.

Lucy, H., Deegan, D. Paul, Cotter, H. Colin dan R. Paul. 2005. Bacteriocins : Biological tools for bio-preservation and shelf-life extensions.. International dairy journal

Martirani, L., M. Varcamonti, G. Naclerio dan M. De Velice. 2002. Purification an Partial Characterization of Bacillocin 490, a Novel Bacteriocin Produced by a Thermophilic Strain of Bacillus licheniformis. Biomed Central: 1-5.

Mitsuoka. 1990. Intestinal Bacteria and Health. Tokyo, HBJ Japan.

Navaro, L., M. Zaraxaga, J. Saenz, F. Ruiz-Larrea Dan C. Torres. 2000. Bacteriocin Production by Lactic Acid Bacteria Isolated From Rioja Red Wines. Journal of Applied Microbiology 88:44-51.

Nurhasanah. 2004. Produksi Bakteriosin Pada Berbagai Tingkat Aerasi dan Uji Kestabilan Bakteriosin Dari Bakteri Asam Laktat Galur M6-15.

Piard, J.C., C. Delmore, M. Desmazheud dan G. Novel. 1993. Conjugal transfer of determinats for bacteriocin (lactacin 481) production imunity in Lactococcus lactis subsp. Lactis CNRZ 481 FEMS. Mocrobiol Letl. 122:313-318.

Ray, B. dan R.A. Field. 1992. Antibacterial Effectiveness of a Pediocin AcH Based Biopreservatif Against Spoilage and Pathogenic Bacteria from Vacum Packaged Refrigerated meat. Proceedings: 38 th International Congress of meat Science and Technology: August 23-28, 1992, Clermont Ferrand, France 4: 31-734.

Ray, B. 1996. Fundamental Food microbiology. Tokyo. CRS Press p:8-29.

Salvadogo, A. 2006. Bacteriocins and Lactic Acid Bacteria-a miniriview. African Journal of Biotechnology 5(9):678-683.

Samelis, J., S. Roller dan J. Metaxopoulus. 1994. Sakacin B, a Bacteriocin produce by Lactobacillus sake isolated from greek dry formaterd sausage. Journal Appl Bacteriol. 76:475-486.

Schnell, N., K.D. Entian, U. Schneider, F. Gots, H. Zahner, R. kellner dan G. Jung. 1998. Prepeptida Sequence of Epidermin, a Ribosomally Synthesized Antibiotic with four Sulphide-ring. Nature London. 333:276-278.

Sutherland, P. S dan Porritt, R.D. 1997. Listeria monocytogenes. Food Born microorganisms of Public health. 5st edition. AIFST

Tagg, J.R., A.S. Dajani, dan L.W. Wannamaker. 1976. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria. Bacteriology Reviews, 40: 722-756.

Tahara, T., M. Oshimura, C. Umezawa dan K. Kanatani. 1996. Isolation, Partial Characterization and Mode of Action of Acidocin J1132, a two-component Bacteriocin Produce by Lactobacillus acidophilus JCM 1132. Applied and Environmental Microbiology 62:892-897.

Venema, K., T. Abee, A.J. Haandrikman, K.J. Leenhout, J. Kok, W.N. Koningsand dan G Venema. 1993. Mode of Action of Lactococcin B, a Thoil Activated Bacteriocin from Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 59: 1041-1048.

Wiryawan, K. G dan Tjakradidjaja, A. S. 2001. Produksi Biopreservatives atau Feed Suplement (bakteriosin) Dari Bakteri Asam Laktat. Laporan akhir hasil penelitian. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor.

Lampiran 1. Diagram alir peremajaan inokulum

K u ltu r a w a l (a g a r m ir in g )

In o k u la s i 1 o s e d a la m 1 0 m l M R S

b ro th

In o k u la s i 1 m l d a la m 1 0 m l M R S

b ro th

In k u b a s i 3 7 o C 2 4 -4 8 ja m

In o k u la s i 1 m l d a la m 1 0 m l M R S

b ro th

In k u b a s i 3 7 o C 2 4 -4 8 ja m

In o k u lu m a k t i f

Lampiran 2. Diagram alir pembuatan kurva pertumbuhan

Lampiran 3. Diagram alir uji daya hambat

Lampiran 4. Hasil pengamatan Kurva pertumbuhan

Jam %T OD pH TPC 0 84.5 0.073 5.78 5.20E+05 1 80.3 0.095 5.80 3.20E+06 2 74.5 0.128 5.77 4.15E+06 3 66.5 0.177 5.60 4.20E+07 4 31.9 0.496 5.28 5.10E+07 5 9.3 1.032 4.82 5.15E+07 6 2.1 1.678 4.46 5.35E+09 7 1.0 2.000 4.33 3.25E+10 8 0.8 2.097 4.25 3.10E+11 9 0.6 2.222 4.20 1.24E+12 10 0.4 2.398 4.20 2.15E+12 11 0.4 2.398 4.21 1.89E+12 12 0.4 2.398 4.19 2.63E+12 13 0.4 2.398 4.17 1.30E+12 14 0.4 2.398 4.18 4.20E+11 15 0.4 2.398 4.16 5.00E+09 16 0.4 2.398 4.13 5.30E+09 17 0.4 2.398 4.10 5.00E+08 18 0.4 2.398 4.10 3.20E+09 19 0.4 2.398 4.11 2.10E+08 20 0.4 2.398 4.08 1.59E+08

Grafik penurunan pH pada pertumbuhan Bakteri SCG 1223

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Jam

pH

Lampiran 5. Hasil pengamatan pada perlakuan supernatant yang tidak dinetralkan

Kode run OD pH Aktivitas hambat (AU/ml) E.coli S. thypimurium L. monocytogenes.

1 0.910 3.93 816.40 816.40 816.40 2 1.854 4.61 816.40 1271.70 392.50 3 0.983 3.89 816.40 816.40 816.40 4 1.921 4.46 1758.40 3587.29 816.40 5 1.337 3.64 392.50 816.40 392.50 6 1.921 4.05 1559.95 2492.53 1758.40 7 1.678 3.54 994.75 1559.95 1178.13 8 2.000 3.99 1859.51 1758.40 2276.50 9 1.979 3.85 816.40 1758.40 4019.20

10 2.523 4.17 1271.70 5338.00 816.40 11 1.754 3.88 1758.40 1758.40 1758.40 12 2.398 4.10 2826.00 1758.40 1758.40 13 0.851 3.90 729.11 1758.40 816.40 14 2.000 4.24 729.11 1559.95 643.07 15 1.018 3.90 904.95 2602.43 994.75 16 1.958 3.98 1758.40 2276.50 1758.40 17 1.568 3.61 1271.70 1085.81 643.07 18 2.096 3.87 1085.81 1758.40 1559.95 19 1.959 3.72 474.77 1178.13 994.75 20 2.221 3.88 1178.13 1462.61 816.40 21 2.000 3.72 1085.81 1961.87 1559.95 22 2.523 3.75 1178.13 4145.43 2826.00 23 1.698 3.95 643.07 1758.40 816.40 24 2.398 4.07 2826.00 1961.87 2170.37

Lampiran 6. Hasil pengamatan pada perlakuan supernatant yang dinetralkan

Aktivitas hambat (AU/ml) Kode run E.coli Salmonella

t. Listeria

m. 1 0.00 0.00 0.00 2 0.00 0.00 0.00 3 0.00 0.00 0.00 4 0.00 0.00 0.00 5 0.00 0.00 0.00 6 0.00 0.00 0.00 7 0.00 0.00 0.00 8 0.00 0.00 0.00 9 0.00 0.00 0.00 10 0.00 0.00 0.00 11 0.00 0.00 0.00 12 0.00 0.00 0.00 13 311.49 392.50 643.07 14 392.50 643.07 474.77 15 643.07 392.50 816.40 16 772.60 474.77 643.07 17 392.50 558.29 433.48 18 904.95 643.07 643.07 19 474.77 516.37 351.84 20 311.49 816.40 392.50 21 474.77 392.50 729.11 22 392.50 433.48 558.29 23 474.77 311.49 558.29 24 1085.81 311.49 1178.13

Lampiran 7. Gambar-gambar penelitian

Isolat BAL SCG 1223 Hail peremajaan

Supernatant hasil penyaringan dengan milipore

Kultur hasil inkubasi selama produksi antibakteri

Daya hambat pada uji aktifitas Terhadap S. thypimurium

Daya hambat pada uji aktifitas terhadap E. coli

Daya hambat pada uji aktifitas terhadap L. monocytogenes

Laminar Air Flow

Gambar bakteri indikator yang digunakan dalam uji aktivitas

Autoclaf Inkubator shaker yang digunakan

Spektrofotometer