histoteknikdasar.2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

All images in this document is removed due to copyright restriction

HISTOTEKNIK DASARAhmad Aulia Jusuf

Bagian Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia

2009

PENDAHULUAN

Histoteknik adalah metoda atau cara/proses untuk membuat sajian histologi dari spesimen

tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap untuk diamati atau

dianalisa. Sajian histologi yang baik dapat digunakan untuk

1. Bahan pengajaran dan praktikum mahasiswa, guna mempelajari bentuk dan struktur

jaringan tubuh tertentu yang normal.

2. Riset, guna mempelajari perubahan jaringan dan organ tubuh hewan percobaan yang

mendapat perlakuan tertentu atau mempelajari pertumbuhan dan perkembangan jaringan

atau organ tubuh tertentu.

3. Membantu menegakkan diagnosa penyakit yang diderita oleh seorang pasien

Untuk mencapai ketiga tujuan tersebut sajian histologi yang dibuat harus dapat memberikan

gambaran tentang bentuk dan besar serta susunan sel; inti sel dan sitoplasma; badan inklusi

(glikogen, tetesan lemak, pigmen dsbnya); susunan serat jaringan ikat; otot dan lain sebagainya

sesuai dengan gambaran jaringan tubuh tersebut dalam kondisi hidup.

Sajian yang baik dapat membantu mahasiswa memahami struktur histologi jaringan tubuh

sesuai dengan kondisi yang sebenarnya pada waktu hidup.

Sajian yang baik juga akan memberikan hasil yang benar-benar shahih (valid/akurat) yang

sangat dibutuhkan oleh para peneliti untuk menjawab permasalahan yang timbul. Di samping itu

sajian yang baik juga diperlukan oleh klinikus untuk menunjang diagnosa penyakit yang diderita

oleh pasien.

SUMBER JARINGAN ATAU ORGAN

1. Manusia

Jaringan yang berasal dari manusia tentulah yang paling ideal karena struktur histologi

yang harus dipelajari oleh mahasiswa adalah struktur histologi manusia. Jaringan tubuh

ini dapat di ambil dari cadaver (jenazah) dengan syarat jaringan atau organ tersebut di

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

1


ambil kurang dari 3 jam setelah kematian, sebab bila lebih lama sudah terjadi

pembusukan atau autolisis. Sayangnya syarat tersebut pada masa kini hampir mustahil

dapat dipenuhi. Cara lain adalah mengambil jaringan atau organ tersebut dari kamar

operasi.

2. Hewan

Jaringan atau organ yang diambil dari hewan merupakan alternatif. Beberapa hewan yang

sering dipakai adalah

a. Kera, paling menyerupai jaringan tubuh manusia karena sama-sama tergolong

mahluk primata

b. Kambing, terutama untuk melihat serat Purkinje di jantung

c. Babi untuk melihat lobulus klasik hepar dan arteri Hulsen pada limpa.

d. Kucing dan anjing

e. Tikus putih (mice) dan rat

f. Kelinci

Jaringan dapat diambil dari hewan yang difiksasi dalam keadaan hidup (fiksasi supra/

intravital) atau hewan yang telah mati (fiksasi emersi/rendam).

Histoteknik ini dapat dilakukan oleh staf pengajar, peneliti atau teknisi laboratorium.

Setiap staf pengajar bagian biomedik harus menguasai teknik pembuatan sajian histologi dengan

baik, karena setiap staf pengajar bagian biomedik dituntut untuk dapat melakukan riset yang

sering kali melibatkan teknik pembuatan sediaan histologi. Setiap peneliti sebaiknya membuat

sajian histologi sendiri, karena dengan melakukannya sendiri setiap peneliti dapat mengetahui

kesulitan-kesulitan yang terjadi sekaligus cara untuk mengatasinya. Disamping peneliti juga dapat

mengamati hal-hal yang terjadi pada jaringan selama proses pembuatan sajian.

Pembuatan sajian histologi yang bersifat massal dan banyak biasanya dilakukan oleh

teknisi laboratorium tetapi harus dikontrol oleh staf pengajar sehingga kualitas sajian histologi

yang dihasilkan akan dapat senantiasa dikontrol.

Setelah jaringan atau organ tubuh yang akan dibuat sajian histologi diisolasi dari

sumbernya, jaringan tubuh tersebut kemudian diproses hingga menjadi sajian histologi.

Rangkaian proses pembuatan sajian histologi (Gb-1) terdiri atas

1. Fiksasi (Fixation)

2. Dehidrasi (Dehydration)

3. Pembeningan (Clearing)

4. Pembenaman (Impregnasi/Embedding)

5. Pengecoran (Blocking)


2


6. Pemotongan jaringan (Sectioning)

7. Pewarnaan (Staining)

8. Perekatan (Mounting)

9. Pelabelan (Labelling)

Uraian selanjutnya akan membahas tahapan pembuatan sajian histologi ini secara lebih rinci.

Gambar-1 Rangkaian Proses dalam Histoteknik

ISOLASI (PENGAMBILAN ) JARINGAN TUBUH

A. Persiapan

Sebelum jaringan tubuh diambil beberapa pesiapan perlu dilakukan yang terdiri atas

1. Persiapan alat dan bahan/cairan

Perangkat peralatan yang harus dipersiapkan untuk melakukan isolasi atau

pengambilan jaringan tubuh terdiri atas peralatan bedah minor (gunting, pinset,

scalpel, klem, pemegang jaringan, kassa, dll), meja operasi, lampu, peralatan

anestesi (disposible syringe, sungkup/masker anestesi) dan obat anestesi (eter,

ketalar, phenobarbital dll) serta perangkat pengawetan jaringan (fiksasi jaringan)

seperti wadah untuk fiksasi emersi, cairan fiksasi (Formol salin, Muller, Bouin,

Zenker dll), peristaltik pump/syringe pump untuk fiksasi supravital dan lain-lain

2. Persiapan sampel

Untuk jaringan yang diambil dari kadaver atau manusia, jaringan segera diambil

dan dimasukkan kedalam caian fiksasi. Untuk sampel yang diambil dari hewan,

maka hewan perlu dipersiapkan terlebih dahulu. Hewan yang dipilih haruslah

sehat, galurnya harus baik dan jelas, mempunyai status gizi yang baik dan

dipelihara sesuai dengan syarat-syarat pemeliharaan hewan coba. Hewan yang

digunakan dipilih sesuai dengan tujuan penelitian dan pengajaran. Kera

merupakan hewan yang mempunyai struktur tubuh yang mirip dengan manusia.

Untuk mempelajari serat purkinje pada jantung dengan lebih jelas dapat

digunakan jantung kambing, untuk mempelajari lobulus hati klasik degan lebih


3


baik digunakan hati babi, untuk mempelajari arteri Hulsen pada limpa lebih baik

digunakan limpa yang berasal dari babi dan sebagainya.

B. Pelaksanaan

Untuk jaringan yang berasal dari kadaver dan dari jaringan operasi, jaringan yang

telah diambil langsung dimasukkan kedalam wadah yang berisi cairan fiksasi. Sedangkan

untuk jaringan yang berasal dari hewan tahapan pengambilan jaringan adalah sebagai

berikut

1. Pembiusan

Untuk membius hewan yang akan diambil jaringan tubuhnya dapat dilakukan

dengan 2 cara yaitu

a. Pembiusan inhalasi dengan menggunakan eter dan sungkup muka

b. Pembiusan dengan menyuntikkan zat anestesi seperti chloralhydrate,

ketalar, phenobarbital, dan sebagainya.

c. Campuran yaitu pembiusan inhalasi yang diikuti dengan pembiusan lewat

suntikan

2. Pembedahan dan isolasi jaringan tubuh

Setelah hewan terbius sempurna, proses selanjutnya adalah melakukan operasi

dan pengambilan jaringan tubuh yang diinginkan. Jaringan tubuh lalu dipotong-

potong didalam cairan fisiologis (NaCl 0.9%) untuk mendapatkan ukuran yang

lebih kecil. Hal ini perlu dilakukan agar cairan fiksasi dapat masuk kedalam

jaringan dengan mudah dan baik. Potongan jaringan kemudian dimasukkan

kedalam wadah-wadah kecil yang telah diberikan label/keterangan. Wadah berisi

cairan fiksasi dan jaringan kemudian disimpan ditempat yang sesuai hingga saat

pemerosesan jaringan selanjutnya.

3. Fiksasi supravital/intra vital

Khusus untuk jaringan tubuh yang difiksasi secara supravital atau intravital,

segera setelah hewan terbius sempurna, hewan dibaringkan di atas meja operasi

dan diikat agar posisinya stabil. Setelah itu dinding perut dibuka dengan sayatan

pada garis tengah dilanjutkan ke samping kiri dan kanan pada sisi atas dan bawah.

Diafragma lalu dibuka. Tulang iga dipotong pada costosterno junction. Tulang


4


sternum lalu ditarik ke atas dan difiksasi. Setelah tulang sternum diangkat ke atas

akan terlihat jantung. Aurikula atrium kanan dan ventrikel kiri lalu diidentifikasi.

Perikardium lalu dibuka. Dinding aurikula atrium kanan digunting dan darah

dibiarkan mengalir. Setelah darah mengalir keluar, jarum yang disambung ke

slang infus ditusukkan kedalam ventrikel kiri. Peristaltik pump lalu dinyalakan

dan cairan infus akan mengalir masuk kedalam ventrikel kiri menggantikan darah

yang hilang lewat atrium kanan. Cairan infus yang pertama mengalir adalah

cairan NaCl 0.9% untuk membilas darah dari jaringan tubuh sehingga jaringan

tubuh yang akan diambil bebas dari kontaminasi darah. Selanjutnya akan

mengalir cairan fiksasi yang akan memfiksasi seluruh jaringan tubuh. Cairan

fiksasi dibiarkan mengalir hingga seluruh jaringan terfiksasi sempurna yang

ditandai oleh adanya leher dan ekor yang kaku. Selama cairan fiksasi mengalir

akan terlihat kedutan pada seluruh otot. Setelah seluruh jaringan terfiksasi

sempurna, sisa bekuan darah dibersihkan dari tubuh hewan dengan mencuci

dengan air kran. Jaringan tubuh yang diinginkan kemudian diisolasi, dipotong-

potong dan dimasukkan kedalam wadah yang berisi cairan fiksasi yang sama

dengan cairan fiksasi yang diinfuskan. Wadah yang berisi cairan fiksasi dan

jaringan kemudian dilabel dan disimpan hingga saat proses pengolahan jaringan

selanjutnya.

FIKSASI (FIXATION)

Dasar dari pembuatan sajian histologi yang baik adalah melakukan fiksasi yang benar.

Kesalahan yang dilakukan pada tahap fiksasi tidak akan pernah dapat diperbaiki lagi pada

tahapan selanjutnya. Jadi hasil akhir sajian histologi yang baik sangat tergantung pada cara

melakukan fiksasi dengan baik.

Tujuan dari fiksasi adalah untuk

1. Mengawetkan jaringan.

Fiksasi bertujuan untuk mempertahankan susunan jaringan agar mendekati kondisi

seperti sewaktu hidup.

2. Mengeraskan jaringan


5


Fiksasi bertujuan untuk mengeraskan jaringan terutama jaringan lunak agar memudahkan

pembuatan irisan tipis.

Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses adalah

1. Menghambat proses pembusukan dan autolisis

Fiksasi akan menghambat terjadinya pembusukan yang disebabkan oleh kuman-kuman

pembusuk yang berasal dari luar tubuh. Waktu pembusukan untuk setiap jaringan atau

organ berbeda-beda tergantung kepada konsistensi dan kandungan unsur-unsur penyusun

jaringan tersebut. Jaringan usus dan otak sangat rentan terhadap proses pembusukan

dibandingkan jaringan tubuh lainnya. Pembusukan seringkali disertai oleh pembentukan

gas yang berbau.

Autolisis adalah proses perusakan jaringan tubuh yang disebabkan oleh ensim-ensim

proteolitik yang terdapat pada jaringan tersebut. Proses proteolitik ini akan lebih cepat

terjadi pada suhu tropik (24-36C). Proses proteolitik lebih mudah terjadi di Jakarta

dibandingkan dengan negeri-negeri dingin.

Untuk menghindari proses pembusukan dan autolisis, jaringan harus segera dimasukkan

kedalam cairan fiksasi segera setelah kematian atau segera setelah diambil dari tubuh.

Bila keadaan ini tidak memungkinkan jaringan dapat disimpan sementara di dalam

ruangan dengan temperatur yang sangat dingin (Freezer).

2. Pengawetan

Sel-sel dan jaringan diawetkan mendekati kondisinya seperti sewaktu hidup.

3. Pengerasan

Efek pengerasan akan mempermudah penangan jaringan lunak, misalnya otak

4. Pemadatan koloid

Fiksasi akan mengubah konsistensi sel yang setengah cair (Sol) menjadi lebih padat (Gel)

5. Differensiasi optik

Fiksasi akan mengubah indeks refraksi berbagai unsur sel dan jaringan sehingga unsur-

unsur yang belum diwarnai dapat dilihat dengan lebih mudah dibandingkan dengan

jaringan yang belum difiksasi.

6. Pengaruh terhadap pewarnaan

Sebagian besar cairan fiksasi yang ada mempengaruhi reaksi histokimia karena mengikat

bagian reaktif jaringan.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan jaringan histologis adalah:


6


1. Tebal irisan jaringan 3-5mm sehingga cairan fiksasi dapat dengan cepat medmfiksasi

seluruh jaringan. Bila irisannya terlalu tebal maka permukaan luarnya saja yang difiksasi

dengan cukup baik, sedangkan bagian tengah jaringan sudah keburu membusuk sebelum

cairan fiksasi sempat merembes ke sana.

2. Volume cairan fiksasi sekurang-kurangnya harus 15-20x volume jaringan yang akan

difiksasi. Besarnya volume jaringan menentukan volume fiksasi yang diperlukan

sedangkan tebal jaringan menentukan kecepatan fiksasi. Panjang dan lebar jaringan

umumnya ditentukan oleh jenis mikrotom yang akan digunakan.

3. Jenis cairan fiksasi yang akan digunakan bergantung kepada unsur jaringan yang akan

didemonstrasikan dan kepada jenis pewarnaan yang akan digunakan. Untuk keperluan

praktis cairan fiksasi dapat dibedakan menjadi 3 kelompok yaitu

A. Micro-anatomical fixation

Fiksasi ini digunakan apabila struktur histologis jaringan hendak dipertahankan

dengan hubungan yang benar antara lapisan jaringan dan kelompok sel. Cairan

fiksasi yang tergolong kelompok ini adalah cairan formalin atau

modifikasinya, cairan acetic alkohol formalin, cairan Heidenhain Susa, cairan

Zenker, cairan Bouin

B. Cytological fixatives

Fiksasi ini digunakan apabila struktur intraselular atau badan inklusi hendak

dipertahankan dan di ekspresikan. Untuk mencapai tujuan ini sering di capai

dengan mengurbankan penetrasi cairan yang merata, kemudahan pemotongan

dengan mikrotom dan hilangnya struktur sel lainnya. Fiksasi ini dapat dibagi

menjadi 2 kelompok yaitu fiksasi inti (nuklear) dan fiksasi sitoplasma. Cairan

fiksasi yang tergolong dalam kelompok ini adalah fiksasi inti (larutan Carnov)

dan fiksasi sitoplasma (larutan Muller, formol saline, formol calcium, Zenker

formol).

C. Histochemical fixatives

Fiksasi ini digunakan apabila jaringan hendak diwarnai dengan pewarnaan

histokimia Cairan fiksasi yang digunakan tidak boleh mengubah atau

sedapatnya mengubah seminim mungkin unsur-unsur yang akan

didemonstrasikan. Fiksasi histokimia yang baik harus memenuhi syarat-syarat

sebagai berikut:

1. Mengawetkan unsur yang akan didemonstrasikan


7


2. Mengikat atau mengawetkan unsur jaringan khusus, tanpa

mempengaruhi gugus reaktif yang digunakan pada visualisasi.

3. Tidak mempengaruhi reagen yang digunakan pada proses visualisasi,

misalnya fiksatif glutaraldehida memfiksasi protein jaringan sedemikian

rupa dengan suatu coating terdiri atas gugus aldehida reaktif sehingga

menghasilkan reaksi PAS atau Schiff positif.

A. LARUTAN FORMALIN

Larutan formalin merupakan cairan fiksasi yang paling umum digunakan. Laurtan formalin yang

digunakan adalah formalin 10%. Formula yang digunakan adalah

Formalin (40% Formaldehida) ........................................................ 10 ml

Air .................................................................................................. 90 ml

Formaldehida 40% adalah gas yang larut dalam air dengan volume 40% dari total berat

larutan. Larutan jenuh ini secara komersial diperdagangkan sebagai Formalin atau 40%

Formaldehida. Telah disepakati bahwa yang dimaksud dengan formaldehida 40% =

larutan jenuh gas formaldehida.

Formalin terutama terdapat dalam bentuk polimer dari formaldehida. Bentuk ini tak dapat

digunakan untuk fiksasi. Yang dapat digunakan adalah bentuk monomernya. Untuk

menghasilkan formalin dalam bentuk monomer diperlukan waktu, kecuali bila pH larutan netral

atau sedikit alkalis, karena kecepatan depolarisasi tergantung pada pH. Jadi jangan sekali-kali

menggunakan formalin 10% yang baru dibuat karena jaringannya keburu membusuk sebelum

terfiksasi dengan baik. Selain itu formalin bersifat asam karena mengandung asam formiat akibat

oksidasi formaldehida. Oleh sebab itu larutan formalin 10% harus dibuat netral atau sedikit

alkalis dengan menggunakan larutan buffer phosphate dengan pH 7.2 sebagai pelarut, atau

dengan menambahkan kalsium asetat. Yang paling mudah dan murah adalah Formol Saline

dengan formulanya

Formalin (formaldehida 40%) .............................................................. 100ml

Sodium klorida (NaCl) .............................................................. 9gram

Air kran ............................................................ 900ml

Larutan formalin 10% dengan phosphate buffer yang sering digunakan adalah

1. Formol Calcium (Lillie 1965)

Formalin (40% formaldehida) ....................................................... 10 ml

Kalsium asetat ................................................................................. 2 gr

Akuades ................................................................................... ad 100 ml


8


2. Formol Calcium (Baker, 1944)

Formalin ............................................................................................. 10 ml

Calcium chlorida .................................................................................. 2 gr

Akuades ....................................... ................................................ad 100 ml

3. Buffer formalin

Formalin ............................................................................................ 10 ml

Acid sodium phosphate monohydrate ............................................... 0.40 gr

Anhydrous disodium phosphate ........................................................ 0.65 gr

Akuades ...........................................................................................ad 100 ml

4. Buffered formalin sukrosa (Holt dan Hicks, 1961)

Formalin ............................................................................................. 10 ml

Sukrosa ................................................................................................ 7.5 gr

M/15 Phosphate buffer (pH 7.4) .......................................................ad 100 ml

Cairan fiksatif formalin akan mengawetkan struktur halus (fine structure) dengan sangat baik,

phospholipid dan beberapa ensim. Cairan ini sangat dianjurkan untuk dipakai pada penelitian

gabungan secara sitokimia dan mikroskop elektron. Untuk mendapatkan hasil yang terbaik

jaringan harus di dinginkan sampai 4 derajat Celsius dalam refrigerator.

Kelebihan larutan fiksatif formalin adalah

a. merupakan cairan fiksatif umum

b. pH mendekati netral

c. Pigmen formalin (acid formaldehyde haematin) tidak terbentuk karena pembentukannya baru

terjadi bila ada interaksi antara larutan formalin pada pH asam dengan hemoglobin atau

produknya (sering dijumpai pada organ yang mengandung banyak darah seperti hepar, lien,

sumsum tulang dan sebagainya). Bila pigmen ini terbentuk dapat dihilangkan dengan

perlakuan pikrat-alkohol atau larutan alkohol 1% dalam sodium hidroksida (NaOH)

d. Potongan jaringan dapat ditinggalkan di dalam cairan formol salin untuk jangka waktu lama

(dapat sampai 1 tahun) tanpa ada perubahan yang berarti

e. Bla diperlukan jaringan yang direndam dalam cairan fiksatif ini dapat di ambil dan

dimasukkan ke dalam cairan fiksatif lainnya bila diperlukan

Kekurangan larutan fiksatif formalin adalah

Jaringan yang difiksasi dengan cara rendam memerlukan waktu sedikitnya 24 jam baru

dapat diproses.


9


B. LARUTAN MULLER

Cairan fiksasi ini merupakan fiksatif sitologi yang dapat digunakan untuk memfiksasi inti

dan sitoplasma sel. Potassium dikromat yang terdapat di dalam larutan Muller akan

memfiksasi protein tanpa mempresipitasikannya. Diduga hal ini terjadi karena ion krom

membentuk kompleks-kompleks dengan air yang mengikat bagian reaktif rantai protein di

dekatnya. Kalium dikromat terutama mengikat gugus karboksil dan hidroksil protein sehingga

fiksatif yang mengandung ion krom tidak dapat di pakai untuk histokimia. Kalium dikromat dapat

digunakan untuk reaksi kromaffin.

Setelah fiksasi dengan larutan Muller jaringan harus dicuci dulu di dalam air kran mengalir

selama 24 jam sebelum dilakukan proses dehidrasi, karena memindahkan jaringan secara

langsung ke dalam alkohol akan menghasilkan oksida yang tak dapat larut dan tak dapat

disingkirkan lagi dari jaringan.

Kelebihan dari larutan Muller adalah

1. Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan baik. Jaringan biasanya akan terfiksasi

baik dalam waktu 24 jam.

2. Memfiksasi inti dan sitoplasma sel dengan baik

Kekurangan dari larutan Muller adalah

1. Jaringan yang difiksasi dengan larutan Muller harus segera dilakukan proses

dehidrasi setelah 24 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat

menyebabkan kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong

dengan mikrotom secara baik.

2. Tidak dapat dipakai untuk pewarnaan dengan metoda histokimia

3. Harus dicuci dulu dengan air kran mengalir sebelum dilakukan dilakukan proses

dehidrasi, karena dehidrasi langsung dengan menggunakan alkohol dapat

menghasilkan oksida yang tak dapat larut dan tak dapat disingkirkan dari jaringan.

Formula larutan Muller adalah sebagai berikut

Potassium dikromat .................................................................. 12.5 gram

Sodium sulfate ............................................................................ 5 gram

Akuades ..................................................................................ad 500 ml


10


C. LARUTAN BOUIN

Larutan fiksatif ini mengandung larutan asam pikrat jenuh. Asam pikrat merupakan zat

berbentuk serbuk bewarna kuning seperti kunyit dan mudah meledak dalam keadaan kering,

sehingga harus disimpan dalam keadaan lembab. Asam pikrat jenuh dibuat dengan cara

melarutkan serbuk asam pikrat dalam air hingga jenuh (terdapat endapan serbuk pikrat di dasar

larutan.

Asam pikrat mempresipitasikan protein dengan cara membentuk ikatan pikrat-protein.

Asam pikrat menyebabkan sel darah merah menjadi rusak, seringkali menghilangkan Fe+3,

terutama bila berada dalam jumlah sedikit dan dapat melindungi RNA dari proses perusakan oleh

ensim ribonuklease.

Kelebihan dari larutan Bouin adalah

1. Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata, tetapi dapat menyebabkan

terjadinya sedikit pengerutan. Untuk mengatasi hal ini ke dalam larutan Bouin

biasanya di tambahkan asam asetat glasial sesaat sebelum dipakai. Waktu fiksasi

cepat yaitu 24 jam, tetapi potongan kecil dengan ketebalan kurang dari 2-3 mm dapat

selesai di fiksasi dalam 2-3 jam.

Asam asetat glasial sendiri mempunyai kemampuan untuk fiksasi meskipun rendah.

Asam asetat glasial biasanya digunakan bersama-sama dengan larutan fiksatif lain

dan berfungsi untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh larutan lainnya.

Nukleoprotein dipresipitasi oleh asam asetat dan sering ditambahkan pada zat wara

hematoksilin agar inti tampak jelas dan tajam.

2. Memberikan warna cemerlang bila diwarnai dengan metoda trichrome.

3. Sangat baik untuk memperlihatkan inti sel seperti pada sel benih di testis dan ovum.

Kekurangan dari larutan Bouin adalah

1. Jaringan yang difiksasi dengan larutan Bouin harus segera dilakukan proses dehidrasi

setelah 24 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat menyebabkan

kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong dengan mikrotom

secara baik.

2. Warna kuning pada jaringan akibat kelebihan pikrat. Untuk menghilangkan warna

kuning, jaringan harus dicelup dalam alkohol atau dengan mencucinya dalam air kran

semalam. Oleh karena terbentuk beberapa ikatan pikrat yang larut dalam air, jaringan

harus segera dipindahkan ke dalam alkohol


11


Formula larutan fiksatif Bouin adalah

Larutan asam pikrat jenuh ......................................................................... 12.5 gram

Formalin 10% (40% formaldehida) ............................................................ 100 ml

Bila akan digunakan baru tambahkan “ asam asetat glasial” ..................... 5 ml

D. LARUTAN ZENKER FORMOL (CAIRAN HELLY)

Larutan fiksatif Zenker mengandung Merkuri klorida yang berfungsi untuk

mempresipitasi protein. Merkuri klorida akan mengikat gugus asam protein dan gugus asam

fosfat nukleoprotein, dan juga bereaksi secara khusus dengan gugus thiol (SH).

Kelebihan dari larutan fiksatif Zenker adalah

1. Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan penetrasinya berkurang setelah

meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang melebihi

ketebalan 5 mm pada umumnya cenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di

bagian perifer dan lunak serta undefixed di bagian tengah. Untuk mengatasi hal

tersebut larutan fiksatif ini biasanya dikombinasi dengan asam asetat, formalin,

potassium dikromat dan sebagainya. Waktu fiksasi umunya 6-24 jam

2. Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan limpa serta organ lain yang

banyak mengandung darah seperti jantung dan otot

3. Warna sitoplasma jaringan yang difiksasi dengan larutan fiksatif ini akan lebih

cemerlang.

Kekurangan dari larutan fiksatif Zenker adalah

1. Pemaparan jaringan di dalam larutan fiksatif ini yang melebihi waktu yang

ditentukan akan mengakibatkan jaringan menjadi rapuh (keras), overfixed dibagian

perifer dan underfixed ditengahnya. Jaringan seperti ini tidak dapat dipotong dengan

mikrotom. Karenanya larutan ini jarang digunakan tersendiri, umumnya

dikombinasikan dengan asam asetat, formalin, potassium bikromat dan sebagainya.

Formula larutan Zenker sebagai berikut

Merkuri klorida .......................................................................................... 5 gram

Potassium dikromat .................................................................................... 2.5 gram

Sodium sulfat ............................................................................................. 1 gram

Akuadest .................................................................................................. ad 100 ml


12


Tambahkan formalin segera sebelum pemakaian ...................................... 5 ml

E. LARUTAN ETHYL ALKOHOL

Fiksasi ini biasanya digunakan untuk sajian hapus dan tidak digunakan untuk fiksasi

jaringan, sebab larutan fiksatif ini mempunyai daya penetrasi yang lambat ke dalam jaringan dan

cenderung untuk mengeraskan jaringan bila jaringan direndam terlalu lama di dalam larutan

fiksasi ini. Larutan ini memfiksasi jaringan dengan cara mendenaturasi protein dan

mempresipitasi glikogen. Apabila fiksatif ini dicampur dengan reagen lainnya seperti larutan

Carnoy, fiksasi berlangsung cepat.

D. LARUTAN ASAM ASETAT-ALKOHOL-FORMALIN (TELLYESNICZKY)

Fiksasi ini digunakan untuk mendemonstrasikan glikogen. Larutan ini akan mencegah

karbohidrat menjadi larut sebelum unsur protein selesai difiksasi. Karena formalin dan alkohol

merupakan zat dengan penetrasi cepat, larutan ini merupakan fiksatif yang kerjanya cepat.

Jaringan dengan ketebalan 5 mm selesai difiksasi dalam 4 jam.

Asam asetat , umumnya disebut asam asetat glasial karena padat pada suhu di bawah 17

derajat Celsius. Asam asetat tidak pernah digunakan sendirian karena efek pembengkakan pada

serat kolagen, tetapi ia digunakan untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh reagen

lainnya. Nukleoprotein (dalam inti sel) dipresipitasikan oleh acetic acid dan karenanya sering

ditambahkan pada zat warna hematoksilin agar inti tampak lebih jelas dan tajam, mitokondria dan

aparatus Golgi dihancurkannya atau menjadi rusak

Formula larutan fiksatif ini adalah

Formalin .................................................................................................... 5 ml

Asam asetat glasial .................................................................................... 5 ml

Alkohol 70% .............................................................................................. 90 ml

E. LARUTAN HEIDENHEIN’S SUSA

Larutan ini merupakan larutan fiksatif karbohidrat yang sangat baik. Larutan fiksatif ini

mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata serta memberikan hasil pulasan yang sangat

cemerlang dengan rincian sitologi yang sangat baik. Jaringan dengan ketebalan kurang dari 8mm

selesai difiksasi setelah 12-24 jam. Bila jaringan difiksasi lebih dari 24 jam, jaringan akan

menjadi keras dan rapuh

Formula larutan fiksatif ini adalah


13


Merkuri klorida ........................................................................................... 4.5 gr

Sodium klorida ............................................................................................. 0.5 gr

Trichloracetic acid ........................................................................................ 2 gr

Acetic acid ................................................................................................... 4 ml

Formalin ....................................................................................................... 20 ml

Akuadest ...................................................................................................... 100 ml

F. LARUTAN CARNOY

Larutan ini merupakan larutan fiksatif inti yang mempunyai daya penetrasi yang cepat.

Di samping itu larutan fiksatif ini juga akan mengawetkan substansia Nissl dan glikogen.

Keuntungan dari larutan Carnoy adalah sangat cepat . Fiksasi ini sering digunakan

apabila suatu diagnostik perlu ditegakkan dengan cepat, misalnya pada bagian bedah untuk

diagnostik sel kanker. Fiksasi umumnya selesai setelah 1-2jam,sedangkan potongan kecil selesai

difiksasi dalam 15 menit.

Kekurangan fiksasi ini adalah efek pengerutan yang kuat dan menghancurkan sebagian

besar unsur sitoplasma lainnya. Efek pengerutan dapat dikurangi dengan melakukan fiksasi pada

suhu nol derajat Celsius selama 18 jam

Formula larutan fiksatif Carnoy adalah

Alcohol absolut ......................................................................................... 60 ml

Chloroform ................................................................................................ 30 ml

Glacial acetic acid ..................................................................................... 10 ml

TEHNIK LENDRUM

Tehnik Lendrum digunakan untuk melunakkan jaringan kulit setelah difiksasi. Hal ini

terjadi karena kulit merupakan jaringan yang keras. Setelah potongan kulit dikeluarkan dari

larutan fiksatif, kulit dicuci sebentar dengan air kran mengalir atau dengan alkohol 90%,

kemudian direndam dalam larutan phenol 4% dalam akwades selama 1-3 hari. Dengan perlakuan

khusus ini diharapkan kulit menjadi mudah diiris dengan pisau mikrotom tajam tanpa merobek .

Sebelum memotong pisau mikrotom sebaiknya direndam dalam es sehingga memudahkan

pemotongan. Setelah dibuat blok, blok preparat sebaiknya disimpan dalam air es.

DEHIDRASI


14


Dehidrasi merupakan langkah ke dua dalam pemerosesan jaringan. Proses ini (Gb-2)

bertujuan untuk mengeluarkan seluruh cairan yang terdapat dalam jaringan yang telah difiksasi

sehingga jaringan nantinya dapat diisi dengan parafin atau zat lainnya yang dipakai untuk

membuat blok preparat. Hal ini perlu dilakukan karena air tidak dapat bercampur dengan cairan

parafin atau zat lainnya yang dipakai untuk membuat blok preparat.

Gambar-2 Proses Dehidrasi

Ada beberapa macam cairan yang dapat dipakai untuk proses dehidrasi yaitu

1. Alkohol

2. sukrosa 20%

3. metil alkohol atau spiritus

Setelah jaringan selesai difiksasi jaringan dipindahkan ke dalam alkohol dan diproses

sebagai berikut

1. alkohol 70% ................................................................................................... 1 hari

2. alkohol 70% .................................................................................................... 1 hari

3. alkohol 70% .................................................................................................... 1 hari

4. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari

5. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari

6. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari

7. alkohol 100% ................................................................................................. 1 hari

8. alkohol 100% ................................................................................................. 1 hari

9. alkohol 100% .................................................................................................. 1 hari

Di samping cara di atas cara lain yang juga sering di pakai adalah dehidrasi bertahap dengan

menggunakan alkohol dengan konsentrasi yang makin meningkat secara lebih perlahan yaitu

1. alkohol 70% ................................................................................................... 1 hari

2. alkohol 80% .................................................................................................... 1 hari

3. alkohol 90% ...................................................................................................... 1 hari

4. alkohol 95% ...................................................................................................... 1 hari

5. alkohol 95% ....................................................................................................... 1 hari

6. alkohol 100% ...................................................................................................... 1 hari

7. alkohol 100% ..................................................................................................... 1 hari


15


Alkohol yang sudah dipakai dapat dimurnikan denga cara memasukkan cuprisulfat (CuSO4)

kedalamnya. Cuprisulfat yang bewarna putih (tak mengandung air) akan berubah menjadi biru

(mengandung air). Ganti cuprisulfat beberapa kali hingga warnanya tetap putih walaupun telah

disimpan beberapa hari. Cuprisulfat yang telah bewarna biru karena mengandung air dapat di

hilangkan airnya dengan cara memanaskan.

Metil alkohol dapat digunakan menggantikan alkohol absolut. Metil alkohol ini terlebih

dahulu diberi cuprisulfat hingga warnanya tetap putih, setelah itu siap untuk digunakan. Bila

menggunakan spiritus harus ditest dulu dengan alkohol absolut murni sebagai kontrol.

Untuk jaringan yang akan dipotong menggunakan cryostat dan blok preparat dibuat

menggunakan tissue tech jaringan di dehidrasi menggunakan sukrosa 20% selama 2 hari. Cairan

pekat sukrosa 20% ini dibuat dengan cara sebagai beikut

Sukrosa (gula pasir) ...................................................... 20 gram

Air suling .....................................................................ad 100 ml

PEMBENINGAN (CLEARING)

Pembeningan adalah suatu tahap untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan dan

menggantinya dengan suatu larutan yang dapat berikatan dengan parafin. Jaringan tidak dapat

langsung dimasukkan ke dalam parafin karena alkohol dan parafin tidak bisa saling melarutkan.

Proses mengeluarkan alkohol dari jaringan ini sangat krusial karena bila di dalam jaringan masih

tertinggal sedikit alkohol maka parafin tidak bisa masuk kedalam jaringan sehingga jaringan

menjadi “ matang diluar, mentah di dalam” dan akan menyebabkan jaringan menjadi sulit untuk

dipotong dengan mikrotom.

Bahan atau reagen pembening yang paling sering dipakai adalah sebagai berikut

1. chloroform

2. benzene/benzol

3. xylene/xylol

4. cedar wood oil

5. benzil benzoat

6. methyl benzoat


16


Chloroform

Chloroform merupakan clearing agent yang paling sering dipakai, karena sifatnya

yang “toleran” artinya jaringan tidak menjadi keras dan rapuh. Sifat ini tak dipunyai oleh

benzene dan xylene. Jaringan biasanya dibeningkan dalam waktu semalam

Kekurangan chloroform adalah titik akhirnya yaitu saat jaringan telah menjadi bening

dan transparan yang tak dapat terlihat dengan jelas oleh mata. Untuk mengatasi hal ini

jaringan sebaiknya direndam dalam chloroform untuk jangka waktu yang lebih panjang

dari yang sebenarnya, sehingga seluruh alkohol diyakini telah keluar dari jaringan dan

jaringan telah sempurna diresapi oleh chloroform. Kekurangan lainnya adalah chloroform

harganya ebih mahal dari xylene dan benzene tetapi lebih murah dari cedarwood oil

Benzene/Benzol dan Xylene

Benzene dan xylene merupakan clearing agent yang cukup cepat. Masa kerja

benzene lebih sedikit lambat dari xylene, tetapi tidak membuat jaringan menjadi serapuh

bila menggunakan xylene. Potongan kecil dapat dibuat menjadi bening dalam waktu ½ -

1 jam, sedangkan yang lebih tebal (5mm) telah menjadi bening dalam waktu 2-4 jam.

Benzene saat ini sudah jarang dipakai karena sifat karsinogeniknya.

Bila xylene atau xylol yang dipakai sebagai zat pembening, metodanya adalah

sebagai berikut:

1. Setelah jaringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi (alkohol) jaringan dimasukkan

kedalam xylol I selama 1 jam.

2. Perhatikan jaringan akan menjadi bening

3. untuk menyakinkan bahwa seluruih cairan alkohol telah keluar, jaringan

kemudian dipindahkanke cairan xylol II. Lama inkubasi dalam xylol tergantung

pada besarnya jaringan, tetapi biasanya berkisar antara ½ - 1 jam.

4. Jaringan kemudian direndam dalam parafin cair di dalam oven selama kira-kira ½

jam. Setelah itu jaringan siap untuk dimasukkan kedalam blok parafin.

Benzyl benzoat

Benzyl benzoat merupakan clearing agent yang lambat penetrasinya sehingga

dibutuhkan waktu inkubasi yang lebih lama Metoda pembeningan adalah sebagai berikut


17


1. Benzyl benzoat I

Jaringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi dan direndam dalam benzyl benzoat

selama semalam (24 jam) sampai seluruh jaringan tenggelam. Benzyl benzoat

mempunyai penetrasi yang lambat sehingga tidak perlu kuatir jaringan menjadi

terlalu keras dan rapuh.. Setelah inkubasi selama semalam, jaringan akan tampak

menjadi bening dan transparan.

2. Benzyl benzoat II

Jaringan lalu dipindahkan ke dalam benzyl benzoat II selama kira-kira 2-3 jam.

3. Benzol parafin

Jaringan lalu dipindahkan ke dalam campuran benzol dan parafin cair dengan

perbandingan yang sama, misalnya benzol/benzene sebanyak 25 ml di campur

dengan parafin cair sebanyak 25 ml juga. Jaringan direndam dalam benzol parafin

selama ½-1 jam.

4. Parafin cair

Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam parafin cair selam kira-kira ½ jam.

Setelah itu jaringan siap untuk dimasukkan kedalam blok parafin.

5. Bisa juga setelah dari benzyl benzoat II jaringan direndam dalam xylol/xylene

selama ½-1jam, baru kemudian dimasukkan kedalam parafin cair di oven selama

½ jam.

Cedarwood oil

Cedarwood oil merupakan zat pembening termahal dari semua clearing agent tetapi

merupakan clearing agent terbaik, karena sifatnya yang tidak mengeraskan jaringan,

sehingga nantinya jaringan sangat mudah untuk diiris tipis dengan mikrotom. Jaringan

dapat direndam dalam clearing agent ini untuk waktu yang lama bahkan hingga berbulan-

bulan tanpa menjadi keras dan rusak. Pembeningan oleh cedarwood oil ini sangat baik

tidak hanya untuk jaringan yang halus tetapi juga untuk jaringan yang keras seperti kulit

dan jaringan ikat padat.

Methyl benzoate


18


Methyl benzoat merupakan clearing agent yang mempunyai dayapenetrasi lebih

cepat dari benzyl benzoat. Kekurangan dari zat clearing ini adalah mudah menjadi

rapuh/keras sehingga menyulitkan pengirisan dengan mikrotom. Prosedur

pembeningannya adalah sebagai berikut

1. Methyl benzoat I

Setelah dikeluarkan dari cairan dehidrasi jaringan dimasukkan kedalam larutan

methylbenzoat sampai tenggelam, dengan waktu kira-kira 2-3 jam.

2. Methylbenzoat II

Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam methyl benzoat II selama 1-2 jam,

tergantung pada besar dan jumlah jaringan.

3. Benzol-Parafin

Jaringan kemudian dipindahkan dan direndam dalam cairan benzol-parafin dan

direndam selama 1/2 hingga 1 jam. Cairan benzol–parafin dibuat dengan

mencampurkan larutan benzol dengan parafin dengan perbandingan yang sama.

4. Jaringan kemudian dipindahkan kedalam cairan parafin selama beberapa menit

PEMBENAMAN (EMBEDDING/IMPREGNASI)

Pembenaman (impregnasi) adalah proses untuk mengeluarkan cairan pembening

(clearing agent) dari jaringan dan diganti dengan parafin. Pada tahap ini jaringan harus

benar-benar bebas dari cairan pembening karena sisa cairan pembening dapat mengkristal

dan sewaktu dipotong dengan mikrotom akan menyebabkan jaringan menjadi mudah

robek.

Zat pembenam (impregnasi agent) yang dipakai adalah

1. Pafin caira panas yang mempunyai temperatur lebur (Melting temperature) kira-

kira 56-59 C

2. Parafin histotek khusus (Tissue mat) dengan suhu 56C

3. Paraplast yaitu campuran parafin murni dengan beberapa polimer plastik.


19


Gambar-3 Pembenaman (Embedding/ Impregnasi)

Keuntungan memakai parafin dengan titik lebur rendah adalah jaringan tidak mudah

menjadi rapuh/garing. Parafin dengan titik lebur rendah biasanya dipakai untuk jaringan

embrional

Keuntungan memakai paraplast adalah sifat parafinnya lebih elastis sehingga tidak

mudah sobek ketika dipotong dengan mikrotom dan dapat dipotong lebih mudah.

Proses pembenaman sebagai berikut

1. jaringan dbenamkan ke dalam parafin/paraplast I selama 2 jam

2. jaringan kemudian dipindahkan kedalam parafin/paraplast II selama 1 jam

3. akhirnya jaringan dimasukkan kedalam parafin/paraplast III selama 2 jam.

4. setelah pembenaman proses dapat dilanjutkan dengan pengecoran/bloking

PENGECORAN (BLOCKING)

Pengecoran (Blocking) adalah proses pembuatan blok preparat agar dapat

dipotong dengan mikrotom.

Untuk membuat blok preparat dapat digunakan 2 macam cara

1. Cara lama yaitu dengan menggunakan potongan besi berbentuk L (Leuckhart)

2 buah potongan besi disusun diatas lembaran logam hingga rapat dan

membentuk ruang seperti kubus. Tuangkan sedikit parafin cair di bagian pinggir

tempat pertemuan potongan besi agar tak bocor. Jaringan kemudian dimasukkan

ke dalam ruangan kubus. Selanjutnya parafin dituangkan kedalam ruangan kubus

tersebut. Hal yang harus dicegah adalah jangan sampai gelembung udara mengisi

kedalam blok parafin tersebut.

2. Cara baru yaitu dengan menggunakan cetakan dari plastik dan piringan logam

Dengan cara ini histoplate dari plastik diletakkan di atas piringan logam (seperti

cetakan membuat es batu). Tuangkan sedikit cairan parafin ke dalam cetakan

tersebut. Secepatnya masukkan jaringan dengan menggunakan pinset yang telah


20


dipanaskan (agar parafin tak beku) dan diatur posisinya di dalam cetakan. Parafin

cair kemudian dituangkan kembali hingga menutupi seluruh cetakan tersebut.

Selama tindakan ini cetakan (histoplate dari plastik) dan piringan logam harus

diletakkan diatas hot plate.

PEMOTONGAN (MOUNTING)

Pemotongan (mounting) adalah proses pemotongan blok preparat dengan

menggunakan mikrotom.

Sebelum melakukan pemotongan serangakaian persiapan yang harus dilakukan

adalah

1. Persiapan pisau mikrotom

Pisau mikrotom harus diasah sebelum dipakai agar jaringan dapat dipotong

dengan baik dan tidak koyak sehingga didapatkan jaringan yang baik. Pisau

mikrotom kemudian diletakan pada tempatnya di mikrotom dengan sudut tertentu.

Rekatkan blok parafin pada holder dengan menggunakan spatula atau scalpel.

Letakkan tempat duduk blok parafin beserta blok preparat pada tempatnya pada

mikrotom.

2. Persiapan Kaca Objek

Kaca objek yang akan direkatkan preparat harus telah dicoated (disalut) dengan

zat perekat seperti albumin (putih telur), gelatin atau tespa

3. Persiapan Waterbath atau wadah berisi air hangat dengan temperatur 37-400C

4. Persiapan sengkelit atau kuas

Tehnik pemotongan parafin yang mengandung preparat adalah sebagai berikut


21


1. Rekatkan blok parafin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di

mikrotom. Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian

diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat.

2. Letak pisau mikrotom pada tempatnya dan atur sudut kemiringannya. Biasanya

sudut kemiringan berkisar 20-30 derajat.

3. Atur ketebalan potongan yang diinginkan, biasanya dipakai ketebalan antara 5-7

mikrometer

4. gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin dan potonglah blok

preparat secara teratur dan ritmis. Buang pita-pita parafin yang awal tanpa

jaringan hingga kita mendapatkan potongan yang mengandung preparat jaringan

5. Pita parafin yang mengandung jaringan lalu dipindahkan secara hati-hati

menggunakan sengkelit atau kuas kedalam waterbath yang temperaturnya diatur

37-40C dan biarkan beberapa saat hingga poita parafin tersebut mengembang.

6. Setelah pita parafin terkembang dengan baik, tempelkan pita parafin tersebut pada

kaca objek yang telah dicoated dengan cara memasukkan kaca objek itu kedalam

waterbath dan menggerakkannya ke arah pita parafin. Dengan menggunakan

sengkelit atau kuas pita parafin ditempelkan pada kaca objek. Setelah melekat

kaca objek digerakkan keluar dari waterbath dengan hati-hati agar pita parafin

tidak melipat.

7. Letakkan kaca objek yang berisi pita parafin di atas hotplate dengan temperatur

40-45C, biarkan selama beberapa jam. Cara lainnya adalah dengan melewatkan

kaca objek di atas api sehingga pita parafin melekat erat di atas kaca objek.

8. Setelah air kering dan pita parafin telah melekat dengan kuat, simpan kaca objek

berisi potongan parafin dan jaringan sampai saatnya untuk diwarnai.

PEWARNAAN (STAINING)


22


Pewarnaan adalah proses pemberian warna pada jaringan yang telah dipotong

sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan dapat dikenali / diamati dengan mikroskop.

Proses timbulnya warna terkait dengan terjadinya ikatan antara molekul tertentu yang

terdapat pada daerah dan struktur jaringan yang tertentu. Sinar dengan panjang

gelombang tertentu yang terdapat dalam sinar yang berasal dari cahaya matahari atau

lampu mikroskop yang dipaparkan pada sajian yang telah diwarnai akan diabsorpsi

(diserap) atau diteruskan. Zat warna yan terikat pada jaringan akan menyerap sinar

dengan panjang gelombang tertentu sehingga jaringan tersebut akan tampak berwarna.

Sebelum melakukan pewarnaan serangkaian persiapan yang harus dilakukan

adalah sebagai berikut

1. Peralatan gelas harus dibersihkan dulu dan dibilas dengan akuades

2. Timbang zat warna dengan cermat dan tepat

3. Larutkan zat warna dalam pelarut yang benar dengan memperhatikan urutan

pencampurannya, misalnya hematoksilin selalu harus dilarutkan dalam alkohol

dulu sebelum ditambahkan bahan lain.

4. Aduk zat warna dengan baik agar seluruh partikel zat warna terlarut dengan baik

5. Tuangkan larutan zat warna ke dalam wadah yang sesuai untuk proses pewarnaan

dengan menyaringnya menggunakan kertas saring

6. Siapkan juga larutan-larutan lain yang diperlukan untuk proses pewarnaan dan

tuangkan dalam wadah yang sesuai

7. Atur urutan larutan-larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses pewarnaan

8. Zat warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan alkohol

yang akan menyebabkan presipitasi (pengendapan) zat warna

Pelarut yang umum dipakai dalam proses pewarnaan adalah air dengan derajat

keasaman yang netral (pH 7). Disamping itu juga dapat digunakan cairan pelarut lainnya

seperti etilalkohol (etanol) dengan derajat konsentrasi yang bervariasi. Bila tidak ada

keterangan dalam proses pelarutan yang menggunakan alkohol berarti konsnetrasi

alkohol yang digunakan adalah alkohol absolut dengan konsentrasi 99.9%.

Pulasan Hematoksilin-Eosin


23


Pulasan (pewarna) yang sering digunakan secara rutin adalah pewarnaan yang dapat

digunakan untuk memulas inti dan sitoplasma serta jaringan penyambungnya yaitu

pulasan hematoksilin-eosin (HE). Pada pulasan HE digunakan 2 macam zat warna yaitu

hematoksilin yang berfungsi untuk memulas nti sel dan memberikan warna biru

(basofilik) serta eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin, digunakan untuk

memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda

dengan nuansa yang berbeda.

Hematoksilin merupakan zat warna alami yang pertama kali dipakai tahun 1863.

Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan senyawaan

lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga. Senyawaan hematoksilin yang

dipakai adalah bentuk oksidasinya yaitu hematein. Proses oksidasi senyawaan

hematoksilin ini dikenal sebagai Ripening dan dapat dipercepat prosesnya dengan

menambahkan senyawaan yang bertindak sebagai oksidator seperti merkuri oksida,

hidrogen peroksida, potassium permanganat dan sodium iodat.

Selama proses oksidasi berlangsung kemampuan hematoksilin utuk mewarnai inti sel

akan terus berlangsung dan akan berkurang bila proses oksidasi telah selesai. Untuk

memperpanjang proses ini larutan hematoksilin dapat disimpan dalam wadah tertutup dan

disimpan dalam ruangan gelap. Dalam kondisi terpapar oleh cahaya sebaiknya larutan

diganti sekurangnya seminggu sekali. Jenis hematoksilin yangsering dipakai adalah

mayer, delafied, Erlich, Bullard dan Bohmer, sedangkan counterstaining yang dipakai

adalah eosin, safranin, dan phloxine.

Beberapa larutan hematoksilin yang digunakan adalah

1. Hematoksilin Erlich

Hematoksilin Erlich adalah hematoksilin yang paling tahan lama, mudah

berdifferensiasi dan warnanya relatif tahan lama. Hematoksilin ini baru bisa digunakan

setelah 1-2 bulan dibuat. Waktu inkubasinya adalah 30 menit dan counterstainingnya

adalah 0.5 -1% larutan eosin dalam air. Formulanya adalah sebagai berikut

o Hematoksilin …………………….. 6 gram

o Alkohol absolut …………………. 300ml

o Akwades ………………………….. 300ml

o Glycerol ……………………………. 300 ml


24


o Glacial acetic acid ………………. 30 ml

o Potassium alum …………………. berlebihan

Cara pembuatannya adalah sebagai berikut

1. Hematoksilin dilarutkan dalam alkohol

2. Sambil digerus dalam mortar secara perlahan-lahan tambahkan bahan lainnya

secara berurutan sambil digerus

3. Akhirnya tambahkan kristal potassium alum (Aluminium potassium sulfate)

sambil menggoyang-goyang botol hingga terdapat endapan kristal alum di dasar

botol.

4. Botol berisi larutan hematoksilin Ehrlich kemudian ditutup secara longgar dengan

gumpalan kapas dan disimpan ditempat terang selama 1-2 bulan sehingga

hematoksilinnya teroksidasi menjadi haematin. Proses ini dikenal sebagai

pematangan

2. Hematoksilin Delafield

Larutan zat warna ini tahan bertahun-tahun dalam penyimpanan, bisa digunakan 3

hari setlah pembuatan, counterstaining dengan menggunakan 0.5-1% larutan eosin dalam

air, waktu inkubasi 15-20 menit. Formula larutan pewarna ini adalah

o Hematoksilin kristal …………………... 6 gr

o Alkohol absolut …………………………. 50 ml

o Ammonium alum ………………………. 55 gr

o Akwades ………………………………….. 600ml

o Glycerol …………………………………… 150ml

Cara pembuiatan larutan hematoksilin Delafield adalah sebagai berikut

1. Larutkan kristal hematoksilin dengan alkohol absolut

2. Larutkan ammonium alum dengan akwades hingga jenuh (saturated)

3. Campurkan kedua larutan tersebut dan diamkan selama 3-5 hari

4. Saring dan tambahkan glycerol

5. Biarkan selama 3 hari dalam botol terpapar cahaya

6. Setelah 3 hari simpan dalam botol tertutup dan lindungi dari cahaya


25


3. Hematoksilin Mayer

Larutan hematoksilin Mayer merupakan larutan yang dapat disimpan dalam

waktu lama (berbulan-bulan), counterstaining dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu

inkubasinya 10-15 menit. Formulanya adalah

o Hematoksilin kristal ……………………….. 1gr

o Aquades ……………………………………….. 1000ml

o Sodium iodate ……………………………….. 0.2 gr

o Ammonium/potassium alum ……………. 50gr

o Citric acid ……………………………………… 1gr

o Chloral hydrate ……………………………… 50gr


1. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam aquades

2. Tambahkan hematoksilin dan campurkan secara baik

3. Kemudian tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate

4. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik

5. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya

4. Hematoksilin Harris

Larutan pewarna yang dapat dipakai segera setelah selesai dibuat, counterstaining

dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu inkubasinya adalah 15-20 menit. Formulanya

adalah sebagai berikut

Kristal hematoksilin …………………………… 5.0 gr

Alkohol 100% ………………………………….. 50 ml

Ammonium/potassium alum ……………….. 100 gr

Distilled water …………………………………… 1000 ml

Merkuri oksida …………………………………… 2.5 gr



26


1. Larutkan hematoksilin di dalam alkohol

2. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam distilled water dan panaskan

3. Hentikan pemanasan dan campur kedua larutan tersebut

4. Panaskan dengan cepat sambil di aduk

5. Hentikan pemanasan dan campurkan merkuri oksida kedalamnya perlahan-lahan

6. Panaskan kembali hingga larutan bewarna purple gelap

7. Hentikan pemanasan dan tempatkan wadah berisi larutan tersebut di dalam wadah

berisi air dingin hingga laurtan hematoksilin menjadi dingin

8. Larutan siap untuk digunakan segera setelah dinginkan

9. Tambahkan 2-4ml asam asetat glasial per 100ml Larutan untuk meningkankan

ketajaman warna inti

10. Saring sebelum digunakan

Larutan Counterstaining

Beberapa pulasan yang dipakai sebagai counterstaining larutan hematoksilin adalah

eosin, safranin dan phloxine.

1. Larutan Eosin

Larutan eosin yang digunakan terdiri atas larutan stok (Stock solution) dan larutan

kerja (working solution). Adapun kedua larutan ini adalah sebagai berikut

1% Stock Alkohol-Eosin

Eosin Y, water soluble ………………………. 1.0 gr

Distilled water ………………………………….. 20 ml

Larutkan dan tambahkan

Alkohol 95% …………………………………….. 80 ml

Working Eosin Solution

Eosin stock solution …………………………… 1 bagian

Alkohol 80% …………………………………….. 3 bagian

Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat

glasial 0.5ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik

2. Larutan Phloxine


27


Laurtan phloxine terdiri atas larutan stock eosin, stock phloxine, working solution

dan larutan Safran. Larutan-larutan tersebut adalah sebagai berikut

Stock Eosin

Eosin Y water soluble …………………………… 1 gram

Distilled water ……………………………………… 100ml

Stock Phloxine

Phloxine B …………………………………………….. 1.5 gr

Distilled water ………………………………………... 100ml

Working Solution

Stock Eosin …………………………………………….. 100ml

Stock Phloxine …………………………………………. 10ml

Alkohol 95% ……………………………………………. 780ml

Asam asetat glasial ………………………………….. 4ml

2% Alkohol Safran

Safran du Gatinais ……………………………………. 2 gram

Alkohol 100% ………………………………………….. 100ml

Pulasan rutin yang banyak dipakai adalah

I. Pulasan Mayer hematoksilin-eosin

Pulasan ini banyak dipakai dengan beberapa pertimbangan

1. Differensiasi warna sangat jelas

2. Mewarnai inti sel dengan baik dan jelas dengan background yang tidak

bewarna

3. Hasil konsisten

4. Prosedurnya sederhana

5. Dapat mewarnai preparat yang difiksasi dengan fiksasi apapun juga

Prosedur yang dipakai adalah sebagai berikut

a. Deparafinisasi dengan xylol (2x2 min)

b. Hidrasi dengan serial Alkohol 100% (2x2 min) – 95% (2min) – 90% (2 min) –

80% (2 min) - 70% (2min) – Distilled water (3min)

c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayers selama 15 min


28


d. Cuci dalam air mengalir selama 15-20menit

e. Observasi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi di air

mengalir selama beberapa menit. Bila sudah cukup warnanya lanjutkan ke

langkah selanjutnya

f. Counterstaining dalam larutan Eosin working solution selama 15 detik hingga

2 menit tergantung pada umur eosin dan kedalaman warna yang diinginkan

g. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat perlahan mulai 70%

hingga 100% masing-masing 2 menit.

h. Jernihkan dan dealkoholisasi dalam xylol 2x2min

i. Tutup dengan balsem kanada

Hasil/ Interpretasi adalah

Inti sel bewarna biru

Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada

komponen tertentu

II. Pewarnaan Hematoksilin Harris-Eosin

Protokol pulasan hematoksilin Harris –eosin adalah sebagai berikut

a. Deparafinisasi dalam xylol

b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%-

90%-80%-70%

c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Harris selama 15 min

d. Bilas dalam air mengalir dalam waktu yang singkat

e. Celup dalam campuran asam-alkohol secara cepat 3-10 celup cek differensiasi

warna di bawah mikroskop

f. Bilas dalam air mengalir secara singkat

g. Celup sebanyak 3-5 kali dalam larutan ammonium atau lithium karbonat hingga

potongan bewarna biru cerah

h. Cuci dalam air mengalir selama 10-20 menit Bila pencucian tidak maksimal

jaringan sulit terwarna oleh Eosin

i. Inkubasi dalam eosin selama 15 detik hingga 2 menit


29


j. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara perlahan,

masing-masing selama 2 menit

k. inkubasi dalam xylol 2x2menit

l. Tutup dengan kaca penutup

Hasil/Interpretasi hasil pulasan

Inti sel bewarna biru

Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna

pada komponen tertentu

III. Pewarnaan Hematoksilin Mayer-Phloxyne-Safran

Prosedur pewarnaan adalah sebagai berikut

a. Deparafinisasi dalam xylol

b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%-

90%-80%-70%

c. Inkubasi dalam larutan asam pikrat jenuh selama 5 menit

d. Cuci dalam air mengalir hingga seluruh asam pikrat hilang

e. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayer selama 15 menit

f. Basuh dengan air mengalir selama 20 menit

g. Warnai dalam larutan 1.5% larutan Phyloxine B selama 2 menit

h. Basuh dengan air selama 5 menit

i. Cuci dengan alkohol absolut 3 kali

j. Warnai dalam 2% larutan alkohol Safran selama 5 menit

k. Cuci dengan alkohol absolut 2 kali

l. Inkubasi dalam xylol 2 kali masing-masing selama 2 menit

m. Rekatkan dengan objek glass menggunakan Balsam Kanada

Hasil/interpretasi

Inti bewarna biru

Sel darah merah bewarna vermillion pink

Tulang bewarna kuning

Tulang rawan bewarna hijau kekuningan


30


Otot bewarna merah

Serat kolagen bewarna kuning

IV. Pulasan Giemsa

Pulasan Giemsa digunakan untuk

1. Pewarnaan darah

2. Pewarnaan sumsum tulang

3. Pewarnaan Riketsia

4. Pewarnaan bakteri Helicobacter pylori

Pulasan ini menggunakan fiksasi buffer formalin, metoda blok parafin dengan ketebalan

potongan 4-7 mikron. Larutan yang dipakai adalah

Yenner stock solution

Yenner bubuk ………………………… 1 gram

Methyl alkohol ……………………….. 400ml

Yenner working solution

Yenner stok …………………………… 25ml

Air suling ………………………………. 25 ml

Giemsa solution (Stock Solution)

Giemsa bubuk ……………………………. 1 gram

Glyserin …………………………………….. 66 ml

Methyl alkohol …………………………… 66 ml

Campurkan glyserin dengan bubuk Giemsa, masukkan dalam oven 60

C selama 2 jam

Tambahkan 66 ml methyl alkohol

Giemsa working solution

Campurkan Giemsa stok 50 tetes dengan air suling 50ml

Setiap kali harus dengan larutan segar

Larutan Asam asetat glasial 1%

Asam asetat glasial (cuka) …………………… 1ml


31


Air suling …………………………………………… 100ml

Prosedur pulasan adalah sebagai berikut

a. Deparafinisasi dengan xylol 3 kali selama 2-3 menit

b. Alkoholisasi dengan larutan alkohol yang konsentrasinya menurun

secara bertahap : Absolut … 95% …… 90% ….. 80% …… 70%

c. Hidrasi dengan air suling

d. Inkubasi dalam methyl alkohol 2 kali masing-masing selama 3 menit

e. Inkubasi dalam Yenner working solution selama 6 menit

f. Inkubasi dalam Giemsa working solution selama 45 menit

g. Inkubasi dalam asetat glasial 1% sampai inti menjadi jelas

h. Cuci dengan air suling

i. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara

bertahap 70%, 80%, 90%, 95%, absolut

j. Dealkoholisasi dengan xylol 2x masing-masing selama 2-3 menit

k. Tutup dengan kaca penutup yang diberi etelan

Hasil/Interpretasi : Bakteri helicobacter dan Riketsia akan bewarna biru

V. Pewarnaan Fite Faraco

Fite Faraco adalah metoda pulasan khusus untuk mendeteksi bakteri tahan asam (BTA)

seperti tuberkulosis dan lepra. Fiksasi yag digunakan adalah buffer formalin 10%, metoda

blok parafin dengan ukuran 4-7 mikron. Larutan yang digunakan adalah

Larutan Carbol Fuchsin

Phenol …………………………….. 2.5ml

Alkohol absolut ………………… 5 ml

Basic Fuchsin …………………… 0.5 gram

Air suling ad……………………… 50 ml

Larutan Methylen Blue


32


Methylen blue …………………… 0.5 gram

Asam asetat glasial ……………. 0.5 ml

Air suling ………………………….. 100 ml

Larutan alkohol asam 1%

Alkohol 70% …………………………… 99ml

Asam chlorida (HCl) ………………… 1 ml

Prosedur pulasan adalah sebagai berikut

Deparafinisasi dengan Campuran minyak kacang dan xylol (1:2)

dilakukan 2 kali masing-masing selama 12 menit

Alirkan dan hapus sisa minyak

Basuh dibawah air mengalir selama 5 menit

Warnai dengan Carbol Fuchsin 20-30 menit

Cuci dengan air mengalir

Cuci dengan alkohol asam 1% selama 1 menit hingga jaringan bewarna

merah jambu

Cuci dengan air mengalir

Warnai dengan Methylen Blue hingga jaringan bewarna biru muda

Bilas dengan air kran

Keringkan dengan kertas penghisap dan biarkan hingga kering betul

Inkubasi dalam xylol 2 kali selama 1-2 menit

Tutup dengan kaca penutup yang diberi Kanada balsem/etelan

Hasil/ Interpretasi hasil

Bakteri tahan asam (BTA) akan memberikan warna merah


33

histoteknikdasar.2009

Documents