KROMATOGRAFI KERTAS

I. TUJUAN PERCOBAAN

Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari pemisahan senyawa sampel asam

amino menggunakan teknik kromatografi kertas dan menentukan jenis asam amino

yang terkandung dalam larutan sampel. Selain itu, praktikum ini juga bertujuan untuk

mempelajari cara pengukuran kadar air dan fungsinya.

II. DASAR TEORI

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan senyawa terlarut dalam

senyawa pelarut. Teknik kromatografi berkembang pada tahun 1903 dan telah

digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang berwarna. Sedangakan

kromatografi kertas sendiri dikembangkan oleh Consden, Gordon dan Martin pada

tahun 1941 (Plummer, 1978). Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan

dua fase yaitu fase diam (stationary) dan fase bergerak (mobile). Pemisahan suatu

senyawa tergantung pada gerakan relatif dari dua fase tersebut. Cara-cara

kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fase diam dan fase

bergerak yang dapat berupa zat padat atau zat cair (Sastrohamidjojo, 2002).

Berdasar fase diam dan fase bergeraknya teknik kromatografi dapat dibedakan

menjadi 4 jenis yaitu:

1. Kromatografi serapan, yaitu apabila fase bergeraknya zat cair dan fase

diamnya zat padat. Ada 2 macam kromatografi serapan yakni kromatografi

lapis tipis dan kromatografi penukar ion.

2. Kromatografi gas-padat, yaitu apabila fase bergeraknya gas dan fase

diamnya zat padat.

3. Kromatografi gas-cair, yaitu apabila fase bergeraknya berupa gas dan fase

diamnya adalah zat cair.

4. Kromatografi partisi, yaitu apabila fase bergeraknya zat cair dan fase

diamnya juga zat cair. Salah satu nacam kromatografi partisi yakni

kromatografi kertas.

(Conn and Stumpf, 1976)

Kromatografi kertas termasuk kromatografi partisi dimana fase bergerak

maupun fase diamnya berupa zat cair. Setetes dari larutan cuplikan yang mengandung

campuran yang akan dipisahkan diteteskan pada sepotong kertas saring dan kemudian

senyawa tersebut akan meluas membentuk noda membulat. Bila noda telah kering,

kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang berisi pelarut sebagai fase ferak.

Pelarut bergerak melalui serat-serat kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan

komponen-komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam aliran

pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauh atau

setelah waktu yang ditentukan, maka kertas diambil dari bejana dan kedudukan

permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-

senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagi pita-pita atau noda-noda yang

terpisah. Jika senyawa-senyawa tak berwarna maka harus dideteksi dengan cara fisika

atau secara kimia yakni dengan menggunakan pereaksi atau juga dengan deteksi

menggunakan sinar ultraviolet atau teknik radiokimia (Sastrohamidjojo, 2002).

Prinsip kerja kromatografi kertas uaitu pemiasahan senyawa-senyawa solute

atau zat terlarut di dalam 2005 atau lebih solvent (pelarut) yang berlainan dengan

menggunakan kertas sebagai medium penyangganya. Kemudian berdasarkan macam

perambatan fase bergeraknya, kromatografi kertas dapat dibedakan menjadi 3 macam

yaitu:

1. Ascending chromatography, yang solventnya merambat ke arah atas

2. Descending chromatography, yang solventnya merambat ke arah bawah

3. Circulair chromatography, yang solventnya bergerak melingkar atau

mendatar

(Heasley et al. 1997)

Metode yang digunakan untuk identifikasi suatu senyawa menggunakan teknik

kromatografi kertas adalah penghitungan Rf. Rf atau racing factor merupakan

perbandingan antara jarak yang ditempuh oleh senyawa yang diidentifikasi dengan

jarak yang ditempuh oleh pelarut (solvent). Pada tiap-tiap senyawa mempunyai nilai

Rf yamg berbeda-beda dan hal inilah yang dijadikan dasar pengidentifikasian suatu

senyawa (Plummer, 1978).

Dalam melakukan teknik kromatografi kertas perlu diperhatikan beberapa hal

antara lain:

1. metode yang digunakan (penaikan, penurunan, atau mendatar)

2. macam kertas

3. pemilihan dan pembuatan pelarut (solvent)

4. penempatan cuplikan

5. metode deteksi dan identifikasi

(Plummer, 1978)

Macam kertas yang digunakan dalam teknik kromatografi kertas adalah kertas

khusus, yaitu kertas yang banyak mengandung selulosa. Berdasarkan sifat selulosa

yang mempunyai daya serap tinggi terhadap suatu larutan, maka kertas berbahan

selulosa sangat cocok digunakan dalam pelaksanaan teknik kromatografi kertas ini.

Kebanyakan kertas yang digunakan dalam teknik kromatogrfai kertas adalah kertas

Whatmann. (Sasrohamidjojo,2002)

Kemudian penggunaan pelarut haruslah disesuaiakan dengan senyawa yang

akan dipisahakn, untuk senyawa polar maka dibutuhkan pula pelarut yang bersifat

polar. Hal ini sesuai hukum like dissolve like, dimana dua senyawa yang mempumyai

kepolaran yang sama akan saling tarik menarik (Heasley et al. 1997). Beberapa

pelarut atau solvent yang digunakan dalam teknik kromatografi kertas antara lain:

Tabel 1. Pelarut-pelarut dalam teknik kromatografi kertas

Pemisahan Pelarut PerbandinganAsam-asam amino

Fenol, airn-buthanol, as. cuka, airn-buthanol, as. cuka, airn-buthanol, pirimidin, air

Larutan jenuh4 : 1 : 512 : 3 : 51 : 1 : 1

Karbohidrat (gula)

Etil asetat, pirimidin, airEtil asetat, n-PrOH, airEtil asetat, as.cuka, air

2 : 1 : 26 : 1 : 33 : 1 : 3

Asam-asam lemak

n-buthanol, 1,5 M NH3 Larutan jenuh

Fe, Cl, Br, I, (garam Na)

Pirimidin, air 9 : 1

Hg, Pb, Cd, Cu, Bi

n-buthanol, 3 M HCl Laruatan jenuh

(Sastrohamidjojo, 2002)

Penggunaan pelarut untuk senyawa-senyawa organik dipilih senyawa-senyawa

bersifat polar agar lebih mudah larut dalam air daripada dalam zat-zat cair organik.

Dalam pemisahan asam-asam amino sasngat baik digunakan campuran berupa n-

buthanol, asam cuka dan air. Pelarut n-buthanol sebenarnya bukan merupakan pelarut

asam amino, akan tetapi bila dijenuhkan dengan air maka akan menjadi pelarut asam

amino yang baik. Penambahan asam cuka dan pemberian lebih banyak air akan

menjadikan kenaikan kelarutan asam-asam amino sehingga lebih mudah untuk

berpisah (Sastrohamidjojo, 2002)

Beberapa kelebihan menggunakan teknik kromatografi kertas dalam usaha

pemisahan sekaligus pengidentifikasian suatu senyawa adalah pertama merupakan

metode pemisahan yang cepat dan mudah serta menggunakan peralatan yang mudah

dan sederhana. Kedua, hanya membutuhkan campuran cuplikan yang sangat sedikit

dan justru tidak menggunakan dalam jumlah yasng besar, dan ketiga pekerjaan dapat

diulang-ulang. Keuntungan lainnya adalah dengan menggunakan teknik kromatografi

kertas dalam menentukan suatu senyawa dapat digunakan berbagai cara antara lain

dengan penentuan Rf dimana spesifik untuk suatu senyawa (Kalthoff and Sandel,

1952).

Dalam menganalisis kandungan kimia suatu sampel berupa bahan segar, perlu

dilakukan pengukuran kadar air. Pengukuran kadar iar dilakukan dengan

mengeringkan bahan segar atau bahan setengah kering dalam oven, sampai

didapatkan berat konstan. Penghitungan persentase kadar air sesuai rumus berikut:

Berat segar – berat kering x 100 %

Berat segar

III. METODE

A. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini antar lain: petridish glass,

jangka, pipet kapiler, hairdryer, botol penymprot, benang katun, oven, pinset,

penggaris, gunting serta pensil. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan dalam

percobaan ini yaitu larutan solute yang berupa campuran asam-asam amino, larutan

solvent: n-buthanol, asam asetat, dan air dengan perbandingan 4 : 1 : 1, 6 asam amino

standar (histidin, alanin, leusis, metionin, arginin,tirosin), kertas Whatmann no.1 dan

regen Ninhydrin.

B. Cara Kerja

Kertas Whatmann digunting sebesar tutup petridish, lalu dibuat lingkaran

berjari-jari 1 cm dari titik tengah kertas menggunakan jangka. Kertas Whatmann

dibagi menjadi 8 bagian yang sama besar denagn menggarisnya menggunakan pensil.

Pada tiap pertemaun anatara lingkaran 1 cm dan garis yang membagi kertas dibuat

lingkara-lingkaran kecil serta diberi nomor secara urut. Pada tengah kertas dilubangi

dan dimasukkan benang katun lalu diikat pada salah satu ujungnya agar tidak lolos

dari kertas Whatmann, benang disisakan sepanjang 4-5 cm.

Di tiap-tiap lingkaran kecil ditetesi dengan menggunakan pipet kapiler 6 macam

sampel asam amino dan 2 larutan sampel. Penempatan larutan-larutan tersebut yakni:

1. sampel

2. asam amino metionin

3. asam amino histidin

4. asam amino tiroksin

5. sampel

6. asam amino alanin

7. asam amino arginin

8. asam amino leusin

Larutan sampel yang diletakkan pada lingkaran nomor 1 dan 5 merupakan larutan

yang jenisnya sama dan dilakukan dengan tujuan sebagi ulangan.

Setelah itu kertas Whatmann dimasukkan pada tutup petridish dan kemudian

tutup tersebut dipasang pada petridish yang telah diisi dengan larutan solvent kurang

lebih 10 ml sehingga ujung benang tercelup ke dalam solvent. Dibiarkan selama 45

menit, kemudian tutup diangkat, batas daerah resapan solvent ditandai dan setelah itu

dikeringkan dalam oven selama 3 menit pada suhu 105 ºC. Setelah kering kertas

Whatmann disemprot dengan reagen Ninhydrin dan dikeringkan kembali dalam oven

kurang lebih selam 3 menit. Noda-noda berwarna ungu akan tampak kemudian diukur

jarak masing-masing bagian tengah jarak tengah rambatan (berwarna ungu) baik

larutan sampel maupun larotan asam amino standar. Kemudian dihitung nilai Rf-nya

dan dibandingkan antar larutan-larutan tersebut unruk menentukan asam amino apa

saja yang menjadi komponen larutan sampel.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, didapatkan Rf untuk masing-

masing larutan baik larutan sampel maupun asam amino standar sebagi berikut:

Tabel 2. Rf larutan sampel dan asam amino standar

No. Larutan Rf1. Sampel

Rf 1Rf 2Rf 3

0,090,300,78

2. Metionin 0,373. Histidin 0,194. Tiroksin 0,565. Sampel

Rf 1Rf 2Rf 3

0100,300,55

6. Alanin 0,307. Arginin 0,158. Leusin 0,65

Kemudian dapat dicari rata-rata Rf tiap sampel sebagai berikut:

Rf 1 = 0,09 + 0,10 = 0,095 (Arginin = 0,10)

2

Rf 2 = 0,30 + 0,30 = 0,30 (Alanin = 0,30)

2

Rf 3 = 0,78 + 0,55 = 0,66 (Leusin = 0,66)

2

Pada percobaan pengukuran kadar air, didapatkan hasil seperti berikut:

Tabe 3. Hasil pengukuran kadar air

No Berat kering Botol (g) Berat awal

(g)

45’ pertama (g) 45’ kedua (g) 45’ ketiga (g)

1. Sampel 1 13,99 2,65 1,97 1,18 0,77

2. Sampel 2 24,82 1,79 1,31 0,61 0,39

Kadar air sampel 1 = 2,65 – 0,77 x 100 % = 70,9 %

2,65

Kadar air sampel 2 = 1,79 – 0,39 x 100 % = 78,2 %

1,79

B. Pembahasan

Nilai Rf merupakan nilai perbandingan antara jarak yang ditempuh oleh solute

(zat terlarut) dengan jarak yang ditempuh solvent (pelarut).

Jarak yang ditempuh solute

Rf = ------------------------------------

Jarak yang ditempuh solvent

Kertas yang digunakan dalam percobaan ini adalah kertas Whatmann no. 1

karena merupakan kertas yang banyak mengandung selulosa (96 %), dan sangat

efektif sebagai media perambatan asam amino yang mempunyai berat molekul (BM)

cukup besar sehingga asam amino tersebut dapat merambat dengan baik. Kertas

Whatmann termasuk media penyangga suatu larutan dengan kecepatan perambatan

sedang serta mempunyai ketebalan yang tipis, hal ini akan mempermudah

pengamatan walaupun jumlah asam amino yang diteteskan sangat sedikit.

Prinsip perambatan pada kertas adalah gaya kapiler dari kertas yaitu pada

poro-porinya yang besar sehingga molekul terutama yang dalam wujud cair dapat

melewatinya. Fungsi kertas dalam pemisahan terutama mempunyai pengaruh pada

kecepata aliran pelarut. Efek-efek serapan disebabkan oleh sifat polar dari gugus-

gugus hidroksil dan sejumlah gugus karboksil dari selulosa akan dapat menaikkan

efek-efek pertukaran ion.

Kemudian selama perlakuan dengan kertas Whatmann, diusahakan agar tidak

ada kontak langsung antara kulit dengan kertas atau kertas terlipat. Hal ini agar tidak

terjadi penempelan asam amino atau senyawa lain yang berasal dari tubuh kita, misal

dari pengeluaran keringat sehingga menyebabkan kontaminasi pada kertas.

Dalam percobaan ini menggunakan solvent yaitu campuran n-buthanol ,air,

dan asam asetat dengan perbandingan 4:1:1. Yang menjadi fase diam atau stationary

adalah air. Sedang yang menjadi fase gerak atau mobile adalah n-buthanol. Fungsi

dari penyemprotan Nynhidrin (indanatrioan hidrat) adalah sebagai pereaksi

yangdigunakan untuk mendeteksi asam-asam amino. Pada suhu kamar pereaksi ini

baru memberikan warna pada asam amino kira-kira setelah 24 jam. Namun, pada

pemanasan pada suhu 100 ºC warna akan timbul kira-kira setelah 4 menit saja.

Inadanatrion hidrat + asam amino kompleks warna ungu

Ada beberapa faktor yang deapat mempengaruhi jarak tempuh suatu senyawa

pada teknik kromatografi kertas ini, yaitu:

1. Pelarut

Karena pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil

dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan jarak tempuh suatu

larutan.

2. Ukuran dari bejana

Volume bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer, jadi mempengaruhi

kecepatan penguapan komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar

digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, lalu akan merubah koefisien

partisi.

3. Suhu

Perubahan pada suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.

4. Kertas yang digunakan

Pengaruh utama kertas pada harga jarak tempuh larutan timbul dari perubahan ion

dan serapan yang berbeda untuk setiap kertas. Selain mempengaruhi kecepatan

aliran, jenis kertas juga akan memprngaruhi keseimbangan partisi.

5. Sifat dari campuran

Berbagai senyawa mwngalami diantara volume yang sama dari fase tetap dan fase

bergerak akan mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap yang lain

dan akhirnya mempengaruhi jauh dekat jarak yang ditempuhnya.

Pada percobaan ini timbul 3 noda pada masing-masing sampel. Sehingga

untuk masing-masing sampel dapat diketahui 3 jenis asam amino penyusunnya.

Caranya adalah dengan mencari rata-rata nilai Rf kedua sampel tersebut pada ketiga

noda yang terbentuk. Rf 1 sampel menunjukkan angka 0,09 dan 0,10. Jika dirata-rata,

hasilnya Rf 1 adalah sebesar 0,095. Hasil ini mendekati Rf Arginin sebesar 0,10

sehingga dapat dikatakan salah satu asam amino penyusun sampel adalah Arginin. Rf

2 sampel menunjukkan angka 0,30 dan 0,30. Jika dirata-rata, hasilnya Rf 2 adalah

0,30. Hasil ini mendekati Rf Alanin sebesar 0,30 sehingga dapat dikatakan Arginin

merupakan salah satu asam amino penyusun sampel. Rf 3 sampel menunjukkan angka

0,78 dan 0,55. Jika dirata-rata, hasilnya Rf 3 sebesar 0,30. Hasil ini mendekati Rf

Leusin sebesar 0,65 sehingga dapat dikatakan asam amino ketiga yang menyusun

adalah Leusin.

V. KESIMPULAN

Dari percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa asam amino

yang terkandung dalam larutan sampel adalah Arginin, Alanin dan Leusin.

Kromatografi kertas termasuk teknik kromatografi partisi dimana fase geraknya

adalah n-butanol dan fase diamnya air. Prinsip kerja kromatografi kertas yaitu

pemisahan senyawa-senyawa solute di dalam 2 atau lebih pelarut yang berlainan

dengan menggunakan kertas sebagai media penyangganya.

Kandungan air pada sampel 1 dan 2 berturut-turut adalah 70,9 % dan 78,2 %.

Analisis kandungan kimia suatu sampel dilakukan pada bahan segar, sehingga fungsi

pengukuran kadar air adalah untuk mengetahui tingkat kesegaran sampel melalui

persentase kadar airnya.

VI. DAFTAR PUSTAKA

Conn, E.E. and P.K. Stumpf. 1976. Outline of Biochemistry. 4th edition. John Willey and Sons Co., Inc. New York. p.590-595.

Heasley, V.L., V.J. Christensen and G.E. Heasley. 1997. Chemistry and Life in Laboratory. 4th edition. Prentice Hall Co., Inc. USA. P. 56-70.

Kalthoff, I. M. and E. B. Sandel. 1952. Textbook of Quantitative Inorganic Analysis. 3rd Edition. The Mac Millan Co., Inc. New York.p. 654-662.

Plummer, D.T. 1978. An Introduction to Practucal Biochemistry. 2th edit. Mc Graw Hill Book Co., Ltd. New York. p. 70-87.

Sastrohamidjojo, H. 2002. Kromatografi. Edisi kedua. Penerbit Liberty. Yogyakarta. Hal. 1-24.

LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK BIOKIMIAACARA VI

KROMATOGRAFI KERTAS

Disusun oleh : Nama : M.A.Fathoni

NIM : BI/7660Gol/Kel. : I B/ 2Asisten : M. Rica A.

LABORATORIUM BIOKIMIAFAKULTAS BIOLOGI

UNIVERSITAS GADJAH MADAYOGYAKARTA

2007