PENGECATAN GRAMOleh: Shofyatul Yumna Triyana

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur.

Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.

PERSIAPAN

Sebelum dilakukan pengecatan Gram, tentu harus disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa. Bahan yang akan diperiksa, dapat berasal dari : 1) langsung dari penderita dapat berupa sputum (dahak), pus (nanah), discharge telinga, discharge hidung, urin dan cairan serebrospinal.

Spesimen yang akan dicat, sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear) terlebih dulu. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides, dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop.

a. Pembuatan preparat

Alat dan bahan yang diperlukan adalah :Alat :

Ose atau kapas lidi steril Gelas obyek Lampu spiritus

Bahan : Bahan yang akan diperiksa.

Untuk bahan yang berbeda, memerlukan cara pembuatan preparat yang berbeda pula. Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan.a.1. Bahan langsung dari penderita

Bahan disentrifuge terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan yang berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut kering. Setelah kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat. a.2. Bahan dari biakan cair

Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung.

a.3. Bahan dari media pertumbuhan padatAmbil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan

memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 – 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita.

Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :

Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai. Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di

atas meja) Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan. Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja.

b. Cat GramCat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat Gram A, B, C dan D.

Masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram, adalah sebagai berikut :1. Cat Gram A

Cat ini terdiri atas :Kristal violet : 2 gramEtil alkohol 95 : 20 mlAmmonium oksalat : 0,8 gramAkuades : 80 mlCat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.2. Cat Gram B

Cat ini terdiri atas :Yodium : 1 gramKalium Yodida : 2 gramAkuades : 300 mlCat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).3. Cat Gram C

Cat ini terdiri atas :Aseton : 50 mlEtil alkohol 95 % : 50 mlCat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :

Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif.

Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.

4. Cat Gram D Cat Gram D terdiri atas :

Safranin : 0,25 gramEtil alkohol 95 % : 10 mlAkuades : 90 mlCat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :

Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D.

Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.

Dasar teori cat GramBerdasarkan sifat terhadap cat Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2

yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu :1. Teori Salton

Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna.

Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu.2. Teori permeabilitas dinding sel

Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar.

Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 – 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium.

CARA PENGECATAN GRAMSebelum melakukan pengecatan Gram, siapkan alat dan bahan yang diperlukan.

Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di tempat yang terjangkau. Jangan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan memakan waktu.

Alat dan bahan yang diperlukan adalah :Alat :

Rak pengecatan Kran/sumber air yang mengalir

Bahan : Cat Gram A, B, C dan D Preparat yang telah siap untuk dicat

Skema cara pengecatan Gram :

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAMKelebihan :

1. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes

Preparat yang telah siap dicat, digenangi dengan cat Gram A selama 1 – 3 menit

Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat digenangi cat Gram B selama 0,5 – 1 menit

Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat ditetesi dengan cat Gram C sampai warna cat tepat dilunturkan.

Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat digenangi dengan cat Gram D selama 1 – 2 menit

Sisa cat dibuang lalu preparat dikeringkan di udara

Preparat siap diamati dibawah mikroskop

kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika.

2. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore.

Kekurangan :Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

Pustaka acuan :

Nirwati, Hera, _______, Pembuatan Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk Praktikum Mikrobiologi, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Strohl, William A, Rouse,H, Fisher, BD, 2001, Lippincott’s Illustrated Reviews: Microbiology, Lippincott William & Wilkins, USA

PRAKTIKUM VI

 

Topik               :  Pengecatan Gram pada Bakteri

Tujuan              : Untuk mempelajari bentuk-bentuk bakteri

melalui pengecatan gram

Hari/ Tanggal    :   Minggu, 27 Mei 2012

Tempat :   Laboratorium Biologi FKIP UNLAM Banjarmasin

 

1.ALAT DAN BAHAN

ALAT :

1. Jarum ose                                 5. Kaca Penutup

2. Pembakar Spiritus                    6. Mikroskop

3. Cawan Petri                             7. Baki

4. Kaca Benda

BAHAN:

1.Medium Biakan murni bakteri (S. aureseus danAsetobacter   

    xylinum)        

2.kristal violet (Gram A)

3.Iodim (Gram B)

4.Alkohol (Gram C)

5.Salfranin (Gram D)

6.Aquadest

7.Alkohol

8.Kapas

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

II.  CARA KERJA1. Membersihkan kaca objek dan kaca penutup

dengan alkohol, melewatkan di atas bunsen atau

lampu spiritus beberapa kali.

2. 2.      Secara aseptis mengambil 1 lup biakan

padat Acetobacter xylinum dan  S. Aureus,

meletakkan di atas kaca objek, meratakan seluas ±

2 cm, mengering anginkan.

3. Memfiksasi di atas nyala lampu spiritus beberapa

kali, sehingga sel-sel bakteri mati.

4. Meneteskan 2-3 tetes larutan Gram A pada preparat

dan mendiamkan selama 1 menit.

5. Mencuci dengan air mengalir sampai cat tercuci

semua, mengering anginkan.

6. Meneteskan 2-3 tetes larutan Gram B dan

mendiamkan selama 1 menit. Mencuci dengan air

mengalir sampai cat tercuci semua, mengering

anginkan.

7. Melunturkan dengan larutan Gram C sampai lapisan

tampak pucat (± 30 menit), dan langsung mencuci

dengan air mengalir lalu mengering anginkan.

8. Meneteskan cat penutup (Gram D) dan membiarkan

selama 2 menit. Mencuci dengan air mengalir dan

mengering anginkan.

9. Mengeringkan bagian bawah kaca objek dengan

tissu, mengamati di bawah mikroskop mulai dari

perbesaran lemah, sedang dan kuat.

10. Menggambar dan memberi keterangan bakteri

yang tampak serta memperhatikan bentuk, warna

dan reaksi pengecatan.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

III. TEORI DASAR

Christian Gram, seorang ahli bakteri Denmark pada tahun 1884

secara kebetulan menemukan prosedur pewarnaan Gram.

Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang

amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi

mikroba. Dengan metode ini, mikroba dapat dibedakan secara

umum menjadi dua kelompok besar yaitu:

(a) organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer

ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak

biru gelap atau ungu) disebut Gram positif,

(b) organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal

pada waktu pembilasan dengan alkohol, namun kemudian

terwarnai oleh pewarna tandingan safranin sehingga sel tampak

merah muda disebut Gram negatif (Hadioetomo, 1985)

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang

salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan

positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini

berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya

dengan sel bakteri akan memberikan warna yang berbeda.

Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan

bakteri. Sel-sel dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam

dan basa. Jika warna terletak dalam muatan positif dari zat

warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada

ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna

basa adalah methylen blue, safranin, netral red dan lain-lain.

Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-,

CH3COOH-, COOHCOO-. Zat warna asam umumnya

mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian

sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi

dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi

oleh faktor-faktor seperti: fiksasi, peluntur warna, substrat,

intensifikasi,pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.

(Sutedo, 1991).

Bentuk dan struktur bakteri dapat diamati dengan dua cara:

1. Mengamati pergerakan sel-sel hidupnya, tanpa pewarnaan.

2. Mengamati sel-sel mati dengan pewarnaan.

Bakteri atau mikroba lain dapat dilihat dengan mikroskop biasa

tanpa pengecatan, yaitu dengan cara-cara khusus, misalnya

dengan cara hanging drop, menggunakan kondensor medan

gelap, dan lain-lain. Tetapi pengamatan tanpa pengecatan ini

lebih sulit dan tidak dapat dipakai untuk melihat bagian-bagian

sel dengan teliti, karena sel bakteri atau mikroba lainnya

transparan atau semi transparan.

Dengan pengecatan dapat dilihat struktur sel mikroba lebih

seksama. Fungsi pengecatan terutama memberi warna pada sel

atau bagian-bagian struktur sel, menunjukkan distribusi susunan

kimia bagian-bagian sel, membedakan mikroba satu dengan

yang lain, menentukan pH dan potensial oksidasi reduksi

ekstraseluler dan intraseluler. Pada umumnya cat yang

digunakan dalam pengecatan merupakan senyawa-senyawa

gram. Cat dapat dibagi dalam dua macam, yaitu cat basis dan

cat asam tergantung pada muatan-muatan listrik cat. Secara

garis besar mekanisme pengecatan bakteri ada dua macam,

yaitu berdasarkan atas pengikatan kimia dan berdasarkan atas

pengikatan fisika. Hasil pengecatan sangat dipengaruhi oleh

beberapa faktor, seperti fiksasi, substrat, peluntur cat

(dekolisator) dan lain-lain.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

IV. HASIL PENGAMATAN

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

V. ANALISA DATA

Dari hasil pengamatan dapat diketahui bahwa hasil pengecatan

diperoleh bakteri jenis gram negatif (-) dengan berwarna merah

tua.

Hasil gambar yang tidak sempurna,tidak sesuai dengan gambar

yang diinginkan,  ketidak berhasilan untuk melihat jenis gambar

yang dilihat dari mikroskop, hal ini disebabkan karena kesalahan

dalam pengerjaan, yaitu ketebalan dalam peletakkan sampel

bakterinya sehingga untuk penelitian melewati mikroskop tidak

dapat dilihat untuk bentuk-bentuk dari bakteri tersebut.

Dari hasil pengamatan terhadap percobaan pengecatan dengan

gram yaitu pencucian dengan menggunakan larutan iodin dan

alkohol.

Pengecatan gram ini dilakukan untuk mengenal dan menentukan

jenis bakteri , hal ini terjadi karena adanya perbedaan bahan

utama pembentuk dinding sel. Bakteri gram positif penyusun

dinding selnya adalah peptiglotin, polisakarida, dan asam

terikoat. Pada percobaan pengecatan gram terhadap biakan

bakteri S. aureus ditemukan adanya bakteri jenis gram negatif

karena dari percobaan warna yang menempel atau melekat

pada bakteri adalah warna hasil merah bukan ungu ataupun biru

yang berbentuk coccus (satu-satu), diplococcus (dua-dua) dan

streptococcus (bergandeng-gandengan panjang).

Adapun fungsi pengecatan ini terutama memberi warna pada sel

atau bagian-bagian struktur sel, menunjukkan distribusi susunan

kimia bagian-bagian sel, membedakan mikroba satu dengan

yang lain, menentukan pH dan potensial oksidasi reduksi

ekstraseluler dan intraseluler.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

VI. KESIMPULAN

 

1. Dari hasil pengamatan dapat dilihat bahwa warna

yang terlihat dari pengecatan tersebut adalah

warna merah, dimana warna merah tersebut adalah

gram negatif (-).

2. Bentuk bakteri tidak dapat dilihat karena ada

kesalahan dalam pengerjaan peletakkan sampel

bakteri di atas preparat.

3. Bakteri gram positif yaitu jika zat warna tambahan

yang ditambahkan terhapus sehingga yang nampak

ialah zat warna asli (ungu). Sedangkan bakteri gram

negatif jika zat warna tambahan (merah) bertahan

hingga zat warna asli tidak tampak.

4. Fungsi pengecatan terutama memberi warna pada

sel atau bagian-bagian struktur sel, menunjukkan

distribusi susunan kimia bagian-bagian sel,

membedakan mikroba satu dengan yang lain,

menentukan pH dan potensial oksidasi reduksi

ekstraseluler dan intraseluler.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

VII. DAFTAR PUSTAKA

Arsyad, Muhammad .2012.Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

Farmasi.

Akademi Farmasi ISFI : Banjarmasin

Anonim. 1995. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Edisi X.

Laboratorium Mikrobiologi FK. Unair : Surabaya.

 

Hadioetomo, Ratna Siri. 1985. Mikrobiologi Dasar Dalam

Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia

: Jakarta.

 

Jutono, dkk. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum

(Untuk Perguruan Tinggi). Departemen Mikrobiologi Fakultas

Pertanian UGM : Yogyakarta.