AbstractHemangioma infantile merupakan tumor vascular yang sering terjadi pada anak2. Walaupun tumor jinak, beberapa hemangioma dapat menyebabkan deformasi dan kerusakan dan dapat membahayakan hidup. Terapi yang ada sekarang antara lain corticosteroid atau propranolol yang dikonsumsi untuk beberapa bulan dan dapat menyebabkan adverse effect terhadap anak2. Kami mendesign a high throughput screen untuk mengidentifikasi FDA-approved drugs yang bias dipakai untuk mengobati tumor ini. Rapamycin yang merupakan mTOR inhibitor diidentifikasi berdasarkan kemampuannya untuk menghambat proliferasi dari hemangioma-derived stem cell population, sel vasculogenic yang kami punya. Pada studi in vitro dan in vivo menunjukkan rapamycin mengurangi self renewal capacity dari stem cell hemangioma, menghilangkan potensi untuk berdiferensiasi dan menghambat aktivitas vasculogenic dari sel in vivo tersebut. Longitudinal in vivo imaging terhadap aliran darah melalui vessels formed with hemangioma stem cells shows that rpamycin juga dapat menyebabkan regresi pada pembuluh darah hemangioma, karena dikenal dengan anti angiogenic activity. Terakhir, kami mendemostrasikan rapamycin-induced loss of stemness dapat bekerja dengan corticosteroid, yaitu standard terapi untuk hemangioma dan untuk memblok pembentukan hemangioma in vivo. Studi kamu menunjukkan rapamycin menargetkan ke self-renewal dan diferensiasi vascular potensial pada patient-derived hemangioma stem cells dan mensarankan therapeutic strategy untuk mencegah formasi tumor ini.

IntoductionInfantile hemangioma merupakan tumor pada anak2 yang tersusun dari pembuluh darah dan sel immature. IH mereprentasikan gangguan pada vasculogenesis pada neonatal, pembentukan de novo vessels dari sel progenitor angiogenesis. Di study ini kami menunjukkan rapamycin, penghambat mTOR pathway, mennghilangkan self renewal capacity dari IH-derived stem cells, menginisiasi differensiasi hemSC terhadap perivascular cell phenotype dan menghambat formasi de novo vessl dari HemSCs. Aktivitas antivasculogenic dari rapamycin, yang merupakan berbeda dari antiangiogenic effects, merupakan penemuan yang sangat wow. Dengan implicasi terhadap mTOR pathway pada neonatal vasculogenesis dan juga strategi baru untuk mengobati IH.

Walaupun tumor junak biasanya tidak berbahaya, beberapa IH dapat menyebabkan deformasi atau bahkan merusak wajah dan/ atau menyebabkan obstruksi penglihatan dan pernafasan. 40-80% hasil pada permanent cutaneous residua, dapat menyebabkan disfiguring. Kortikosteroid merupakan first line therapy, biarpun begitu ada banyak adverse effect dan sekitar 16% hemangioma tidak merespon terhadap pengobatannya. Propranolol baru-baru ini sudah diperkenalkan sebagai pengobatan yang aman dan efektif. Tapi, bukan berarti tidak ada resiko, tidak semua tumor merespon. Jadi, masih dibutuhkan terapi tambahan yang bisa mengurangi durasi pengobatan atau bahkan pemcegah pembentukan hemangioma.

Pada jurnal ini, mereka mengisolasi stem sel (HemSCs) dan endhotelial cells (HemECs) dari specimen yang berproliferasi IH. HEMSCs mempunyai mesenchymal morphology, robust prolferasi, menjalani multi-lineage differensiasi dan membentuk pembuluh darah manusia dengan penampilan IH saat diinjeksi subcutan ke tikus percobaan. Kortikosteroid menghambat pembentukan vessel formation dengan menekan VEGF-A di HemSCs, tetapi tidak ada efek terhadap HemECs atau normal human cord blood-derived endothelial progenitor cells. Walaupun begitu, kortikosteroid tidak mempunyai efek terhadap proliferasi HemSC. Maka dari itu, di jurnal disimpulkan bahwa obat yang menghambat proliferasi HemSCs dapat mencegah pertumbuhan dan proliferasi IH. Untuk mendapatkan ini, di jurnal disebuktkan bahwa

Results.

A cell-based screen identifies compounds that selectively inhibit proliferation of HemSCs.

Di jurnal ditulis bahwa mereka mendesign tes proliferasi assay untuk tes parallel HemSCs dan sumsum tulang-derived stem cells. BM-MSCs berbagi beberapa karakteristik dengan HemSCs ; ekspresi dari mesenchymal markers, spindle shaped morphology dan potensial untuk berdiferensiasi menjadi tulang, lemak dan kartilago. Kebalikannya dari HemSCs, BM-MSCs tidak membentuk pembuluh darah saat diinjeksi sebagai single cell type di matrigel ketikus percobaan.

Dari Sembilan compound yang diidentifikasi, kami memilih rapamycin untuk penelitian lebih lanjut karena aktivitasnya yang bisa dipertahankan pada konsentrasi rendah dan keamanannya sudah disahkan di pediatric clinical trials. Rapamycin dapat menghambat proliferasi HemSCs hinggal 40% pada konsentrasi 1ng/ml atau lebih tinggi. Sementara BM-MSCs atau normal human dermal fibroblast kurang sensitive. Proliferating Cell nuclear antigen digunakan sebagai ukuran tambahan proliferasi. Rapamycin led to dose-dependent decrease pada persentase PCNA-positive HemSCs dengan 80% supresi pada 10ng/ml. tidak ada efek terhadap viabilitas.

Rapamycin merupakan inhibitor dari mTOR (mammalian target of rapamycin) untuk memverivikasi bahwa rapamycin menginhibisi mTOR di HemSCs, mereka tes phosphorylasi status dari dua target mTOR signaling serine/threonine kinase p 70 S6 kinase dan eIF-4ebp1. RAPAMYCIN menyebabkan penurunan dose dependent terhadap serum/ growth factor stimulated levels of phosphorylated 4Ebp1. Untuk memverifikasi mTor target relevant IH, di jurnal dianalisa lagi upstream regulator AKT. Phosphorylated AKT dideteksi pada proliferating IH tumor specimens. Kebalikannya, very low expression dapat diobservasi pada involution IH specimens.

RAPAMYCIN MENEKAN VASCULOGENESIS PADA IH TUMOR MODEL

Selanjutnya, kami tes dari efek systemic rapamycin terhadap dua model sel dari IH. HemSCs dan cbEPCs dicampur dengan matrigel dan diinjeksi subkutan ke tikus percobaan. Dua model sel memiliki keuntungan dari diinjeksi HemSC saja, pertama lebih rpbust sehingga lebih sensitive dalam mendeteksi dose response activity. Dua, bisa dites secara terpisah dari efek rapamycin terhadap HemSC vs cbEPCs, yang merupakan primary ecS yang diisolasi dari darah plasenta yang dijadikan sebagai prototypic young ECs. Rapamycin dimasukkan setiap hari melalui intra-peritoneal injection. Dibandingkan dengan vehicle-injected mice, rapamycin dapat menyebabkan dose-dependent inhibisi dari vascularisais dari matrigel implants. Anti-human CD31 staining verified bahwa rapamycin menginhibisi formasi de novo dari human CD31-positive blood vessels : CD31-Positive cellse terdeteksi tetapi tanpa lumen formation. Rapamycin juga menghambat vessel formation saat HemSC ditanam sendiri. Dua penghambat mTOR, everolimus dan temsirolimus, diinjeksi sistemik dan terbukti dapat menghambat formasi dari pembuluh darah.

Untuk membuktikan HemSCs target untuk rapamycin, versus the cbEPCs atau murine host cell, mereka pre-treated HemSCs dengan rapamycin selama tiga hari dalam in vitro, dibersihkan, rapamycin-treated di resuspended atau mengendalikan HemSCs dengan cbEPCs dalam matrigel dan diinjeksikan kedalam tikus percobaan. Pre-treatmen pada HemSCs dengan rapamycin menunjukkan penghambatan sebesar 80% terhadap pembentukan pembuluh darah. Pre treatment cbEPCs tidak mempunyai efek apapun. Hasil ini membuktikan bahwa HemSCs directly targeted by rapamycin.

An Anti proliferative drug is not sufficient to inhibit vasculogenesis in ViVO

Kami berhasil mengidentifikasi rapamycin berdasarkan preferential inhibition of HemSCs proliferasi. Lalu dites lagi apakah terdpat antiproliferative effect yang sama bila menggunakan obat yang berbeda, apakah anti-vasculogenic. Untuk melakukan ini, kami menggunakan obat antiproliferative roscovitine, purine analogue dan cyclin-dependent kinase inhibitor. Pertama dititrasi effect dari roscovitine pada HemSCs proliferasi, terdapat efek yang sama rapamycin, assayed pada experiment yang sama. Selanjutnya di pre-treated HemSCs in vitro selama tiga hari dengan roscovitine atau rapamycine, dibersihkan, lalu sel diinjeksi dengan untreated cbEPC kedalam tikus. Rapamycin inhibited microvessel density sebesar 60%. Sebaliknya, roscovitine tidak. Hasil ini membuktikan pretreatmen HemSC in vitro dengan anti proliferative drug tidak cukup untuk mengurangi vasculogenic potential.

HemSC self renewal and multi lineage differentiation are disrupted by rapamycin

Aktivitas mTOR terbukti penting dalam mempertahankan pemberharuan stemcell. Untuk membuktikan kapasitas pemberharuan dari HemSCs, dilakukan clonogenic assay. Pre-treatmen dari HemSCs dengan rapamycin didapatkan hasil penurunan 60% untuk jumlah HemSC colonies yang terbetuk dalam 9 hari. Moreover, penumpukan colonies menjadi groups dengan peningkatan jumlah sel membuktikan rapamycin pretreatmen menghilangkan penampilan colonies dengan >500cells, mengurangi persentasi dari clonies dengan 100-250 atau 250-500 celss percolony dan peningkatan persentasi colonies dengan 10 atau kurang. Hasil ini memperlihatkan bahwa pre-treatmen dari cells dengan rapamycin selama 4 hari menghasilkan berkurangnya jumlah dari proliferative clones. Clonally derived population dari HemSCs mempunyai kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi ECs dan adipocytes dalam in vitro dan in vivo. Di assay apakah multi-lineage differentiation dari HemSCs dapat altered oleh rapamycin. Rapamycin memblok ekspresi dari adipgenic markers lipoprotein lipase. CCAAT enhancer binding protein alpha dan akumulasi dari lipid droplet saat HemSC were wubjected to an adipogenic differentiation protocol. Tidak ada efek yang ditemukan pada kemampuan HemSC untuk berdiferensiasi dibawah empirically-defined in vitro condition, terhadap endothelial phenotype. Observasi ini mengindikasikan bahwa rapamycin menghambat adipogenic differentiative activity of HemSCs.

Rapamycin leads to mesenchymal maturation dan impaired vasculogenic potential

Reduksi pada self-renewal capacity dan inhibisi dari adipogenesis memperlihatkan bahwa rapamycin mendorong HemSCs untuk maturasi melewati state of multipotency. Bersambungan dengan hypothesis ini, HemSCs diinukbasi dengan rapamycin mempunyai elongasi morphology dibandingkan dengan control cells. Maka dari itu kami tes apakah rapamycin-treated HemSCs akan berdiferensiasi terhadap smooth muscle cell atau pericytic phenotype. Sebagai control positive, kami menggunakan endothelial co-culture untuk menstimulasi HemSCs terhadap SMC/Pericytic differentiation. Sama terhadap co-cultures dari mesenchymal progenitor cells dan ECs saat clonal HemSCs are co-cultured dengan ECs terdapat upregulation terhadap SMC dalam HemSCs dimulai pada hari ketiga. Inkubasi dari HemSCs dengan rapamycin selama 4 hari menunjukkan upregulation dari smooth muscle myosin heavy chain dan SM22-Alpha transcript levels. Hal yang sama juga terjadi pada SM22-alpha dan alpha smooth muscle actin yang meningkat pada protein level. Ekspresi level dari calponin, NG2 dan PDGF-Rbeta tidak berubah. Untuk tes functional features dari SMCs, dianalisa calcium influx di HemSC treated dengan rapamycin atau DMSO selama 6 hari. Hasilnya mengindikasikan rapamycin-treated HemSC mengekspresikan L-type voltage gated channels. Untuk memverivikasikan bahwa mesenchymal maturation mempunyai efek negative terhadap vasculogenic capability, kami plated HemSC sendiri atau dengan cbEPC selama 4 hari, setelah 4 hari cbEPCs terpisahkan dari HemSCs menggunakan anti-CD31-conjugated magnetic beads. HemSC yang terdiferensiasi digabungkan dengan cbEPC segar yang disuspensi di matrigel dan diinjeksikan ke tikus percobaan. Prior co-culture menujukkan penurunan sebesar 75% dalam hal microvessel density. Penemuan ini mengindikasikan independent of the means by terdapat induksi diferensiasi mesenchymal, antara rapamycin pre-treatment atau endothelial co-culture, vasculogenic potential dari HemSCs tidak ada.