i

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PROTEOLITIK PADA

PROSES PENGOMPOSAN LIMBAH DOMESTIK

(Skripsi)

Oleh

LUTHFI HIJRIANTO

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2019

ii

ABSTRAK

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PROTEOLITIK PADA

PROSES PENGOMPOSAN LIMBAH DOMESTIK

Oleh

LUTHFI HIJRIANTO

Kompos merupakan salah satu jenis pupuk yang selama proses pembuatannya

dibantu oleh berbagai jenis mikroorganisme dengan mengeluarkan enzim

hidrolitik yang digunakan untuk mengurai material organik sebagai substrat.

Tujuan penelitian ini adalah melakukan isolasi dan identifikasi bakteri proteolitik

pada proses pengomposan limbah domestik. Metode yang digunakan meliputi

isolasi bakteri dari sampel kompos pada beberapa fase pengomposan, uji

proteolitik secara kualitatif, analisis karakter biokimia dan produksi enzim

protease dari isolat terpilih. Hasil menunjukkan bahwa terdapat 13 isolat dengan

indeks proteolitik yang beragam. Hasil pengujian terhadap isolat terpilih dengan

indeks proteolitik dan karakter biokimia yang berbeda, diperoleh 5 isolat untuk

ditentukan kurva pertumbuhan dan aktivitas proteolitik, yaitu isolat PKMA4,

PKMG2, PKTB3, PKTD4 dan PKPG2. Produksi enzim dari 5 isolat terpilih

dilakukan sesuai waktu optimum pertumbuhan masing-masing isolat. Hasil

penentuan aktivitas spesifik isolat terpilih, menunjukkan bahwa aktivitas isolat

PKMA4: 0,1716 U/mg, isolat PKMG2: 0,197 U/mg, isolat PKTB3: 0,333 U/mg,

isolat PKTD4: 0,167 U/mg dan isolat PKPG2: 0,207 U/mg.

Kata kunci: Bakteri proteolitik, Kompos, Limbah domestik, Protease.

iii

ABSTRACT

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF PROTEOLYTIC

BACTERIA ON DOMESTIC WASTE COMPOSTING PROCESSES

By

LUTHFI HIJRIANTO

Compost is a kind of fertilizer which is produced by synergism of various

degradation microorganisms, that produces hydrolytic enzymes to degrade the

organic material as a substrate. The purpose of this study are to isolate and

characterize some proteolytic bacteria that live in the domestic waste in

composting process. We observed number of colonies in each steps of

composting, and also type of cultived colonies, further more examined some of

biochemical properties and screened for proteolytic using clear zone method. We

obtained 13 isolates which showed proteolytic activity and screened them into 5

isolates namely PKMA4, PKMG2, PKTB3, PKTD4 and PKPG2 isolates. The

enzyme production from 5 selected isolates was carried out according to the

optimum growth time of each isolate. Based on the result, their protease specific

activites are PKMA4: 0.1716 U/mg, PKMG2: 0.197 U/mg, PKTB3: 0.333 U/mg,

PKTD4: 0.167 U/mg and PKPG2: 0.207 U/mg.

Keywords: Compost, Domestic waste, Protease, Proteolytic bacteria.

i

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PROTEOLITIK PADA

PROSES PENGOMPOSAN LIMBAH DOMESTIK

Oleh

LUTHFI HIJRIANTO

(Skripsi)

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar

SARJANA SAINS

Pada

Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2019

ii

iii

iv

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Pringsewu pada tanggal 13 Juni 1996,

sebagai anak ke dua dari empat bersaudara, putra dari

pasangan Bapak Muladi dan Ibu Muryanti, S.Pd. Penulis

menyelesaikan pendidikan pertama di TK Dharma Wanita

Kagungan Ratu pada tahun 2002, kemudian melanjutkan

pendidikan ke SD Negeri 1 Kagungan Ratu dan lulus pada tahun 2008. Penulis

kemudian melanjutkan pendidikan di MTs Al-Ikhlas Kagungan Ratu dan lulus

pada tahun 2011. Penulis kemudian melanjutkan pendidikan di SMAN 1

Tumijajar dan lulus pada tahun 2014.

Penulis diterima sebagai mahasiswa Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung

pada tahun 2014 melalui jalur Seleksi Bersama Masuk Perguruan Tinggi Negeri

(SBMPTN). Penulis telah menyelesaikan praktik kerja lapangan pada tahun 2017

dengan judul Uji Cemaran Mikrobia pada Obat Tradisional di Balai Besar

Pengawas Obat dan Makanan Bandar Lampung, yang dilaksanakan di Balai Besar

Pengawas Obat dan Makanan Bandar Lampung. Penulis melaksanakan kegiatan

KKN PPM Pembuatan Kompos dari Limbah Pasar Sidomulyo, di desa Sidomulyo

kecamatan Sidomulyo kabupaten Lampung Selatan pada bulan Juli – Agustus

2016. Selama menjadi mahasiswa, penulis menjadi asisten praktikum Biokimia

v

jurusan Biologi tahun 2018. Penulis tedaftar sebagai Kader Muda Himaki

(KAMI) periode kepengurusan 2014/2015. Penulis selanjutnya aktif sebagai

anggota bidang Sains dan Penalaran Ilmu Kimia (SPIK) Himpunan Mahasiswa

Kimia (HIMAKI) periode kepengurusan 2015/2016 dan periode kepengurusan

2016/2017.

vi

MOTTO

Jika semua yang kita lakukan adalah hanya untuk mengejar ridho-

Nya, tugas kita telah selesai. Karena hasil dari yang kita usahakan

akan dijamin oleh-Nya hingga di kehidupan selanjutnya.

Cobalah berhenti mengeluhkan dan mengkhawatirkan sesuatu yang

belum bisa kita raih, karena apa yang sudah kita lakukan beserta

hasilnya terlalu berharga bila hanya dianggap hal yang berlalu,

bersyukur atas kemampuan kita adalah jalan untuk bersyukur akan

apa yang kita raih selanjutnya.

vii

Dengan mengucap Alhamdulillahirabbil’alamin atas Rahmat dan Kemurahan-Nya

Kupersembahkan Karya Sederhanaku ini

Teruntuk

Bapak dan Ibuku tercinta Yang selalu memperjuangkanku tanpa mengenal lelah, dan

dengan sabar selalu mendo’akan serta mendukungku

Seluruh keluarga besarku yang selalu mendo’akan keberhasilanku

Teman-temanku yang selalu berbagi semangat

dan kebahagian bersama-sama

Guru-guru sekolahku dan seluruh Dosen Jurusan Kimia yang telah membimbing dan membagikan ilmu selama

perkuliahan yang tak ternilai

dan Almamater Tercinta Universitas Lampung

viii

SANWACANA

Alhamdulillahirabbil’alamin, segala puji dan syukur kepada Allah SWT yang

selalu memberikan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan

penyusunan skripsi yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Bakteri Proteolitik

pada Proses Pengomposan Limbah Domestik” sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar sarjana Sains pada Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam. Sholawat serta salam selalu tersanjungakan kepada

Nabiullah Muhammad SAW, yang sangat dinantikan syafaatnya di yaumil akhir

kelak, amin Allahumma amin.

Dengan kerendahan hati, penulis menyadari tidak akan pernah mampu

menyelesaikan tugas akhir ini tanpa ada orang lain di sekitarnya yang turut

membantu sedemikian bentuknya. Oleh karena itu, dengan teriring do’a yang

tulus penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Kedua orang tuaku yang tercinta “Bapak Muladi dan Ibu Muryanti, S.Pd.”,

yang tidak pernah berhenti memperjuangkanku, mendo’akanku,

membimbingku, menasehatiku, mendukungku, dan semua usaha tanpa

lelahmu untukku. Semoga Allah SWT selalu menunggu kehadiran kedua

orang tuaku di janah-Nya tanpa ada penghalang lain kecuali kematian. Amin

ya robbal’alamin.

ix

2. Saudara dan saudariku Mas Irfan, Rahayu, dan Alinda, yang selalu menjadi

penyemangat, mendo’akan, dan memotivasi untuk meraih keberhasilanku.

Semoga Allah SWT selalu memberikan kesahatan dan kebahagian kepada

kalian, serta selalu diberikan rahmat-Nya.

3. Ibu Dr. Nurhasanah, M.Si. selaku pembimbing 1 penelitian saya yang selalu

sabar dan teliti dalam membimbing, mengajar dengan sabar di perkuliahan,

dan memfasilitasi keperluan peneleitian baik dalam bentuk peralatan, bahan

dan pengetahuan sehingga dapat melancarkan terselesaikannya tugas akhir

yang saya kerjakan. Semoga Allah SWT membalas segala kebaikkan beliau,

dan selalu memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.

4. Bapak Dr. Eng. Heri Satria, M.Si. selaku pembimbing 2 penelitian saya yang

dengan sabar dan teliti dalam membimbing, mengajar dengan sabar dan

semangat di perkuliahan, serta selalu memberikan memberikan koreksi dan

solusi yang membangun sehingga dapat melancarkan tugas akhir yang saya

kerjakan. Semoga Allah SWT membalas segala kebaikkan beliau, dan selalu

memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.

5. Ibu Dr. Rinawati, M.Si. selaku pembahas penelitian saya yang selalu sabar dan

teliti dalam mengoreksi dan membimbing, mengajar dengan sabar di

perkuliahan, serta memberikan saran dan solusi sehingga dapat melancarkan

tugas akhir yang saya kerjakan. Semoga Allah SWT membalas segala

kebaikkan beliau, dan selalu memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.

6. Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T. selaku pembimbing akademik

yang dengan sabar membimbing dan memberikan solusi dari awal menjadi

mahasiswa baru hingga terselesaikannya tugas akhir yang saya kerjakan, serta

x

mengajar di perkuliahan dengan sabar dan memberikan motivasi yang sangat

membangun. Semoga Allah SWT membalas segala kebaikkan beliau, dan

selalu memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.

7. Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Kimia FMIPA Unila, yang telah membagikan

ilmu pengetahuan, waktu, pengalaman dan motivasi selama masa perkuliahan.

Semoga Allah SWT membalas segala kebaikkan beliau, dan selalu

memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.

8. Seluruh civitas akademik Jurusan Kimia FMIPA Unila, yang senantiasa

membantu dan membagikan pengalaman serta solusi selama masa

perkuliahan. Semoga Allah SWT membalas segala kebaikkan beliau, dan

selalu memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.

9. Teruntuk partner all the time Dessy Tiara Elvia Nita Sari, S.Si., yang selalu

berbagi kebahagiaan, tawa, solusi, waktu, bantuan dalam bentuk apapun,

cerita dan semua penyelesaian masalah yang sudah dilewati. Semoga Allah

SWT selalu memberikan kesehatan, kebahagiaan dan kebaikan yang telah

dilakukan dapat kembali kepadamu, cita-cita yang sangat diimpikan, serta

tetap terjalin silaturahim hingga di kemudian hari.

10. Teruntuk kance-kanceku, M. Ilham Haqqiqi, S.Si., Teguh Wijaya Hakim,

S.Si., Dellania Frida Yulita, S.Si., Dessy Tiara Elvia Nita Sari, S.Si., Riri

Auliya, S.Si., Windi Antika, S.Si. dan Yunita Damayanti, S.Si., terimakasih

atas segala canda tawa, kebahagiaan, cerita dan pengalaman yang telah

dibagikan. Semoga kalian selalu diberikan kesehatan dan dapat menggapai

cita-cita kalian.

xi

11. Seluruh teman-teman nge-lab-ing yang telah berbagi pengalaman,

pengetahuan, waktu, solusi, canda tawa, cerita dan juga jajanan yang selalu

ada menjadi teman ngelab. Semoga Semoga kalian selalu diberikan kesehatan

dan dapat menggapai cita-cita kalian.

12. Seluruh teman-teman kimia’14, kalian keluarga yang telah memulai semua

nya di perkuliahan ini, dan semoga ini dapat terus berlanjut, dan kalian dapat

meraih semua yang telah kalian usahakan.

13. Seluruh kakak-kakak di Jurusan Kimia, terima kasih telah berbagi

pengalaman, ilmu, cerita, canda tawa, saran, nasehat, motivasi dan semuanya

yang telah dibagikan dengan ikhlas. Semoga kakak-kakak semua selalu diberi

kesehatan dan dapat meraih semua yang dicita-citakan.

Akhir kata, penulis memohon maaf atas segala kekurangan dan kesalahan apabila

karya penulis ini masih jauh dari sempurna, semoga karya penulis dapat

bermanfaat sebagaimana mestinya, Amiin.

Bandar Lampung, 01 Februari 2019

Penulis,

Luthfi Hijrianto

i

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ........................................................................................................... i

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ iii

DAFTAR TABEL ................................................................................................. v

I. PENDAHULUAN .......................................................................................... 1

A. Latar Belakang ............................................................................................ 1

B. Tujuan Penelitian ......................................................................................... 4

C. Manfaat Penelitian ....................................................................................... 4

II. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................. 5

A. Limbah ........................................................................................................ 5

B. Pengolahan Limbah Domestik .................................................................... 8

C. Bakteri Proteolitik ..................................................................................... 10

D. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme .......................................................... 11

E. Uji Biokimia .............................................................................................. 12

F. Enzim Protease .......................................................................................... 16

G. Spektrofotometer UV-Vis ......................................................................... 19

III. METODE PENELITIAN ............................................................................ 23

A. Waktu dan Tempat .................................................................................... 23

B. Alat dan Bahan .......................................................................................... 23

1. Alat ..................................................................................................... 23

2. Bahan .................................................................................................. 23

C. Prosedur Kerja ........................................................................................... 24

1. Tahap Persiapan ................................................................................. 24

2. Pembuatan Kompos............................................................................ 25

3. Pengambilan Sampel .......................................................................... 26

4. Homogenisasi Sampel ........................................................................ 26

5. Isolasi Bakteri dari Sampel Kompos .................................................. 26

6. Skrining Bakteri Proteolitik ............................................................... 27

7. Seleksi Isolat Bakteri Proteolitik ........................................................ 27

ii

8. Karakterisasi Biokimia Isolat Bakteri Proteolitik .............................. 27

9. Pembuatan Starter Isolat Bakteri Proteolitik ...................................... 29

10.Uji Tingkat Kekeruhan/Optical Density (OD) ................................... 29

11.Uji Aktivitas Proteolitik Isolat Bakteri secara Kuantitatif ................. 29

12.Produksi Enzim Protease ................................................................... 30

13.Uji Aktivitas Unit Enzim Protease ..................................................... 31

14.Uji Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik ........................................... 32

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................... 33

A. Kompos dari Limbah Domestik ................................................................ 33

B. Bakteri dari Sampel Kompos .................................................................... 34

C. Isolat Bakteri dengan Potensi Proteolitik .................................................. 35

D. Karakter Biokimia Isolat Bakteri Proteolitik Terpilih ............................... 38

E. Tingkat Kekeruhan/Optical Density (OD) Isolat Terpilih ........................ 40

F. Aktivitas Kuantitatif Isolat Proteolitik Terpilih ........................................ 42

G. Enzim Protease Isolat Bakteri dari Kompos ............................................. 44

V. SIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 46

A. Simpulan .................................................................................................... 46

B. Saran .......................................................................................................... 47

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 48

LAMPIRAN ......................................................................................................... 53

iii

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Limbah organik ................................................................................................... 6

2. Limbah anorganik ............................................................................................... 6

3. Proses pengomposan ........................................................................................... 9

4. Skema kerja spektrofotometer UV-Vis ............................................................. 20

5. Kompos limbah domestik ................................................................................. 33

6. Hasil isolasi bakteri ........................................................................................... 34

7. Isolat dengan potensi proteolitik ....................................................................... 36

8. Kurva pertumbuhan bakteri............................................................................... 41

9. Kurva aktivitas proteolitik................................................................................. 43

10. Hasil isolasi metode streak plate fase mesofilik awal .................................... 54

11. Hasil isolasi metode streak plate fase termofilik ............................................ 54

12. Hasil isolasi metode streak plate fase pematangan ......................................... 55

13. Isolat bakteri dengan potensi proteolitik fase mesofilik awal ......................... 56

14. Isolat bakteri dengan potensi proteolitik fase termofilik ................................ 56

15. Isolat bakteri dengan potensi proteolitik fase pematangan ............................. 57

16. Hasil uji Gram fase mesofilik awal ................................................................. 58

17. Hasil uji Gram fase termofilik......................................................................... 58

18. Hasil uji Gram fase pematangan ..................................................................... 59

iv

19. Hasil uji endospora fase mesofilik awal.......................................................... 59

20. Hasil uji endospora fase termofilik ................................................................. 60

21. Hasil uji endospora fase pematangan .............................................................. 60

22. Kurva standar BSA ......................................................................................... 71

v

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Spektrum tampak dan warna komplementernya ............................................... 22

2. Bakteri dari sampel kompos .............................................................................. 35

3. Indeks proteolitik isolat bakteri dari kompos .................................................... 36

4. Karakter biokimia isolat bakteri proteolitik terpilih.......................................... 39

5. Nilai optical density (OD) ................................................................................. 40

6. Nilai aktivitas proteolitik secara kuantitatif ...................................................... 42

7. Nilai aktivitas unit enzim protease isolat bakteri dari kompos ......................... 44

8. Kadar protein dan aktivitas spesifik .................................................................. 45

9. Nilai absorbansi optical density ........................................................................ 63

10. Nilai absorbansi aktivitas proteolitik secara kuantitatif .................................. 66

11. Absorbansi aktivitas unit enzim protease ........................................................ 70

12. Absorbansi aktivitas spesifik enzim protease ................................................. 72

1

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Limbah atau sampah di beberapa negara berkembang seperti Indonesia, menjadi

masalah yang cukup serius dihadapi oleh pemerintah dan juga masyarakat. Selain

menimbulkan kondisi yang tidak nyaman, limbah juga mempengaruhi faktor

kebersihan dan kesehatan lingkungan. Terlebih lagi di daerah perkotaan yang

mayoritas jumlah penduduknya lebih besar daripada daerah pedesaan,

permasalahan mengenai limbah juga menjadi lebih besar. Pasca tahun baru 2018

total jumlah sampah di kota Bandar Lampung meningkat hingga 700 – 800 ton

yang meliputi sampah organik, kertas, plastik, kayu, logam, kaca, karet, kain, dan

lain-lain (Tribun Lampung, 2018).

Limbah dibedakan menjadi beberapa jenis berdasarkan sumbernya, yaitu limbah

industri, limbah pertambangan, limbah pertanian, limbah medis dan limbah

domestik. Penelitian ini difokuskan pada masalah mengenai limbah domestik,

yang merupakan limbah yang berasal dari aktivitas manusia sehari-hari seperti

dari aktivitas makan, minum, memasak, belanja dan lain-lain. Pemilihan limbah

domestik sebagai bahan pembuatan kompos dalam penelitian ini, selain karena

efek buruk yang ditimbulkan terhadap lingkungan, juga sumber limbahnya yang

terus ada setiap harinya dan kurangnya pemanfaatan limbah domestik secara

2

optimal dan produktif. Sehingga potensi ketersediaan bahan yang digunakan

untuk pembuatan kompos cukup menjanjikan (Sudarwanto, 2010).

Sebagian besar masyarakat menggunakan limbah domestik seperti sisa-sisa

makanan untuk pakan ternak secara langsung. Tetapi hal tersebut belum optimal

untuk menanggulangi masalah limbah domestik karena hanya sebatas limbah sisa-

sisa makanan, sehingga perlu dilakukan penanganan yang lebih optimal. Menurut

Sumampouw (2017), terdapat beberapa macam penanganan yang dapat dilakukan

untuk menanggulangi masalah limbah domestik, yaitu pembuangan secara teratur

dan pada tempat yang disediakan, melakukan daur ulang, pembakaran,

pemisahan, pembusukan dan juga pengomposan.

Pengomposan merupakan proses penguraian atau degradasi molekul-molekul

organik oleh berbagai jenis bakteri seperti bakteri lipolitik, selulolitik, amilolitik,

proteolitik (Karina dkk., 2014), serta berbagai macam fungi. Selama

pengomposan berbagai mikroorganisme yang terdapat pada kompos akan

mengeluarkan enzim hidrolitik yang digunakan untuk mendekomposisi limbah

domestik sebagai substratnya.

Enzim yang dapat dihasilkan dari mikroorganisme pada proses pengomposan

yaitu meliputi alkaline phosphatase, acid phosphatase, phosphohydrolase, lipase,

esterase-lipase esterase, leucine aminopeptidase, cystine aminopeptidase,

chymotrypsin, dan trypsin (Jain et al, 1998), serta b-galactosidase, b-glucosidase,

N-acetyl-b-glucosaminidase, a-glucosidase, a-galactosidase, b-glucuronidase,

dan a-fucosidase (Beffa et al., 1995).

3

Menurut Beffa et al (1995), mikroorganisme yang terdapat pada proses

pengomposan yaitu meliputi bakteri, actinomycetes, yeasts, dan fungi. Bakteri

yang terdapat pada proses pengomposan yaitu meliputi Pseudomonas putida,

Pseudomonas sp., Nitrosospira briensis, Salmonella sp., Streptomyces rectus,

Thermonospora curvata, Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Actinobifida

chromogena, Pseudonocardia thermophila, dan lain-lain. Adapun fungi yang

terdapat pada proses pengomposan yaitu meliputi Mortierella turficola, Mucor

miehei, Rhizomucor pusillus, Aporothielavia leptoderma, Armillaria mellea,

Coprinus sp., Lanzites sp., Aspergillus fumigatus, Thermomyces lanuginosus,

Paecilomyces sp., dan lain-lain (Insam and Bertoldi, 2007).

Penelitian ini difokuskan pada kelompok bakteri yang memiliki aktivitas

proteolitik. Proteolitik adalah aktivitas yang dihasilkan oleh mikroorganisme

untuk mengekskresikan enzim protease keluar sel. Protease merupakan jenis

enzim yang mengkatalisis pemecahan protein menjadi senyawa yang lebih

sederhana. Saat ini penggunaan enzim protease sudah mencapai hingga skala

industri. Pada industri pangan, enzim protease digunakan dalam pengolahan roti,

biskuit, susu, pematangan keju dan pengempukan daging. Selain itu, enzim

protease juga digunakan dalam beberapa industri seperti industri deterjen, produk-

produk kulit, farmasi dan juga pengolahan limbah industri tersebut (Singh et al.,

2016). Enzim protease juga dapat digunakan dalam proses bioremediasi.

Beberapa enzim lain seperti lipase, amilase, urease, dan selulase juga diketahui

dapat mendegradasi bahan organik (BOD dan COD), sehingga dapat

dimanfaatkan dalam proses bioremediasi (Priadie, 2012). Enzim protease dapat

diisolasi dari berbagai organisme seperti bakteri, hewan, tumbuhan dan jamur.

4

Isolasi dari mikroorganisme seperti bakteri merupakan yang paling sering

dilakukan karena lebih efektif dan efisien, yaitu dengan pertumbuhannya yang

cepat, skala produksi sel yang besar dan waktu produksi yang lebih cepat (Karina

dkk., 2014). Berdasarkan uraian di atas, penelitian ini dilakukan untuk

mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri proteolitik pada proses pengomposan

limbah domestik, serta mengetahui aktivitas enzim protease yang dihasilkan.

B. Tujuan Penelitian

Adapun tujuan dari dilakukannya penelitian ini antara lain sebagai berikut:

1. Mengisolasi bakteri proteolitik dari proses pengomposan limbah domestik.

2. Mengidentifikasi bakteri proteolitik yang diperoleh dari proses pengomposan

limbah domestik.

3. Mengetahui aktivitas enzim protease dari bakteri proteolitik yang diisolasi dari

proses pengomposan limbah domestik.

C. Manfaat Penelitian

Adapun manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat diperoleh bakteri proteolitik

dari kompos yang dapat menghasilkan enzim protease dengan aktivitas yang

relatif lebih baik, sehingga dapat digunakan pada berbagai macam aplikasi seperti

bioremediasi limbah. Penelitian ini juga diharapkan dapat menjadi rujukan

informasi mengenai bakteri proteolitik khususnya yang diisolasi dari proses

pengomposan limbah domestik.

5

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Limbah

Limbah merupakan suatu zat sisa atau buangan dari pengolahan atau proses

produksi yang tidak terpakai, baik dalam skala rumah tangga maupun skala

industri, yang dapat berupa padatan, cairan maupun gas (Doraja dkk., 2012).

Pada umumnya limbah hanya akan menjadi sampah yang dibuang begitu saja

sehingga diperlukan perlakuan khusus untuk menghadapi masalah limbah, supaya

tidak terjadi penumpukan setiap harinya. Pada skala industri yang besar, limbah

akan lebih sulit untuk ditangani terlebih lagi bila limbah tersebut mengandung

senyawa kimia yang berbahaya bagi lingkungan.

Berdasarkan materi penyusunnya, limbah dibedakan menjadi 2 yaitu limbah

organik dan limbah anorganik. Limbah organik merupakan limbah yang

mengandung unsur karbon, seperti buangan makhluk hidup (meliputi kotoran

manusia dan hewan), sisa-sisa makanan (meliputi sayur-sayuran, daging dan

sebagainya), kertas, kardus, karton, minyak goreng bekas dan lain-lain (Hasibuan,

2016) seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Pada umumnya, limbah organik

dapat membusuk atau terdegradasi oleh mikroorganisme. Hal tersebut mendorong

terbentuknya berbagai macam pengolahan limbah dengan melibatkan kemampuan

degradasi suatu mikroorganisme (Doraja dkk., 2012).

6

Gambar 1. Limbah organik (Badan Litbang Pertanian, 2011)

Adapun limbah anorganik, berdasarkan pengertian kimiawi adalah limbah yang

tidak mengandung unsur karbon. Seperti logam, kaca, plastik, sisa pupuk

anorganik dan lain-lain seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2. Limbah

anorganik juga didefinisikan sebagai limbah yang tidak dapat terdegradasi secara

alami oleh mikroorganisme. Limbah organik seperti karet mengandung unsur

karbon dengan bentuk rantai yang panjang dan kompleks, sehingga sulit

terdegradasi secara alami oleh mikroorganisme (Hasibuan, 2016).

Gambar 2. Limbah anorganik (Hasibuan, 2016)

7

Limbah dibedakan menjadi beberapa jenis berdasarkan sumbernya, yaitu meliputi

limbah industri, limbah pertambangan, limbah pertanian, limbah medis dan

limbah domestik. Limbah industri merupakan limbah yang dihasilkan dari hasil

samping pada proses pengolahan dalam suatu industri. Misalnya zat warna dari

industri tekstil, limbah cair industri tahu, limbah industri alkohol dan lain-lain

(Widayatno dan Sriyani, 2008). Limbah industri hampir sama dengan limbah

pertambangan, akan tetapi limbah industri mengacu pada pembuatan atau sintesis

sedangkan limbah pertambangan mengacu pada hasil samping industri pada

pertambangan. Misalnya industri batubara, limbah pertambangan minyak, emas,

timah dan lain-lain (Nugeraha dkk., 2010)

Limbah pertanian merupakan limbah yang dihasilkan dari proses pertanian seperti

limbah kulit buah, jerami dan limbah pupuk anorganik yang mengandung nitrat,

amonium, sulfur dan lain-lain (Rusydi dkk., 2015). Adapun limbah medis

merupakan limbah yang dihasilkan dari kegiatan medis, rumah sakit dan

sejenisnya, dapat berupa padatan atau cairan seperti sisa bahan kimia, obat-obatan,

kantong infus, alat suntik dan sebagainya (Pratiwi dan Maharani, 2013).

Limbah domestik merupakan limbah yang dihasilkan dari kegiatan atau aktivitas

manusia sehari-hari, misalnya kegiatan memasak, belanja, membakar sampah dan

lain-lain. Contoh dari limbah domestik meliputi air cucian, limbah toilet, bungkus

kemasan, minyak bekas, sisa makanan, sisa sayuran, sisa daging, sisa penjualan

ikan, sisa buah-buahan dan lain sebagainya. Sampah pada daerah perkotaan

hanya 40% yang diangkut menuju tempat pembuangan akhir (TPA), dengan

penanganan yang minim dapat menyebabkan penumpukan sampah secara besar

8

yang menjadi sumber penyakit yang membahayakan manusia maupun lingkungan

sekitar (Sudarwanto, 2010).

B. Pengolahan Limbah Domestik

Solusi untuk menanggulangi masalah limbah domestik, terdapat beberapa cara

yang dilakukan, diantaranya pembuangan secara teratur dan pada tempat yang

disediakan, melakukan daur ulang, pembakaran, pemisahan, pembusukkan dan

juga pengomposan. Penanganan limbah domestik dengan cara pengomposan

merupakan hal yang sangat penting karena selain dapat mengurangi dampak

penumpukan limbah dan perusakan lingkungan, juga dapat menghasilkan produk

yang memiliki nilai jual (Sumampouw, 2017).

Pengomposan adalah proses penguraian material-material organik dengan bantuan

mikroorganisme sebagai agen pendegradasi. Produk pengomposan adalah

kompos yang digunakan sebagai pupuk alami (organik) yang dapat menghasilkan

humus yang berfungsi untuk memperbaiki struktur tanah, sehingga tanah menjadi

lebih subur. Misalnya dapat digunakan pada tanaman hias, tanaman buah,

maupun padi. Secara spesifik, fungsi dari kinerja kompos yaitu untuk

meningkatkan kesuburan tanah seperti pada lahan yang baru dibuka yang biasanya

mengalami penurunan kesuburan, sehingga lahan baru tersebut dapat segera untuk

digunakan (Sulistyorini, 2005). Prinsip pengomposan didasarkan pada penurunan

C/N rasio bahan organik menjadi sama dengan C/N rasio tanah. C/N rasio adalah

hasil perbandingan antara karbohidrat dan nitrogen yang terkandung di dalam

suatu bahan. Nilai C/N rasio tanah adalah pada kisaran 10 – 12. Bahan organik

9

yang memiliki C/N rasio sama dengan tanah, memungkinkan bahan tersebut dapat

diserap oleh tanaman atau bahkan lebih cepat diserap (Widiyaningrum dan

Lisdiana, 2015).

Gambar 3. Proses pengomposan (Badan Litbang Pertanian, 2011)

Terdapat tiga tahap pada proses pengomposan yang ideal, tahap pertama yaitu

tahap penghangatan (fase mesofilik awal). Mikroorganisme mesofilik hidup pada

temperatur 25 – 45 ºC, pada fase ini ukuran partikel bahan organik akan diperkecil

sehingga luas permukaan bahan bertambah sehingga mempercepat proses

pengomposan. Tahap kedua yaitu fase termofilik, mikroorganisme termofilik

hidup pada temperatur 45 – 100 ºC. Pada fase ini molekul karbohidrat dan protein

akan dipecah sehingga bahan kompos dapat terdegradasi dengan cepat.

Mikroorganisme pada fase ini berupa Actinomycetes dan jamur termofilik,

sebagian dari Actinomycetes mampu merombak selulosa dan hemiselulosa.

Kemudian proses dekomposisi mulai melambat dan temperatur puncak dicapai.

Selanjutnya tahap ketiga yaitu tahap pendinginan dan pematangan (fase mesofilik

akhir). Pada tahap ini, jumlah mikroorganisme termofilik berkurang karena bahan

10

makanan bagi mikroorganisme ini juga berkurang, hal ini menyebabkan

mikroorganisme mesofilik mulai beraktivitas kembali. Mikroorganisme mesofilik

tersebut akan merombak selulosa dan hemiselulosa yang tersisa dari proses

sebelumnya menjadi gula yang lebih sederhana, tetapi kemampuannya tidak

sebaik mikroorganisme termofilik (Olaniyi and Ojetayo, 2011).

C. Bakteri Proteolitik

Bakteri proteolitik merupakan bakteri yang mampu memproduksi enzim protease

secara ekstraseluler. Enzim tersebut merupakan enzim yang dapat mendegradasi

protein yang diproduksi di dalam sel dan dilepaskan keluar sel. Bakteri pada

proses pengomposan yang mempunyai aktivitas proteolitik umumnya adalah

bakteri dari genus Proteus, Bacillus, Pseudomonas dan Staphylococcus

(Puspitasari dkk., 2012). Tingkat aktivitas proteolitik secara kualitatif dapat

diidentifikasi melalui pengamatan pertumbuhannya pada media padat yang

mengandung kasein. Besar aktivitas proteolitik ditunjukan dengan semakin

lebarnya zona bening yang terbentuk di sekitar koloni yang tumbuh pada media

tersebut. Hasil perombakan polimer protein ditunjukan dengan terbentuknya zona

bening yang menandakan protein dalam media padat tersebut telah dirombak

menjadi senyawa peptida dan asam amino (Saidah, 2014).

Penelitian yang dilakukan oleh Wahjuningrum dkk (2009) mengenai bakteri

proteolitik, diisolasi dari bagian eksternal ikan nila. Hasilnya menunjukkan

bahwa dari bagian kulit ikan nila diperoleh isolat bakteri dengan indeks proteolitik

paling besar yaitu 3,33, dan dari bagian insang diperoleh diperoleh isolat bakteri

11

dengan indeks proteolitik paling besar yaitu 4,25. Berdasarkan karakter

morfologi, fisiologi dan biokimia, isolat bakteri proteolitik yang diperoleh pada

penelitian oleh Wahjuningrum dkk (2009) merupakan bakteri yang terdiri dari

genus Staphylococcus sp., Necromonas sp. dan Enterobacter sp. Penelitian yang

dilakukan oleh Rizaldi dkk (2018) juga mengidentifikasi bakteri proteolitik, tetapi

berbeda sumber yaitu diisolasi dari tumbuhan lamun. Hasil pada penelitian

Rizaldi dkk (2018) menunjukkan bahwa bakteri proteolitik yang diperoleh terdiri

dari beberapa genus yaitu meliputi Staphylococcus sp., Plesiomonas shigelloides,

Bacillus sp. dan Pseudomonas sp.

D. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme

Setiap bakteri memiliki kemampuan pertumbuhan yang berbeda satu sama lain,

dengan demikian dapat diketahui waktu tertentu yang dapat digunakan untuk

produksi supaya dapat diperoleh hasil yang maksimal. Terdapat empat macam

fase pertumbuhan bakteri yaitu fase lag, fase log (fase eksponensial), fase

stasioner, dan fase kematian:

1. Fase Lambat (lag phase)

Fase lambat mengikuti inokulasi media nutrient, dan dapat merupakan periode

adaptasi. Bila suatu biakan dipindahkan dari suatu lingkungan yang lain,

maka mikroba itu perlu mengorganisasi kembali konstituen mikro dan makro

molekulnya. Selama fase ini massa sel mungkin saja bertambah tanpa diikuti

oleh pertumbuhan jumlah sel (Rahmawati, 2016).

12

2. Fase Eksponensial (log phase)

Fase eksponensial merupakan fase pertumbuhan sel, ini merupakan periode

pertumbuhan yang stabil atau keadaan pertumbuhan yang tenang dan laju

pertumbuhan spesifiknya tetap. Komposisi kimia total cairan fermentasinya

sedang berubah, sebab nutrien-nutrien sedang dikonsumsi mikroba dan

produk-produk metabolit sedang diproduksi.

3. Fase Seimbang (stationary phase)

Fase seimbang ini terjadi bila semua sel telah mencapai kesetimbangan

dengan sel-sel yang mati. Meskipun pertumbuhan bersihnya telah berhenti, di

sana masih mungkin terjadi metabolisme dan mengakumulasikan produk-

produk dalam sel atau cairan fermentasi. Massa total sel mungkin tetap tetapi

jumlah sel yang hidup mungkin menurun.

4. Fase Kematian

Jumlah sel yang mati telah meningkat dan lebih banyak dari jumlah sel yang

hidup, faktor penyebabnya adalah ketidaktersediaan nutrisi dan akumulasi

produk buangan yang bersifat toksik (Pratiwi dan Maharani, 2013).

E. Uji Biokimia

Terdapat beberapa macam uji biokimia yang digunakan dalam karakterisasi suatu

bakteri, diantaranya yaitu meliputi:

1. Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram merupakan salah satu karakterisasi yang sangat umum

digunakan untuk mengidentifikasi suatu bakteri. Metode pewarnaan Gram

13

dilakukan berdasarkan perbedaan ketebalan peptidoglikan yang terdapat pada

dinding sel dan banyaknya lemak pada membran sel. Bakteri dengan

peptidoglikan yang tebal dikategorikan sebagai bakteri Gram positif,

sedangkan bakteri dengan peptidoglikan yang tipis dikategorikan sebagai

bakteri Gram negatif. Dinding sel bakteri Gram positif terdiri dari membran

sitoplasma, lapisan polimer peptidoglikan dengan jumlah besar yang

dihubungkan oleh rantai asam amino dan lapisan luar yang disebut kapsul.

Bakteri Gram negatif memiliki membran luar bilayer, lapisan peptidoglikan

yang tipis dan membran plasma bilayer (Kurjogi and Kaliwal, 2018).

2. Uji Katalase

Uji katalase bertujuan untuk mengetahui sifat bakteri dalam kemampuannya

untuk menghasilkan enzim katalase. Pengujian dilakukan dengan

menggunakan larutan H2O2 yang disuspensikan pada koloni bakteri (Yusuf

dkk., 2009).

3. Uji Indol

Tujuan dari uji indol adalah untuk mengetahui kandungan enzim triptofanase

pada bakteri, yang merupakan enzim yang mengkatalisis penguraian gugus

indol pada asam amino triptofan. Uji indol dilakukan menggunakan air

pepton sebagai media dan reagen Kovac.

4. Uji Sitrat

Tujuan dari uji sitrat adalah untuk mengidentifikasi kemampuan bakteri dalam

menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Media

14

yang digunakan pada uji sitrat yaitu media Simmon’s Citrate, dengan hasil

positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna media menjadi biru.

5. Uji Molalitas

Tujuan dari uji molalitas adalah untuk mengetahui kemampuan gerak aktif

ataupun gerak Brown dari bakteri. Media yang digunakan yaitu media NA

dengan jumlah 1/10 lebih sedikit, dengan uji positif yang ditunjukkan dengan

pertumbuhan yang menyebar di sekitar tusukan (Rahmawati, 2016).

6. Uji Methyl Red (MR)

Tujuan dari uji MR adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

memfermentasi metilen glikon. Media yang digunakan adalah media glukosa

fosfat dan ditambah metil merah. Uji positif ditunjukkan dengan adanya

perubahan warna media menjadi merah.

7. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

Tujuan dari uji TSIA adalah untuk membedakan jenis bakteri berdasarkan

kemampuan bakteri dalam memecahkan dextrosa, sukrosa, laktosa dan

pembebasan sulfida. Selain itu uji TSIA juga berfungsi untuk mengetahui

apakah bakteri tersebut dapat menghasilkan gas H2S atau tidak. Terdapat dua

jenis media yang digunakan dalam uji TSIA, yaitu media slant (miring) dan

media butt (tusuk) (Yusuf dkk., 2009).

8. Uji Urease

Tujuan dari uji urease adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

mengubah urea menjadi amonia. Media yang digunakan yaitu media Urea

15

Base Agar, dengan uji positif yang ditunjukkan dengan adanya perubahan

warna media menjadi merah muda.

9. Uji Amilase

Tujuan dari uji amilase adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

menghidrolisis amilum. Media yang digunakan adalah media Starch Agar,

dengan uji positif yang ditunjukkan dengan adanya zona bening disekitar

koloni.

10. Uji Koagulase

Tujuan dari uji koagulase adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

menggumpalkan fibrin. Uji koagulase dilakukan dengan menggunakan reagen

oksidase, dengan hasil positif yang ditunjukkan dengan aglutinasi atau

penggumpalan (Ulfa dkk., 2016).

11. Uji Oksidase

Tujuan dari uji oksidase adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

menghasilkan enzim oksidase. Uji oksidase dilakukan menggunakan kertas

oksidase, dengan mengamati perubahan warna yang terjadi. Uji positif

ditandai dengan adanya perubahan warna kertas menjadi biru violet.

12. Uji Fermentatif

Tujuan dari uji fermentatif adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri

dalam memfermentasi glukosa. Uji fermentatif dilakukan dengan menutup

tabung media dengan menggunakan parafin, sehingga dapat mendukung

terjadinya fermentasi dengan keadaan kedap udara (Yusuf dkk., 2009).

16

F. Enzim Protease

Enzim protease adalah enzim yang dapat menghidrolisis protein menjadi

senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti peptida dan asam amino.

Berdasarkan cara pemotongan ikatan peptida, enzim protease dibagi menjadi 2

yaitu eksopeptidase dan endopeptidase. Eksopeptidase terdiri dari karboksi-

eksopeptidase yang memotong peptida dari arah gugus karboksil terminal dan

amino-eksopeptidase dari gugus amino terminal, sedangkan endopeptidase

memecah ikatan peptida dari dalam (Naiola dan Widhyastuti, 2002).

Berdasarkan jenis residu asam amino dalam sisi aktifnya, enzim protease dapat

dibedakan menjadi empat golongan yaitu protease serin, protease sulfihidril,

protease karboksil dan protease logam.

1. Protease Serin

Protease serin memiliki residu serin pada gugus aktifnya dan bersifat

endopeptidase. Contoh dari protease serin meliputi tripsin, kimotripsin dan

subtilin.

2. Protease Sulfihidril

Protease sulfihidril memiliki residu sulfihidril pada gugus aktifnya, contohnya

meliputi papain dan bromielin (Cuesta et al., 2015).

3. Protease Karboksil

Protease karboksil memiliki dua gugus karboksil pada gugus aktifnya,

contohnya meliputi pepsin dan renin. Kereaktifan protease karboksil dapat

terhambat dengan adanya p-bromo fenasilbromida.

17

4. Protease Logam

Kereaktifan protease logam dipengaruhi dengan adanya logam dan dapat

dihambat menggunakan EDTA. Contoh dari protease logam yaitu enzim

peptidase (Choliq, 2008).

Enzim protease dan juga enzim lain dapat diisolasi dari tumbuhan, hewan dan

mikroorganisme. Penggunaan tumbuhan sebagai sumber protease sangat terbatas

karena hanya memiliki sedikit lahan tanam dan kondisi pertumbuhan yang sesuai,

serta memerlukan waktu produksi enzim yang cukup lama. Produksi protease dari

hewan juga terbatas karena kurangnya ketersediaan ternak penghasil enzim.

Mikroorganisme merupakan sumber enzim yang memiliki potensi paling besar

dibandingkan tumbuhan dan hewan. Penggunaan mikroorganisme juga lebih

menguntungkan karena pertumbuhannya yang cepat, dapat tumbuh pada substrat

yang ekonomis, lebih mudah ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi

pertumbuhan dan rekayasa genetik (Yuniati dkk., 2015).

Terdapat berbagai jenis bakteri dan kapang yang dilaporkan mampu menghasilkan

enzim protease, yaitu meliputi Bacillus amylolique, B. licheniformis, B. subtilis,

B. cereus, B. polymyxa, B. thermoproteolyticus, Mucor pucillus, M. miehei,

Aspergillus oryzae, A. sojae dan phoenicis. Beberapa diantara mikroorganisme

tersebut telah digunakan dalam skala industri. Kapang Mucor javanicus

merupakan salah satu mikroorganisme yang memiliki daya proteolitik cukup kuat,

sehingga memiliki kapasitas besar untuk dikembangkan sebagai kapang penghasil

enzim protease (Choliq, 2008). Untuk melakukan produksi enzim protease dari

bakteri diperlukan proses pemilihan, isolasi dan identifikasi bakteri unggul, yaitu

18

bakteri proteolitik yang dapat menghasilkan enzim protease dalam jumlah besar

dan aktivitas enzim yang tinggi.

Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi banyaknya pemilihan bakteri

sebagai sumber enzim, yaitu meliputi:

1. Skala produksi mudah ditingkatkan.

2. Kondisi produksi tidak bergantung pada musim dan waktu produksi.

3. Bakteri lebih cepat dan mudah untuk tumbuh.

4. Waktu produksi lebih singkat.

5. Biaya produksi relatif rendah (Soeka dan Sulistiani, 2017).

Kemampuan enzim protease dalam mempercepat reaksi dipengaruhi oleh

beberapa faktor, yang menyebabkan enzim dapat bekerja dengan optimal. Faktor-

faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim yaitu meliputi konsentrasi enzim,

substrat, senyawa inhibitor dan aktivator, pH serta temperatur lingkungan. Pada

temperatur rendah, reaksi enzimatis berlangsung lambat. Kenaikan temperatur

dapat mempercepat reaksi enzimatis, hingga suhu optimum tercapai dan reaksi

enzimatis mencapai maksimum. Kenaikan temperatur yang melebihi temperatur

optimum menyebabkan enzim terdenaturasi dan menurunkan kecepatan reaksi

enzimatis. Sehingga perlu dilakukan kontrol temperatur yang maksimal dengan

memperhatikan temperatur optimum (Noviyanti dkk., 2012). Kecepatan reaksi

enzimatis tersebut biasa disebut dengan aktivitas enzim. Aktivitas enzim

merupakan kecepatan pengurangan substrat ataupun kecepatan pembentukan

produk pada kondisi optimum. Aktivitas enzim secara kualitatif dapat ditentukan

menggunakan suatu reaksi kimia, yaitu dengan substrat yang dikatalisis oleh

19

enzim tersebut dan secara kuantitatif dengan mengukur laju reaksinya. Aktivitas

enzim protease secara kualitatif tidak selalu menjadi dasar yang baik sebagai

indikasi aktivitas enzimnya, sehingga perlu dilakukan uji aktivitas enzim protease

secara kuantitatif (Saidah, 2014).

Aktivitas unit enzim didefinisikan sebagai jumlah unit yang dapat mengubah

sejumlah mikromol substrat permililiter enzim. Adapun aktivitas spesifik adalah

jumlah unit enzim permiligram protein. Aktivitas spesifik merupakan ukuran

kemurnian enzim, nilainya meningkat seiring dengan proses pemurnian suatu

enzim. Nilai aktivitas spesifik mencapai maksimum apabila suatu enzim telah

murni. Sebagai contoh yaitu penelitian yang dilakukan oleh Sudha et al (2018),

yang memproduksi enzim protease dari bakteri Exiguobacterium profundam sp

MM1. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa enzim protease yang dihasilkan

mempunyai aktivitas berkisar antara 0,2 – 1,1 U/mL. Adapun penelitian lain

yang dilakukan oleh Saidah (2014), memproduksi enzim protease dari bakteri

proteolitik yang diisolasi dari sumber air panas Pacet, Mojokerto. Hasil yang

diperoleh menunjukkan bahwa enzim protease yang dihasilkan mempunyai

aktivitas berkisar antara 0,385 – 0,631 U/mL.

G. Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis merupakan instrumen yang digunakan dalam penelitian

ini untuk mengukur aktivitas enzim yang diperoleh, yaitu dengan mengukur

absorbansi blanko dan ekstrak kasar enzim. Spektrofotometri UV-Vis merupakan

teknik analisis spektroskopi menggunakan sumber radiasi elektromagnetik

20

ultraviolet (10 – 380 nm) dan sinar tampak (380 – 780 nm) dengan menggunakan

instrumen spektrofotometer. Spektrofotometer UV-Vis menggunakan energi

elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga banyak

digunakan pada analisis kuantitatif (Mulja dan Suharman, 2009).

Molekul hanya menyerap radiasi elektromagnetik pada panjang gelombang yang

khusus (spesifik untuk molekul tersebut). Absorbansi cahaya ultraviolet (radiasi

berenergi tinggi) mengakibatkan berpindahnya suatu elektron ke orbital yang

lebih tinggi. Radiasi elektromagnetik yang dipancarkan menyerupai partikel yang

disebut foton, energi foton berbanding terbalik dengan panjang gelombang.

Radiasi dengan panjang gelombang lebih pendek mempunyai energi yang lebih

tinggi, sehingga foton dari cahaya ultraviolet mempunyai energi yang lebih tinggi

dibandingkan dengan foton gelombang radio. Skema kerja dari spektrofotometer

UV-Vis dapat dilihat pada Gambar 4 (Fessenden dan Fessenden, 1997).

Gambar 4. Skema kerja spektrofotometer UV-Vis (Kusnanto, 2013)

21

Kelebihan dari serapan ultraviolet yaitu gugus-gugus karakteristik dapat dikenal

dalam molekul-molekul yang sangat kompleks. Serapan dari radiasi UV-Vis,

pada umumnya disebut dengan spektroskopi elektronika. Molekul-molekul yang

mempunyai orbital d yang terisi sebagian akan mengalami absorbsi pada panjang

gelombang UV-Vis. Hal tersebut diakibatkan oleh interaksi ligan dengan orbital d

dari logam. Pada ion bebas orbital d berada pada tingkat energi yang sama.

Interaksi logam dengan ligan menyebabkan terjadinya pembelahan orbital d

(splitting) (Skoog, 2007). Terdapat beberapa istilah yang umum dalam kajian

spektra elektronik, yaitu meliputi:

1. Auksokrom

Auksokrom merupakan gugus jenuh yang bila terikat pada suatu kromofor

akan mempengaruhi panjang gelombang dan intensitas serapan maksimumnya

(misalnya NH2, OH dan Cl).

2. Kromofor

Kromofor merupakan gugus tak jenuh kovalen yang menyebabkan serapan

elektronik (misalnya C=C, C=O dan O=C=O).

3. Pergeseran Batokromik (pergeseran merah)

Pergeseran batokromik merupakan pergeseran serapan ke arah panjang

gelombang yang lebih panjang karena pengaruh substitusi atau pelarut.

4. Pergeseran Hipsokromik (pergeseran biru)

Pergeseran hipsokromik merupakan pergeseran serapan ke arah panjang

gelombang yang lebih pendek akibat pengaruh substitusi atau pelarut.

22

5. Efek Hiperkromik

Efek hiperkromik merupakan suatu kenaikan intensitas serapan pada panjang

gelombang tertentu.

6. Efek Hipokromik

Efek hipokromik merupakan suatu penurunan intensitas serapan pada panjang

gelombang tertentu.

Secara kualitatif, absorbsi cahaya dapat diperoleh dengan pertimbangan absorbsi

cahaya pada daerah tampak. Objek dilihat dengan adanya bantuan cahaya yang

diteruskan dan dipantulkan. Apabila cahaya polikromatis (cahaya putih) yang

berisi seluruh spektrum panjang gelombang melewati medium tertentu, akan

terjadi penyerapan panjang gelombang lain sehingga medium tersebut akan

tampak berwarna. Oleh karena hanya panjang gelombang yang diteruskan yang

sampai ke mata maka panjang gelombang inilah yang menentukan warna dari

medium. Warna ini disebut dengan warna komplementer terhadap warna yang

diabsorbsi. Adapun tabel spektrum tampak dan warna komplementernya dapat

dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Spektrum tampak dan warna komplementernya

Panjang gelombang (nm) Warna yang diserap Warna komplementer

340 - 450 Lembayung Kuning - Hijau

450 - 495 Biru Kuning

495 - 570 Hijau Violet

570 - 590 Kuning Biru

590 - 620 Jingga Kuning - Hijau

620 - 750 Merah Biru - Hijau

(Triyati, 2013).

23

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli sampai Oktober 2018, bertempat di

Laboratorium Biokimia FMIPA Universitas Lampung dan UPT Laboratorium

Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung. Karakterisasi

biokimia dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi cawan petri, jarum ose,

pipet tetes, mikro pipet, tabung reaksi, labu Erlenmeyer, gelas kimia, gelas

ukur, spatula, batang pengaduk, bunsen, rak tabung reaksi, colony counter,

termometer, neraca analitik, Autoclave (model S-90N), inkubator, sentrifuga,

Laminar Air Flow (LAF) (CURMA model 9005 FL), shaker, shaker

incubator, Spektrofotometer UV-Vis (Varian Cary 50 Probe).

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi limbah domestik

berwujud padat (meliputi sisa makanan, sayuran dan lain-lain) sebagai bahan

24

baku pembuatan kompos, aquades, alkohol, kapas berlemak, kain kasa, kertas

saring, kertas pH, media Nutrient Agar (NA), media Skim Milk Agar (SMA),

pepton, yeast extract, dextrose, susu skim, kristal violet, larutan iodin,

safranin, malachite green, buffer fosfat, kasein, Asam Trikloroasetat (TCA),

pereaksi C, pereaksi D, Bovine Serum Albumine (BSA) dan NaCl.

C. Prosedur Kerja

1. Tahap Persiapan

a. Sterilisasi Alat, Bahan dan Media

Sterilisasi dilakukan menggunakan Autoclave (model S-90N) pada suhu

121 °C selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Sterilisasi berfungsi untuk

membersihkan alat, bahan dan media dari mikroorganisme, sehingga tidak

menyebabkan kontaminasi.

b. Pembuatan Larutan Fisiologis

Larutan fisiologis dibuat dengan melarutkan 0,85 g NaCl dalam 100 mL

aquades dan dipanaskan hingga mendidih, kemudian disterilisasi

menggunakan Autoclave pada suhu 121 °C selama 15 menit dengan

tekanan 1 atm. Larutan Fisiologis berfungsi sebagai pelarut yang dapat

mempertahankan kestabilan mikroorganisme dibandingkan dengan pelarut

menggunakan aquades.

c. Pembuatan Media Nutrient Agar

Media ini disiapkan dengan cara melarutkan 2,8 g NA dalam 100 mL

aquades dan dipanaskan hingga mendidih, kemudian disterilisasi

25

menggunakan Autoclave pada suhu 121 °C selama 15 menit dengan

tekanan 1 atm. Media Nutrient Agar digunakan sebagai media umum pada

isolasi bakteri.

d. Pembuatan Media Skim Milk Agar

Media ini disiapkan dengan cara melarutkan 0,5 g pepton, 0,5 g NaCl, 0,2

g yeast extract, 2 g agar, 0,1 g dextrose, 0,5 g kasein dan 2,5 g susu skim

dalam 100 mL aquades (Chu, 2006) dan dipanaskan hingga mendidih,

kemudian disterilisasi menggunakan Autoclave pada suhu 121 °C selama

15 menit dengan tekanan 1 atm. Media SMA digunakan sebagai media

selektif dan juga untuk menentukan aktivitas proteolitik secara kualitatif.

e. Pembuatan Media Cair

Media ini disiapkan dengan cara melarutkan 0,5 g pepton, 0,5 g NaCl, 0,2

g yeast extract, 0,1 g dextrose, 0,5 g kasein dan 2,5 g susu skim dalam

100 mL aquades dan dipanaskan hingga mendidih, kemudian disterilisasi

menggunakan Autoclave pada suhu 121 °C selama 15 menit dengan

tekanan 1 atm. Media cair berfungsi sebagai media produksi enzim dan

media uji tingkat kekeruhan. Komposisi media cair hampir sama dengan

media SMA tetapi tidak ditambahkan agar.

2. Pembuatan Kompos

Pembuatan kompos dilakukan dengan menggunakan limbah domestik

berwujud padat. Limbah domestik dan kompos matang dicampurkan dengan

perbandingan rasio 60:40 dengan penyebaran yang merata, kemudian dicetak

menggunakan kotak dengan ukuran 30×30×50 cm. Campuran diletakkan pada

26

tempat yang terhindar dari sinar matahari langsung, dengan dilakukan

penutupan menggunakan terpal. Campuran harus dipastikan mendapat

sirkulasi udara yang cukup untuk mengatur kelembaban, suhu dan oksigen

pada proses pengomposan dengan dilakukan proses pembalikan secara

berkala.

3. Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel kompos dilakukan pada tiga titik di fase pengomposan,

yaitu mesofilik awal (25 – 45 °C), termofilik (46 – 100 °C) dan mesofilik

akhir/pematangan (25 – 45 °C). Setiap hari dilakukan pengukuran temperatur

untuk mengetahui fase pengomposan. Ketika pengukuran suhu menunjukkan

ketiga fase tersebut, maka pada waktu tersebut dilakukan pengambilan sampel

kompos sebanyak 10 g lalu dicatat suhu dan pHnya.

4. Homogenisasi Sampel

Sampel pada setiap fase ditimbang sebanyak 5 g dan dimasukkan ke dalam

labu Erlenmeyer 250 mL. Kemudian sampel dihomogenkan dengan

penambahan larutan fisiologis hingga larut. Kemudian dishaker selama 15

menit yang bertujuan untuk mengoptimalkan pelepasan mikroba yang masih

terjerat pada sampel. Sampel diencerkan secara bertingkat dari 10-1 – 10-7

dengan menggunakan larutan fisiologis.

5. Isolasi Bakteri dari Sampel Kompos

Sampel dari masing-masing pengenceran dituangkan sebanyak 0,1 mL dengan

metode Spread plate pada media NA dalam cawan petri. Sampel diinkubasi

selama 24 – 48 jam pada suhu inkubasi sesuai dengan suhu pada pengambilan

27

sampel. Kemudian dilakukan penghitungan jumlah koloni yang tumbuh pada

masing-masing pengenceran dengan menggunakan colony counter.

6. Skrining Bakteri Proteolitik

Isolat bakteri dengan koloni terpisah yang tumbuh pada media NA,

diinokulasikan pada media SMA dengan metode tusuk. Kemudian sampel

diinkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu inkubasi sesuai dengan suhu

pengambilan sampel. Indikasi aktivitas bakteri proteolitik ditandai dengan

terbentuknya zona bening (Wahjuningrum dkk., 2009).

7. Seleksi Isolat Bakteri Proteolitik

Koloni murni dari stok pada masing-masing fase pengambilan, diinokulasikan

pada media SMA dengan metode tusuk. selama 24 – 48 jam pada suhu

inkubasi sesuai dengan suhu pengambilan sampel. Zona bening pada koloni

yang tumbuh mengindikasikan adanya aktivitas bakteri proteolitik , dan

dihitung indeks proteolitiknya dengan metode titik. Berikut ini adalah rumus

untuk menghitung indeks proteolitik (IP):

IP = diameter zona bening

diameter koloni

Isolat bakteri dengan indeks proteolitik paling tinggi kemudian dilanjutkan ke

tahap karakterisasi (Karina dkk., 2014).

8. Karakterisasi Biokimia Isolat Bakteri Proteolitik

Terdapat beberapa uji karakterisasi isolat bakteri proteolitik yang dilakukan,

diantaranya yaitu:

28

a. Pengamatan Morfologi

Pengamatan morfologi isolat bakteri proteolitik dilakukan dengan

mengacu pada buku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology edisi

ke-9, yaitu meliputi bentuk koloni, elevasi koloni dan tepi koloni.

b. Pewarnaan Gram

Proses pewarnaan Gram dilakukan menggunakan lempeng kaca sebagai

lempeng objek. Lempeng kaca dibilas dengan alkohol dan dilewatkan di

atas api bunsen hingga bersih. Sebanyak 2 tetes larutan fisiologis

diteteskan pada permukaan lempeng kaca menggunakan jarum ose steril.

Sebanyak 1 ose isolat bakteri proteolitik diambil dan disuspensikan secara

aseptik pada larutan fisiologis pada lempeng kaca, kemudian dikeringkan

dan dipanaskan sedikit di atas api bunsen. Larutan kristal violet diteteskan

pada isolat bakteri secara merata, dibiarkan selama 1 menit, dibilas dengan

aquades dan dianginkan hingga kering. Selanjutnya larutan iodin

diteteskan pada isolat bakteri secara merata, dibiarkan selama 1 menit,

dibilas menggunakan aquades dan dianginkan hingga kering. Alkohol

95% diteteskan pada isolat bakteri secara merata, dibiarkan selama 1

menit, dibilas menggunakan aquades dan dianginkan hingga kering.

Safranin diteteskan pada isolat bakteri secara merata, dibiarkan selama 1

menit, dibilas menggunakan aquades dan dianginkan hingga kering.

Kemudian diamati menggunakan mikroskop (Safrida dkk., 2012).

29

c. Pewarnaan Endospora

Pewarnaan endospora dilakukan dengan mengambil isolat bakteri

proteolitik sebanyak 1 ose dan diletakkan pada lempeng kaca. Sebanyak 1

– 3 tetes malachite green ditambahkan secara merata, didiamkan selama

15 menit, dibilas dengan aquades, ditambahkan 1 – 3 tetes safranin dan

didiamkan selama 1 menit. Kemudian dilakukan pengamatan

menggunakan mikroskop.

9. Pembuatan Starter Isolat Bakteri Proteolitik

Isolat bakteri proteolitik diinokulasikan sebanyak 1 ose ke dalam 10 mL

media kultur cair, kemudian diinkubasi pada shaker incubator dengan

kecepatan 120 rpm selama 24 jam pada suhu inkubasi sesuai dengan suhu

pengambilan sampel.

10. Uji Tingkat Kekeruhan/Optical Density (OD)

Uji tingkat kekeruhan bertujuan untuk menentukan kurva pertumbuhan bakteri

dari masing-masing isolat. Starter isolat bakteri proteolitik diinokulasikan

sebanyak 2 % dalam 100 mL media cair, kemudian diinkubasi pada shaker

incubator dengan kecepatan 120 rpm selama 72 jam pada suhu inkubasi sesuai

dengan suhu pengambilan sampel. Inokulum bakteri diambil sebanyak 2 mL

pada 0, 12, 24, 36, 48, 60 dan 72 jam. Sampel diukur absorbansinya

menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 600 nm.

11. Uji Aktivitas Proteolitik Isolat Bakteri secara Kuantitatif

Inokulum bakteri yang diambil sebanyak 2 mL pada uji kekeruhan juga diukur

aktivitas proteolitiknya. Inokulum disentrifugasi dengan kecepatan 10.000

30

rpm selama 15 menit. Filtrat diambil sebanyak 0,5 mL dan ditambahkan 0,5

mL buffer fosfat pH 7, kemudian didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit

ditambahkan substrat (2 % kasein dalam buffer fosfat pH 7) sebanyak 0,5 mL

dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 °C. Reaksi dihentikan dengan

menambahkan 1 mL larutan TCA, kemudian diaduk dan didiamkan selama 30

menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15

menit dan dipisahkan filtratnya. Kemudian filtrat diukur absorbansinya

menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 580 nm.

Kontrol dibuat dengan menambahkan larutan TCA pada larutan enzim

sebelum substrat ditambahkan. Aktivitas Unit (AU) enzim dihitung dengan

rumus:

AU = Asp − Abl

Ak − Abl × P ×

1

T

Keterangan:

AU = Aktivitas Unit (U/mL)

Asp = Absorbansi Sampel

Ak = Absorbansi kontrol

Abl = Absorbansi Blanko

P = Faktor Pengenceran

T = Waktu Inkubasi (menit) (Tremacoldi and Carmona, 2005).

12. Produksi Enzim Protease

Produksi enzim protease dilakukan terhadap isolat bakteri proteolitik terpilih.

Starter isolat bakteri proteolitik diinokulasikan sebanyak 2 % dalam 100 mL

media cair, kemudian diinkubasi pada shaker incubator dengan kecepatan 120

rpm pada suhu inkubasi sesuai dengan suhu pengambilan sampel, dengan

waktu yang digunakan adalah waktu optimum yang diperoleh dari uji tingkat

31

kekeruhan dan uji aktivitas proteolitik secara kuantitatif. Kemudian sampel

disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit (Rodarte et al.,

2011). Selanjutnya supernatan diambil dan dipisahkan dari pellet, supernatan

yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim protease.

13. Uji Aktivitas Unit Enzim Protease

Ekstrak kasar enzim protease diambil sebanyak 0,5 mL dan ditambahkan 0,5

mL buffer fosfat pH 7, kemudian didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit

ditambahkan substrat (2 % kasein dalam buffer fosfat pH 7) sebanyak 0,5 mL

dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 °C. Reaksi dihentikan dengan

menambahkan 1 mL larutan TCA, kemudian diaduk dan didiamkan selama 30

menit. Selanjutnya, sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm

selama 15 menit dan dipisahkan filtratnya. Kemudian filtrat diukur

absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang

gelombang 580 nm. Standar dibuat dengan menambahkan larutan TCA pada

larutan enzim sebelum substrat ditambahkan. Aktivitas Unit (AU) enzim

dihitung dengan rumus:

AU = Asp − Abl

Ak − Abl × P ×

1

T

Keterangan:

AU = Aktivitas Unit (U/mL)

Asp = Absorbansi Sampel

Ak = Absorbansi Kontrol

Abl = Absorbansi Blanko

P = Faktor Pengenceran

T = Waktu Inkubasi (menit) (Tremacoldi and Carmona., 2005).

32

14. Uji Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik

Enzim protease sebanyak 0,1 mL ditambahkan 0,9 mL aquades lalu

direaksikan dengan 5 mL pereaksi C dan dihomogenkan. Sampel dibiarkan

selama 10 menit pada suhu ruang. Pereaksi D ditambahkan sebanyak 0,5 mL,

didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang. Kontrol dibuat dengan

mengganti 0,1 mL enzim dengan 0,1 mL aquades, selanjutnya dilakukan

perlakuan sama seperti sampel. Setelah didiamkan selama 30 menit, sampel

dan kontrol disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit,

supernatan dipisahkan dari endapannya kemudian diukur absorbansinya.

Serapan diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang

gelombang 600 nm. Konsentrasi protein enzim ditentukan menggunakan

kurva standar BSA (Bovine serum Albumin). Sedangkan untuk Aktivitas

spesifik enzim protease (U/mg) merupakan perbandingan antara aktivitas

protease (U/ml) dengan kadar protein (mg/ml) (Suhartono dan Artika., 2017).

46

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan sebagai

berikut:

1. Total koloni yang diperoleh pada tahap awal isolasi antara lain meliputi

fase mesofilik: 4,9 × 108 cfu/mL, fase termofilik: 8,8 × 108 cfu/mL, dan fase

pematangan: 4,4 × 109 cfu/mL.

2. Hasil uji indeks proteolitik yaitu terdapat 13 isolat dengan indeks

proteolitik bervariasi, diantarnya isolat PKMA1, PKMA4, PKMB2,

PKMF1, PKMG2, PKTA1, PKTB3, PKTC6, PKTD4, PKPA1, PKPB2,

PKPG1 dan PKPG2.

3. Hasil karakterisasi biokimia yaitu terdapat 5 isolat terpilih, diantaranya

isolat PKMA4, PKMG2, PKTB3, PKTD4 dan PKPG2.

4. Hasil pengukuran aktivitas spesifik isolat proteolitik terpilih pada kondisi

optimum pertumbuhan yaitu PKMA4: 0,1716 U/mg, PKMG2: 0,197 U/mg,

PKTB3: 0,333 U/mg, PKTD4: 0,167 U/mg dan PKPG2: 0,207 U/mg.

5. Isolat PKTB3 merupakan isolat proteolitik dengan aktivitas yang relatif

lebih baik dibandingkan isolat yang lainnya.

47

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, pada penelitian selanjutnya

disarankan:

1. Melakukan karakterisasi molekular terhadap isolat-isolat bakteri proteolitik

yang diperoleh, untuk mengetahui kekerabatan dengan spesies terdekat dari

database yang sudah ada.

2. Melakukan optimasi produksi enzim protease menggunakan substrat yang

berbeda untuk mendapatkan aktivitas proteolitik yang lebih baik.

3. Mempelajari lebih lanjut isolat yang diperoleh pada penelitian ini mengenai

karakterisasi enzim yang dihasilkan.

48

DAFTAR PUSTAKA

Badan Litbang Pertanian. (2011). Pupuk Organik dari Limbah Organik Sampah

Rumah Tangga. Jurnal Agro Inovasi. 3: 1 – 11.

Beffa, T., Blanc, M., Marilley, L., Fisher, J.L., Lyon, P.F. and Aragno, M. 1995.

Taxonomic and Metabolic Microbial Diversity During Composting. in The

Science of Composting. Journal of Microbiology Blackies Academic and

Professional. 1: 1 – 8.

Choliq, A. 2008. Aktivitas Enzim Protease dari Mucor javanicus yang

Ditumbuhkan pada Media Tepung Singkong (Manihot utilissima). Jurnal

Mikrobiologi LIPI Bogor. 3: 299 – 303.

Chu, W.H. 2006. Optimization of Extracellular Alkaline Protease Production from

Species of Bacillus. Journal of Microbiol Biotechnol. 34: 241 – 245.

Cuesta, S.M., Rahman, S.A., Furnham, N., and Thornton, J.M. 2015. The

Classification and Evolution of Enzyme Function. Biophysical Journal. 1:

1082 – 1086.

Deng, A., Wu, A., Zhang, Y., Zhang, G., and Wen, T. 2010. Purification and

Characterization of a Surfactant-Stable High-Alkaline Protease from Bacillus

sp. B001. Journal of Bioresource Technology. 1: 7100 – 7106.

Doraja, P.H., Shovitri, M., dan Kuswytasari, N.D. 2012. Biodegradasi Limbah

Domestik dengan Menggunakan Inokulum Alami dari Tangki Septik. Jurnal

Sains dan Seni ITS. 1: 44 – 47.

Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S. 1997. Dasar-dasar Kimia Organik. Bina

Aksara. Jakarta. Pp: 112 – 115.

Gandjar, I., Sjamsuridzal, W., dan Oetari, A. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan.

Yayasan Obor Indonesia. Jakarta. Pp: 63 – 68.

Hasibuan, R. 2016. Analisis Dampak Limbah/Sampah Rumah Tangga terhadap

Pencemaran Lingkungan Hidup. Jurnal Ilmiah Advokasi. 1: 42 – 52.

49

Insam, H. and Bertoldi, M.D. 2007. Microbiology of The Composting Process.

Compost Science and Technology. 3: 25 – 48.

Jain, P.C., Lacey, J., and Stevens, L. 1991. Use of API-ZYM Strips and 4-

Nitrophenyl Substrates to Detect and Quantify Hydrolytic Enzymes in Media

and Grain Colonized with Aspergillus, Eurotium and Pennicillium sp.

Journal of Mycological Research. 95: 834 – 842.

Karina, A.N., Hussain, D.R., Johanes, E, dan Nawir, N.H., 2014. Isolasi dan

Karakterisasi Bakteri Proteolitik dari Saluran Pembuangan Limbah Industri

Tahu. Jurnal Biologi Universitas Hasanuddin. 1: 1 – 8.

Kurjogi, M.M. and Kaliwal, B.B. 2018. Rapid and Sensitive Method for Detection

of Staphylococcus Aureus Enterotoxin Genes in Milk Sample. Journal of

Applied Biology and Biotechnology. 2: 15 – 19.

Kusnanto, M.W. 2013. Analisis Spektroskopi UV-Vis “Penentuan Konsentrasi

Permanganat (KMnO4)”. Jurnal FMIPA Jurusan Fisika. 1: 1 – 18.

Mulja, M. dan Suharman. 2009. Analisis Instrumental. Jurnal Kimia Analitik. 1:

114 – 138.

Naiola, E., dan Widhyastuti, N. 2002. Isolasi, Seleksi dan Optimasi Produksi

Protease dari Beberapa Isolat Bakteri. Jurnal Mikrobiologi LIPI Bogor. 3:

467 – 473.

Narihiro, T., Takebayashi, S., and Hiraishi, A., 2004. Activity and Phylogenetic

Composition of Proteolytic Bacteria in Mesophilic Fed-Batch Garbage

Composters. Journal of Microbes Environ. 4: 292 – 300.

Ngan, T.L.K. and Diep, C.N. 2016. Isolation, Identification of Mesophiles and

Thermophiles from Landfills in Cantho City, Vietnam and Their

Application for Biowaste Treatment. World Journal of Pharmacy and

Pharmaceutical Sciences. 9: 373 – 386.

Noreen, S., Siddiqa, A., Fatima, R., Anwar, F., Adnan, M., and Raza, A. 2017.

Protease Production and Purification from Agro Industrial Waste by

Utilizing Penicillium digitatum. International Journal of Applied Biology

and Forensics. 4: 119 – 129.

Noviyanti, T., Ardiningsih, P., dan Rahmalia, W., 2012 Pengaruh Temperatur

terhadap Aktivitas Enzim Protease dari Daun Sansakang (Pycnarrhena

cauliflora diels). Jurnal Biokimia Universitas Tanjungpura. 1: 31 – 34.

Nugeraha, Sumiyati, S., dan Samudro, G. 2010. Pengolahan Air Limbah Kegiatan

Penambangan Batubara Menggunakan Bio Koagulan: Studi Penurunan

Kadar TSS, Total Fe dan Total Mn Menggunakan Biji Kelor (Moringa

oleifera). Jurnal Presipitasi. 2: 57 – 61.

50

Olaniyi, J.O., and Ojetayo, A.E. 2011. Effect of Fertilizer Types on The Growth

and Yield of Two Cabbage Varieties. Journal of Animal & Plant Sciences. 2:

1573 – 1582.

Partanen, P., Hultman, J., Paulin, L., Auvinen, P., and Romantschuk, M. 2010.

Bacterial Diversity at Different Stages of The Composting Process. Journal

of BioMed Central Microbiologi. 4: 1 – 11.

Pratiwi, D. dan Maharani, C. 2013. Pengelolaan Limbah Medis Padat pada

Puskesmas Kabupaten Pati. Jurnal Kesehatan Masyarakat. 1: 74 – 84.

Priadie, B. 2012. Teknik Bioremediasi sebagai Alternatif dalam Upaya

Pengendalian Pencemaran Air. Jurnal Ilmu Lingkungan. 10: 38 – 48.

Puspitasari, F.D., Shovitri, M., dan Kuswytasari, N.D. 2012. Isolasi dan

Karakterisasi Bakteri Aerob Proteolitik dari Tangki Septik. Jurnal Sains dan

Seni ITS. 1: 1 – 4.

Rahmawati, N.H.F. 2016. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Proteolitik dari Feses

Hewan Luwak. Jurnal Biologi Universitas Negeri Yogyakarta. 4: 1 – 8.

Rizaldi, R., Setyantini, W.H., dan Sudarno. 2018. Isolasi dan Karakterisasi

Bakteri Proteolitik yang Berasosiasi dengan Lamun Enhalus acoroides di

Pantai Bama, Taman Nasional Baluran, Situbondo, Jawa Timur. Jurnal

Ilmiah Perikanan dan Kelautan. 1: 12 –20.

Rodarte, M.P., Dias, D.R., Vilela, D.M., and Schwan, R.F. 2011. Proteolytic

Activities of Bacteria, Yeasts and Filamentous Fungi Isolated from Coffee

Fruit (Coffea arabica l.). Journal of Agronomy. 3: 457 – 464.

Rusydi, A.N., Naily. W., dan Lestiana, H. 2015. Pencemaran Limbah Domestik

dan Pertanian Terhadap Air Tanah Bebas di Kabupaten Bandung. Jurnal

Pusat Penelitian Geoteknologi LIPI. 2: 87 – 97.

Safrida, Y.D., Yulvizar, C. dan Devira, C.N. 2012. Isolasi dan Karakterisasi

Bakteri Berpotensi Probiotik pada Ikan Kembung (Rastrelliger sp.). Jurnal

Biologi Universitas Syah Kuala. 3: 200 – 203.

Saidah, A.N, 2014. Isolasi Bakteri Proteolitik Termofilik dari Sumber Air Panas

Pacet Mojokerto dan Pengujian Aktivitas Enzim Protease. Jurnal Biologi.

Pp: 1 – 10.

Singh, R., Mittal, A., Kumar, M., and Mehta, P.K. 2016. Microbial Proteases in

Commercial Application. Journal of Pharmaceutical, Chemical and

Biological. 3: 365 – 374.

Skoog, D. A. 2007. Principles of Instrumental Analysis. Thompson Brooks/Cole.

Kanada. Pp: 76 – 79.

51

Soeka, S.Y. dan Sulistiani, S. 2017. Karakterisasi Enzim Protease dari Bakteri

Stenotrophomonas Sp. Asal Gunung Bromo, Jawa Timur. Jurnal

Mikrobiologi LIPI Bogor. 2: 203 – 211.

Steinkraus, K.H. 2002. Indigenous Fermented-Food Technologies for Small-Scale

Industries. Food and Nutrition Bulletin (7). Pp: 23 – 32.

Sudarwanto, S. 2010. Peran Strategis Perempuan dalam Pengelolaan Limbah

Padat Bernilai Ekonomi. Jurnal Ekosains. 1: 65 – 74.

Sudha, S., Nandhini, S.U., Mathumathi, V., and Nayaki, J.M.A. 2018. Production,

Optimization and Partial Purification of Protease from Terrestrial Bacterium

Exiguobacterium profundam sp. MM1. Journal of Biocatalysis and

Agricultural Biotechnology. 3: 1878 – 1881.

Suhartono, S. dan Artika, W. 2017. Isolasi dan Uji Aktivitas Protease dari

Aktinobakteri Isolat Lokal (AKJ-09) Aceh. Jurnal Biologi Universitas Syah

Kuala. 3: 116 – 120.

Sulistyorini, L. 2005. Pengolahan Sampah dengan Cara Menjadikannya Kompos.

Jurnal Kesehatan Lingkungan. 1: 77 – 84.

Sumampouw, O.J. 2017. Diare Balita: Suatu Tinjauan dari Bidang Kesehatan

Masyarakat. Deepublish. Yogyakarta. Pp: 54 – 59.

Tremacoldi, C. R. and Carmona, E. C. 2005. Production of Extracellular Alkaline

Proteases by Aspergillus clavatus. World Journal of Microbiology and

Biotechnology. 21: 169 – 172.

Tribun Lampung. 2018. Tahun Baru Sisakan Sampah 800 Ton.

lampung.tribunnews.com/2018/01/04/wow-tahun-baru-sisakan-sampah-800-

ton. Diakses pada tanggal 26 November 2018 pukul 22.49 WIB.

Triyati, E. 2013. Spektrofotometer Ultra-Violet dan Sinar Tampak serta

Aplikasinya dalam Oseanologi. Jurnal Oseana. 1: 39 – 47.

Ulfa, A., Suarsini, E., dan Muhdhar, M.H.I. 2016. Isolasi dan Uji Sensitivitas

Merkuri pada Bakteri Dari Limbah Penambangan Emas di Sekotong Barat

Kabupaten Lombok Barat. Proceeding Biology Education Conference. 1:

793 – 799.

Utomo, M.A.P. dan Shovitri, M. 2014. Bakteri Tanah Pendegradasi Bahan

Organik Desa Talango, Pulau Poteran, Sumenep. Jurnal Sains dan Seni

POMITS. 3: 80 – 83.

Valsange, A., Evarkar, S.P., Tawde, S.V., Kareppa, B.M., and Gujar, R.S. 2012.

Analysis of Protease Activity of Enzyme Isolated from Compost Soil.

International Multidisciplinary Research Journal. 6: 1 – 4.

52

Wahjuningrum, D., Mayasari., dan Mubarik, N.R. 2009. Isolasi dan Identifikasi

Bakteri Proteolitik Patogen dari Bagian Eksternal Ikan Nila GIFT

Oreochromis niloticus. Jurnal Akuakultur Indonesia. 2: 169 – 174.

Widayatno T. dan Sriyani, S. 2008. Pengolahan Limbah Cair Industri Tapioka

dengan Menggunakan Metode Elektroflokulasi. Jurnal Teknik Kimia. 1: 85 –

89.

Widiyaningrum, P. dan Lisdiana. 2015. Efektifitas Proses Pengomposan Sampah

Daun dengan Tiga Sumber Aktivator Berbeda. Jurnal Jurusan Biologi. 2:

107 – 113.

Yuniati, R., Nugroho, T., dan Puspita, F. 2015. Uji Aktivitas Enzim Protease dari

Isolat Bacillus Sp. Galur Lokal Riau. Jurnal Biologi. 2: 116 – 122.

Yusuf, N.W.H., Subekti, S., dan Kusdarwati, R. 2009. Isolasi dan Identifikasi

Bakteri Gram Negatif pada Luka Ikan Maskoki (Carassius auratus) Akibat

Infestasi Ektoparasit Argulus sp.. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan. 2:

1 – 15.