interaksi-mikroba-tanaman.doc

7/31/2019 interaksi-mikroba-tanaman.doc

http://slidepdf.com/reader/full/interaksi-mikroba-tanamandoc 1/27

Interaksi Mikroba-Tanaman

Produksi produk pertanian dalam jumlah yang mencukupi kebutuhan manusia di dunia

masih merupakan permasalahan yang sangat penting. Dengan kata lain, pentingnya pertanian

dalam struktur ekonomi global, walaupun perkiraan persis nilai moneternya sangat susah dibuat.Tabel 9.1 menyantumkan perkiraan harga bahan pangan, tetapi karena beberapa alasan (termasuk

sedikit alasan yang dapat dipercaya), figur-figur tersebut tidak nyata. Contohnya, kami

menyebutkan harga ekspor/impor daging, tetapi, mungkin harga-harga ini berbeda dari harga lokal,karena kualitas daging ekspor berbeda dari daging lokal dan karena peraturan ekspor pemerintah.

Meskipun begitu, perkiraan tidak tepat ini menunjukan bahwa pertanian merupakan salah satu

sektor perekonomian utama manusia. Perkembangan industri pertanian membawa dampak yangsangat luar biasa dibidang ekonomi, dan metode bioteknologi menunjukkan dua strategi yang

bermanfaat bagi perkembangan lebih besar.

• Perbaikan dengan penggunaan mikroorganisme patogen simbiotik atau yang potensial mikroorganisme.

Tanaman berada dekat dengan banyak mikroorganime. Permukaan daun ditutupilapisan simbiotik dan terkadang dengan bakteri-bakteri patogen dan yeast, dan

tanah yang dekat dengan akar diisi spesies bakteri yang berbeda dengan bakteriyang ditemukan di tanah yang dijauhkan dari tanaman. Ada beberapa percobaan

yang bisa dilakukan untuk memodifikasi mikroorganisme simbiotik sehingga

menguntungkan tanaman. Contoh yang disebutkan pada Bab 1 termasuk penggunaan ice nucleation-defective Pseudomonas syringae untuk mengurangi

bahaya pembekuan dan penggunaan spesies Rhizobium yang sudah dimodifikasi

untuk meningkatkan nutrisi nitrogen pada tanaman yang diolah.

Tabel 9.1

Produk Pertanian di seluruh dunia (1986)

Produksi setiap tahun perkiraan harga

(jutaan ton) (milyaran dolar)

Biji-bijian 1867 270

Umbi-umbiana,b 592 51

Sayur mayor c,d 414 192

Buah-buahane 326 205

Minyak f 130 27

Gula (mentah) 100 13Kopi (hijau) 5.2 23

Biji coklat 2.0 4.4

Teh 2.3 3.9

Serat sayurang 21 36

Tembakau 6.1 22

Karet 4.4 3.7Daging 155 306

Susu 521 175telur 31 25

Angka produksi berasal dari production yearbook 1986 FAO (Food and Agriculture of the United

state). Sedangkan harga masing-masing produk berasal dari Trade yearbook FAO 1986 dimana

harga-harga tersebut merupakan rata-rata harga impor internasional.akentang merupakan komoditi yang mendominasi pada kategori ini



bharga komoditi dikalkulasi dengan mengasumsikan umbi-umbian selain kentang harganya adalah

50% dari harga kentang.c produksi sayur mayur tidak dimasukkan di banyak Negara. Sayur-sayuran diperkirakan 40% dari

total produksi dibeberapa Negara.dstatistik dari 14 kategori sayur tersedia dalam FAO year book, tetapi hany terdiri dari setengahtotal produksi sayur. Sangat susah menentukan harga pasrinya karena perbedaan yang besar dan

kerumitan kategorinya. Oleh karena itu kami menyederhanakan situasi dan mengambil, sepertiharga satuan, harga satuan tomat dan bawang merah (dua jenisa sayuran yang tumbuh dalam

jumlah yang besar). Dengan demikian harganya hanya perkiraan.eapel, pisang, jeruk, dan anggur dihitung mencapai 2/3 dari total produksi buah. Harga satuannya

dihitung dengan merata-ratakan harga buah-buahan tersebut.f kedelai merupakan produk utama pada kategori inig75%dari kategori ini adalah koton. Sekitar 20% adalah goni

• Perbaikan dengan produksi tanaman transgenik.

Tanaman olahan menunjukkan usaha perbaikan yang sungguh-sunguh selama bertahun-tahun (kadang berabad-abad). Program pengembangbiakaan tanaman

secara traditional dilaksanakan dengan dua metode: pemilihan mutasi spontan yang

menguntungkan dan pemasukan ciri yang diinginkan dari spesies yang terkaitdengan cara pengembangan silang. Metode pertama sangat tidak efisien dan

lambat; yang kedua dibatasi dengan kekurangan bahan yang dapat dipakai.

Teknologi DNA Rekombinan membawa perubahan revolusioner pada usahatersebut. Hal ini memungkinkan peneliti untuk mendefinisikan gen secara jelas

dengan ciri-ciri yang jelas, mengklon gen, dan mentransfernya pada tanaman yang

diteliti. Gen-gen tersebut dapat diambil dari organisme yang tidah ada sangkut

pautnya dengan tanaman target- bahkan dari bakteri ataupun binatang.

Pentransferan gen yang sudah diklon dari prokariotik bakteri kedalam eukariotik yang lebih

tinggi seperti kedalam tanaman sangatlah susah. Namun, ada dua spesies bakteri, Agrobacteriumtumefaciens dan A. rhizogenes, yang mentransfer bagian kecil DNA kedalam tanaman seperti

bagian dari siklus hidup normalnya. Sampai saat ini, system pentransferan DNA alami menjadi

sesuatu yang sentral dalam konstruksi variasi tanaman dengan ciri-ciri yang lebih unggul. Peran Agrobacterium saat ini dalam rancangan genetik pada tanaman menunjukan manfaat mempelajari

pisiologi dari terbentuknya bakteri secara alami untuk mengetahui kegunaan bakteri ini pada

teknologi baru.Beberapa langkah dimana pertanian dapat memberikan keuntungan dari rancangan genetik

diteliti di bab ini. Tujuan nyata dari peningkatan hasil panen dapat diwujudkan baik dengan

manipulasi tanaman secara langsung ataupun secara tidak langsung dengan menambahkan gen

asing yang mengkode penyakit atau sifat resisten serangga. Salah satu tujuan jangka panjang yangmenarik adalah menggabungkannya kapasitas dan fikasai nitrogen kedalam tanaman yang diolah.

Yang lainnya adalah untuk meningkatkan kualitas produk. Beberapa strategi dapat didefinisikan

pada level molekular. Seperti contohnya, untuk membuat roti berkualitas tinggi, tepung teriguharus mengandung protein (glutenin yang berat molekulnya tinggi) yang mampu memberikan

elastisitas, dan protein ini rupanya terlibat dalam rantai polipeptida yang berisikan banyak putaran.

Akan menjadi sangat mudah mengubah ciri-ciri protein ini dengan mutagenesis site-directed danuntuk memasukan allele yang memberikan peningkatan elastisiti yang diinginkan kedalam terigu

kultivar yang lain. Tujuan jangka panjang yang lain adalah untuk mengubak komposisi asam

amino protein biji-bijian. Benih merupakan sumber utama protein untuk sebagian besar populasi di



dunia, karena benih kurang akan asam amino esensial tertentu, seperti metionin dan lisin. Mungkin

simpanan protein didalam benih dapat dirancang untuk mengubah komposisinya dan

meningkatkan kadar nutrisinya. Seperti contoh yang lainya, dengan mengubah level ekspresi dariasam lemak desaturase, salah satunya mungkin menghasilkan minyak sayur dengan ciri yang

diinginkan. Akhirnya, perbaikan yang akan mengubah panen yang lebih mudah, tidak cepat busuk

selama transportasi, dan tahan lama memiliki nilai ekonomi yang sangat potensial.

Penggunaan Simbion dan Patogen

Seperti yang akan kita lihat nanti, banyak usaha penelitian pertanian menunjukan pemasukan gen-gen asing yang berpotensi menguntungkan ke dalam persediaan tanaman. Namun,

karena ada banyak bakteri simbiotik tergabung secara normal dengan organ berbagai macam

tanaman, rencana yang lebih sederhana mungkin untuk memodifikasi bakteri-bakteri tersebut dan

kemudian memakai interaksi bakteri dengan tanaman untuk memasukan ciri yang sudahdimodifikasi pada tempat yang sesuai. Pilihan pendekatan ini lebih mudah secara teknik, karena

rangcangan DNA bakteri dengan metode DNA rekombinan saat ini lebih sering dilakukan,

mengingat manipulasi penanaman DNA belum sempurna.

Perlindungan Tanaman dari Bahaya Pembekuan dengan Bakteri Simbiotik terencena (engineered)

Salah satu contoh awal modifikasi bakteri simbiotik yang berhasil adalah pada Pseudomonas syringae, yang ditemukan pada daun tanaman dengan konsentrasi tinggi. Banyak

strain dari bakteri ini memproduksi protein ice nucleation yang rupanya terletak pada permukaan

sel bakteri, dan keberadaan protein ini menyebabkan terbentuknya es pada suhu dibawah 0ºC,mengakibatkan bahaya pembekuan yang sangat berarti pada tanaman panen dan memudahkan

pemasukan bakteri kedalam jaringan tanaman. Steven Lindow dan koleganya adalah orang

pertama yang mengklon gen ice nucleation pada P. syringae dengan vektor kosmid. E. coli yang

menerima molekul DNA rekombinan disaring untuk pengintian formasi es pada suhu -9 ºC. Delesidibuat dalam gen ini dengan metode DNA rekombinan, dan delesi tersebut dikembalikan kedalam

kromosom P. syringae dengan proses rekombinan homolog. Hasil dari strain es serupa dengan

strain es inang pada semua ciri, penggunaan berlebih mutan pada daun strawberry, misalnya,memudahkan kolonisasi yang sukses dengan bakteri tipe liar (wild type), sehingga melindungi

tanaman dari bahaya pembekuan.

Penggunaan Nitrogen-Banteri Fiksasi untuk Memperbaiki Hasil Panen.

Fokus penelitian sekarang--salah satunya yang memiliki pengaruh yang luas—adalah

proses fiksasi nitrogen. Semua binatang dan tanaman dan sebagian besar bakteri tergantung dari

ketersediaan beberapa bentuk nitrogen kombinasi pada lingkungannya: nitrat (NO3-), ammonia

(NH3), dan nitrogen-nitrogen sejenisnya-yang mengandung senyawa organik seperti asam amino.

Jumlah besar N2, yang tersedia di atmosper tidak mencukupi dunia biologi kecuali proses fiksasi

nitrogen. Nitrogen telah difiksasi atau dirubah menjadi pupuk (sebagian besar garam amoniak),

dengan proses industri sejak awal abad ini. Karena N2 merupakan senyawa stabil yang luar biasa,

perubahan N2 menjadi NH3 membutuhkan kondisi yang keras--temperatur lebih dari 500ºC dantekanan melebihi 200 atm. Dengan demikian pembuatan pupuk kimia menghabiskan porsi energi

yang sangat berarti. Disamping itu, jumlah besar pupuk yang digunakan pada lahan justru diserap

oleh sungai, kolam, dan bahkan samudra, yang kemudian menyebabkan polusi air yang cukup

berarti, termasuk pertumbuhan alga yang tidak diinginkan dan mikroorganisme lain.



Berbeda halnya, proses biologi fiksasi nitrogen, dilaksanakan oleh sejumlah kecil spesies

prokariotik, tidak membutuhkan bahan bakar ataupun tenaga elektrik dan karena proses ini diatur

sesuai dengan kebutuhan akan nitrogen dilingkungan yang diberikan, maka tidak menimbulkan polusi terhadap lingkungan. Dengan demikian, meningkatkan perluasan fiksasi nitrogen biologi

merupakan tujuan penting dibidang bioteknologi. Menariknya, meskipun sejumlah besar pupuk

kimia saat ini digunakan, diperkirakan banyak nitrogen atmosper yang difiksasi dengan organisme perbaikan nitrogen. Sesuai dengan salah satu perkiraan, proses biologi memfiksasi enam kali lebih

nitrogen (24 x 107 ton/tahun) dari pada nitrogen yang diubah menjadi pupuk kimia melalui proses

industri. Meskipun kemajuan kecil pada perluasan proses biologi akan memberikan dampak luas.Proses biologi fiksasi nitrogen sangat kompleks dan memerlukan banyak molekul ATP,

karena enzim yang terlibat dalam proses ini harus mengatasi banyak rintangan energi aktivasi yang

sama seperti sistesis kimia amonia. Dua enzim yang dibutuhkan adalah: Komponen I (nitrogenase)

komponen II (nitrogenase reductase). Setelah komponen II dikurangi dengan reduktan biologi yangkuat (ferredoxin atau flavodoxin), 16 molekul (sudah dipercaya) ATP dihidrolisis untuk

menyempurnakan reduksi komponen I. Hanya dengan komponen II yang sudah direduksi saja

tidak mampu mengatasi ringtangan energi aktivasi. Komponen I yang direduksi kemudian

mereduksi N2 menjadi dua molekul NH3 (Gb. 9.1). Fiksasi nitrogen adalh reaksi reduktif yangkuat, dan enzim yang terlibat selalu dinonaktifkan secara takterbalikkan ketika berinteraksi dengan

oksigen. Kepekaan oksigen sangat penting untuk memengertikan biologi tentang N2- fiksasimikroorganisme seperti yang digambarkan dibawah ini.

Kemampuan memfiksasi nitrogen ditemukan pada anggota terpencar kingdom eubakteri.

Beberapa genus fiksasi nitrogen memiliki jarak yang cukup jauh dengan yang lainnya, yangmenunjukan bahwa fungsinya mungkin ditransfer “secara menyamping”—yakni diantara

organisme yang berbeda---selama evolusi. Beberapa kelompok fiksasi nitrogen adalah organisme

bebas. Salah duanya adalah Clostridium dan Klebsiella fiksasi nitrogen yang berada pada kondisi

anaerob, penyerapan yang konsisten dengan kepekaan oksigen enzim. Bakteri yang hidup bebaslainnya dapat memfiksasi nitrogen bahkan dalam kondisi aerob, karena masing-masing organisme

ini mengembangkan perlindungan untuk melindungi alat fiksasi nitrogen dari oksigen. Dengan

demikian kyanobacteri, yang melaksanakan fotosintesis, menunjukan fiksasi nitrogen hanya padasel-sel khusus yang disebut heterosit, yang tidak menghasilkan oksigen. Azotobacter membutuhkan

oksigen dalam jumlah yang besar, dan dalam pelaksanaanya bakteri ini melindungi alat fiksasi

nitrogennya. Kelompok bakteri yang lain yang memfiksasi nitrogen hanya ketika bakteri tersebutmemiliki hubungan simbion dengan tanaman. Hasil studi terbaik tentang pengikat nitrogen

simbiotik adalah Rhizhobium, yang menyerang jaringan akar tanaman leguminous, seperti alfalfa,

kacang polong, semanggi, dan kedelai serta tinggal didalam sel vakuola. Vakuola menjadi terisikan

dengan ikatan oksigen-protein, leghemoglobin, yang dihasilkan tanaman. Kondisi ini menciptakanlingkungan yang rendah akan oksigen dimana Rhizobium dapat melaksanakan fiksasi nitrogen.



Gb. 9.1

Mekanisme enzim fiksasi nitrogen

Organisasi gen yang terlibat dalam fiksasi oksigen pertama kali diuraikan pada Klebsiella.Sungguh, pada genus tersebut sejumlah besar gen diorganisaikan menjadi kelompok tunggal gennif (Gb. 9.2). penemuan ini mengantarkan, pada awal 1970an, pada suatu ide bahwa kloning

terhadap kelompok gen tersebut kemudian meletakkan hasil klon pada tanaman panen yang

diinginkan mungkin memproduksi persediaan tanaman tanpa pupuk kimia—sebuah kemungkinanyang jika disadari akan merevolusi pertanian. Tentu saja situasinya jauh lebih rumit. Pertama, jika

alat fiksasi nitrogen diproduksi dalam sel tanaman yang tidak tersedia mekanisme perlindungan

yang dibutuhkan, proses fiksasi ini akan dinonaktifkan oleh oksigen. Kedua, sejumlah besar ATPyang dibutuhkan dalam proses ini juga harus tersedia. Pentingnya keberadaan ATP sangat jelas

ketika kita membandingkan jumlah nitrogen yang difiksasi oleh simbion dan bakteri yang hidup

bebas. Tanah yang ditutupi semanggi merah, membawa pasangan simbionnya, Rhizobium,

memfiksasi kira-kira 300 kg N/hektar/tahun. Sebaliknya, bakteri yang hidup bebas seperti Azotobakter , pada tanah yang sama, hanya memfiksasi dalam jumlah yang kecil (sekitar 1 kg N/

hektar/tehun). Diantara organisme yang hidup bebas, kyanobakteri menyumbangkan lebih besar,

tetapi jumlah N2 yang difiksasi oleh bakteri tersebut dalam kondisi yang terbaik, jumlahnya lebihkecil dibanding aktivitas Rhizobium-kombinasi semanggi. Perbedaan ini diakibatkan oleh

pemasukan energi yang besar. Tanaman Leguminous tersusun dengan Rhizobiun dan menunjukan

simbiosis yang sukses dengan mengekspresikan lebih dari 20 gen secara rinci untuk tujuantersebut. Salah satu sumbangan dari tanaman inang ini adalah menyediakan aliran senyawa yang

terus-menerus, seperti asam dikarboksilik, yang merupakan sumber energi bakteri. Fiksasi N2 oleh

organisme yang hidup bebas selalu dibatasi dengan persediaan energi yang terbatas (hal inimenjelaskan keberhasilan bakteri kyanobakteri, yang merupakan fototropik). Pemasukan

sederhana gen nif tidak memberikan kemampuan pada tanaman untuk fiksasi Nitrogen.



Gb. 9.2

Gen organisasi fiksasi nitrogen (nif) pada Klebsiella pneumonia, Azotobacter vinelandii, dan Bradyrhizobium

japonicum. Organisme dua terakhir garis putus-putus menunjukakan wilayah dimana gen yang lain dan ORF berada,

tidak ditunjukan skalanya. Pada Bradyrhizobium, gen nod terlibat dalam pembentukan nodul akar simbiotik; gen fix

merupakan gen fiksasi nitrogen yang tidak memiliki homolog pada K. pneumoniae hidup bebas atau A. vinelandii.

Karena mutan sebagian besar gen fix masih mengijinkan fiksasi nitrogen secara lambat pada kultur bebas tanamantetapi tidak fiksasi dalam tanaman. Mutan ini mungkin berfungsi dalam penggunaan reduktan yang terdapat pada

tanaman. Setelah Dean; D.R., Jacobson, M.R.(1992) Nitrogenase genetik biokimia, di Stacey, G., Burris., dan

Evans, H.J. (eds), Biological Nitrogen Fixation, pp. 763-834 (Chapman dan Hall)

Kesadaran inilah yang membawa peneliti untuk mencoba lebih banyak pendekatansederhana yang berhubungan dengan perbaikan N2 simbiotik-fiksasi bakteri, seperti Rhizobium.

Salah satu target yang mungkin untuk perbaikan adalah kadar fiksasi nitrogennya. Pada spesies

Rhizobium, semua gen yang terlibat dalam proses fiksasi nitrogen, dan juga sebagian besar genyang terlibat interaksi dengan tanaman diketahui berada dalam plasmid (“Plasmid Sym”).

Ukurannya berkisar 200-300 kb dalam R. leguminosarum sampai 1200-1500 kb dalam R. meliloti.

Penggabungan ekspresi protein regulator pada gen tesebut, atau peningkatan sederhana jumlah



duplikat gen ditemukan untuk memproduksi peningkatan kecil namun berarti pada jumlah nitrogen

yang difiksasi pada tanaman inang yang sesuai.

Area lain yang memiliki potensi untuk perbaikan adalah interaksi antara inang-bakteri.Meskipun interaksi antara Rhizobium dengan inangnya sangat komplek, banyak gen yang sesuai

diidenfikasi. Rhizobium tidak hanya mengenali tanaman yang diujikan sebagai inang tetapi juga

menginduksi semua kumpulan reaksi didalamnya, yang menyebabkan akar-akar serabutmengeriting, benang infeksi terbentuk, benang tersebut kemudian berkembang menjadi membrane

yang menyelubungi bakteri. Bakteri ini juga menginduksi tanaman untuk mengeluarkan

leghemoglobin, memenuhi tempat disekitaran bakteri dan menyalurkan dengan konstan sejumlah besar sumber energi bagi bakteri (seperti asam dikarboksilik), seperti yang dijelaskan sebelumnya.

Seperti contohnya, produk gen Rhizobium nodD menanggapi senyawa flavonoid khusus yang

diproduksi oleh tanaman dan mengaktifkan gen lain yang terlibat dalam nodulasi. Dengan

menggabungkan susunan nodD, akan memungkinkan untuk mengubah (dan kadang memperluas)spesifikasi inang dari strain Rhizobium yang diujikan. Pada proses nodulasi berikutnya, produk gen

nodH dan nodQ Rhizobium mensintesis berat molekulaar rendah (low-molecular-weight) menandai

molekul yang dikenali oleh tanaman inang khusus, yang menanggapi keritingnya akar rambut dan

sebagainya. Mengganti gen dari spesies Rhizobium yang berbeda pada gen-gen tersebutmenghasilkan penggabungan yang sukses pada susunan inang.

Hasil ini sangat mengagumkan, tetapi belum ada yang mampu memproduksi strain“perbaikan” yang menunjukan secara efektif dibawah kondisi penelitian. Salah satu masalah utama

adalah bahwa strain yang dimasukkan dari sumber eksternal tidak selalu mampu bersaing pada

tanah alami. Lahan dimana tanaman leguminous ditumbuhkan pada basis regular, tanah yangdigunakan cenderung mengandung banyak strain Rhizobium yang khusunya cocok bertahan pada

lingkungan yang berbeda, meskipun efesiensi fiksasi N2nya bisa tidak bersaing dengan strain

rancangan terbaru. Studi menunjukan ketika strain Rhizobium yang seharusnya memfiksasi N2

yang lebih efisien dimasukkan pada lahan tersebut, strain ini sangat jarang mampu bertahan akantekanan reaksi dari strain asli. Tujuan lain dari pemasukan strain Rhizobium yang diatur secara

genetik supaya menempel pada hasil produksi kolonisasi yang lebih baik dan kelompok yang lebih

yang mampu bertahan—namun sayangnya, kondisi ini merupakan bidang yang sedikit diketahuioleh peneliti.

Usaha untuk memperluas jagkauan inang Rhizobium yakni untuk menyertakan tanaman

nonleguminous, telah disebutkan sebelumnya. Namun, sedikit dari sifat kompleks interaksiRhizobium—tanaman inang akan tidak mudah. Banyak penelitian dilakukan pada asosiatif dengan

alay fiksasi N2, yang hubungan simbiotiknya dengan tanaman jauh. Spesies Azospirillum misalnya,

tumbuh berasosiasi dengan tanaman bahan pangan monokotil seperti tanaman tebu, ikatan dengan

inangnya hanya berupa lembaran, dan sebagian besar mengkoloni pada permukaan akar. Ada hargayang harus dibayar untuk hilangnya ciri interaksi. Tanaman tidak dapat memnyediakan nutrisi

secara berkesinambungan ke bakteri dibawah kondisi seperti itu, efisiensi fiksasi N2 dalam sistem

seperti tersebut tidak dapat terbentuk dalam jumlah yang tinggi

Produksi Tanaman Transgenik

Seperti yang kita baca sebelumnya, penerapan bioteknologi yang penting dalam pertanianadalah produksi persediaan tanaman yang sudah diperbaiki. Pemasukan gen klon dengan ciri yang

diinginkan kedalam tanaman bukanlah permasalahan yang sepele. Sel tanaman dikelilingi oleh

dinding sel yang tebal dan kaku, dan DNA biasanya tidak bisa dimasukkan kecuali dinding sel

tersebut dihilangkan terlebih dahulu. Meskipun potongan DNA asing dapat dimasukkan kedalam



sel tanaman secara sukses, DNA tersebut tidak direplikasi pada keturunan yang sukses. Seperti

yang kita lihat pada Bab 3 dan 4, pendekatan sederhana untuk mengatasi kesulitan ini adalah

dengan meletakkan segmen klon DNA ke dalam plasmid, yang akan mereflikasi secara tak terbatas pada inang tertentu. Eukariotik rendah seperti yeast kadang-kadang mengandung plasmid, yang

digunakan untuk mengkonstruksi kumpulan vektor. Namun, sebagian besar sel tanaman tidak

diketahui apakah mengandung plasmid DNA. Pilihan yang lain, adalah menggabungkan DNA klonkedalam kromosom inang, namun ini merupakan peristiwa yang tidak pasti.

Untuk memproduksi tanamn transgenik, ada beberapa langkah-langkah penting yakni

pemasukan material genetik klon kedalam inti sel tanaman secara efisien dan penggabungan yangmudah gen klon kedalam kromosom tanaman. Akan sangat menarik jika digunakan metode terbaik

untuk melakukan langkah-langkah tersebut dengan menggunakan sistem yang sudah berada dalam

cirri dasar, sistem dimana plan-path-ogenic bakteri Agrobacterium tumefaciens memasukan

sejumlah DNA plasmidnya kedalam tanaman dan menyelipkannya kedalam genom tanaman.(penekanan ini merupakan pentingya praktik pada studi “sejarah sifat dasar interaksi Bakteri-

tanaman)

Pemasukan Gen Klon ke dalam Tanaman dengan Menggunakan Agrobacteriumtumefaciens.Gb. 9.3. Struktur Ti Plasmid, dengan wilayah vir nya dan T-DNA. Disamping itu, plasmid tersebut mengandungreflikasi asli dan beberapa gen yang membantu kolonisasi tanaman inang, seperti gen yang menurunkan oktopin dan

nopalin

A. Tumefaciens merupakan bakteri Gram-negative yang menyebabkan tidak terkontrolnya penggandaan sel yang ditransformasi, sel yang seperti sel tumor—penyakitnya diketahui sebagai

crown gall—pada tanaman inang. Menariknya, homologi rRNA menunjukan A. tumefacien

berhubungan dekat dengan Rhizobium, tetapi A. tumefaciens juga mengandung sejumlah besar (200 kb atau bahkan lebih) plasmid “penginduksi tumor”, Ti Plasmid(Gb. 9.3). Wilayah kecil

plasmid , wilayah vir (virulence), mengandung sekitar dua lusin gen yang terlibat dalam infeksi

tanaman dan pada transfer sejumlah kecil bagian plasmid, T-DNA, kedalam sel tanaman (Figure9.4). Baru-baru ini pengetahuan akan proses yang rumit ini menunjukan perkembangan yang

mengagumkan.Gen wilayah vir menjadi aktif menanggapi zat yang menetes dari jaringan tanaman yang

terluka. Zat ini merupakan tanda yang menunjukan sel A. tumefaciens yang berada didepantanaman yang terluka dan mudah diserang. Protein yang menyadari dan menannggapi tanda

tersebut, VirA dan VirG, merupakan anggota family protein regulator prokariotik, yang sering

disebut sistem dua komponen, yang membuat beberapa organisme mampu menanggapi secaraadaptip untuk mengubah keosmolaran, ketersediaan sumber nitrogen, keberadaaan

chemoattractant, dan sebagainya (Gb. 9.5). Sistem dua komponen secara khusus mengandung



protein sensor yang terletak dalam membrane sitoplamik. Keberadaan molekul sinyal

mengaktifkan fungsi protein kinase dari sensor ini, dengan konsekuensi posporilasi pada

komponen kedua, regulator respon dan protein transducer. Posporilasi ini mengaktifkan regulator respon, dan contohnya dapat mengaktifkan transkripsi dari gen yang bersangkutan.

Gb. 9.4. Susunan dan fungsi wilayah virulen Ti Plasmid. Tnada panah besar menunjukkan arah transkripsi. C dan M

menunjukkan sitoplasmik dan lokasi membran produk gen secara berturut-turut. Menurut Zambryski, P. (1988) proses-proses dasar yang mendasari Agrobacterium —memediasi transfer DNA kedalam sel tanaman, Ann. Rev.

Genet. 22:1-30; dan Kuldau, G.A.,et al. (1990) operon virB Agrobacterium tumefaciens pTiC58 mengkode 11 ORF,

Mol. Gen. Genet . 221:256-266.

Gb. 9.5. Sistem regulator dua komponen bakteri. Sebuah sistem disusun oleh dua protein, histidin kinase dan

regulator respon. Sekarang diketahui lebih dari lusinan contoh. Semua histidin kinase sama sesuai dalam pemberian

tiga wilayah homologi (ditunjukan dengan I, II, III) dan semua regulator respon memberikan susunan yang sama

pada wilayah N-terminalnya. (ditunjukan dengan kotak). Pada banyak kasus, histidin kinase merupakan membrane protein (wilaya tak tertuga trans-membran ditunjukan dengan kotak hitam) dan merasakan sifat dasar dari

lingkungan luar—sebagai contoh, tekanan osmosis (EnvZ), keberadaan hexose fospat (UhpB), atau keberadaan

tanda dari tanaman terluka seperti asetosiringone (VirA). Pengaktifan histidin kinase menghasilkan posporilasi

residu histidin yang diawetkan pada wilayah I protein ini, kemudian fospat ditransfer ke residu aspartat terawetkan pada protein regulator respon. Ini kemudian mengaktifkan regulator respon, yang secara khusus mempengaruhi

kadar transkripsi relevan gen (OmpR, diposporilasi oleh EnvZ, meregulasi gen porin; UhpA, diposporilasi oleh

UhpB, meregulasi ekspresi pengangkutan gen hexose fosfat, and VirG, diposporilasi oleh VirA, menstimulasi

transkripsi gen vir ). Beberapa sistem memiliki sitosolik histidin kinase, seperti CheA yang berfungsi padakemotaksis dengan memposporilasi CheY, yang bertindak mengartikan rotasi flagellar. Untuk penjelasan terbaru

tentang sistem dua komponen, lihat Parkinson, J.S., dan , E.C. (1992), Ann.Rev.Genet.26:71-112.

Gb. 9.6.

Struktur asetosiringone

Pada sistem VirA-VirG, VirA sebagai protein membran, rupanya bersikap sebagai sensor. VirA diaktifkansecara sinergis oleh keberadaan senyawa phenolik, seperti asetosiringon (Gb. 9.6), keluarnya jaringan tanaman yang

rusak, dan keberadaan D-glukosa, D-galaktosa, I-arabinose, dan gula lain yang umum terdapat di tanaman. Gula

tersebut terikat pada protein pengikatan dalam periplasma, dan kemudian protein pengikat berinteraksi dengan

wilayah periplasmik VirA. Mekanisme interaksi asetosiringon masih belum jelas diketahui. VirA yang aktif



memposporilasi wilayah sitoplasmiknya sendiri, dan kelompok fosfat ditransfer kedalam VirG, yang berada dalam

sitoplasma. VirG yang diposporilasi kemudian mengikat wilayah promoter dari gen vir yang lain dan mengaktifkan

transkripsinya.

Langkah selanjutnya adalah menyayat Ti DNA pada titik khusus dengan “nucleus pembatas” yang dikode

oleh gen virD1 dan virD2. Fragmen DNA standar tunggal yang kira-kira 22 kb disebut T-strand, disadari dihasilkandari reaksi pelepasan, dan pada waktu yang sama, strand pengganti disintesis (Gb. 9.7). Proses tersebut dilanjutkan

dengan transfer T-strand secara rapi, yang dimulai dengan pembatasan “kanan”, kedalam sel tanaman. Prosestersebut-penyayatan DNA strand ganda dan pelepasan serta pemasukan fragmen strand tunggal-sungguh sama

dengan peristiwa yang terjadi pada konjugasi bakteri, dan dua proses diperkirakan memiliki origin biasa yang

evolusioner.

Gb. 9.7. Penyayatan dan transfer T-DNA. Ujung panah yang di atas menunjukan susunan pembatas 25-bp, yang

dibelah dengan endonukleus khusus. Sintesa stran pengganti (garis putus-putus) menghasilkan T-DNA sebagai

strand tunggal (T strand), yang dimasukkan kedalam sel tanaman. Dari Zambryski,P ., et al (1989), Transfer dan

Fungsi gen T-DNA Plasmid Ti dan Ri Agrobacterium dalam tanaman, cell 56:193-201, dengan perseijinan

Produk dari gen VirE2, DNA strand tunggal yang mengikat protein, mengikat T-strand, sepertinya

memudahkan pelepasan dan pemasukan. Protein VirD2 berdempetan dengan ujung 5’ T-strand dan diperkirakan

berfungsi sebagai “pengemudi” yang mengantarkan DNA kedalam sel tanaman.

Penyuntikan dikatalisasi oleh produk gen vir B. Lokus vir B berisi 11 gen, fakta yang rupanya menunjukkan

kerumitan proses pengangkutannya. Beberapa dari virB ditemukan dalam membrane sitoplasmik, dimana gen-gen

ini berfungsi sebagai saluran. Setidak-tidaknya salah satu dari gen tersebut berisi sebuah binding fold-nukleotida dan

dihipotesis menjadi pasangan ATP hidrolisis pada proses transfer.Setelah T-strand disuntikan kedalam sel tanaman, T-strand harus memasuki sel intisel, strand pelengkap

harus disintesis, dan produk strand ganda, T-DNA harus digabungkan dengan genom tanaman. Proses ini masih

belum banyak bisa diidenfikasi.

Ketika T-DNA telah digabungkan kedalam salah satu kromosom tanaman, beberapa gen pada fragmen

mulai diekspresi. Gen-gen tersebut mengkode sintesis opin dan hormon tanaman. Opin (asam amino derivative yang

hanya bisa dipakai oleh sel anggota Agrobacterium; lihat Gb. 9.8) memudahkan penyerangan pada tanaman oleh

banyak sel Agrobacterium, dan hormon (auxin: asam indoleasetik, sitokinin: N6-isopentiladenin) menstimulasi divisi

dan pertumbuhan sel tanaman, yang memproduksi ciri tumor atau gall.



Gb. 9.8. Struktur opin, oktopin, dan nopalin. Senyawa ini dibuat dari residu arginina (ditulis tebal) digabungkan

dengan senyawa acidic. Agrobacterium juga memproduksi family senyawa yang sama dimana residu argenina

diganti oleh asam amino dasar yang lain.

Sistem Ti Agrobacterium tampaknya hampir dibuat jahitan untuk ekploitasi yang dilakukan

oleh ilmuwan bioteknologi. Transfer T-DNA ditentukan secara esensial dengan pengulangan

“tepi” 25-bp. DNA diantara pengulangan tersebut ditransfer dan diintegrasi tanpa memperhatikan

susunannya. Karena itu, insersi materi genetis yang tak berhubungan ke tengah segmen T-DNA

plasmid tidak memiliki pengaruh negatif pada transfer dan integrasi segmen tersebut ke dalam sel

inang.

Sayangnya, plasmid Ti terlalu besar untuk dimanipulasi secara in vitro. Oleh karena itu,

bagian DNA asing yang diklon hampir selalu dimasukkan ke dalam plasmid vektor yang lebih

kecil terlebih dahulu. Kemudian satu dari dua strategi digunakan untuk mentransfer susunan yang

diklon ke dalam tanaman.

• Penggunaan kointegrasi menengah. Dalam hal ini, lebih sering frekuensi metode

yang digunakan, gen asing diinsersi ke dalam vektor kecil, seperti turunan pBR322

(begitu sering digunakan untuk kloning dalam E .coli), dengan metode in vitro yang biasa

dilakukan dalam teknologi DNA rekombinan. Kemudian sel A. tumefaciens yang

mengandung plasmid Ti yang dimodifikasi (memproduksi non-tumor) diubah dengan

plasmid rekombinan ini. Plasmid Ti yang dimodifikasi juga mengandung potongan

susunan pBR322 diantara tepi kanan dan kiri daerah T-DNAnya. Karena homolog

dengan replikon pBR322 ini, rekombinasi dapat terjadi untuk meregenerasi suatu plasmid

kointegrasi yang mengandung keseluruhan susunan dari plasmid yang lebih kecil antara

tepi T-DNA bagian kanan dan kirinya (gambar 9.9). Jika populasi dipilih untuk

keberadaan gen penanda, seperti gen plasmid pBR322 yang resisten terhadap obat-

obatan, hanya sel-sel yang mengandung kointegrasi yang bertahan dari seleksi. Sel yang



terkointegrasi menginjeksi susunan diantara kedua tepi, yang mengandung gen asing, ke

dalam tanaman.

Metode kointegrasi memiliki beberapa kebalikan. Potongan DNA yang diinjeksi

relatif besar, mengandung banyak informasi yang tidak berkaitan, jadi susah untum

mengontrol proses transfer gen dengan pasti. Seringkali, hanya sebagian dari DNA ini

yang terintegrasi dalam genom tanaman. Lebih jauh lagi, gen “penanda” resisten

terhadap antibiotik mungkin ditransfer dalam plasmid Ti dengan mekanisme selain

rekombinasi homolog, dan karenanya tidak ada jaminan bahwa sel donor Agrobacterium

mengandung kointegrasi yang diharapkan. Akhirnya, mengetahui struktur kointegrasi

dengan metode in vitro biasa sulit dilakukan karena ukurannya yang besar. Pertimbangan

atas poin ini menimbulkan perkembangan pendekatan plasmid biner.

• Penggunaan vektor biner . Metode ini mengambil keuntungan dari fakta bahwa gen-

gen vir pada suatu plasmid dapat mengkatalis pemotongan dan transfer susunan T-DNA

yang berlokasi pada plasmid lainnya; itulah, gen-gen ini dapat bertindak dalam trans.

Pendekatan plasmid biner meliputi kloning fragmen DNA yang diinginkan ke dalam

susunan T-DNA vektor plasmid dengN cakupan inang yang luas yang mampu bereplikasi

baik dalam E. coli maupun A. tumefaciens. Plasmid DNA kemudian dimasukkan ke

dalam sel A. tumefaciens yang mengandung plasmid Ti “dilucuti” dengan gen-gen vir

kecuali susunan T-DNA. Gen-gen vir dari plasmid yang dilucuti mempengaruhi transfer T-DNA sari plasmid lain tanpa pembentukan kointegrasi menengah (gambar. 9.10).

Dalam metode ini, hanya potongan DNA yang telah diselipkan diantara tepi kanan dan

kiri dari plasmid yang lebih kecil yang ditransfer ke dalam tanaman, memungkinkan

kontrol proses secara lebih tepat.

Kedua metode ini memerlukan beberapa perubahan dalam plasmid Ti. Dalam plasmid Ti

yang digunakan untuk metode kointegrasi, gen-gen penghasil tumor dinonaktifkan atau

dihilangkan; sebaliknya, sel-sel tanaman yang berubah akan menjadi tumor, bukan “tanaman

transgenic” sehat. Terlebih lagi, susunan pBR diinsersi ke dalam daerah T-DNA, sebagaimana

ditunjukkan dalam gambar 9.9. Dalam plasmid Ti yang digunakan untuk strategi plasmid biner,

keseluruhan wilayah T-DNA dihilangkan (lihat gambar 9. 10); sebaliknya, T-DNA dari plasmid Ti

akan bersaing dengan injeksi T-DNA dari plasmid yang lebih kecil.



Strategi manapun yang digunakan, site insersi gen-gen asing biasanya terapit diantara

susunan promoter yang berfungsi secara efektif dalam tanaman dan susunan terminator. Protein

promoter 35S dan virus mozaik bunga kol (CaMV) cukup dikenal karena kemampuan ekspresinya

yang tinggi dalam berbagai varieatas tanaman. Susunan terminator yang terkenal adalah susunan

nopalin sintetase. (Suatu terminator efektif menjamin ujung 3’ dari mRNA diproses dan

dipoliadenilasi sehingga mRNA memperoleh tingkat stabilitas yang memadai).

Disamping itu, daerah yang dimasukkan dalam tanaman harus mengandung penanda yang

baik sehingga sel-sel tanaman yang telah menerima dan mengintegrasi gen-gen asing dapat

diterima dengan mudah. β-Glukuronidase merupakan suatu penanda yang aktivitasnya dapat siap

dideteksi dalam jaringan tanaman. Bahkan penanda yang lebih bermanfaat adalah yang

memungkinkan pemilihan, tidak hanya menutupi, untuk sel-sel tanaman dengan T-DNA yang

terintegrasi. Sekarang ini, penanda yang paling populer dari jenis ini adalah gen neomisin

(aminoglikosida) fosfotransferase II, yang secara efektif menonaktifkan antibiotik aminoglikosida

yang aktivitasnya dapat terdeteksi melawan sel tanaman, seperti neomisin dan kanamisin.

Gambar 9.9

Transfer T-DNA melalui pembentukan kointegrasi plasmid. Plasmid pBR mengandung suatu

penanda yang dapat dipilih dalam A. tumefaciens, seperti penanda resistensi terhadap antibiotik

yang sesuai )kotak terbuka). DNA asing diklon dalam plasmid pBR, dan plasmid gabungan



dimasukkan dalam A. tumefaciens yang telah mengandung plasmid Ti yang sudah “dilucuti dengan

menghilangkan gen-gen yang bertanggungjawab atas produksi tumor dan telah diubah lebih jauh

dengan menggabungkan fragmen kecil dari susunan pBR di tengah T-DNA. Asal replikasi dalam

plasmid pBR berfungsi dengan baik dalam E. coli tapi tidak berfungsi sama sekali dalam A.

tumefaciens. Karenanya pemilihan antibiotik hanya memperkaya sel-sel yang mengandung

kointegrasi, yang dibentuk dengan rekombinasi homolog, menggunakan susunan homolog pBR,

diantara plasmid Ti dan plasmid pBR. Karena kointegrasi mengandung seluruh gen vir , gen asing

tersebut akan ditransfer ke dalam tanaman sebagai bagian dari T-DNA yang termodifikasi. Dari

Lurquin, P.F. (1987). Ekspresi gen asing dalam sel tanaman, Prog. Nucl. Acid Res. 34:143-188,

dengan ijin.

Gambar 9.10. Transfer T-DNA dengan sistem vektor biner. DNA

asing diklon ke tengah plasmid T-DNA, ditunjukkan di bagian

atas, yang mengandung satu atau lebih origin replikasi yang

berfungsi baik dalam E. coli maupun dalam A. tumefaciens.

Dalam vektor tertentu yang ditunjukkan, susunan T-DNA asli

telah digantikan oleh site kloning berganda (MCS), diikuti oleh

suatu susunan terminator fungsional dalam tanaman, bertempat

diantara susunan tepi kiri (LB) dan kanan (RB). Plasmid tersebut

juga mengandung gen resisten terhadap antibiotik (dalam hal ini

aminoglikosida fosforitransferase, aph, untuk memungkinkan

pemilihan sel yang mengandung plasmid pada cawan yang berisi

aminoglikosida). Plasmid gabungan ini dimasukkan ke dalam sel

A. tumefaciens yang mengandung plasmid lainnya, ditunjukkan di bagian bawah. Plasmid yang

lebih besar, suatu turunan plasmid Ti, hanya mengandung daerah vir dan origin replikasi dan

secara keseluruhan tidak ada wilayah T-DNA. Karena kedua plasmid tidak memiliki susunan

umum, tidak ada pembentukan gabungan dan kointegrasi. Meskipun demikian, produk gen vir

pada plasmid yang lebih besar dapat memediasi transfer tersebut, ke dalam tanaman, dari susunan

T-DNA plasmid lainnya.



Contoh-contoh Tanaman Transgenik

Kami contohkan A. tumefaciens

Sistem Agrobacterium merupakan sistem yang mengagumkan untuk memasukkan gen asing ke

dalam kromosom tanaman. Transfer ke dalam sel tanaman utuh terjadi pada frekuensi tinggi, T-

DNA juga biasanya terintegrasi ke dalam kromosom tanaman pada frekuensi tinggi tanpa

mengalami perubahan structural, dan sel-sel yang telah menerima T-DNA dapat dipilih dengan

mudah dengan menggunakan resisten antibiotik sperti penanda resisten terhadap neomisin.

Akhirnya, tanaman transgenic diproduksi dengan cara ini cukup stabil setidaknya untuk beberapa

generasi. Akibatnya, hampir seluruh tanaman transgenic yang ada dengan ciri-ciri yang secara

potensi diinginkan telah dikumpulkan dengan metode ini.

Dalam kasus yang lebih sederhana, ciri-ciri yang diinginkan muncul dalam tanaman

transgenik melalui ekspresi berkelanjutan dari gen-gen asing. Di bawah ini kami mendaftar

beberapa contoh tanaman transgenic jenis ini.

Tanaman yang Resisten terhadap Herbisida

Keuntungan membuat tanaman panen resisten terhadap herbisida telah terbukti nyata.

Walaupun ada ketakutan bahwa resistensi semacam ini dapat dengan cepat meningkatkan

penggunaan bahan kimia herbisida, terdapat beberapa alasan untuk mengharapkan bahwa tanaman

transgenik ini akan mempromosikan penggunaannya yang lebih aman, herbisida yang dapat

terdegradasi, mungkin dalam jumlah yang lebih sedikit. Satu contoh meelibatkan herbisida

glikofosfat, yang menginhibisi 5-enolpirovilshikimat 3-fosfat sintase – suatu enzim yang terlibat

dalam biosintesis asam amino aromatik – dengan berperan sebagai analog structural dari fosfoenol

piruvat (Gambar 9.11). Enzim ini telah dimurnikan dari tanaman panen dan disusun, dan probe

DNA yang berhubungan dengan susunan assam aminonya telah disintesis. Probe ini digunakan

untuk mengisolasi cDNA untuk enzim dari baris penyimpanan cDNA sel tanaman yang diketahui

untuk memproduksi 5-enolpiruvilsikamat 3-fosfat sintase. Gen cDNA kemudian diklon dibelakang

promoter CaMV kuat, dan kompleks gen promoter dimasukkan ke dalam sel tanaman (sebagai

contoh, petunia) melalui vektor plasmid Ti yang dilucuti. Tanaman transgenik memperoduksi

enzim target yang jauh lebih tinggi levelnya dan karena itu secara signifikan lebih resisten terhadap

glikofosfat (Gambar 9.12). Hasil ini memberikan harapan karena glikofosfat memiliki kadar racun

yang sangat rendah, untuk hewan dan didegradasi secara cepat dalam tanah.



Variasi strategi ini merupakan pemasukkan gen-gen mutan dari enzim target. Campuran

Sulfonilurea beraksi pada tanaman dengan menghambat asetolaktat sintase, suatu enzim yang

terlibat dalam cabang rantai sintesis asam amino. Mutan tanaman yang ditunjukkan resisten

terhadap herbisida yang dipilih dalam Arabidopsis ini. Ukuran yang kecil dan generasi yang

pendek (Kotak 9.1) dari Arabidopsis memungkinkan pemilihan tipe ini pada keseluruhan level

tanaman. Gen asetolaktat sintase dari mutan Arabidopsis diklon dengan menggunakan susunan

homolog dengan enzim yeast yang diketahui dan ditunjukkan untuk membedakan oleh basa

tunggal dengan tipe liar, berakibat pada perubahan residu asam amino tunggal. Ketika gen mutan

ini dimasukkan ke dalam tanaman tembakau, tanaman transgenik hampir 100 kali resisten terhadap

sulfonylurea klorosulfuron.

Mengubah level atau sifat enzim yang ditargetkan dengan herbisida karenanya merupakan

pendekatan yang efektif untuk memproduksi tanaman yang resisten terhadap herbisida. Meskipun

demikian, pendekatan ini memiliki beberapa keterbatasan. Pertama, hanya menghasilkan resistensi

tingkat sedang, karena jumlah herbisida yang lebih besar akan tetap menghambat enzim target

yang diproduksi secara berlebih atau yang kurang sensitif. Kedua, produksi yang berlebihan dari

salah satu enzim dalam jalur kompleks dapat mengganggu pengaturan jalur tertentu dan bisa

memperlambat pertumbuhan tanaman. Ketiga, sulit untuk mengubah suatu enzim sehingga enzim

tersebut belum dapat mengikat analog racun dengan baik berlanjut untuk mengikat substrat yang

sebenarnya dalam cara yang melebihi atau kurang normal. Anggapan seperti ini telah mendorong

eksplorasi metode alternatif untuk mengembangkan resistensi terhadap herbisida dalam tanaman.

Satu teknik yang sangat sukses dalam hal produksi resistensi pada tanaman transgenik

merupakan pemasukan gen-gen yang mengkode enzim herbicide-detoxifying. Sebuah contoh

menarik melibatkan fosfinotrisin, suatu analog asam glutamik yang menghambat glutamine

sintetase (Gambar 9.13). Walaupun fosfinotrisin disintesis secara kimia dan dijual secara komersial

sebagai herbisida, senyawa itu sebenarnya ditemukan separuh aktif dari antibiotik, bialaphos,

diproduksi oleh suatu strain Streptomyces. Seperti yang dijelaskan dalam bab 13, mikroorganisme

yang mensekresi antibiotik seringkali memproduksi enzim-enzim yang menguraikan racun

antibiotik untuk melindungi dirinya sendiri. Streptomyces yang memproduksi bialaphos bukanlah

suatu perkecualian, dan Streptomyces memproduksi enzim yang menonaktifkan baik bialaphos

maupun fosfinotrisin oleh asetilasi. Gen yang mengkode enzim ini diklon dari Streptomyces,

diletakkan di belakang promoter CaMV 35S, dan dimasukkan ke dalam tanaman yang dipanen,



seperti kentang. Tanaman transgenik menunjukkan resistensi yang kuat terhadap fosfinotrisin,

bahkan dalam tes dibawah kondisi lapangan.

Gambar 9.11

Glikofosfat dan cara reaksinya. Glikofpsfat, bertindak sebagai suatu analog fosfoenolpiruvat,

menghambat pembentukan 5-enolenolpiruvilsikamat 3-fosfat, suatu prekusor asam amino

aromatik.

Gambar 9.12

Produksi tanaman resisten terhadap gliposat. Gen untuk 5-enolenolpiruvilsikamat 3-fosfat sintase,

diklon di belakang promoter kuat, dimasukkan ke dalam tanaman petunia sebagaimana diterangkan

dalam teks. Ketika tanaman petunia transgenik ini (atas) dan tanaman kontrol yang tak diubah



(bawah) disebarkan dengan Roundup (suatu pestisida yang mengandung glikoposat), setelah tiga

minggu tanaman kontrol mati tapi tanaman transgenik, tanaman yang resisten benar-benar sehat.

Dari Shah, D.M., et al. (1986), teknik toleransi terhadap herbisida dalam tanaman transgenik,

Science 233: 478-481, dengan ijin.

Kotak 9.1 Arabidopsis

Arabidopsis merupakan tanaman krusiferus kecil yang secara cepat menjadi spesies pilihan untuk

studi genetic dan DNA rekombinan dalam tanaman – hal ini mengasumsikan seperti posisi E. coli

diantara prokariot. Keuntungannya yang banyak meliputi genom yang berjumlah sedikit (70,000

kb, hanya 5 kali ukuran genom ragi dan hanya 10% ukuran genom tanaman panen khusus) dengan

jumlah DNA repetitive yang sedikit. Arabidopsis juga memiliki siklus reproduksi yang cepat

(benih dapat dikumpulkan 6 minggu setelah perkecambahan); melakukan penyerbukan sendiri, jadi

strain mutan dapat dirawat dengan mudah; dan dapat menjadi suspect pengubahan Ahrobacterium,

jadi materi genetic dapat dimasukkan dengan metodologi DNA rekombinan. Untuk tinjauan, Lihat

Estelle, M.A., dan Somerville, C.R. (1989). Mutan-mutan Arabidopsis, Tr. Genet . 2:89-93; dan

Meyerowitz, E.M. (1989). Arabidopsis, rumput laut yang berguna, Sel 56:263-269.

Gambar 9.13

Fosfinotrisin dan cara reaksinya. Fosfinotrisin merupakan analogi glutamate. Fosfinotrisin

berikatan dengan glutamate sintetase untuk menghambat sintesis glutamine. Bialaphos, suatu

antibiotik yang diproduksi oleh spesies Streptomyces, merupakan tripeptida (fosfinotrisinil-alanil-

alanin) yang diubah menjadi fosfinotrisin oleh peptidase tanaman.



Tanaman yang Resisten terhadap Serangga

Bacillus thuringiensis digunakan dalam kontrol biologis ulat karena sel-sel yang berspora

mengandung protein racun (Bab 6). Gen untuk suatu protein racun diklon di belakang promoter

yang secara efektif diekspresi dalam tanaman dan dimasukkan ke dalam sel tanaman melalui

vektor plasmid Ti, sehinggamenghasilkan tanaman yang beracun bagi ulat. Masalah terbesarnya

dengan cara ini adalah rendahnya tingkat ekspresi protein racun dalam tanaman, yang agaknya

berhubungan dengan fakta bahwa gen tersebut berasal dari suatu bakteri. Namun, metode ini telah

memproduksi tanaman tomat dan tembakau yang terbukti cukup resisten terhadap ulat dalam lahan

yang diujikan. Bagaimana pun juga, kapas, seringkali diserang serangga yang lebih resisten

terhadap racun B. thuringiensis, dan tingkat ekspresi yang rendah dari racun ini dalam kapas

transgenik menyediakan sedikit perlindungan bagi tanaman. Baru-baru ini, susunan pengkode dari

racun tersebut diubah secara meluas untuk menggantikan kodon yang jarang digunakan dalam

tanaman selain juga untuk menghalangi pembentukan struktur sekunder yang kuat dalam mRNA.

Saat tanaman kapas disediakan dengan gen yang termodifikasi (ditempatkan di belakang promoter

CaMV dengan daerah yang mempertinggi duplikasi), produksi racun bakterinya meningkat 100

kali, dan tanaman-tanaman itu menunjukkan resistensi yang mengesankan terhadap serangga

Lepidoptera biasa yang merusak tanaman tak termodifikasi.

Beberapa benih mengandung konsentrasi penghambat protease yang tinggi, yang dipikirkan

untuk mengganggu proses pencernaan serangga. Kloning gen penghambat tripsin cowpea, sebagai

contoh, dan transfernya ke tanaman tembakau telah menghasilkan ketahanan yang baik terhadap

berbagai jenis serangga pemakan daun. Dalam hal ini, tidak ada masalah dengan ekspresi

proteinnya. Produksi protein itu mencapai tingkat setinggi 1% dari totao protein tanaman, agaknya

karena gen yang diklon berasal dari tanaman asli. Juga berbeda dengan racun B. thuringiensis,

perlindungan itu mencakup berbagai jenis serangga secara luas.

Tanaman yang Resisten terhadap Virus

Metode yang paling sering digunakan untuk memproduksi tanaman yang resisten terhadap virus

terbuka dari observasi dimana, seringkali, tanaman yang terinfeksi oleh virus yang hampir bersifat

virulen kemudian resisten terhadap superinfeksi virus yang sangat virulen dan masih berkaitan.

Karenanya, infeksi yang disengaja dengan strain virus avirulen telah digunakan untuk

memproduksi perlindungan pada tanaman panen. Bagaimanapun, metode tersebut tidak aman



secara total, karena strain yang avirulen mungkin bermutasi untuk memproduksi strain yang

patogen secara signifikan. Sebagian besar virus tanaman merupakan virus strand RNA positif yang

dilapisi oleh sub unit protein (Gambar 9.14). Ketika virus tersebut memasuki sel tanaman yang

terluka, proses replikasi dimulai, dimulai dari pelucutan progresif dari virus dari ujung RNA 5’.

Berbagai observasi menyatakan bahwa resistensi silang antar virus terjadi karena keberadaan

selimut protein virus dalam sel tanaman yang terinfeksi sebelumnya dipengaruhi oleh proses

pelucutan lapisan selimut virus ini. Tentunya, tanaman transgenik, yang genomnya mengandung

gen-gen protein selimut virus mozaik tembakau (TMV) yang disisipkan dan yang secara

berkesinambungan mensintesis protein selimut, menunjukkan resistensi terhadap infeksi virus.

Fenotif tanaman ini sesuai dengan pemikiran bahwa resistensi merupakan hasil dari terbukanya

lapisan selimut partikel virus: Walaupun sel tanaman resisten terhadap partikel TMV utuh, sel-sel

tersebut masih sensitif terhadap RNA TMV atau partikel TMV yang tak diselimuti protein virus.

Gen selimut protein biasanya diletakkan di belakang promoter kuat seperti promoter 35S

CaMV dan dimasukkan ke dalam genom tanaman melalui sistem Ti Agrobacterium. Tanaman

transgenik menunjukkan ketahanan yang signifikan terhadap TMV, virus mozaik alfalfa, virus

mozaik mentimun, virus streak tembakau, dan virus derik tembakau telah diproduksi dengan cara

ini. Dalam eksperimen baru-baru ini, dua gen protein selimut virus, dari virus kentang X dan virus

kentang Y, dimasukkan secara serempak ke dalam kultivar kentang yang penting secara komersial,

dan salah satu tanaman transgenik yang dihasilkan terbukti cukup tahan terhadap kedua jeis virus

di bawah kondisi lapangan yang dites. Dalam sebagian besar sistem, tingkat ketahanan lebih atau

kurang sejajar dengan tingkat selimut protein yang dihasilkan.

Pendekatan lainnya untuk menciptakan tanaman yang resisten terhadap virus melibatkan

kloning gen satelit RNA. Populasi dari beberapa virus tanaman meliputi partikel subpopulasi yang

menyerupai virus yang mengandung molekul DNA yang lebih kecil disebut RNA satelit. RNA

satelit tidak tampak mengkode protein apa pun, tapi bereplikasi dengan enzim yang dikode untuk

RNA virus normal dan kemudian dikemas ke dalam partikel yang menyerupai virus dengan

selimut protein virus. Yang menarik adalah bahwa beberapa RDA satelit menghambat replikasi

virus dengan kuat, sepertinya karena memiliki afinitas yang sangat tinggi terhadap alat replikasi

virus. Sehingga saat cDNA dibuat dari satelit RNA diselipkan di antara promoter CaMV 35S dan

terminator yang sesuai dan ditransfer ke dalam tanaman melalui sistem Agrobacterium, banyak

tanaman transgenik menunjukkan ketahanan signifikan terhadap virus ringspot tembakau dan virus



mozaik mentimun. Sebuah promoter kuat diperlukan karena RNA satelit harus diproduksi dengan

transkripsi “gen” ini. Dibandingkan dengan ketahanan yang dihasilkan oleh produksi selimut

protein berlebih, jenis ketahanan ini dilaporkan lebih sulit ditangani dengan dosis virus yang lebih

tinggi.

Di masa depan, dimungkinkan untuk mengambil keuntungan dari “respon hipersensitif”

dengan dimana tanaman bereaksi terhadap infeksi virus, bakteri dan fungi. Satu aspek dari respon

ini adalah produksi metabolit sekunder dengan berat molekuler rendah, seperti phytoalesxins

(Kotak 9.2). Tampaknya peningkatan genetis dari reaksi ini akan memproduksi tanaman dengan

resistensi umum terhadap agen infeksi dengan cakupan yang luas. Merupakan suatu pendekatan

yang cukup sulit secara teknis, karena gen-gen yang terlibat diatur dalam cara yang rumit.

Gambar 9.14. Struktur TMV (virus mozaik tembakau). Gambar ini menunjukkan hanya 1/20 dari

panjang partikel virus berbentuk batang. RNA rantai tunggal digulung diantara heliks yang

dibentuk oleh subunit protein. Untuk RNA virus yang akan direplikasi, pertama-tama harus dibuka

selimutnya dengan protein pembersih. Proses ini dimulai dari ujung 5’ dari RNA. Dan

dilangsungkan dengan proses translasi menggunakan RNA virus ini sebagai pesannya. After Klug,

A., dan Caspar D.L.D. (1960), Struktur virus-virus kecil, Adv. Virus Res. 7:225-325, dengan ijin.

Kotak 9.2.

Tidak seperti hewan, tanaman tidak dapat memproduksi antibody untuk melawan mikroorganisme

penyerang. Banyak tanaman memproduksi, sebagai suatu respon terhadap infeksi mikroba,

metabolit sekunder dengan berat molekul rendah – fitoaleksin – yang menghambat pertumbuhan



mikroorganisme penyerang. Struktur fitoaleksin bersifat spesifik pada spesies tanaman yang

menghasilkannya. Di sini kami menunjukkan dua contoh, faseolin (suatu gabungan isoflavonoid

yang diproduksi oleh kacang hijau) dan rishitin (suatu norsesquiterpene yang diproduksi oleh

kentang).

Modifikasi Gen-gen Tanaman Endogen

Dalam sebagian besar contoh yang telah kita diskusikan, tanaman panen telah

dikembangkan dengan memasukkan gen-gen yang diambil dari organisme yang terkait. Tanaman

transgenik telah didesain untuk mengekspresi gen-gen ini sesuai aturan, seringkali pada tingkatan

yang cukup tinggi. Namun, hal ini bukan merupakan satu-satunya cara untuk memproduksi

peningkatan stok. Banyak pengembangan dapat diajukan dengan menggunakan teknologi DNA

rekombinan untuk mengubah gen-gen endogen spesies.

Satu wilayah dimana beberapa kesuskesan telah dicapai melalui cara ini yaitu modifikasi

warna bunga. Jalur biosintesis pigmen bunga diketahui secara detail, jadi dimungkinkan untuk

membawan gen dari spesies tanaman yang berbeda untuk menghasilkan warna yang “tidak alami”

yang secara dramatis mengubah penampilan bunga tersebut. Salah satu contoh, gen jagung

dimasukkan ke dalam petunia (melalui agen sistem Agrobacterium) untuk menghasilkan bunga

dengan warna merah bata.

Aktivitas lainnya yang sangat menarik adalah upaya utuk menunda pelunakan buah, seperti

tomat. Memperlambat proses pelunakan akan memperpanjang waktu penyimpanan buah-buahan

dan memudahkan transportasinya. Bukti menunjukkan bahwa hidrolisis poligalakturonat, suatu

komponen polisakarida dinding sel buah-buahan, dengan enzim poligalakturonase terlibat dalam

pelunakan tomat. Gen yang mengkode enzim ini diklon, dan diletakkan di belakang promoter

CaMV 35S kuat dalam orientasi terbalik. Konstruksi ini kemudian dimasukkan ke dalam tanaman

tomat melalui sistem Ti Agrobacterium. Tanaman transgenik yang dihasilkan, memproduksi



poligalakturonase dalam tingkat yang jauh lebih rendah, karena “antisense mRNA” yang

dihasilkan dari pembacaan gen dalam orientasi terbalik dengan translasi mRNA normal, mungkin

dengan cara mendinginkannya. Namun, efek terakhir dari rendahnya ekspresi poligalakturonase

kontroversial, beberapa pengujian tidak menunjukkan perbedaan baik dalam proses pelunakan

maupun dalam hirolisis pektin dinding sel. Meskipun demikian, pengurangan tingkat enzim ini

tampak menghambat degradasi pektin menjadi fragmen-fragmen kecil, dan dilaporkan mengurangi

kerusakan selama perpindahan. Salah satu versi tomat yang direkayasa ini sekarang sedang

dipasarkan di Amerika Serikat. Walaupun ada keprihatinan atas keberadaannya, dalam produk

seperti ini, dari gen-gen yang resisten terhadap antibiotik yang digunakan untuk memilih sel

tanaman trasgenik, terdapat beberapa metode yang dapat dilakukan untuk menghilangkan gen-gen

penanda dari tanaman.

Wilayah nyata untuk eksploitasi masa depan adalah modifikasi susunan nukleotida gen-gen

untuk protein biji-bijian baik untuk meningkatkan nilai nutrisi atau mengembangkan kualitas

prosesnya, seperti disebutkan di awal bab ini. Beberapa contoh lainnyajuga telah diuraikan. Akan

tetapi upaya-upaya untuk mengembangkan hasil panen tanaman atau untuk mengubah sifatnya

dalam cara utama biasanya membutuhkan manuver rumit dan tajam. Tanaman merupakan

organism kompleks yang mengandung organ dan jaringan yang sangat berdiferensiasi yang diatur

dalam tata cara yang bergantung pada waktu dan lingkungan. Tantangannya adalah untuk

menemukan cara pengaturan gen-gen endogen dalam cara yang terkoordinasi secara seksama. Ini

merupakan tujuan yang sulit, tapi mungkin dapat dicapai, mempertimbangkan bahwa kemajuan

kuat sedang dibuat dalam pengertian kita tentang bagaimana gen-gen tanaman diatur.

Sistem Agrobacterium telah digunakan dalam memproduksi hampir seluruh contoh

tanaman transgenik yang telah dijeaskan sejauh ini. Agrobacterium memiliki spisifikasi inang yang

luas dan secara prinsip dapat mempengaruhi sebagian besar tanaman dikotil. Namun, setelah

transfer gen termediasi Agrobacterium terjadi, langkah selanjutnya mengacu pada produksi

tanaman transgenik kadang sulit dikerjakan. Pada sebagian besar kasus hal ini tergantung pada

kesuliatn meregenerasi tanaman lengkap diluar sel yang mampu menerima T-DNA. Pengguanan

jaringan embrioik (seperti epikotil dan hipokotil) sebagai penerima T-DNA sekarang sedang

sieksplorasi, karena potensi regenerasinya yang tinggi.

Pemasukan Fragmen DNA secara Langsung



Di alam, Agrobacterium tidak menginfeksi tanaman monokotil (monokot), subklas

tanaman yang meliputi seluruh hasil biji-bijian. Tampaknya, hal ini terutama tergantung pada

respon luka yang sangat lemah yang ditemukan pada jaringan tanaman biji-bijian, dan sampai saat

belakangan ini sudah tidak ada metode reproduksi yang sukses untuk memasukkan dan

menggabungkan T-DNA ke dalam spesies ini. Walaupun transfer gen Agrobacterium terintegrasi

ke dalam jaringan embriobik padi dilaporkan baru-baru ini, masih tetap dapat dilihat apakah

pendekatan tersebut dapat direproduksi pada spesies dan varietas berbeda.

Kesulitan dengan sistem yang dimediasi Agrobacterium telah mengacu pada jumlah usaha

untuk memasukkan DNA langsung ke dalam sel tanaman dengan metode berikut ini:

• Inkubasi protoplas tanaman dengan DNA. Protoplas bertidak sebagai DNA dalam

kehadiran polietilenglikol (Bab 4). Saat protoplas dibuat dari sel-sel embrionik,

seringkali dimungkinkan untuk meregenerasi tanaman transgenik.

• Fusi liposom yang mengandung DNA dengan protoplas. Metode ini akan bekerja

untuk tanaman yang dapat diregenerasi dari protoplas. Namun, sebanyak-banyaknya

DNA yang dapat dimasukkan secara efisien dengan menggunakan polietilenglikol,

metode ini tampaknya tidak menawarkan banyak keuntungan.

• Pemasukan DNA ke dalam protoplas dengan elektroporasi. Aplikasi sementara dari

voltasi elektrik tinggi melintasi membrane protoplas akan menghasilkan pori yang

vesar, melalui dimana DNA dalam membrane berdifusi secara spontan (Bab 4). Lagi, pendekatan ini tidak menawarkan keuntungan yang besar melebihi metode pertama

yang dijelaskan.

• Bombardemen sel - sel tanaman dengan mikroproyektil yang diselimuti DNA. Pelet

mikroskopik dilapisi dengan larutan DNA dan secara harfiah “ditembakkan” ke

dalam jaringan dan sel. Metode ini, kadang disebut biolistik, memiliki potensi besar

karena tidak melibatkan proses regenerasi sel dan jaringan yang seringkali merupakan

proses yang rumit di luar protoplas. Meskipun demikian, ada sejumlah kekurangan.

Keterbatasan yang paling penting adalah begitu rendahnya frekuensi pemasukan dan

integrasi DNA asing dengan sukses, yang berarti bahwa seseorang harus meneliti

sejumlah besar sel-sel keturunan untuk menemukan hasil yang memperoleh gen baru.

Tidak satupun dari semua metode ini memperoleh efisiensi dan ketahanan uji dari metode

transfer gen dimediasi Agrobacterium yang digunakan pada tanaman dikotil. Meskipun demikian,



kita tahu bahwa pemsukan secara langsung dari DNA asing ke dalam sel dan protoplas tanaman

berakibat pada integrasi DNA ke dalam genom tanaman, kadang dengan efisiensi yang tingginya

masuk akal, bahkan walaupun sel-sel tanaman tidak dipenuhi dengan sistem eksogen yang spesifik

untuk mengkatalisasi reaksi integrasi. Metode-metode ini, khususnya pemasukan langsung DNA

ke dalam protoplas dengan polietilenglikol atau dengan elektroporasi, telah digunakan dengan

sukses untuk memproduksi tanaman transgenik pada monokotil yang penting secara ekonomi

seperti padi, gandung dan jagung.

Ringkasan

Banyak spesies mikroorganisme berinteraksi dengan tanaman baik sebagai simbion maupun

patogen, dan ilmuwan telah mengambil keuntungan dari hubungan dekat ini dalam usahanya untuk

mengembangkan produksi pertanian melalui bioteknologi. Sebagai contoh, bakteri patogen

tanaman, dinonaktifkan melalui delesi gen-gen yang esensial untuk pathogenesis yang disengaja

(seperti gen nukleasi es) telah digunakan dengan sukses sebagai kompetitor melawan patogen

alami. Usaha serupa sedang dilakukan untuk meningkatkan sifat – seperti, cakupan sel inang – dari

simbion bermanfaatseperti bakteri fiksasi nitrogen. Pada sebagian besar kasus, bagaimanapun juga,

fokus pengembangan adalah konstitusi genetik dari tanaman yang diberikan – yaitu, produksi

tanaman transgenik. Tapi bahkan kasus-kasus ini telah mengeksploitasi kapasitas alami patogen

tanaman Agrobacterium tumefaciens untuk memasukkan sebagian plasmid DNA, T-DNAnya, ke

dalam sel tanaman. Pemasukan gen-gen eksogen dari tanaman atau mikroorganisme lainnya

dengan cara ini telah mengakibatkan produksi tanaman yang tahan terhadap herbisida, pestisida

serangga, atau virus. Mungkin bahkan strategi lainnya yang signifikan dalam studi adalah untuk

mengembangkan kualitas produk pertanian melalui manipulasi gen-gen tanaman endogen. Buah

dan sayuran dengan ketahanan penyimpanan yang dikembangkan dan bunga dengan warna yang

baru dan tak terduga telah diproduksi dengan sukses. Bahkan produksi protein pangan dengan nilai

nutrisi yang lebih tinggi, atau hasil panen yang lebih banyak, yang mungkin diluar jangkauan.

Pemahaman yang lebih baik atas pengaturan gen tanaman, bagaimanapun juga, tampaknya

diperlukan sebelum tujuan-tujuan ini dapat diraih.

Daftar Pustaka yang Dipilih



Umum

Grierson, D. (ed.), 1991. Plant Genetic Engineering . Chapman dan Hall.

Penggunaan Mikroorganisme Simbiotik

Lindow, S.E., Panopoulos, N.J., dan McFarland, B.L., 1989. Genetic engineering of bacteria from

managed and natural habitats. Science. 144:1300-1305.

Stacey, G., Burris, R.H., dan Evans, H.J. (eds.), 1992. Nitrogen Fixation. Chapman dan Hall.

Long, S.R., 1989. Rhizobium-legume nodulation: Life together in the underground. Cell 56:203-

214.

Martinez, E., Romero, D., dan Palacios, R., 1990. The Rhizobium genome. CRC Crit. Rev. Plant

Sci. 9:59-93.

Paau, A.S., 1991. Improvement of Rhizobium inoculants by mutation, genetic engineering and

formulation. Biotechnol . Adv. 9:173-181.

Quispel, A., 1991. A critical evaluation of the prospects for nitrogen fixation with non-legumes.

Plants Soil 137:1-11.

Sistem Ti Agrobacterium

Zambryski, P., Tempe, J., dan Schell., 1989. Transfer and function of T-DNA genes from

Agrobacterium Ti and Ri Plasmids in plants. Cells 56:193-201.

Jin, S.G., Prusti, R.K., Roitsch, T., Ankenbauer, R.G., and Nester, E.W., 1990.

Photophosporylation of the VirG protein of Agrobacterium tumefaciens by the

autophosphorilated VirA protein: Essential role in biological activity of VirG. J. Bacteriol .

172:4945-50.

Shimoda, N., et al., 1990. Control of expression of Agrobacterium vir genes by synergistic actions

of phenolic signal molecules and monosaccharides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6684-6688.

Cangelosi, G.A., Ankenbauer, R.G., dan Nester, E.W. 1990. Sugars induce the Agrobacterium

virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6708-12.

Zambryski, P.C., 1992. Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story. Ann.

Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:465-490.



Produksi Tanaman Transgenik dengan Pengubahan Melalui Agrobacterium

Gasser, C.S., dan Fraley, R.T., 1989. Genetically engineered plants for crop improvement. Science

244:1293-1299.

Oxtoby, E., dan Hughes, M.A., 1990. Engineering herbicide tolerance into crops. Tr. Biotechnol .

8:61-65.

Barton, K.A., Whiteley, H.R., dan Yang, N.-S., 1987. Bacillus thuringiensis delta-endotoxin

expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to lepidopteran insects. Plant

Physiol . 85:1103-1109.

Register, J.C., Lawton, M.A., Dron, M., dan Dixon, R.A., 1989. Signals and transduction

mechanism for activation of plant defenses against microbial attack. Cell 56:215-224.

Raineri, D.M., Bottino, P., Gordon, M.P., dan Nester, E.W., 1990. Agrobacterium-mediated

transformation of rice (Oryza sativa L.). Bio/Technology. 11:895-902.

Tucker, G.A., 1990. Genetic manipulation of fruit ripening plants for altered starch content and

composition. Tr. Biotechnol . 11:63-68.

Beck, C.I., dan Ulrich, T., 1993. Biotechnology in the food industry. Bio/Technology 11:895-902.

Goldsbrough, A.P., Lastrella, C.N., dan Yoder, J.L., 1993. Transposition mediated re-positioning

and subsequent elimination of marker genes from transgenic tomato. Bio/Technology 11:1286-

1292.

Transformasi Sel Tanaman dengan Pemasukan DNA Langsung

Potrykus, I., 1990. Gene transfer to cereals: An assessment. Bio/Technology 8:535-542.

Oard, J.H., 1991. Physical methods for the transformation of plant cells. Biotech. Adv. 9:1-11.

interaksi-mikroba-tanaman.doc

Documents