FORM PENGAJUAN DANA BEASISWA

Nama : Muhammad Badrul Huda Nama Bank : Bank Rakyat Indonesia (BRI) Nama Account : Muhammad Badrul Huda Nomor Rekening : 1369-01-003967-50-3 BIC / Swift Code : IBAN / ABA / BSB :

Kampus : Universitas Gadjah Mada

Negara : Indonesia

Jenis Dana Pengajuan

dan Jumlahnya

: Dana Penelitian Tesis Dalam Negeri Rp. 25.117.340

Berikut saya lampirkan : 1. Kartu Tanda Mahasiswa (KTM) 2. Kartu Tanda Penduduk (KTP) 3. Rekening Buku Tabungan 4. Letter of Acceptance (LoA) 5. Surat Keterangan bahwa Penelitian tidak dibiayai oleh Kampus 6. Rancangan Anggaran Biaya Penelitian 7. Proposal Penelitian

1. KTM

2. KTP 3. Rekening Buku Tabungan

4. Letter of Acceptance (LoA)

5. Surat Keterangan bahwa Penelitian tidak dibiayai oleh Kampus

p. Silika gel 1 kg 75.000 75.000 75.000 CV. Chem-Mix Pratama Jogja

q. Etil Asetat 100 mL 1.438 143.800 143.800 http://simalab.mipa.ugm.ac.id

r. N-heksana 100 mL 720 72.000 72.000 http://simalab.mipa.ugm.ac.id

s. Aseton 50 gram 56.000 2.800.000 2.800.000 https://app.lppt.ugm.ac.id

t. Siklopentanon 50 mL 4.342 217.100 217.100 https://app.lppt.ugm.ac.id

u. Sikloheksanon (for

analysis, EMPLURA)

200 mL 1.484 296.800 296.800 Merck Chemical Pricelist 2017

v. Kalium Hidroksida 40 gram 900 36.000 36.000 http://simalab.mipa.ugm.ac.id

w. Asam Klorida 37% 50 mL 840 42.000 42.000 http://simalab.mipa.ugm.ac.id

x. Indikator pH Universal 2 kotak 180.000 360.000 360.000 CV. Chem-Mix Pratama Jogja

y. KH2PO4 for analysis

EMSURE

50 gram 2.396 119.800 119.800 Merck Chemical Pricelist 2017

z. K2HPO4 for analysis

EMSURE

50 gram 3.848 192.400 192.400 Merck Chemical Pricelist 2017

ab. Kalium Klorida 20 gram 1.297 25.940 25.940 http://simalab.mipa.ugm.ac.id

ac. Natrium Hidroksida 20 gram 575 11.500 11.500 http://simalab.mipa.ugm.ac.id

Rancangan Anggaran Biaya

Dana Bantuan Penelitian Tesis Tahun 2019

Nomor Induk Penerima Beasiswa 201808110213247

Nama Lengkap Muhammad Badrul Huda

Batch dan Tahun Persiapan Keberangkatan Batch 115 Tahun 2017

Program Studi Magister Kimia

Universitas Universitas Gadjah Mada

Jurusan Kimia

Penelitian Laboratorium

Negara Indonesia

No. Komponen Jumlah

yang

dibutuhkan

Satuan Harga

Satuan

Nominal

Dalam

IDR

Total Biaya Keterangan Komponen

1. Biaya Material Habis Pakai

a. 4-hidroksibenzaldehid

(for analysis)

25 gram 32.000 800.000 800.000 Progo Mulyo

b. 3-hidroksibenzaldehid 15 gram 62.000 930.000 930.000 Progo Mulyo

c. 2-hidroksibenzaldehid 250 mL 35.520 888.000 888.000 Progo Mulyo

d. N,N-

dimetilformamida

500 mL 1.628 814.000 814.000 Progo Mulyo

e. Kalium Iodida 20 gram 4.200 84.000 84.000 Progo Mulyo

f. Kalium Karbonat 50 gram 2.851 142.550 142.550 Progo Mulyo

g. Benzil Klorida 40 mL 462 18.480 18.480 Progo Mulyo

h. Akuades 200 Liter 1.300 260.000 260.000 Progo Mulyo

i. Kertas Saring 50 lembar 5.000 250.000 250.000 Progo Mulyo

j. Plastik Wrap 4 roll 40.000 160.000 160.000 Progo Mulyo

k. Aluminium Foil 2 roll 50.000 100.000 100.000 Progo Mulyo

l. Etanol (absolute for

analysis)

1,5 Liter 5280 792.000 792.000 Progo Mulyo

m. Aseton teknis 1 Liter 60.000 60.000 60.000 Progo Mulyo

n. Pipa Kapiler 2 botol 65.000 130.000 130.000 Progo Mulyo

o. Plat Kromatografi

Lapis Tipis (KLT)

4 lembar 180.000 720.000 720.000 http://simalab.mipa.ugm.ac.id

ad. Pati (Amilum) 50 gram 8.500 425.000 425.000 CV. Chem-Mix Pratama Jogja

ae. Iodin (I2 for analysis,

Suprapur)

10 gram 115.580 1.155.800 1.155.800 Merck Chemical Pricelist 2017

af. Enzim alfa amilase 1 0,25 kg 850.000 850.000 850.000 Delta Laboratorium Malang

ag. Enzim alfa-glukosidase 1 0,25 kg 850.000 850.000 850.000 Delta Laboratorium Malang

ah. p-Nitrofenil α-D-

glukopiranosida

(PNPG)

5 gram 44.000 44.000 220.000

ai. akarbosa 100 gram 2.750 2.750 27.500

ak. Tween 80 20 Gram 3.200 64.000 64.000 CV. Chem-Mix Pratama Jogja

al. Natrium Klorida 20 gram 906 18.120 18.120 http://simalab.mipa.ugm.ac.id

am. Sarung tangan lateks 4 kotak 48.000 192.000 192.000 CV. Chem-Mix Pratama Jogja

an. Masker 4 kotak 27.000 108.000 108.000 CV. Chem-Mix Pratama Jogja

ao. Tinta Canon 1 botol 55.000 55.000 55.000

Sub Total 14.205.220

2. Biaya Penggandaan

a. Fotokopi draft

proposal

5 Jilid 20.000 100.000 100.000

b. Fotokopi makalah

seminar proposal

5 Jilid 30.000 150.000 150.000

c. Fotokopi makalah

seminar hasil

5 Jilid 30.000 150.000 150.000

d. Fotokopi draft Tesis

tahap konsultasi

4 Jilid 40.000 160.000 160.000

e. Fotokopi draft Tesis

tahap Ujian

5 Jilid 40.000 200.000 200.000

f. Fotokopi draft Tesis

tahap koreksi

5 Jilid 40.000 200.000 200.000

g. Fotokopi dan

penjilidan hard cover

5 Jilid 70.000 350.000 350.000

Sub Total 1.310.000

3. Biaya Uji Laboratorium

a. FTIR 10 Jam 50.000 500.000 500.000 http://simalab.mipa.ugm.ac.id

b. GC-MS 15 Jam 60.000 900.000 900.000 http://simalab.mipa.ugm.ac.id

c. DI-MS 15 Jam 60.000 900.000 900.000 http://simalab.mipa.ugm.ac.id

d. H-NMR 6 sampel 400.000 2.400.000 2.400.000 https://layanan.lipi.go.id

e. C-NMR 6 sampel 400.000 2.400.000 2.400.000 https://layanan.lipi.go.id

f. Spektrofotometer

UV/VIS (dengan data

print)

20 jam 40.000 800.000 800.000 https://app.lppt.ugm.ac.id

g. TLC Scanner Camag 15 Jam 50.000 750.000 750.000 https://app.lppt.ugm.ac.id

h. TLC Scanner Shimadzu 15 Jam 35.000 525.000 525.000 https://app.lppt.ugm.ac.id

Sub Total 9.175.000

TOTAL BIAYA PENELITIAN 24.690.220

Yogyakarta, 23 September 2019

Diajukan Oleh Disetujui Oleh

Muhammad Badrul Huda Dr. Endang Astuti, M.Si

18/433836/PPA/05651 196812231997022001

i

Referensi Harga dan Komponen Honor Uji

ii

iii

i

PROPOSAL TESIS

SINTESIS ANALOG KURKUMIN MONO-KETON BERBAHAN DASAR

BENZILOKSI-BENZALDEHIDA DAN UJI AKTIVITASNYA SEBAGAI

INHIBITOR ENZIM α-AMILASE DAN α-GLUKOSIDASE

SYNTHESIS OF MONO-KETONE CURCUMIN ANALOGUES FROM

BENZYLOXY-BENZALDEHYDE AND THEIR ACTIVITY ASSAY AS

INHIBITOR OF α-AMILASE AND α-GLUKOSIDASE ENZYME

MUHAMMAD BADRUL HUDA

18/433836/PPA/05651

PROGRAM STUDI S2 KIMIA

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA

2019

ii

HALAMAN PENGESAHAN

PROPOSAL TESIS

SINTESIS ANALOG KURKUMIN MONO-KETON BERBAHAN DASAR

BENZILOKSI-BENZALDEHIDA DAN UJI AKTIVITASNYA SEBAGAI

INHIBITOR ENZIM α-AMILASE DAN α-GLUKOSIDASE

Telah dipersiapkan dan disusun oleh

MUHAMMAD BADRUL HUDA

18/433836/PPA/05651

Mengetahui,

Pembimbing

Dr. Endang Astuti, M.Si.

196812231997022001

iii

DAFTAR ISI

HALAMAN PENGESAHAN ii

DAFTAR ISI iii

DAFTAR GAMBAR v

DAFTAR TABEL vi

BAB I PENDAHULUAN 1

I.1 Latar Belakang 1

I.2 Tujuan Penelitian 4

I.3 Manfaat Penelitian 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA DAN PERUMUSAN HIPOTESIS 5

II.1 Tinjauan Pustaka 5

II.1.1 Kurkumin 5

II.1.2 Sintesis analog kurkumin 6

II.1.3 Sintesis 4-benziloksibenzaldehida 7

II.1.5 Diabetes mellitus 9

II.1.6 Enzim 12

II.1.7 Enzim α-amilase dan α-glukosidase 20

II.2 Perumusan Hipotesis 23

II.2.1 Perumusan hipotesis 1 23

II.2.2 Perumusan hipotesis 2 24

II.2.3 Perumusan hipotesis 3 25

II.2.4 Perumusan hipotesis 4 25

II.2.5 Rancangan penelitian 26

BAB III METODE PENELITIAN 27

III.1 Bahan 27

III.2 Peralatan 27

III.3 Prosedur Penelitian 27

III.3.1 Sintesis senyawa 3-benziloksibenzaldehida 27

III.3.2 Sintesis senyawa analog kurkumin 28

III.3.3 Uji Aktivitas Inhibisi Enzim α-amilase dan α-glukosidase 28

iv

III.3.3.1 Pembuatan larutan buffer fosfat saline pH 6,9 28

III.3.3.2 Pembuatan substrat pati dan PNPG (0,5 g/L) 29

III.3.3.3 Pembuatan larutan iodin 0,2% (b/v) 29

III.3.3.4 Pembuatan larutan enzim (20 U/mL) 29

III.3.3.5 Penentuan panjang gelombang (λ maks) 29

III.3.3.6 Pembuatan larutan sampel analog kurkumin dan akarbosa 29

III.3.3.7 Uji aktivitas inhibisi analog kurkumin dan akarbosa terhadap

enzim α-amilase α-glukosidase 29

III.3.3.8 Pembuatan kurva standar 31

III.3.3.9 Penentuan KM dan Vmaks 31

III.3.3.10 Penentuan tipe inhibitor senyawa analog kurkumin dan akarbosa 32

DAFTAR PUSTAKA 33

LAMPIRAN

v

DAFTAR GAMBAR

Gambar II.1 Kurkumin dalam keto-enol tautomer 5

Gambar II.2 Contoh reaksi eter Williamson 8

Gambar II.3 Sintesis analog kurkumin 8

Gambar II.4 Model kunci dan gembok enzim dan substrat 16

Gambar II.5 Model induksi pas enzim dan substrat 13

Gambar II.6 Kurva energi dalam reaksi 14

Gambar II.7 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal

reaksi enzimatik 15

Gambar II.8 Grafik Lineweaver-Burk 17

Gambar II.9 Grafik Lineweaver-Burk untuk inhibitor kompetitif 18

Gambar II.10 Grafik Lineweaver-Burk untuk inhibitor non kompetitif 19

Gambar II.11 Grafik Lineweaver-Burk untuk inhibitor unkompetitif 20

Gambar II.12 Enzim α-amilase 21

Gambar II.13 Enzim α-glukosidase 23

vi

DAFTAR TABEL

Tabel III.1 Komposisi pereaksi dalam system reaksi 30

1

BAB I

PENDAHULUAN

I. 1 Latar Belakang

Diabetes Melitus (DM) merupakan gangguan metabolisme kompleks yang

ditandai dengan peningkatan kadar glukosa darah (hyperglycemia). Hal tersebut

terjadi karena adanya ketidaknormalan metabolisme karbohidrat, lemak dan protein

yang disebabkan oleh kelainan sekresi insulin, sensitivitas insulin, atau kedua-

duanya. Penderita diabetes melitus dengan hiperglikemia kronis akan mengalami

beberapa gangguan fungsi organ seperti kebutaan, gagal ginjal, gangguan saraf,

gangguan hati, stroke, serangan jantung dan penghambatan pembuluh darah

(Baena, dkk., 2016). DM berada pada peringkat ketiga sebagai penyakit yang paling

mematikan di dunia, setelah kanker dan kardiovaskular (Guo et al., 2010).Jumlah

penderita diabetes melitus setiap tahunnya terus meningkat dan peningkatan

prevalansi ini diperkirakan akan jauh lebih besar terjadi di negara-negara

berkembang, seperti Indonesia (Zaccardi dkk., 2015). Indonesia masuk dalam 10

besar negara dengan jumlah penderita DM terbanyak di dunia. Penderita DM

masyarakat Indonesia sebanyak 5,6% dari total populasi yaitu sekitar 8,5 juta jiwa

dan pada tahun 2030 diperkirakan akan meningkat hingga 14,1 juta jiwa (Shaw

dkk., 2014). Pola makan, gaya hidup, dan kurangnya aktivitas fisik adalah penyebab

utama penyakit ini. Mihardja dkk. (2014) menyatakan penderita diabetes pada umur

produktif mempunyai resiko yang lebih besar. Faktor penyebabnya adalah obesitas,

hipertensi, dan dislipidemia yang dapat menyebabkan komplikasi seperti stroke dan

tuberkulosis.

Diabetes melitus diklasifikasikan menjadi 2 jenis yaitu DM tipe 1 dan DM

tipe 2. DM tipe 1 disebabkan pengaruh dari sel beta, sistem imun, dan juga faktor

genetik dan lingkungan, yang menyebabkan kerusakan autoimun pada sel beta

pankreas dan menyebabkan tubuh penderita sama sekali tidak menghasilkan insulin

sehingga membutuhkan insulin eksogen. DM tipe 1 biasanya terjadi pada anak-anak

dan remaja. DM tipe 2 lebih banyak diderita oleh orang dewasa yang disebabkan

karena obesitas dan resistansi insulin, bersamaan dengan kurangnya fungsi sel beta

2

sehingga tidak memproduksi insulin yang cukup (Mancia dkk., 2015). Jumlah

mayoritas penderita penyakit diabetes melitus di seluruh dunia merupakan

penderita penyakit diabetes melitus tipe 2 dengan presentase mencapai 90-95%

sedangkan penderita diabetes melitus tipe 1 hanya berkisaran kurang dari 10%

(Olokoba dkk., 2012).

DM tipe 2 berkaitan dengan kenaikan hiperglikemia setelah makan. Jika

tubuh tidak mempunyai cukup insulin, kadar glukosa dalam darah akan tinggi

setelah makan karena semua glukosa akan tinggal di dalam darah. Penderita akan

merasa sangat sakit bahkan tidak sadarkan diri. Tubuh tidak mampu mengatasi gula

yang berlebihan dalam seketika. Keadaan inilah yang disebut keadaan

hiperglikemia (Richard, 2010). Salah satu strategi dalam menghadapi DM tipe 2

adalah dengan mengontrol kadar glukosa dalam darah. Kadar glukosa dalam darah

dapat dikontrol dengan menghambat absorbsi karbohidrat setelah masuknya

makanan. Keadaan ini dapat dilakukan dengan cara menghambat kerja enzim α-

amilase dan α-glukosidase. Enzim α-amilase bertindak sebagai katalis dalam reaksi

hidrolisis pati membentuk maltosa, maltotriosa dan oligosakarida (6-8 rantai

glukosa) melalui pemutusan ikatan glikosida (Agarwal dan Gupta, 2016).

Sedangkan enzim α-glukosidase berperan dalam menghidrolisis oligosakarida

menjadi glukosa pada dinding usus halus (Shinde dkk., 2008). Penghambatan dua

enzim ini dapat menunda pencernaan karbohidrat dan memperpanjang waktu

pencernaan karbohidrat, sehingga mengurangi kecepatan absorpsi glukosa yang

pada akhirnya dapat mengontrol kenaikan glukosa setelah makan (Oboh dkk.,

2016).

Pada saat ini obat yang digunakan untuk menginhibisi enzim α-amilase dan

α-glukosidase adalah Akarbosa, miglitol, dan voglibosa. Akan tetapi, obat sintetik

ini memiliki efek samping kepada penderitanya seperti mual, kembung, diare, dan

meningkatkan komplikasi diabetes (Nampoothiri dkk., 2011). Oleh karena itu, saat

ini sedang digalakkan penelitian mengenai senyawa lain yang dapat menghambat

enzim α-amilase dan α-glukosidase tanpa menimbulkan efek samping pada

penderitanya. Yousefi dkk., (2015) telah membuktikan bahwa senyawa kurkumin

dapat digunakan sebagai inhibitor enzim α-amilase dan α-glukosidase.

3

Kurkumin telah diketahui memiliki berbagai aktivitas biologis yang sangat

baik seperti antiinflamatori, antioksidan, antikarsinogenik, antimutagenik,

antikoagulan, antifertilitas, antidiabetes, antibakteri, antijamur, antiprotozoa,

antivirus, antiracun, dan antialzheimer (Najafian, 2015). Namun senyawa kurkumin

memiliki kelemahan yaitu bioavailabilitas dan stabilitasnya rendah sehingga

membatasi kemampuan kurkumin sebagai obat. Hal ini dikarenakan struktur

kurkumin yang mengandung gugus hidroksi fenolik yang bersifat labil dan bagian

β-diketon yang membuat kurkumin rentan terhidrolisis dan terdegradasi oleh

perubahan pH. Bagian β-diketon yang sangat reaktif menjadikan struktur kurkumin

tidak stabil pada pH diatas 6,5. Apalagi dengan adanya gugus hidroksi pada fenol

menyebabkan kurkumin sangat cepat termetabolisme karena glukuronidasi sangat

mudah terjadi. Jadi, gugus hidroksi yang tersubstitusi di benzaldehid pada

kurkumin harus ditutup atau dibuang agar kurkumin menjadi stabil (Jantarat, 2013).

Oleh karena itu, banyak penelitian yang modifikasi senyawa analog kurkumin agar

mendapatkan kurkumin yang lebih stabil. Modifikasi tersebut dapat dilakuakan

dengan cara mengganti substituen pada gugus fenil, mengubah gugus diketon

menjadi gugus monoketon yang biasa dikenal dengan istilah monokarbonil

kurkumin, dan menutup gugus hidroksi pada kurkumin menjadi gugus alkoksida.

Das dkk., (2015) telah melakukan modifikasi kurkumin dengan mengubah

gugus diketon menjadi monoketon yang memiliki aktivitas diabetes sangat tinggi

dengan menurunkan level glukosa hingga 93,35% pada tikus yang terkena diabetes.

Selain itu Lin dkk. (2013) juga telah membuktikan bahwa analog kurkumin

monokarbonil mampu menghambat aktivitas enzim 11β-HSD. Enzim 11β-HSD

merupakan katalis untuk mengaktifkan glukokortikoid dalam jaringan insulin

target. Bila jumlah glukokortikoid meningkat, maka akan menyebabkan

peningkatan glukosa yang dikeluarkan di hati serta mempengaruhi akumulasi

lemak, sehingga senyawa analog kurkumin tersebut dapat berfungsi sebagai

antidiabetes. Hawaiz and Omer (2017) melakukan sintesis 4-

benziloksibenzaldehida untuk selanjutnya digunakan sebagai bahan dasar sintesis

analog kurkumin. Sintesis analog kurkumin dilakukan menggunakan metode

ultrasound yaitu dengan mereaksikan aseton dan 4-benziloksi-benzaldehida dalam

4

pelarut etanol dan katalis NaOH. Campuran direaksikan dalam suhu ruang selama

5-10 menit. Sintesis tersebut menghasilkan rendemen sebesar 90%.

Senyawa analog kurkumin monoketon dengan variasi subtituen pada

benzaldehida dapat meningkatkan stabilitas dan bioavailabilitasnya. Oleh karena

itu, pada penelitian ini dilakukan sintesis senyawa analog kurkumin dari turunan

benzaldehida yaitu 2-benziloksi-benzaldehida, 3-benziloksi-benzaldehida dan 4-

benziloksi-benzaldehida yang direaksikan dengan keton (aseton, siklopentanon dan

sikloheksanon). Penentuan aktivitas penghambatan dari senyawa analog kurkumin

tersebut dilakukan melalui uji aktivitas inhibisi terhadap enzim α-amilase dan α-

glukosidase serta dilakukan penentuan tipe inhibitor bagi senyawa analog kurkumin

hasil sintesis. Selain itu, juga dilakukan metode molecular docking untuk

mengamati interaksi analog kurkumin pada enzim α-amilase dan α-glukosidase.

Metode ini dilakukan menggunakan software PyRx dengan parameter binding

afinity.

I.2 Tujuan Penelitian

Berdasarkan latar belakang yang diuraikan di atas maka tujuan dari

penelitian ini adalah:

1. Melakukan sintesis bahan dasar benziloksi-benzaldehida dari hidroksi-

benzaldehida dan benzil klorida.

2. Melakukan sintesis senyawa analog kurkumin berbahan dasar benziloksi -

benzaldehida dengan variasi keton yaitu aseton, siklopentanon dan

sikloheksanon.

3. Melakukan uji aktivitas inhibisi senyawa analog kurkumin terhadap enzim

α-amilase dan α-glukosidase.

4. Menentukan tipe inhibitor senyawa analog kurkumin yang menghambat

aktivitas enzim α-amilase dan α-glukosidase.

5. Melihat interaksi senyawa analog kurkumin pada enzim α-amilase dan α-

glukosidase berdasarkan molecular docking.

5

I.3 Manfaat Penelitian

Adapun manfaat dari penelitian ini antara lain:

1. Memperoleh informasi mengenai senyawa baru yang dapat dijadikan

sebagai kandidat obat diabetes.

2. Memberikan kontribusi dalam pengembangan ilmu pengetahuan dan

teknologi dalam bidang kimia organik sintesis dan aplikasi di bidang

kesehatan.

6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA DAN PERUMUSAN HIPOTESIS

II.1. Tinjauan Pustaka

II.1.1 Kurkumin

Kurkumin merupakan pigmen berwarna kuning yang terkandung dalam

rimpang tanaman Curcuma longa, yang secara tradisional dan secara luas telah

digunakan sebagai zat pewarna makanan alami. Kurkumin memiliki berat molekul

368,37 gram/mol, tidak larut dalam air dan eter tetapi larut dalam etanol, metanol,

aseton, kloroform, dimetilsulfoksida dan diklorometana. Kurkumin terdapat di

alam dalam bentuk enolik dan β-diketon. Kurkumin ada sebagai campuran

kesetimbangan dari dienon simetri dalam larutan dan keto-enol tautomer yang

distabilisasi oleh ikatan hidrogen intramolekul (Li dkk., 2015). Struktur kurkumin

ditunjukkan oleh Gambar II.2. Kurkumin dan turunannya menunjukkan berbagai

macam aktivitas biologis dan sifat farmakologis seperti antioksidan (Jovanovic

dkk., 2001), anti-inflammatori (Han dan Yang, 2005), anti-HIV protease

(Mazumder dkk., 1997), antikanker (Adams dkk., 2004), antimalaria (Ji dan Shen,

2009), dan antimikroba (Nelson dkk., 2017).

Gambar II.1 Kurkumin dalam keto-enol tautomer.

Kurkumin juga bersifat sebagai antidiabetes karena menunjukkan efek

penghambatan terhadap enzim 11β-HSD1 dalam sel yang utuh pada manusia dan

tikus (Yuan dkk., 2014). Meskipun kurkumin menunjukkan berbagai macam

7

aktivitas biologis dan farmakologis, namun kegunaannya sebagai agen terapeutik

sangat terbatas. Hal tersebut dikarenakan sifat kurkumin yang tidak larut dalam air,

memiliki bioavailabilitas dan stabilitas yang rendah. Stabilitas yang rendah

dipengaruhi oleh gugus β-diketon dan gugus metilena. Oleh karena itu,

penghilangan kedua gugus tersebut dapat meningkatkan stabilitas dari turunan

kurkumin (Ramya dkk., 2018). Berbagai penelitian terbaru menunjukkan bahwa

struktur kurkumin sebagai kurkumin mono-keton dapat meningkatkan

kestabilannya secara signifikan, tetapi tetap menjaga sifat tidak toksiknya serta

bioavailabilitas yang tinggi (Li dkk., 2015).

II.1.2 Sintesis Analog Kurkumin

Kurkumin dilaporkan memiliki sifat yang sangat aman karena kurkumin

tidak menyebabkan efek samping, bahkan jika dikonsumsi dalam jumlah dosis yang

tinggi. Bioavailabilitas dari kurkumin merupakan suatu fokus utama yang

membatasi pemanfaatan terapeutiknya. Hampir 75% kurkumin yang dikonsumsi

akan diekskresikan dalam feses, hal tersebut mengindikasikan terjadinya

penyerapan kurang efektif yang terjadi di dalam usus. Oleh karena itu, untuk

mengatasi kekurangan tersebut maka dilakukan sintesis analog kurkumin sebagai

alternatif utama untuk mendapatkan kurkumin dengan bioavailabilitas dan stabilitas

yang tinggi serta meningkatkan potensial metabolismenya di dalam tubuh (Vyas

dkk., 2013). Analog kurkumin merupakan senyawa yang relatif berbeda dengan

bentuk dasar kurkumin. Analog kurkumin dapat diperoleh dari penyederhanaan

gugus β-diketon menjadi gugus mono-keton. Berbagai metode telah dilaporkan

dalam sintesis analog kurkumin, salah satunya adalah metode sintesis konvensional

kondensasi aldol silang Claisen-Schmidt (Wang dkk., 2017). Reaksi terjadi pada

suatu aril aldehida dan alkil keton baik dengan katalis asam maupun katalis basa

seperti NaOH dan KOH (Ramya dkk., 2018).

Namun, penggunaan katalis basa lebih banyak digunakan karena alasan

efisiensi produk reaksi (Patil dkk., 2009). Pada reaksi berkatalis basa, tahap pertama

adalah kondensasi aldol silang yang melibatkan adisi nukleofilik karbanion dari

keton alkil terhadap karbon karbonil dari aldehida aromatik, dilanjutkan dehidrasi

hidroksi keton untuk membentuk analog kurkumin (Ramya dkk., 2018).

8

Yuan dkk. (2014) telah berhasil melakukan sintesis senyawa analog

kurkumin dari reaksi kondendasi turunan benzaldehida dengan aseton,

siklopentanon dan sikloheksanon menggunakan katalis basa berupa larutan KOH

5% (b/v) dengan metode refluks selama 50 menit. Li dkk. (2015) telah berhasil

melakukan sintesis senyawa analog kurkumin dari variasi turunan benzaldehida

dengan aseton menggunakan katalis basa berupa larutan NaOH 8% (b/v). Hawaiz

dan Omer (2017) telah melakukan sintesis analog kurkumin berbahan dasar 4-

benziloksibenzaldehida dengan aseton menggunakan katalis basa berupa larutan

NaOH 8%.

Yousefi dkk. (2015) telah berhasil mensintesis senyawa analog kurkumin-

pirano[2,3-d]pirimidin dan menguji aktivitasnya sebagai inhibitor enzim α-

glukosidase. Senyawa analog kurkumin-pirano[2,3-d]pirimidin terbukti memiliki

aktivitas penghambatan yang lebih baik dibandingkan dengan obat antidiabetes

yang telah paten seperti akarbosa. Hal tersebut ditunjukkan dengan persen

penghambatan senyawa analog kurkumin-pirano[2,3-d]pirimidin sebesar 90%,

sedangkan persen penghambatan akarbosa hanya sebesar 85%. Oleh karena itu,

senyawa analog kurkumin dikatakan memiliki sifat antidiabetes yang baik.

II.1.3 Sintesis 4-benziloksi-benzaldehida

Senyawa 4-benziloksibenzaldehida dengan rumus molekul C14H12O2

adalah senyawa organik dengan berat molekul 212,25 g/mol. Senyawa ini tidak

larut dalam air tetapi larut dalam etanol dan kloroform. Sintesis 4-

benziloksibenzaldehida umum dilakukan dengan mekanisme reaksi eter

Williamson. Reaksi eter Williamson adalah suatu reaksi SN2 antara suatu alkil

halida dan suatu alkoksida atau fenoksida. Pada reaksi ini, gugus hidroksi dari

hidroksialdehida yang telah terdeprotonasi oleh basa berperan sebagai nukleofil,

sedangkan gugus halida pada alkil halida berperan sebagai gugus pergi. Rendemen

terbaik diperoleh apabila alkil halida berupa metil atau primer (alkil halida sekunder

atau tersier akan menghasilkan alkena, sedangkan aril dan vinil halida tidak

bereaksi SN2). Contoh reaksi eter Williamson dapat dilihat pada Gambar II.6

(McMurry, 2016).

9

Gambar II.2 Contoh reaksi eter Williamson (McMurry, 2016)

Terdapat beberapa metode untuk mensintesis 4-benziloksibenzaldehida

dengan menggunakan berbagai macam pelarut, basa, dan benzil halida. Lin et

al.,(2005) melakukan sintesis benzilasi menghasilkan berbagai macam turunan

benziloksibenzaldehida dengan mereaksikan benzilklorida dalam pelarut THF dan

K2CO3 sebagai basa. Senyawa 4-benziloksibenzaldehida didapatkan rendemen

sebesar 92%.

Metode lain dikemukakan oleh Rahman et al., (2018) dalam melakukan

sintesis 4-benziloksibenzaldehida. Sintesis tersebut dari 4-hidroksibenzaldehida

dan benzil klorida dalam pelarut aseton dan K2CO3 sebagai basa. Sintesis

dilakukan dengan menggunakan metode refluks selama 3 jam. Hasil reaksi

kemudian diekstraksi dengan pelarut etil asetat (30 mL x 3) menghasilkan

rendemen sebesar 85%. Sintesis 4-benziloksibenzaldehida juga dikemukakan oleh

Baugaard (2013). Senyawa 4-hidroksibenzaldehida direaksikan dengan benzil

bromida dalam pelarut DMF dan K2CO3 sebagai basa. Campuran reaksi diaduk

menggunakan stirrer selama 3 jam pada suhu 90 °C. Sintesis tersebut menghasilkan

padatan dengan rendemen 84,4%. Sintesis 4-benziloksibenzaldehida yang

dilakukan oleh Baugaard (2013) dapat dilihat pada Gambar II.7.

Gambar II.3 Sintesis 4-benziloksibenzaldehida (Baugaard, 2013)

Senyawa 4-benziloksibenzaldehida selanjutnya digunakan sebagai bahan

dasar pembuatan senyawa analog kurkumin dengan mereaksikan menggunakan

keton.

10

II.1.4 Diabetes Melitus

Diabetes melitus merupakan gangguan metabolisme kompleks yang

ditandai dengan peningkatan kadar glukosa dalam darah secara tidak normal

(hyperglicemia). Hal tersebut terjadi karena adanya ketidaknormalan metabolisme

karbohidrat, lemak dan protein yang disebabkan oleh kelainan sekresi insulin,

sensitivitas insulin, atau kedua-duanya. Glukosa merupakan merupakan

monosakarida dari proses pemecahan ikatan glikosida suatu polisakarida,

oligosakarida dan disakarida. Glukosa di dalam usus akan diserap dan dialirkan

oleh darah ke seluruh tubuh. Hal ini menyebabkan kadar glukosa dalam darah akan

meningkat dan memicu sel beta pulau langerhans kelenjar pankreas mensekresikan

hormon insulin. Insulin berperan dalam dalam proses transpor glukosa ke dalam sel

sehingga insulin dapat membantu mengatur kadar glukosa darah dalam tubuh.

Glukosa akan mengalami proses metabolisme yang bertujuan untuk menghasilkan

energi. Adanya sekresi insulin dan masuknya glukosa ke dalam sel mengakibatkan

kadar glukosa dalam darah menurun. Ketika kadar glukosa dalam darah tinggi maka

sekresi insulin juga akan meningkat. Hal tersebut tidak terjadi pada penderita

diabetes melitus. Perubahan kadar glukosa dalam darah pada penderita diabetes

melitus tidak stabil karena terjadi gangguan pada produksi insulin atau sensitivitas

insulin. Penurunan sekresi insulin dan gangguan sensitivitas insulin dapat

menghambat masuknya glukosa ke dalam sel-sel yang mengakibatkan

hiperglikemia (Surya dkk., 2014).

Diabetes melitus dibagi menjadi dua jenis yaitu diabetes melitus tipe 1 dan

diabetes melitus tipe 2. Penyakit diabetes melitus tipe 1 sering dikenal dengan

istilah Insulin Dependent Diabetes Mellitus (IDDM). IDDM disebabkan oleh

gangguan autoimun yaitu sistem pertahanan tubuh menyerang sel beta pulau

langerhans kelenjar pankreas sebagai penghasil insulin. Kerusakan sel beta

menyebabkan jumlah insulin yang dihasilkan oleh kelenjar pankreas menurun.

Akibatnya glukosa yang masuk ke dalam tubuh tidak dapat diproses secara

sempurna sehingga konsentrasi glukosa dalam darah akan meningkat. Penderita

diabetes melitus tipe 1 sekitar 5-10% dari semua kasus diabetes. Hampir 80-90%

diabetes melitus tipe 1 diderita oleh anak-anak dan remaja (Atkinson dkk., 2014).

11

Umumnya pengobatan diabetes melitus tipe 1 dilakukan dengan penyuntikkan

insulin untuk mendapatkan insulin pengganti (Gregory dkk., 2013). Penyakit

diabetes melitus tipe 2 sering dikenal dengan istilah Non-Insulin Dependent

Diabetes Mellitus (NIDDM). NIDDM merupakan tipe diabetes yang terjadi karena

insulin yang dihasilkan oleh sel beta pulau langerhans kelenjar pankreas mengalami

resistensi sehingga bersifat kurang efektif dalam merespon sel-sel secara normal.

Konsumsi glukosa yang berlebih dan resistensi yang terjadi pada insulin

akan menyebabkan terjadinya peningkatan glukosa darah. Diabetes melitus tipe 2

disebabkan oleh dua faktor utama yaitu gaya hidup dan genetik. Sejumlah gaya

hidup seperti pola makan, kurangnya aktivitas fisik, merokok, mengkonsumsi

alkohol dan mengkonsumsi obat-obatan terlarang dapat berperan penting dalam

pengembangan penyakit diabetes melitus tipe 2 ini. Jumlah mayoritas penderita

penyakit diabetes melitus di seluruh dunia merupakan penderita penyakit diabetes

melitus tipe 2 dengan presentase mencapai 90-95% sedangkan penderita diabetes

melitus tipe 1 hanya berkisaran kurang dari 10% (Olokoba dkk., 2012). Pengobatan

diabetes melitus tipe 2 dapat dilakukan dengan mengonsumsi obat oral. Penggunaan

obat-obatan tersebut memberikan efek hipoglikemik sehingga mencegah kadar

glukosa dalam darah meningkat (Matthaei dkk., 2009).

Pengobatan diabetes melitus dilakukan dengan penyuntikkan insulin

ataupun mengonsumsi obat-obatan oral sintesis. Penggunaan obat-obatan oral

sintesis memberikan efek hipoglikemik sehingga mencegah kadar glukosa dalam

darah meningkat. Ada berbagai jenis obat oral sintesis yang biasanya dikonsumsi

oleh penderita diabetes melitus khususnya diabetes melitus tipe 2, yaitu:

a. Metformin

Metformin merupakan turunan dari guanidine yang dapat meningkatkan

pemanfaatan glukosa di seluruh tubuh. Metformin akan memperbaiki kontrol

diabetes dengan mengurangi resistensi insulin di dalam hati dan meningkatkan

sensitivitas jaringan otot tanpa meningkatkan sekresi sel beta pulau langerhans

kelenjar pankreas sehingga absorpsi glukosa ke dalam sel-sel jaringan tubuh

meningkat (Natali dan Ferrannini, 2006). Selain itu, metformin juga dapat

12

menghambat proses glukoneogenesis sehingga dapat menurunkan produksi glukosa

oleh hati (Song, 2016).

b. Sulfonilurea dan Meglitinida

Sulfonilurea dan Meglitinida telah digunakan untuk mengobati diabetes

melitus tipe 2. Kedua obat tersebut bekerja dengan merangsang sel beta pulau

langerhans kelenjar pankreas untuk mensekresikan insulin dan memberikan efek

hipoglikemik. Penggunaan sulfonilurea dan meglitinide menyebabkan berat badan

bertambah dan peningkatan risiko terkenal penyakit cardiovaskular (Penalver dkk.,

2016).

c. Tiazolidinedione

Rosiglitazone dan pioglitazone merupakan obat oral sintesis yang termasuk

ke dalam golongan tiazolidinedione. Obat-obatan oral sintesis tersebut dapat

meningkatkan sensitivitas terhadap insulin yang bekerja pada otot dan jaringan

disposal pada sel sehingga terjadinya peningkatan pemanfaatan glukosa. Selain itu,

tiazolidinedione dapat mengurangi glukosa yang dihasilkan oleh hati dan mengatur

kadar glukosa dalam darah dengan menjaga fungsi sel beta pankreas. Penggunaan

obat tiazolidinedione dalam jangka waktu panjang dapat menyebabkan serangan

jantung, bertambahnya berat badan dan kepadatan tulang menurun (Park dkk.,

1997).

d. Penghambat α-Amilase dan α-Glukosidase

Akarbosa, miglitol, voglibose dan quercetin merupakan obat oral sintesis

yang dapat menghambat kerja enzim α-amilase dan α-glukosidase. Penggunaan

obat-obatan oral sintesis ini dimaksudkan untuk mengontrol kadar glukosa post-

prandial sehingga menyebabkan absorpsi glukosa setelah makan tertunda.

Penggunaan obat sintesis ini juga dapat mengurangi risiko terkena penyakit

cardiovascular, tetapi tetap memberikan efek samping seperti alergi dan hepatitis

akut (Chiasson dkk., 2003).

Akarbosa merupakan senyawa yang termasuk golongan oligosakarida

dengan berat molekul sebesar 645 g/mol. Akarbosa telah terbukti mempunyai

aktivitas penghambatan terhadap enzim α-glukosidase dan α-amilase. Akarbosa

mampu menurunkan kadar glukosa dalam darah. Saat ini, akarbosa telah banyak

13

digunakan untuk mengobati diabetes melitus tipe 2. Penggunaan akarbosa dalam

jangka waktu pendek relatif aman. Apabila dikonsumsi dalam jangka waktu yang

lama dan dosis tinggi maka dapat memberikan efek samping seperti gangguan

saluran pencernaan dan perut kembung (Pratley, 2013).

II.1.5 Enzim

Enzim merupakan biokatalisator. Enzim adalah protein yang mengkatalisis

reaksi kimia spesifik tanpa pembentukan produk samping. Enzim bersifat spesifik

terhadap substratnya. Enzim berperan penting dalam metabolisme makhluk hidup.

Beberapa enzim hanya terdiri dari polipeptida dan sebagian enzim lain ada yang

memerlukan komponen tambahan pendukung untuk dapat beraktivitas. Komponen

pendukung tersebut dapat berupa senyawa organik (koenzim) atau senyawa

anorganik (kofaktor) seperti ion Fe2+, Mn2+, dan Zn2+ (Nelson dan Cox, 2012).

Enzim mempunyai berat molekul sekitar 12.000 sampai lebih dari 1 juta Da.

Enzim mempunyai ukuran yang lebih besar dibandingkan dengan substrat sehingga

menyebabkan tidak semua sisi enzim dapat mengalami kontak dengan substrat.

Kontak antara enzim dengan substrat hanya terjadi pada bagian sisi aktif enzim.

Mekanisme interaksi antara enzim dengan substrat telah dijelaskan oleh Emil

Fischer pada tahun 1894. Emil Fischer menjelaskan bahwa mekanisme enzim

dengan substrat dapat dianalogikan seperti kunci dan gembok yang bentuknya

saling bersesuaian (lock and key model). Ilustrasi kunci dan gembok ditunjukkan

pada Gambar II.3.

Gambar II.4 Model kunci dan gembok enzim dan substrat (Nelson dan Cox,

2012).

Kontak antara enzim dan substrat hanya dapat terjadi apabila bagian sisi

aktif enzim memiliki ruang yang tepat untuk menampung substrat. Jika substrat

memiliki bentuk atau konformasi yang tidak sesuai dengan enzim maka substrat

14

tidak bisa ditampung oleh sisi aktif enzim. Hal tersebut yang menyebabkan enzim

dikatakan memiliki spesifitas tertentu terhadap substrat (Denniston dkk., 2007).

Seiring dengan perkembangan pengetahuan tentang konformasi struktur enzim,

diketahui bahwa sisi aktif enzim bersifat fleksibel dan tidak kaku. Bentuk dari

enzim, sisi aktif dan substrat menyesuaikan supaya didapatkan posisi pas secara

maksimal untuk memperbaiki proses katalisis. Model ini disebut dengan model

induksi pas (induced-fit model). Model ini lebih konsisten dengan rentang yang

lebih luas dalam menjelaskan mekanisme kerja enzim. Ilustrasi induksi pas

ditunjukkan oleh Gambar II.4.

Gambar II.5 Model induksi pas enzim dan substrat (Nelson dan Cox, 2012).

Berdasarkan reaksi yang dikatalisis, enzim diklasifikasikan ke dalam enam

kelas. Kelas oksidareduktase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi transfer

elektron (reduksi oksidasi). Kelas transferase adalah enzim yang mengkatalisis

reaksi pemindahan atom dan gugus fungsi selain oksigen dan hidrogen. Kelas

hidrolase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis. Kelas liase adalah

enzim yang mengkatalisis reaksi non-hidrolisis untuk menghilangkan gugus fungsi

dari substrat sehingga produk yang terbentuk memiliki ikatan rangkap. Kelas

isomerase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi pemindahan gugus di dalam

molekul dan menghasilkan bentuk isomer (rasemasi dan cis-trans isomerase). Kelas

ligase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi pembentukan ikatan C−C, C−S,

C−O, dan C−N melalui reaksi kondensasi (Nelson dan Cox, 2012).

Kinetika Enzim

Enzim (E) mengikat substrat (S) dalam reaksi bolak-balik membentuk

kompleks enzim-substrat (ES). Reaksi ini berlangsung cepat.

E+S ES (II.1)

15

Kompleks enzim-substrat (ES) kemudian terurai dalam reaksi satu arah

menghasilkan produk reaksi (P) dan enzim bebas (E). Reaksi ini berjalan lambat,

sehingga reaksi ini digunakan untuk menghitung kinetika suatu enzim.

ES P+E (II.2)

Reaksi enzimatis akan menghasilkan senyawa intermediet yang

membutuhkan energi aktivasi lebih rendah daripada reaksi tanpa enzim. Enzim

berperan sebagai biokatalisator yang mampu mempercepat reaksi kimia dengan

menurunkan energi aktivasi (Gambar II.5). Energi aktivasi adalah energi minimal

yang diperlukan untuk mengawali suatu reaksi. Dalam reaksi enzimatis energi

aktivasi diperlukan untuk dapat mencapai keadaan transisi antara reaktan dan

produk (Copeland, 2000).

Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim dipengaruhi oleh konsentrasi

substrat. Jika konsentrasi substrat meningkat maka kecepatan reaksi juga akan

meningkat. Pada titik tertentu, kecepatan reaksi hanya akan meningkat sedemikian

kecil dengan bertambahnya konsentrasi substrat. Hal ini menunjukkan bahwa

kecepatan reaksi maksimum (Vmaks) telah tercapai. Enzim telah jenuh oleh

substrat dan tidak dapat berfungsi lebih cepat.

Gambar II.6 Kurva energi dalam reaksi (Nelson dan Cox, 2012).

Kurva yang menyatakan hubungan antara konsentrasi substrat dengan kecepatan

reaksi enzimatik mengikuti pola hiperbola seperti yang ditunjukkan pada Gambar

II.6.

16

Gambar II.7 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi

enzimatik (Nelson dan Cox, 2012).

Michaelis dan Menten mendefinisikan suatu tetapan, yang sekarang

dinyatakan sebagai KM yang bermanfaat dalam menyatakan hubungan yang tepat

di antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatis. KM didefinisikan

sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai setengah kecepatan

maksimumnya. Persamaan Michaelis-Menten menyatakan bentuk kurva kejenuhan

substrat yang khas bagi suatu enzim. Persamaan tersebut diturunkan menjadi bentuk

matematika sederhana. Penurunan persamaan Michaelis-Menten secara modern

diawali dengan persamaan reaksi dasar yang terlibat dalam pembentukkan dan

penguraian kompleks enzim substrat sebagai berikut:

P EES S E 2

1

1-

kk

k

(II.3)

k1 adalah konstanta laju reaksi pembentukan kompleks enzim-substrat dan k-1

adalah konstanta laju reaksi penguraian kompleks enzim-substrat menjadi substrat

dan enzim sedangkan k2 adalah konstanta laju reaksi pembentukan produk.

Ketika konsentrasi substrat menjadi sangat besar untuk menggeser

kesetimbangan menuju ke pembentukkan ES, maka reaksi tahap pembentukkan

produk menjadi reaksi pembatas karena tidak ada lagi ES yang dapat diubah dan

kompleks enzim-substrat berada pada nilai maksimumnya. Oleh karena itu,

persamaannya dapat dituliskan sebagai berikut:

17

∂[ES]

∂t = k1[E][S] – k-1[ES] – k2[ES] (II.4)

Dengan pendekatan steady state maka

∂[ES]

∂t = 0 (II.5)

∂[ES]

∂t = k1[E][S] – k-1[ES] – k2[ES] = 0 (II.6)

Penataan ulang menghasilkan persamaan untuk tetapan Michaelis-Menten (KM).

KM = k−1 + k2

k1 =

[E] [S]

[ES] (II.7)

Laju reaksi pembentukkan produk dirumuskan sebagai berikut

v0 = k2[ES] (II.8)

dengan k2 adalah konstanta laju reaksi pembentukan produk dan enzim bebas.

Apabila [E]t adalah konsentrasi enzim total maka [E]t = [E] + [ES]. Substitusi

persamaan tersebut ke persamaan (II.6) sehingga didapatkan persamaan berikut

k1([E]t – [ES])[S] = (k-1 + k2) [ES] (II.9)

Terjadi penataan ulang sehingga

[ES](k-1 + k2 + k1[S]) = k1[E]t [S] (II.10)

Persamaan di atas dapat lebih disederhanakan lagi dengan mengkalikan kedua ruas

dengan k1 sehingga didapatkan persamaan

[ES] = [E]t [S]

KM+[S] dengan KM =

k−1 + k2

k1 (II.11)

Kedua ruas dikalikan dengan k2 untuk memperoleh nilai Vmaks sehingga diperoleh

k2[ES] =k2[E]t [S]

KM+[S] dengan v0 = k2[ES] dan Vmaks = k2[E]t (II.12)

sehingga diperoleh persamaan Michaelis-Menten sebagai berikut:

v0 = Vmaks [S]

KM+[S] (II.13)

Persamaan (II.13) merupakan persamaan Michaelis-Menten yang merupakan

pernyataan aljabar bagi bentuk kurva hiperbolik dengan parameter berupa

konsentrasi substrat ([S]), kecepatan awal (v0), kecepatan maksimum (Vmaks) dan

tetapan Michaelis-Menten (KM). Ketika keadaan steady state KS dapat diganti

dengan KM. Umumnya, karena tahap substrat mengikat molekul enzim relatif lebih

18

cepat dibandingkan tahap penguraian kompleks ES menjadi produk dan enzim

maka 𝐾𝑀≈𝐾𝑆.

Persamaan Michaelis-Menten merupakan dasar bagi penelitian mengenai

kinetika kerja enzim. Persamaan Michaelis-Menten menghubungkan kecepatan

reaksi enzim dengan konsentrasi substrat dan Vmaks melalui tetapan KM. Jika nilai

KM dan Vmaks diketahui maka kecepatan reaksi dari suatu enzim pada setiap

konsentrasi substrat dapat dihitung. Penentuan nilai KM dan Vmaks dilakukan

dengan melakukan inversi terhadap persamaan Michaelis-Menten menjadi

persamaan Lineweaver-Burk.

1

v0 =

KM

Vmaks [S] +

1

[Vmaks] (II.14)

Jika laju reaksi diukur pada berbagai variasi konsentrasi substrat maka dapat dibuat

grafik dari persamaan Lineweaver-Burk untuk mendapatkan nilai KM dan Vmaks

(Gambar II.7).

Setiap enzim memiliki nilai KM yang khas bagi substrat tertentu sehingga

dengan demikian nilai KM merupakan parameter kinetik yang menjadi gambaran

karakteristik dari suatu enzim (Nelson dan Cox, 2012).

Gambar II.8 Grafik Lineweaver-Burk (Nelson dan Cox, 2012).

Inhibitor enzim

Inhibitor dapat mempengaruhi aktivitas kerja suatu enzim. Inhibitor adalah

suatu senyawa yang dapat menghambat atau menurunkan laju reaksi yang

19

dikatalisis oleh enzim. Ada dua jenis tipe inhibitor yaitu inhibitor yang bekerja

secara tidak dapat balik (irreversible) dan inhibitor yang bekerja secara dapat balik

(reversible). Inhibitor reversible adalah inhibitor yang dapat berikatan dengan suatu

enzim. Inhibitor reversible digolongkan menjadi 3 yaitu

a. Inhibitor kompetitif

Inhibitor kompetitif (I) mempunyai struktur yang menyerupai substrat dan

bersaing dengan substrat (S) untuk dapat berikatan dengan sisi aktif enzim (E).

Inhibitor kompetitif akan berikatan secara dapat balik dengan enzim membentuk

suatu kompleks enzimi-inhibitor (EI).

(II.15)

Adanya inhibitor kompetitif menyebabkan nilai KM meningkat karena afinitas

enzim terhadap substrat menurun tetapi tidak mempengaruhi nilai Vmaks.

Pergeseran nilai KM ditunjukkan pada Gambar II.8.

Gambar II.9 Grafik Lineweaver-Burk untuk inhibitor kompetitif (Nelson dan

Cox, 2012).

20

b. Inhibitor non-kompetitif atau inhibitor campuran (mixed inhibitor)

Inhibitor non kompetitif (I) tidak berikatan pada sisi aktif enzim (E)

melainkan berikatan pada sisi lain dari enzim bebas (E) dan kompleks enzim-

substrat (ES). Inhibitor non kompetitif termasuk dalam inhibitor campuran.

(II.16)

Adanya inhibitor non kompetitif menyebabkan nilai Vmaks menurun sedangkan

nilai KM tetap atau tidak mengalami perubahan. Pergeseran nilai Vmaks

ditunjukkan pada Gambar II.12.

Gambar II.10 Grafik Lineweaver-Burk untuk inhibitor non kompetitif (Nelson dan

Cox, 2012).

c. Inhibitor unkompetitif

Inhibitor unkompetitif (I) tidak dapat berikatan dengan enzim bebas (E) namun

hanya dapat berikatan dengan kompleks enzim-substrat (ES).

21

(II.17)

Adanya inhibitor unkompetitif menyebabkan nilai KS dan Vmaks menurun.

Penurunan KM menunjukkan afinitas enzim terhadap substrat mengalami

peningkatan karena kompleks enzim substrat yang terbentuk tidak produktif

sehingga mengakibatkan konsentrasi enzim bebas menurun. Pergeseran nilai KM

dan Vmaks ditunjukkan pada Gambar II.13.

Gambar II.10 Grafik Lineweaver-Burk untuk inhibitor unkompetitif (Nelson dan

Cox, 2012).

II.1.6 Enzim α-Amilase dan α-Glukosidase

Enzim α-Amilase

Enzim amilase diklasifikasikan menjadi 3 tipe yaitu α, β, dan γ amilase,

sedangkan tipe α dan β yang paling banyak digunakan. Enzim α-amilase lebih cepat

dari β-amilase dalam menghidrolisis substrat. Enzim α-amilase bekerja dengan cara

menghidrolisis pati pada ikatan α-1,4 glikosida dan kemudian dapat disebut juga

sebagai enzim hidrolase glikosida. Amilase dikelompokkan lagi menjadi

22

endoamilase dan eksoamilase. Endoamilase mengkatalisis hidrolisis molekul

substrat secara acak. Hal ini menyebabkan terbentuknya oligosakarida linier dan

bercabang dengan panjang tertentu. Eksoamilase menghidrolisis substrat dari

ujungnonreduksi rantai pati, menghasilkan produk yang lebih pendek secara

berurutan. Semua α-amilase menghidrolisis polisakarida sebagai substrat kemudian

menghasilkan maltosa (disakarida), oligosakarida, dan dengan bantuan enzim α -

glukosidase menghasilkan unit-unit kecil glukosa (monosakarida). Struktur enzim

α-amilase disajikan pada Gambar II.15 (Gopinath et al., 2017).

Gambar II.12 Struktur enzim α-amilase (Gopinath, 2017)

Enzim α-amilase dapat bereaksi pada pati, glikogen, dan polisakarida serta

oligosakarida melalui reaksi tertentu. Enzim α-amilase merupakan enzim yang

berperan dalam proses pencernaan dengan cara mengkatalisis tahap hidrolisis dari

pati untuk diubah menjadi oligosakarida yang terdiri dari maltosa, maltotriosa, dan

beberapa α-(1,6) serta α-(1,4) oliglukan (Singh et al., 2012). Metode yang

digunakan dalam mengukur aktivitas α-amilase adalah dengan mengukur warna

kompleks iodin dengan pati. Pati yang terhidrolisis akan menghasilkan maltosa.

Ketika terdapat penambahan iodin, iodin akan berikatan kompleks dengan maltosa

menghasilkan warna ungu. Semakin besar aktivitas enzim α-amilase maka jumlah

pati yang terhidrolisis semakin banyak. Warna kompleks dapat dikuantifikasi

23

dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Metode lain yang digunakan

adalah pengukuran gula pereduksi yang terbentuk akibat hidrolisis pati oleh enzim

α-amilase. Terdapat pereaksi yang umum digunakan dalam pengukuran gula

pereduksi yaitu reagen asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS). DNS akan tereduksi oleh

maltosa hasil hidrolisis pati dan menghasilkan kompleks warna jingga yang

kemudian dapat dikuantifikasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis (Xiao et al.,

2006).

Enzim α-Glukosidase

Enzim α-glukosidase adalah enzim yang berperan pada konversi

karbohidrat (oligosakarida) menjadi glukosa. Karbohidrat akan dicerna diserap ke

dalam tubuh dan meningkatkan kadar gula darah. Proses pencernaan karbohidrat

tersebut menyebabkan pankreas melepaskan enzim α-glukosidase ke dalam usus

yang akan mencerna karbohidrat menjadi oligosakarida yang kemudian akan

diubah lagi menjadi glukosa oleh enzim α-glukosidase yang dikeluarkan oleh sel-

sel usus halus yang kemudian akan diserap ke dalam tubuh.

Dengan dihambatnya kerja enzim α-glukosidase, kadar glukosa dalam darah

dapat dikembalikan dalam batas normal. Enzim α-glukosidase adalah golongan

karbohidrase eksotipe dengan nama trivial yaitu maltase. Enzim-enzim α-

glukosidase (maltase, isomaltase, glukomaltase, dan sukrase) berfungsi untuk

menghidrolisis oligosakarida dan disakarida pada dinding usus halus (Shinde dkk.,

2008). Struktur molekul dari enzim α-glukosidase dapat dilihat pada Gambar II.14

Berdasarkan spesifisitas terhadap substratnya, enzim α-glukosidase dibedakan

menjadi α-glukosidase golongan I dan II. α-glukosidase golongan I berasal dari

bakteri, yeast (Saccharomyces cerevisiae) dan serangga, sedangkan α-glukosidase

golongan II berasal dari mold, tumbuhan dan mamalia (Budiman, 2011). Pada

manusia, enzim α-glukosidase terdapat pada membran lisosom sel epitel instine dan

berperan pada pencernaan karbohidrat makanan. α-glukosidase dapat memutus

ikatan glikosida α(1→4) dan α(1→6) pada titik percabangan amilopektin dan

glikogen menghasilkan glukosa (Risma, 2012).

24

Gambar II.11 Enzim α-glukosidase (Bemmiler dan Whistler, 2009).

II.1.7 Molecular Docking

Dalam penelitian pemodelan molekul, docking adalah metode yang

digunakan untuk memprediksi posisi terbaik antara molekul satu (ligan) dengan

molekul lainnya (protein) untuk membentuk ikatan kompleks stabil (Lengauer dan

Rarey, 1996). Docking berguna untuk memprediksi kuatnya interaksi molekul satu

dengan yang lain menggunakan nilai binding affinity. Docking Molekuler

merupakan metode yang paling sering digunakan dalam pemodelan obat

berdasarkan struktur suatu molekul. Hal tersebut dikarenakan kemampuan metode

Docking Molekuler dalam memprediksi konformasi ligan pada sisi pengikatan

target molekul.

Gambar II.8 Ilustrasi docking protein dan ligand (Meiler dan Baker, 2006).

25

Docking sering kali dikaitkan dengan teori gembok dan kunci, karena

sifatnya yang hampir sama yaitu mencari posisi (pose) yang paling sesuai pada

suatu molekul untuk membuat ikatan kompleks. Docking menggunakan dua

pendekatan yaitu pendekatan bentuk dan pendekatan secara simulasi. Pendekatan

bentuk berarti metode yang memperhatikan kemiripan bentuk geometri antara

protein dan ligan (Goldman dan Wipke, 2000). Metode simulai lebih rumit, pada

pendekatan ini protein dan ligan dipisahkan secara fisik, dan ligan harus

menemukan posisi menuju sisi pengikatan protein dalam beberapa pergerakan.

Energi total yang dihasilkan dihitung berdasarkan setiap pergerakan pada protein,

dalam metode simulasi protein bersifat rigid (kaku) sedangkan ligan bersifat

fleksibel (Feig dkk., 2003). Aplikasi docking molekuler yang sering digunakan

adalah AutoDock Vina, Glide, FlexX, GOLD dan DOCK.

II.2 Perumusan Hipotesis dan Rancangan Penelitian

II.2.1 Perumusan Hipotesis 1

Reaksi eterifikasi Williamson merupakan reaksi pembentukkan eter melalui

reaksi substitusi nukleofilik (SN2) yang terjadi antara alkilhalida primer dan

alkohol yang membutuhkan konsentrasi nukleofil kuat untuk membentuk eter.

Reaksi eterifikasi Williamson membutuhkan katalis basa untuk mendeprotonasi

gugus alkohol menjadi ion alkoksida sehingga ion alkoksida dapat bereaksi dengan

alkilhalida primer membentuk eter (Clayden dkk., 2001). Reaksi eterifikasi

Williamson hanya dapat terjadi dalam suasana basa. Salah satu reaksi eterifikasi

Williamson adalah benzilasi. Benzilasi terhadap senyawa aldehida yang memiliki

gugus hidroksi (fenolik) banyak dilakukan untuk menghasilkan senyawa prekursor,

salah satunya 4-benziloksibenzaldehida (Hawaiz dan Omer, 2017).

Metode umum untuk benzilasi vanilin adalah dengan melibatkan THF atau

DMF sebagai pelarut, K2CO3 sebagai katalis basa dan KI. Lin dkk. (2005)

melakukan benzilasi terhadap o-vanilin menggunakan benzil klorida dalam pelarut

THF, K2CO3 sebagai basa dan KI dengan metode refluks pada temperatur 85 ℃

selama 1 jam menghasilkan padatan berupa serbuk dengan rendemen 89% dan titik

leleh 58-59 °C.

26

Hipotesis 1

Jika senyawa 3-hidroksi-benzaldehida direaksikan dengan benzil klorida

melalui reaksi eterifikasi Williamson menggunakan KI dan katalis basa K2CO3

dengan metode refluks pada temperatur 85 ℃ selama 1 jam maka akan dihasilkan

senyawa 3-benziloksi-benzaldehida.

II.2.2 Perumusan Hipotesis 2

Senyawa analog kurkumin dapat disintesis dengan cara reaksi kondensasi

aldol silang Claisen-Schmidt yaitu reaksi antara aril aldehida dengan alkil keton

untuk membentuk α,β-tak jenuh (Wang et al., 2017). Reaksi kondensasi aldol silang

Claisen-Schmidt dapat terjadi dalam suasana asam atau basa seperti NaOH dan

KOH (Ramya dkk., 2018). Namun, penggunaan katalis basa lebih banyak

digunakan karena alasan efisiensi produk reaksi (Patil dkk., 2009). Pada reaksi

berkatalis basa, tahap pertama adalah kondensasi aldol silang yang melibatkan adisi

nukleofilik karbanion dari keton alkil terhadap karbon karbonil dari aldehida

aromatik, dilanjutkan dehidrasi hidroksi keton untuk membentuk analog kurkumin

(Ramya dkk., 2018).

Yuan dkk. (2014) telah berhasil melakukan sintesis senyawa analog

kurkumin dari reaksi kondendasi turunan benzaldehida dengan aseton,

siklopentanon dan sikloheksanon menggunakan katalis basa berupa larutan KOH

5% (b/v) dengan metode refluks pada temperatur 50 ℃ selama 50 menit

menghasilkan rendemen sebesar 70%. Hawaiz dan Omer (2017) telah melakukan

sintesis analog kurkumin berbahan dasar 4-benziloksibenzaldehida dengan aseton

menggunakan katalis basa berupa larutan NaOH 8%.

Hipotesis 2

Jika senyawa 3-benziloksi-benzaldehida direaksikan dengan senyawa alkil

keton (aseton dan siklopentanon) melalui reaksi kondensasi aldol silang Claisen-

Schmidt menggunakan katalis basa KOH 5% (b/v) dengan metode refluks pada

temperatur 50 ℃ selama 50 menit maka akan dihasilkan senyawa analog kurkumin

aseton ((1E,4E)-1,5-bis(3-(benziloksi-fenil)penta-1,4-dien-3-on), siklopentanon

27

((2E,5E)-2,5-bis(3-(benziloksi-fenil)siklopenta-1-on), dan sikloheksanon ((2E,5E)-

2,6-bis(3-(benziloksi-fenil)sikloheksa-1-on).

II.2.3 Perumusan Hipotesis 3

Pengobatan bagi penderita diabetes melitus dilakukan dengan penyuntikan

insulin dan mengkonsumsi obat-obatan oral sintesis. Adapun jenis obat-obatan oral

sintesis yang biasanya dikonsumi oleh penderita diabetes melitus salah satunya

adalah obat yang menghambat kerja enzim α-glukosidase. Enzim α-glukosidase

memainkan peranan penting dalam peningkatan konsentrasi glukosa darah di dalam

tubuh. Enzim α- glukosidase bertindak sebagai katalis dalam reaksi maltosa,

maltotriosa, dan oligosakarida menjadi monomernya (glukosa) (Sales dkk., 2012).

Senyawa analog kurkumin dilaporkan mampu menghambat aktivitas enzim

α-glukosidase. Yousefi dkk. (2015) telah berhasil mensintesis senyawa analog

kurkumin- pirano[2,3-d]pirimidin dan menguji aktivitasnya sebagai inhibitor enzim

α-glukosidase. Senyawa analog kurkumin-pirano[2,3-d]pirimidin terbukti memiliki

aktivitas penghambatan yang lebih baik dibandingkan dengan obat antidiabetes

seperti akarbosa. Hal tersebut ditunjukkan dengan persen penghambatan senyawa

analog kurkumin-pirano[2,3-d]pirimidin sebesar 96%, sedangkan persen

penghambatan akarbosa hanya sebesar 89%.

Hipotesis 3

Jika sintesis senyawa analog kurkumin yang berasal dari 3-benziloksi-

benzaldehida dan alkil keton (aseton, siklopentanon dan sikloheksanon) berhasil

dilakukan maka diharapkan ketiga senyawa tersebut akan memiliki persen

penghambatan lebih tinggi dibandingkan akarbosa terhadap aktivitas enzim α-

amilase dan α-glukosidase.

II.2.4 Perumusan Hipotesis 4

Persamaan Michaelis-Menten merupakan dasar bagi penelitian mengenai

kinetika kerja enzim sehingga memungkinkan analisis penghambatan enzim dapat

diketahui (Nelson dan Cox, 2012). Acarbose dan miglitol merupakan jenis obat oral

sintetis yang dapat menghambat aktivitas enzim α-glukosidase. Inhibitor

glukosidase akan menghambat atau menurunkan laju reaksi hidrolisis ikatan 1,6’-

α-glikosida pada suatu oligosakarida. Du dkk. (2006) telah melakukan sintesis

28

analog kurkumin dan menentukan tipe inhibitor terhadap enzim α-glukosidase

secara in vitro. Senyawa analog kurkumin yang disintesis dapat menghambat enzim

α-glukosidase secara unkompetitif.

Hipotesis 4

Jika senyawa analog kurkumin yang berasal dari 3-benziloksi-benzaldehida

dan alkil keton (aseton, siklopentanon dan sikloheksanon) dapat menurunkan nilai

KM dan Vmaks terhadap nilai KM dan Vmaks enzim α-amilase dan α-glukosidase

tanpa inhibitor. Maka tipe inhibitor dari kedua senyawa analog kurkumin tersebut

adalah inhibitor unkompetitif.

II.2.5 Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian dibuat untuk membuktikan hipotesis tersebut, maka

akan dilakukan beberapa langkah dalam penelitian ini. Penelitian diawali dengan

melakukan sintesis senyawa prekursor 3-benziloksi-benzaldehida, dengan cara

benzilasi senyawa 3-hidroksi-benzaldehida dengan reagen benzil klorida, K2CO3

sebagai katalis basa dan KI menggunakan metode refluks pada temperatur 85 ℃

selama 1 jam. Langkah selanjutnya dilakukan sintesis senyawa analog kurkumin

aseton ((1E,4E)-1,5-bis(3-(benziloksi-fenil)penta-1,4-dien-3-on), siklopentanon

((2E,5E)-2,5-bis(3-(benziloksi-fenil)siklopenta-1-on), dan sikloheksanon ((2E,5E)-

2,6-bis(3-(benziloksi-fenil)sikloheksa-1-on) dari bahan dasar 3-benziloksi-

benzaldehida dan KOH 5% sebagai katalis basa dalam pelarut dengan

menggunakan metode refluks pada temperatur 50 ℃ selama 50 menit. Hasil sintesis

ketiga senyawa tersebut kemudian dibuktikan kebenaran strukturnya, dilakukan

elusidasi struktur dengan spektrometer FTIR, Direct Inlet-MS, 1H-NMR dan 13C-

NMR. Senyawa analog kurkumin aseton dan siklopentanon hasil sintesis diuji

aktivitas inhibisinya terhadap enzim α-amilase dan α-glukosidase serta ditentukan

tipe inhibitornya.

29

BAB III

METODE PENELITIAN

III.1 Bahan

Bahan yang digunakan untuk sintesis memiliki kualitas pro analisis dari

Merck, antara lain benzil klorida, kalium karbonat, kalium iodida, N,N-

dimetilformamida, etanol, aseton, siklopentanon, sikloheksanon, kalium

hidroksida, 2-hidroksi-benzaldehida, 3-hidroksi-benzaldehida dan 4-hidroksi-

benzaldehida. Bahan lain yang digunakan antara lain kertas saring Whattman dan

akuades.

Bahan yang digunakan untuk uji aktivitas inhibisi enzim yaitu enzim α-

amilase dan α-glukosidase (Xi’an Lyphar Biotech Co., LTD) dan bahan yang

memiliki kualitas pro analisis dari Merck antara lain yaitu, KH2PO4, K2HPO4, KCl,

amilum, p-Nitrofenil α-D-glukopiranosida (PNPG), Tween 80, NaOH, iodin, KI.

Bahan lain yang digunakan adalah akuades.

III.2 Peralatan

Peralatan yang digunakan untuk sintesis benziloksi-benzaldehida dan

analog kurkumin yaitu peralatan gelas laboratorium, satu set alat refluks, plat

pemanas dan pengaduk magnet (hot plate Thermo Scientific), desikator vakum,

penangas air, timbangan analitik (Libror EB-330 Shimadzu), penentu titik lebur

(Electrothermal 9100), bejana pengembang (chamber glass) dan penyaring

Buchner. Peralatan untuk analisis struktur adalah Spektrofotometer Fourier

Transform Infrared (FTIR, Shimadzu Prestige-21), Direct-Inlet Spektrometer

Massa (DI-MS, Shimadzu QP2010S), Spektrometer Resonansi Magnetik Inti

Proton dan Inti Karbon (NMR, 1H dan 13C (500 MHz) JEOL JNM-ECZ).

Peralatan yang digunakan untuk uji aktivitas inhibisi enzim α-amilase dan

α-glukosidase adalah peralatan gelas laboratorium, timbangan analitik (Libror EB-

330 Shimadzu), termometer, pH meter, dan spektrometer UV-Vis (Shimadzu UV-

1800).

30

III.3 Prosedur Penelitian

III.3.1 Sintesis Bahan Dasar Benziloksi-benzaldehida

Metode sintesis benzilasi ini mengacu pada sintesis yang telah dilakukan

oleh Lin dkk., (2005). Sebanyak 9,87 mmol hidroksi-benzaldehida (orto,meta dan

para) dimasukkan ke dalam 10 mL N,N-dimetilformamida kemudian ditambahkan

0,68 mmol KI dan 15,99 mmol K2CO3. Campuran tersebut direfluks hingga

mencapai temperatur 85 ºC sambil diaduk dengan pengaduk magnetik. Campuran

kemudian ditambahkan 13,35 mmol benzil klorida sedikit demi sedikit dan refluks

dilanjutkan selama 1 jam. Campuran didinginkan pada temperatur ruangan.

Campuran tersebut kemudian dituang ke dalam es akuades dan diaduk

menggunakan pengaduk magnet hingga seluruh es mencair. Padatan yang terbentuk

kemudian disaring dengan menggunakan corong Buchner. Selanjutnya, padatan

direkristalisasi menggunakan 20 mL etanol panas. Hasil rekristalisasi dituang

kembali ke dalam es akuades. Padatan yang terbentuk kemudian disaring

menggunakan Buchner. Padatan dikeringkan di dalam oven dan ditimbang. Padatan

kemudian diuji titik lebur dan strukturnya dianalisis dengan FT-IR, Direct Inlet-

MS, 1H dan 13C-NMR.

III.3.2 Sintesis Analog Kurkumin

Sintesis analog kurkumin mengacu pada metode yang telah dilakukan Yuan

dkk. (2014). Mula-mula sebanyak 3,85 mmol turunan benzaldehida (orto, meta, dan

para) direaksikan dengan 1,75 mmol keton (aseton, siklopentanon, sikloheksanon)

kemudian ditambahkan 10 mL etanol dan larutan diaduk pada temperatur kamar

selama 20 menit. Campuran ditambahkan 2 mL KOH 5% (b/v) tetes demi tetes.

Pengadukan dilanjutkan kembali pada temperatur 50 °C selama 50 menit.

Campuran didinginkan hingga mencapai temperatur kamar. Campuran kemudian

didinginkan dalam penangas es untuk mengoptimalkan hasil sintesis. Padatan yang

diperoleh disaring menggunakan corong Buchner dan dicuci dengan etanol dingin

dan akuades dingin. Padatan tersebut dikeringkan dalam oven sampai berat konstan

dan disimpan di desikator. Produk ditimbang, diuji titik leburnya dan elusidasi

struktur senyawa menggunakan spektrometer FT-IR, Direct Inlet-MS, 1H dan 13C

NMR.

31

III. 3.3 Uji Aktivitas Inhibisi Enzim α-amilase dan α-Glukosidase

III.3.3.1 Pembuatan larutan buffer fosfat saline pH 6,9

Sebanyak 1,74 g KH2PO4 ditimbang untuk membuat konsentrasinya 0,1 M

dan 1,36 g untuk membuat K2HPO4 0,1 M kemudian masing-masing dilarutkan

dalam akuades 100 mL. Sebanyak 60 mL KH2PO4 0,1 M dan 40 mL K2HPO4 0,1

M dicampurkan kemudian ditambahkan KCl sebanyak 0,5 g. Agar didapatkan pH

6,9 ditambahkan NaOH 1 M tetes demi tetes dan diukur menggunakan pH meter.

III.3.3.2 Pembuatan substrat pati dan p-Nitrofenil α-D-glukopiranosida

(PNPG) (0,5 g/L)

Sebanyak 100 mL buffer fosfat pH 6,9 dipanaskan pada temperatur 70 °C.

Sebanyak 0,05 g pati kemudian dimasukkan ke dalam larutan buffer fosfat dan

diaduk selama 15 menit. Sedangkan untuk substrat p-Nitrofenil α-D-

glukopiranosida (PNPG) sebanyak 0,05 g dilarutkan dalam aqua demineralisasi.

III.3.3.3 Pembuatan larutan iodin 0,2% (b/v)

Sebanyak 0,2 gram iodin dilarutkan dalam 100 mL akuades yang

mengandung 2% (b/v) kalium iodida.

III.3.3.4 Pembuatan larutan enzim (20 U/mL)

Sebanyak 0,01 gram enzim (α-amilase dan α-glukosidase) ditambahkan ke

dalam 10 mL buffer fosfat pH 6,9. Larutan enzim yang telah dibuat kemudian

diencerkan 100 kali.

III.3.3.5 Penentuan panjang gelombang (λmaks)

Larutan substrat (pati dan p-Nitrofenil α-D-glukopiranosida (PNPG)) yang

telah dibuat sebelumnya diambil 10 mL kemudian ditambahkan larutan iodin 0,2%

(b/v) sebanyak 0,1 mL. Campuran larutan tersebut kemudian diukur absorbansinya

pada panjang gelombang 400-800 nm.

III.3.3.6 Pembuatan larutan sampel senyawa analog kurkumin dan akarbosa

Pembuatan larutan sampel berupa senyawa analog kurkumin A, senyawa

analog kurkumin B, senyawa analog kurkumin C, dan senyawa akarbosa dengan

variasi konsentrasi 0,0625; 0,125; 0,250; 0,500; 1,000 mM. Sebanyak 0,0506 gram

senyawa analog kurkumin A, 0,0532 gram senyawa analog kurkumin B, 0,0532

gram senyawa analog kurkumin C, dan 0,0645 gram senyawa akarbosa masing-

32

masing ditambahkan 1 mL larutan Tween 80. Larutan ditambahkan 100 mL larutan

buffer fosfat pH 6,9 sehingga diperoleh larutan sampel dengan konsentrasi 1 mM.

Larutan sampel kemudian diencerkan untuk memperoleh larutan dengan variasi

konsentrasi 0,0625; 0,125; 0,250; 0,500 mM.

III.3.3.7 Uji aktivitas inhibisi analog kurkumin dan akarbosa terhadap enzim

α-amilase dan α-glukosidase

Larutan substrat yang telah dibuat pada prosedur III.3.3.2 kemudian

ditambahkan 1 mL larutan sampel senyawa analog kurkumin (analog kurkumin A

analog kurkumin B, dan analog kurkumin C pada gelas yang berbeda) dengan

variasi konsentrasi yang digunakan yaitu 0,0625; 0,125; 0,250; 0,500; 1,000 mM.

Larutan ditambahkan 0,5 mL larutan enzim kemudian diinkubasi pada temperatur

37 °C selama 10 menit. Larutan ditambahkan 1 mL larutan HCl 1% kemudian

ditambahkan 0,1 mL larutan iodin 0,2%. Larutan diukur absorbansinya pada λmaks.

Pemilihan waktu inkubasi selama 10 menit dikarenakan telah dilakukan optimasi

sebelumnya.

Dalam pengujian inhibisi ini dilakukan pengujian pada empat sistem yang

berbeda namun perlakuan yang diperoleh sama. Sistem pertama (S1) berupa sistem

yang mengandung sampel (larutan analog kurkumin A, larutan analog kurkumin B,

larutan analog kurkumin C dan Akarbosa), substrat dan enzim. Sistem kedua (S0)

berupa sistem yang mengandung sampel (larutan analog kurkumin A, larutan

analog kurkumin B, larutan analog kurkumin C, dan akarbosa), substrat dan tanpa

enzim. Sistem ketiga (kontrol) berupa sistem yang mengandung enzim, substrat dan

tanpa sampel. Sistem keempat (blanko) berupa sistem yang mengandung substrat

tetapi tidak mengandung sampel dan enzim. Komposisi pereaksi dalam sistem

reaksi untuk setiap pengujian dapat dilihat pada Tabel III.1.

Tabel III.1 Komposisi pereaksi dalam sistem reaksi

Blanko (mL) Kontrol (mL) S0 (mL) S1 (mL)

Larutan sampel - - 1 1

Larutan substrat 10 10 10 10

Larutan enzim - 0,5 - 0,5

Inkubasi 37 °C Selama 10 menit

Larutan HCl 1% - 1 - 1

33

Larutan iodin 0,2% 0,1 0,1 0,1 0,1

Presentase inhibisi dapat ditentukan dengan rumus berikut:

Persentase inhibisi = (Ablanko−Akontrol)−(AS0−AS1)

(Ablanko−Akontrol) (III.1)

Keterangan:

AS1 = Absorbansi dari sistem yang mengandung substrat, enzim dan sampel

AS0 = Absorbansi dari sistem yang mengandung substrat, sampel tanpa enzim

Akontrol = Absorbansi dari sistem yang mengandung substrat, enzim tanpa sampel

Ablanko = Absorbansi dari sistem yang mengandung substrat tanpa enzim dan

sampel

III.3.3.8 Pembuatan kurva standar

Pembuatan kurva standar dilakukan dengan membuat variasi konsentrasi

substrat. Variasi konsentrasi larutan substrat yang digunakan yaitu 0,0100; 0,0125;

0,0250; 0,0375; 0,0625; 0,0875; 0,1000 g/L. Sebanyak 0,00100; 0,00125; 0,00250;

0,00375; 0,00500; 0,00625; 0,00750; 0,00875; 0,01000 gram substrat masing-

masing dilarutkan dalam 100 mL larutan buffer fosfat pH 6.9 yang telah dipanaskan

hingga 70 °C. Larutan dipanaskan kembali pada temperatur 70 °C selama 15 menit.

Larutan didinginkan kemudian masing-masing larutan ditambahkan 0,1 mL larutan

iodin 0,2%. Larutan kemudian diukur absorbansinya pada λmaks. Kurva standar

dibuat dengan memplotksn konsentrasi substrat dengan absorbansinya.

III.3.3.9 Penentuan KM dan Vmaks

Penentuan nilai KM dan Vmaks dilakukan dengan membuat variasi substrat.

Variasi konsentrasi larutan substrat yang digunakan yaitu 0,100; 0,125; 0,250;

0,375; 0,500; 0,625; 0,750; 0,875; 1,000 g/L. Sebanyak 0,00100; 0,00125; 0,00250;

0,00375; 0,00500; 0,00625; 0,00750; 0,00875; 0,01000 gram substrat masing-

masing dilarutkan dalam 10 mL larutan buffer fosfat pH 6.9 yang telah dipanaskan

hingga 70 °C. Larutan dipanaskan kembali pada temperatur 70 °C selama 15 menit.

Larutan didinginkan kemudian ditambahkan 0,5 mL larutan enzim. Larutan

diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 10 menit. Larutan ditambahkan 1 mL

larutan HCl 1%. Larutan kemudian ditambahkan 0,1 mL larutan iodin 0,2%.

34

Larutan diukur absorbansinya pada λmaks. Tabel dibuat dengan membuat grafik

(1/V) lawan (1/S) kemudian ditentukan nilai KM dan Vmaks yang didasarkan atas

persamaan kurva Lineweaver-Burk.

1

v0 =

KM

Vmaks [S] +

1

Vmaks (III.2)

III.3.3.10 Penentuan tipe inhibitor senyawa analog kurkumin dan akarbosa

Penentuan nilai KM dan Vmaks dilakukan dengan membuat variasi substrat.

Variasi konsentrasi larutan substrat yang digunakan yaitu 0,100; 0,125; 0,250;

0,375; 0,500; 0,625; 0,750; 0,875; 1,000 g/L. Sebanyak 0,00100; 0,00125; 0,00250;

0,00375; 0,00500; 0,00625; 0,00750; 0,00875; 0,01000 gram substrat masing-

masing dilarutkan dalam 10 mL larutan buffer fosfat pH 6.9 yang telah dipanaskan

hingga 70 °C. Larutan didinginkan kemudian ditambahkan 1 mL larutan senyawa

analog kurkumin (analog kurkumin A dan kurkumin B pada gelas yang berbeda)

pada konsentrasi yang memiliki persen inhibisi tertinggi. Larutan kemudian

ditambahkan 0,5 mL larutan enzim. Larutan diinkubasi pada temperatur 37 °C

selama 10 menit. Larutan ditambahkan 1 mL HCl 1% kemudian ditambahkan 0,1

mL larutan iodin 0,2%. Larutan diukur absorbansinya pada λmaks. Tabel dibuat

dengan memplotkan (1/V) dan (1/S) kemudian ditentukan nilai KM dan Vmaks yang

didasarkan atas persamaan kurva Lineweaver-Burk.

1

v0 =

KM

Vmaks [S] +

1

Vmaks (III.3)

Nilai KM dan Vmaks yang diperoleh selanjutnya dibandingkan dengan nilai

KM dan Vmaks dari enzim α-amilase dan α-glukosidase (prosedur III.3.3.9) sehingga

dapat ditentukan tipe inhibitornya. Jika nilai Vmaks tidak berubah dan KM meningkat

maka tipe inhibitornya adalah kompetitif. Jika nilai Vmaks menurun dan KM tidak

berubah maka tipe inhibitornya adalah non kompetitif. Jika nilai KM dan Vmaks

menurun maka tipe inhibitornya adalah unkompetitif (Nelson dan Cox, 2012).

Penentuan tipe inhibitor untuk senyawa akarbosa dilakukan dengan prosedur yang

sama. Namun, larutan sampel analog kurkumin digantikan oleh larutan sampel

sampel akarbosa dengan konsentrasi yang memiliki persen inhibisi tertinggi.

35

DAFTAR PUSTAKA

Adams, B. K., Ferstl, E. M., Davis, M. C., Herold, M., Kurtkaya, S., Camalier, R.

F., Hollingshead, M. G., Kaur, G., Sausville, E. A., Rickles, F. R., Synder,

J. P., Liotta, D. C. and Shoji, M., 2004, Synthesis and Biological Evaluation

of Novel Curcumin Analogs as Anti-Cancer and Anti-Angiogenesis Agents,

Bioorg. Med. Chem., 12(14), 3871-3883.

Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. and Michels, A. W., 2014, Type 1 Diabetes,

Lancet., 383, 69-82.

Chiasson, J. L., Josse, R. G., Gomis, R., Hanefeld, M., Karasik, A. and Laakso, M.,

2003, Acarbose Treatment and The Risk of Cardiovascular Disease and

Hypertension in Patients with Impaired Glucose Tolerance: The STOP-

NIDDM Trial, JAMA, 290, 486-494.

Clayden, J., Greeves, N. and Warren, S., 2012, Organic Chemistry, 2nd Ed, Oxford

University Press, Oxford.

Copeland, R., 2000, Enzymes: A Pratical Introduction to Structure, Mechanism,

and Data Analysis, 2nd Ed., A John Wiley & Sons Inc., New York.

Denniston, K.D., Topping, J.J., Robert. L. and Caret, L. L., 2007, General Organic

and Biochemistry, 5th Ed, Mc-Graw Hill, New York.

Gregory, J. M., Moore, D. J. and Simmons, J. H., 2013, Type 1 Diabetes Mellitus,

Pediatr. Rev., 34(5), 203-215.

Hawaiz, F. E. and Omer, D. A. S., 2017, Ultrasound-assisted Synthesis of Some

New Curcumin Analogs and Their Corresponding Pyrazoline Derivatives,

ARO, 30-35.

Ji, H. F. and Shen, l., 2009, Interaction of Curcumin with The PfATP6 Model and

The Implications for Its Antimalarial Mechanism, Bioorg. Med. Chem.

Lett., 19(9), 2453-2455.

Jovanovic, S. V., Steenken, S., Boone, C. W. and Simic, M. G., 2001, How

Curcumin Works Preferentially with Water Soluble Antioxidant, J. Am.

Chem. Soc., 123, 3064-3068.

Matthaei, S., Bierwirth, R., Fritsche, A., Gallwitz, B., Haring, H. U., Joost, H. G.,

Kellerer, M., Kloos, C., Kunt, T., Nauck, M., Schernthaner, G., Siegel, E.

and Thienel, F., 2009, Medical Antihyperglycaemic Treatment of Type 2

Diabetes Mellitus, Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes., 117, 522-557.

Mazumder, A., Neamati, N., Sunder, S., Schluz, J., Pertz, H., Eich, E. and Pommier,

Y., 1997, Curcumin Analogs with Altered Potencies Against HIV-1

36

Integrase as Probes for Biochemical Mechanisms of Drug Actions, J. Med.

Chem., 40 (19), 3057-3063.

Mun’im, A., and Hanami, E., 2011, Fitoterapi Dasar, PT. Dian Rakyat, Jakarta.

Natali, A. and Ferrannini, E., 2006, Effects of Metformin and Thiazolidinediones

on Suppression of Hepatic Glucose Production and Stimulation of Glucose

Uptake in Type 2 Diabetes: a Systematic Review. Diabetologia, 49, 434-

441.

Nelson, D. L. dan Cox, M. M., 2012, Lehninger Principles of Biochemistry, 6th Ed,

W. H. Freeman, New York.

Nelson, K. M., Dahlin, J. L., Bisson, J., Graham, J., Pauli, G. F. and Walters, M.

A., 2017, The Essential Medicinal Chemistry of Curcumin, J. Med. Chem.,

60, 1620-1627.

Olokoba, A. B., Obateru, O. A. and Olokoba, L. B., 2012, Type 2 Diabetes Mellitus:

A Review of Current Trends, Oman. Med. J., 27(4), 269-273.

Park, K. S., Ciaraldi, T. P., Carter, L. A., Mudaliar, S., Nikoulina, S. E. and Henry

R. R., 1997, PPAR-Gamma Gene Expression is Elevated in Skeletal Muscle

of Obese and Type II Diabetic Subjects, Diabetes., 46, 1230-1234.

Patil, C.B., Mahajan, S.K. and Katti, S.A., 2009, Chalcone: A Versatile Molecule,

J. Pharm. Sci. & Res., 1(3), 11-22.

Penalver, J. J. M., Timon, I. M., Collantes, C. S. and Gomes, F. J. C., 2016, Update

on Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus, World. J. Diabetes., 7(17), 354-

395.

Pratley, R. E., 2013, The Early Treatment of Type 2 Diabetes, Am. J. Med., 126(9),

1-9.

Ramya, P. V. S., Guntuku, L., Angapelly, S., Karri, S., Digwal, C. S., Babu, B. N.,

Naidu, V. G. M. and Kamal, A., 2018, Curcumin Inspired 2-

Chloro/Phenoxy Quinoline Analogues: Synthesis and Biological Evaluation

as Potential Anticancer Agents, Bioorg. Med. Chem. Lett., 28, 892-898.

Risma, D., 2012, Isolasi dan Karakterisasi Enzim α-Gluosidase Dari Beras Lapuk

(Oryza Sativa), Skripsi, Universitas Indonesia, Depok.

Riyaphan, J., Jhong, C. H., Tsai, M. J., Lee, D. N., Leong, M. K. and Weng, C. F.,

2017, Potent Natural Inhibitors of Alpha-Glucosidase and Alpha-Amylase

Against Hyperglycemia in Vitro and in Vivo, Preprints., 1-20.

37

Sales, P. M., Souza, P. M., Simeoni, L. A., Magalhaes, P. O. and Silveira, D., 2012,

α-Amylase Inhibitors: A Review of Raw Material and Isolated Compounds

from Plant Source, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 15(1), 141-183.

Shinde, J. , T. Taldone, M. Barletta, N. Kunaparaju, H. Bo, dan S. Kumar. 2008.

Alpha-glucosidase Inhibitory Activity of Syzygium cumini (Linn) Skeels

Seed Kernel in Vitro an in Goto-Kakizaki (GK) Rats. Journal Carbohydrate

Research. 343(7), 1278-1281.

Song, R., 2016, Mechanism of Metformin: A Tale of Two Sites, Diabetes Care.,

39, 187-189.

Subroto, A., 2006, Ramuan Herbal untuk Diabetes Melitus, Penebar Swadaya,

Depok.

Surya, S., Salam, A. D., Tomy, D. V., Carla, B., Kumar, R. A. and Sunil, C., 2014,

Diabetes Mellitus and Medical Plants-A Review, Asian, Pac. J. Trop. Dis.,

4(5), 337-347.

Vyas, A., Dandawatea, P., Padhyea, S., Ahmad, A. and Sarkarb, F., 2013,

Perspectives on New Synthetic Curcumin Analogs and their Potential

Anticancer Properties, Curr. Pharm. Des., 19(11), 2047-2069.

Wang, Z. S., Chen, L. Z., Zhou, H. P., Liu, X. H. and Chen, F. H., 2017,

Diarylpentadienone Derivatives (Curcumin Analogues): Synthesis and

Anti-Inflammatory Activity, Bioorg. Med. Chem. Lett., 27, 1803-1807.

Yadav, G. D. and Lande, S. V., 2006, Rate Intensive and Selective Etherification

of Vanillin with Benzyl Chloride under Solid–Liquid Phase Transfer

Catalysis by Aqueous Omega Phase, J. Mol. Catal. A. Chem., 244(1), 271-

277.

Yousefi, A., Yousefi, R., Panahi, F., Sarikhani, S., Zolghadr, A., Bahaoddini, A.

and Nezhad, A. K., 2015, Novel Curcumin-Based Pyrano[2,3-d]Pyrimidine

Anti-Oxidant Inhibitors for α-Amylase and α-Glucosidase: Implications for

Their Pleiotropic Effects Against Diabetes Complications, Int. J. Biol.

Macromol., 78, 46-55.

Yuan, X., Li. H., Bai, H., Su, Z., Xiang, Q., Wang, C., Zhao, B., Zhang, Y., Zhang,

Q., Chu, Y. and Huang, Y., 2014, Synthesis of Novel Curcumin Analogues

for Inhibition of 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 with Anti-

Diabetic Properties, Eur. J. Med. Chem., 77, 223-230.

Zaccardi, F., Webb, D. R., Yates, T. and Davies, M. J., 2015, Pathophysiology of

Type 1 and Type 2 Diabetes Mellitus: a 90-year Perspective, Postgrad. Med.

J., 1-7.

38

JADWAL PENELITIAN

No. Jenis Kegiatan Waktu Pelakanaan

2019 2020

Jul Agt Sept Okt Nov Des Jan Feb Mar

1. Penyiapan

literatur,

penyusunan

proposal

penelitian,

pengadaan bahan

kimia, dan

persiapan alat.

2. Pelaksanaan

kegiatan

penelitian, sintesis

senyawa

target, dan

elusidasi struktur

senyawa yang

dihasilkan.

3. Uji senyawa hasil

sintesis untuk

mengetahui

aktivitas inhibisi

terhadap enzim α-

amilase sebagai

antidiabetes.

4. Analisis data,

penyusunan

naskah penelitian,

seminar/publikasi,

dan sidang akhir

penelitian.