23

III. METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini telah dilaksanakan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi

Pangan, Fakultas Pertanian Peternakan, Universitas Muhammadiyah Malang dan

di Materia Medica Batu pada bulan April – Juli 2019.

3.2. Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1 Alat Penelitian

Alat yang digunakan untuk penelitian ini antara lain loyang, blender,

baskom, neraca analitik, gelas ukur, sendok, cabinet dryer, ayakan 60 mesh,

pisau, baskom, talenan, tray, grinder, gelas ukur, gelas beaker,sendok,erlenmeyer,

botol gelap, lemari asam, vacuum evaporator, pompa vacuum, batang pengaduk,

spatula. Sedangkan alat – alat yang digunakan untuk analisis adalah vacuum

evaporator, Erlenmeyer, krus porselen, oven, kertas whattman, spektrofometer

UV-Visible, desikator, timbangan analitik, penjepit, mikropipet, rak tabung reaksi,

alumunium foil, waterbath shaker, Erlenmeyer, corong dan gelas beaker, tabung

reaksi, rak tabung reaksi, cawan, vortex, Sentrifugasi, bola hisap, pipet volume,

desikator, kuvet, mikropipet 1000 µl, mikropipiet 10µl, spektrofotometer.

3.2.2 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah buah pare (Momordica

charantina L.), aquades, DPPH (2-2 diphenyl – 2 – picrylhidrazil), etanol 96%,

etil asetat, N-Heksane, etanol 95%, reagen Folin-Ciocalteu, Na2CO3 7,5%,

NaNO3 5%, AlCl3 10%, NaOH 1M, BSA 1% (Bovine Serum Albumin), Buffer

Fosfat pH 6,9; 0,1 M, nitrogen.

24

3.2 Metodelogi Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang terdiri dari 9

perlakuan sebagai berikut:

A1B1 : Pengeringan dengan Rumah Kaca (Green House) dan pelarut etanol 96%

A1B2 : Pengeringan dengan Rumah Kaca (Green House) dan pelarut etil asetat

A1B3 : Pengeringan dengan Rumah Kaca (Green House) dan pelarut N-Heksane

A2B1 : Pengeringan dengan kabinet dan pelarut etanol 96%

A2B2 : Pengeringan dengan kabinet dan pelarut etil asetat

A2B3 : Pengeringan dengan kabinet dan pelarut N-Hekasane

A3B1 : Buah Pare Segar (kontrol) dan pelarut etanol 96%

A3B2 : Buah Pare Segar (kontrol) dan pelarut etil asetat

A3B3 : Buah Pare Segar (kontrol) dan pelarut N-Heksane

3.3 Prosedur Penelitian

Penelitian ini dimulai dengan pembuatan simplisia buah pare, ekstraksi

simplisia buah pare dengan menggunakan metode maserasi dan pelarut yang

berbeda, kemudian dilakukan analisis rendemen, analisis kadar air, analisis

aktivitas antioksidan metode DPPH, total flavonoid, total fenol, dan analisis

aktivitas antibakteri.

3.4.1 Pembuatan Simplisia Buah Pare

Buah pare yang digunakan adalah buah pare jenis gajih yang memiliki

kulit berwarna hijau tua, dikumpulkan dan dibersihkan dari kotoran-kotoran yang

menempel (sortasi basah), dicuci dengan air mengalir sampai bersih, kemudian

ditiriskan untuk membebaskan buah dari sisa-sisa air cucian, kemudian buah

dipisahkan dari bijinya lalu dirajang tipis-tipis dengan ketebalan kurang lebih,1

25

cm, kemudian dikeringkan sampai kering dengan beberapa metode pengeringan.

Simplisia kering dibersihkan kembali dari kotoran yang mungkin tidak hilang

pada saat pencucian (sortasi kering). Tahap selanjutnya simplisia kering

dihaluskan sehingga menjadi simplisia serbuk.

3.4.2 Metode Ekstraksi Simplisia Buah Pare

Simplisia pare sebanyak 100 gram di ekstraksi menggunakan Pelarut

etanol 96%, etil asetat, N-Heksane dengan perbandingan (1:5) selama 72 Jam,

kemudian disaring menggunakan kertas saring. Selanjutnya hasil ekstraksi

dipekatkan menggunakan rotary evaporator dengan tekanan rendah dan suhu

600C lalu dikeringkan dengan nitrogen sehingga didapatkan ekstrak kental buah

pare (Momordica charantia L.

Pencucian

Potong ± 1 cm

Pengeringan

Penghalusan

Serbuk

Simplisia

a

- Rumah Kaca (Green

House), T: 300 – 60

0 C,

t: 7 Hari

- Kabinet, T: 500C, t: 72

Jam

- Kontrol (buah pare

tanpa pengeringan)

Gambar 6. Diagram Pembuatan Simplisia Pare

Buah Pare

Air Air Kotor

26

Serbuk

Simplisia

Pare

Penimbangan (100 g)

Perendaman

t= 72 Jam

Penyaringan

Filtrat

Pemisahan pelarut

T: 600C

Ekstrak

Buah Pare

Pengeringan

Ekstrak

Kental Pare

Etanol 96%,

Etil Asetat, n-

heksane

(500 ml)

500 ml)

Ampas

Remaserasi

sebanyak 3 kali

Gambar 7. Diagram Ekstraksi Simplisia Buah Pare

Analisa:

Kadar Air,

Rndemen, Fenol,

Flavonoid,

Aktivitas

Antioksidan dan

Antiinflamasi

Nitrogen

27

3.5 Prosedur Analisis

3.5.1 Analisa Kadar Air (Andarwulan dkk, 2011)

1. Botol vial ditimbang

2. Botol vial yang telah ditimbang dimasukkan kedalam oven selama 24 jam

dengan suhu 100 – 1050C

3. Botol vial didinginkan dalam desikaror selama 15 menit

4. Botol vial ditimbang untuk mendapatkan berat botol (a)

5. Sampel ditimbang ± 2g dalam botol vial (b)

6. Sampel dikeringkan dalam oven pada suhu 100 – 1050C selama 6 Jam

7. Sampel didinginkan didalam desikator selama 15 menit

8. Sampel ditimbang sebagai bobot akhir sampel (c)

9. Kadar air dihitung berdasarkan persamaan berikut

Kadar Air =

Keterangan:

a: bobot cawan kosong (g)

b: bobot cawan kosong dan sampel sebelum di oven (g)

c: bobot cawan kosong dan sampel setelah di oven (g)

3.5.2 Analisa Rendemen

1. Simplisia yang akan diekstrak ditimbang sebanyak 100 gram (a)

2. Proses maserasi dilakukan dengan menambahkan pelarut perbandingan (1:5)

dengan waktu maserasi yang telah ditentukan.

3. Pelarut dan ampas dipisahkan

4. Pelarut diuapkan dengan senyawa yang telah diekstrak

5. Berat akhir ekstrak ditimbang (b)

28

6. Rendemen ekstrak dihitung dengan rumus berikut.

Rendemen =

3.5.3 Analisis Kadar Flavonoid

1. Sampel ditimbang sebanyak 15 mg kemudian dilarutkan dalam 10 mL etanol

sehingga diperoleh konsentrasi 1500 ppm

2. Larutan diambil sebanyak 1 mL dari ekstrak yang telah dibuat kemudian

menambahkan 1 mL larutan AlCl3 10% 0,1 mL, natrium asetat 1 M sebanyak

0,1 mL, dan 2,80 mL aquades

3. Larutan dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit

4. Serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang

gelombang 510 nm

5. Kadar total flavonoid diukur dengan rumus:

Kadar Flavonoid Total=

3.5.4 Analisis Kandungan Total Fenol Metode Folin-Ciocalteu

1. Sampel ditimbang sebanyak 100 mg kemudian dilarutkan dalam 100 mL

aquades sehingga diperoleh konsentrasi 10 mg/mL

2. Larutan diambil sebanyak 1 mL dengan konsentrasi 10 mg/mL dan diencerkan

dengan aquades sampai 10 mL dan diperoleh konsentrasi 1 mg/mL

3. Ekstrak diambil sebanyak 0,2 mL kemudian ditambahkan aquades 15,8 mL dan

1 mL reagen Folin-Ciocalteu lalu dikocok

4. Larutan didiamkan selama 8 menit kemudian ditambahkan 3 mL Na2CO3 10 %

dalam campuran

5. Larutan didiamkan selama 2 jam dalam suhu ruang

29

6. Serapanya diukur dengan spektofotometer UV-Vis pada panjang gelombang

765 nm

7. Kadar fenol total dihitung dengan rumus:

Kadar Fenol Total =

3.5.5 Analisis Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (Yue dan Xu,

2008)

1. Sampel dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak 1 mL

2. Etanol 95% ditambahkan sebanyak 5 mL, kemudian di vortex untuk membantu

melarutkan sampel

3. Ekstrak disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit untuk

memisahkan ekstrak

4. Supernatan diambil 4 ml kemudian ditambahkan dengan 1 mL larutan DPPH

(2-2 diphenyl-2-picrylhidrazil) 0,2 mM

5. Sampel Disimpan dalam ruangan gelap selama 20 menit

6. Absorbansinya Diukur pada panjang gelombang 517 nm dan dihitung dengan

menggunakan rumus:

% Inhibisi =

3.5.6 Analisis Aktivitas Antiinflamasi In Vitro (Bindu, 2015)

1. Sampel sebanyak 50 µl dimasukkan dalam tabung reaksi.

2. Larutan BSA 1% ditambahkan sebanyak 450 µl.

3. Sampel diinkubasi 370C selama 20 menit didalam waterbath.

4. Sampel dipanaskan dengan suhu 570C selama 3 menit didalam waterbath.

5. Sampel yang akan diuji didinginkan dalam suhu ruang.

6. Sampel ditambahkan 2,5 ml Buffer Fosfat pH 6,9; 0,1 M.

30

7. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang λ= 278 nm dan dihitung

dengan rumus:

% Inhubisi =