investigación en chaperonas para pku

UE/EU-FEDER/ERDF

Investigación en chaperonas para PKUJavier Sancho

Dep. Bioquímica y Biología Molecular y Celular. Universidad de ZaragozaInst. de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI). Universidad de Zaragoza

Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud. Universidad de Zaragoza

VI Congreso Regional de Enfermedades Metabólicas Hereditarias de la Región de Murcia 18-20 septiembre 2015. La Manga (Murcia)

Mutaciones desestabilizantes en la enzima FAH

908 mutaciones conocidas(a 5 de septiembre de 2015)

1:10000 recien nacidos

Introducción

4 SUBUNIDADES

Proteínaantes de plegarse(NO FUNCIONA)

Introducción

ProteínaBien plegada

(SI FUNCIONA)

Introducción


(SI FUNCIONA)mutaciones PKU

Introducción


(SI FUNCIONA)

= Chaperona farmacológica

Kuvan

Tafamidis

Fenilcetonuria

Amiloidosis TTR

Introducción

Temperatura

% Proteína inactiva

Tm

100

50

0

Introducción

Las proteínas emiten luz que cambia de color cuando se inactivan por el calor

T´m

Omeprazol

Aspirina

Ibuprofeno

N+ N

I-

N

O

OHO

N

NS

O

Cl

NN+

-O

OO

NH2

O

O

N+

N

NO

S

-O

O

O

O

N

N

O

HO

SN O

O

O

Cl

Cl

NNH

O

OCl

N

N S

SNH

102 millones de compuestos químicos (4 sep 2015)

Usamos QUIMIOTECAS:selecciones representativas

Kuvan

Introducción

Aceite mineralFenilalanina hidroxilasa+ 1 compuesto (o varios)

30 40 50 60 700

1

2

3

4

Fluo

resc

enci

a

Temperatura (º C)B7 D4 E11 G8 H11

40

44

48

52

T m

Compuestos candidatos

Tm

35 40 45 50 55 600.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Seña

l nor

mal

izada

Temperatura (º C)

Cribado rápido mediante ensayos de estabilidad

Trabajo previo Búsqueda inicial de nuevas chaperonas

Temperatura ( o C)

30 40 50 60 70

Frac

ción

des

pleg

ada

0.0

0.5

1.0

N

N

HN

O

N

NH2

IN

N +

N N

N

O -

OII

N

N

NH2

O

NO 2

III N

NH

S S

N

OIV

Descubrimiento de 4 compuestosque estabilizan la FAH silvestre

greenred

cyan blue

PAHalone

Pey et al. 2008.Identification of pharmacological chaperones as potential therapeutic agents to treat phenylketonuria.Journal of clinical investigation 118: 2858-2867.

Prof. A. Martínez(U Bergen)


III IV

Aumenta la cantidad de proteína

III IV

Aumenta la actividad enzimática

Efecto de los compuestos III y IV en células que expresan FAH

silvestre o con mutaciones PKU

PAH

act

ivity

(nm

ol/m

in.m

g)

0

1

2

3

DMSO III IV

*

*

A

PAH

pro

tein

fold

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

DMSO III IV

B* *

DMSO III IV

Efecto de los compuestos III y IV tras administración oral a ratones sanos


Estructura de la unión entre la FAH y la chaperona IV

Torreblanca et al. 2012Structural and mechanistic basis of the interaction between a pharmacological chaperone and human phenylalanine hydroxylase ChemBioChem 13:1266-1269

Dr. Ramón HurtadoUniv. Zaragoza


Objetivos:

Identificar y desarrollar nuevas chaperonas útiles para fenilcetonuria

Comparar su espectro de acción y su eficacia con los de Kuvan

FenilcetonuriaDiagnóstico y combate molecular de tres

enfermedades neurodegenerativas:

Parkinson, fenilcetonuria y amiloidosis TTR

FenilcetonuriaAcciones

Diseño computacional de mejores chaperonas basadas en la chaperona IVJuan José Galano Frutos (Zaragoza)Dr. Rui Brito (Coimbra)

Síntesis química y ensayo in vitro de las nuevas chaperonas diseñadasMaría Galiana (Zaragoza)Míriam Alías (Zaragoza)MD Díaz de Villegas (Zaragoza)María Conde (Zaragoza)

Cribado experimental de nuevas quimiotecas de mayor tamaño para descubrir nuevas chaperonas

Sandra Salillas (Zaragoza)

Ensayos de toxicidad y eficacia encélulas humanas y en ratones sanos.Comparación con Kuvan María Conde

Dra. Marie-Lise Maddelein

Mejora racional de uno de los compuestos previamente encontrados (compuesto CIV)

N

NH

S S

N

OIV

Búsqueda de nuevas chaperonas ensayando quimiotecas mayores

Cálculos “alquímicos” de energía de unión (AFEC)

ΔGbind(B)

ΔGbind(A)

ΔGA-BboundΔGA-B

unbound

ΔGbind(A) + ΔGA-Bbound - ΔGbind(B) - ΔGA-B

unbound = 0

ΔΔGB-A = ΔGA-Bbound - ΔGA-B

unbound

Juan José Galano

Diseño computacional de mejores chaperonas basadas en la chaperona IV

Síntesis química y ensayo in vitro de las nuevas chaperonas diseñadas

María Galiana Dra. Míriam Alías Dra. MD Díazde Villegas

Cribado de una quimioteca

Estab. Térmica de FAH

Estruct. cristalinaenzima + chaperona

Estudio de la coordinaciónde chaperona y enzima

Modificación desustituyentes

IV

María Conde

-4

-3

-2

-1

0

1

-8 -6 -4 -2 0 2

y = -0,18+ 0,52x R= 0,902au

men

to d

e en

ergí

a de

uni

ón M

ED

IDO

(kJ/

mol

)

aumento de energía de unión CALCULADO(kJ/mol)

Nuevas posibles chaperonas más potentes

20 30 40 50 60 70 80-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Unfol

ded f

ractio

n

Temperature (؛C)

VP1 VP2 VP3 VP4 VP5 VP6 VP7 VP8 VP9 VP10 VP11 VP12 VP13 Control

Sandra Salillas

Cribado experimental de nuevas quimiotecas de mayor tamaño para descubrir nuevas potenciales chaperonas

Comparación con Kuvan

20 30 40 50 60 70 80-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Unf

olde

d fra

ctio

n

Temperature (ºC)

Control VP13 Kuvan

Sandra Salillas

Cribado experimental de nuevas quimiotecas de mayor tamaño para descubrir nuevas potenciales chaperonas

Compuestos que estabilizan a la enzima activa

¿tienen efecto estos compuestos en la estabilidad y plegamiento de distintos mutantes de la proteína?

I65TPKU

moderada

Y414CPKU leve

R241HPKU leve

V245LPKU clásica

E280KPKU clásica

V388MPKU moderada

A395PPKU clásica

R408QPKU leve

mutaciones que responden a Kuvanmutaciones que no responden a Kuvan

María Conde

Ensayos de toxicidad y eficacia en células transfectadas y en ratones sanos.Comparación con Kuvan

Dra M-L Maddelein(Francia)

Compuestos que estabilizan a la enzima activa

¿tienen efecto estos compuestos en la estabilidad y plegamiento de distintos mutantes de la proteína?

¿son compuestos tóxicos en células humanas?

¿tienen efecto estos compuestos en células humanas?

¿tienen efecto estos compuestos en modelos animales de la enfermedad?


María Conde



María Conde


Mutaciones a

Mutaciones b

Mutaciones c

~ 900 mutaciones conocidas en la proteína FAH

Dietas bajas en Phe/ tratamiento con Kuvan

Chaperonas farmacológicas

Otras terapias

Cribado de alto

rendimiento

Validación in vitro de los compuestos

prometedores

Ensayos de toxicidad y efectividad in vivo con

células humanas

Ensayos in vivo con modelos de la enfermedad

Potencial chaperona

farmacológica

Perspectiva

Otras enfermedades metabólicasMSUD como ejemplo

El complejo de la deshidrogenasa de alfacetoácidos de cadena ramificada (BCKD)


Es una enzima compleja formada con participación de 4 genes ( , , , )


Es una enzima compleja formada con participación de 4 genes ( , , , )

E1

descarboxilasa

E2

transacilasaE3

deshidrogenasa

E2 /12 E1 /6 E3

EN TOTAL 84 SUBUNIDADES

Distintas mutaciones en cualquiera de esos cuatro genes reducen o eliminan la función de la enzima y hacen que se acumulen sustancias tóxicas que causan la enfermedad del jarabe de arce

GEN proteína Variantes en OMIM

Descritas como

patológicas

PotencialmenteRecuperables con

chaperonas%

Enfermedad del jarabe de arce

BCKDHA Sub. α de la descarboxilasa (E1)

76 31 16 50 %

BCKDHB Sub. β de la descarboxilasa (E1)

81 35 17 50 %

DBT Sub. de la transacilasa (E2)

67 27 7 25 %

DLD Sub. de la deshidrogenasa (E3)

47 12 10 90 %

271 105 50 48 %

Fenilcetonuria

PAH Subunidad única 615 120 72 60 %

Enfermedad Enzima defectuosa

Ubicación

PKU Mássencilla

citoplasma

Jarabe de arce

Máscompleja

mitocondrias


Ubicación Terapia dereemp.

enzimático

PKU Mássencilla

citoplasma Más fácil

Jarabe de arce

Máscompleja

mitocondrias

Difícil



enzimático


Hay cofactores?

PKU Mássencilla

citoplasma Más fácil Sí: BH4 (Kuvan)

Jarabe de arce

Máscompleja

mitocondrias

Difícil Sí:E1: TPPE2: Acido Lipoico, Co AE3: FAD, NAD



enzimático


Hay cofactores?

Son posibles otras

chaperonas?

PKU Mássencilla


Sí

Jarabe de arce

Máscompleja

mitocondrias


Sí



enzimático


Hay cofactores?

Son posibles otras

chaperonas?

Harán falta

varias?

PKU Mássencilla


Sí Menos probable

Jarabe de arce

Máscompleja

mitocondrias


Sí Masprobable

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