Elektroforesis protein dan Gel

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu

medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung

pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat

digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi

molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau

autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk

mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang

digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang

banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang

dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE =

poly-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan

komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam

suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke

elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis

untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya.

Didalam elektroforesis tak-penyahaslian (nondenaturing) atau elektroforesis natif,

protein dipisahkan dalam bentuk aslinya berdasarkan cas, saiz, dan bentuk

molekul tersebut. Satu lagi bentuk elektroforesis yang selalu digunakan bagi

pemisahan protein ialah elektroforesis penyahaslian. Elektroforesis gel

poliakrilamid (PAGE) dengan suatu detergen anion, sodium dodesil sulfat (SDS)

digunakan untuk memisahkan subunit protein mengikut saiz. Protein dilarutkan

didalam suatu larutan penimbal yang mengandungi SDS dan agen penurun,

merkaptoetanol atau ditiotreitol, untuk menceraikan protein menjadi subunit dan

menurunkan ikatan disulfat (Rajah 1). Protein bergabung dengan SDS lalu bercas

negartif, dan dipisahkan hanya berdasarkan saiz.

Tatakerja:

Sebuah pembekal kuasa dan radas elektroforesis mengandungi matrik gel

poliakrilamid dan dua takungan (reservoir) larutan penimbal adalah diperlukan

ubtuk menjalankan satu pemisahan. Contoh gel keping dan unit elektroforesis

ditunjukkan didalam Rajah 2. Sumber kuasa digunakan untuk menwujudkan

medan elektrik dengan menyediakan suatu sumber arus, voltan atau kuasa yang

konstan. Penimbal elektrod mengawal pH bagi mengekalkan cas yang sesuai pada

protein dan menkonduksikan arus melalui gel poliakrilamid. Sistem penimbal

yang biasa digunakan termasuklah penimbal anionik tris-(hidroksimetil)amino

metan dengan gel pelerai (desolving gel) pada pH 8.8 dan penimbal asetat yang

kationik pada pH 4.3.

Matrik gel poliakrilamid terbentuk melalui pempolimeran akrilamid dengan

sedikit (selalunya 5% atau kurang) reagen pempaut silang (cross-linking) N.N’-

metilen-bisakrilamid dengan kehadiran satu mangkin, tetrametiletilendiamin

(TEMED) dan sumber radikal bebas, amonium persulfat seperti ditunjukkan

didalam Rajah 3. Gel boleh disediakan didalam makmal atau dibeli siap diacu

(pre-cast).

Matrik gel tak selanjar (discontinuous) selalunya digunakan untuk memperbaikki

peleraian (resolution) protein didalam campuran yang kompleks. Matrik tak

selanjar terdiri dari satu gel penimbun (stacking gel) dengan saiz liang yang besar

(selalunya 3-4% akrilamid) dan satu gel pelerai (resolving gel) yang mempunyai

saiz liang yang kecil. Gel penimbun, seperti yang dimaksudkan dengan namanya,

digunakan untuk menimbunkan atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang

sempit sebelum protein itu memasukki gel pelerai (Rajah 4). 

Pada pH 6.8, satu kecerunan voltan terbentuk diantara ion klorid (cas negatif

tinggi) dan glisin (cas negatif rendah) didalam penimbal elektrod yang bertujuan

menimbunkan protein menjadi jalur-jalur sempit diantara ion-ion. Migrasi

kedalam gel pelarian (running gel) yang mempunyai pH berlainan (pH 8.9)

mengganggu kecerunan voltan ini lalu membenarkan pemisahan protein menjadi

jalur-jalur yang diskrit. 

Saiz liang gel pelarian dipilih berdasarkan berat molekul protein yang hendak

dipisahkan dan boleh diubah dengan cara menukar kepekatan akrilamid didalam

larutan. Protein selalunya boleh dipisahkan pada gel pelarian yang mengandungi 4

ke 15 peratus akrilamid. Kepekatan akrilamid 15 peratus selalunya digunakan

untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul dibawah 50,000.

Protein yang mempunyai berat molekul lebih besar dari 50,000 lazimnya

dipisahkan pada gel yang kepekatan akrilamidnya dibawah 7 peratus. Satu gel

kecerunan (gradient gel) dimana kepekatan akrilamis meningkat dari atas

kebawah gel selalunya digunakan untuk memisahkan satu campuran protein yang

mempunyai banjaran berat molekul yang luas.

Bagi menjalankan sesuatu pemisahan, protein didalam penimbal yang sesuai

pHnya dimuatkan disebelah atas gel penimbun. Pewarna penjejak (tracking dye)

bromofenol biru ditambahkan kedalam larutan protein. Pewarna ini molekul kecil

yang migrasi terdahulu daripada dan digunakan untuk memonitor kemajuan

sesuatu pemisahan. Selepas sesuatu larian (run) elektroforesis, jalur-jalur yang

terdapat pada gel umumnya divisualkan dengan menggunakan pewarna (stain)

protein seperti Coomassie Brilliant Blue atau pewarna timah (silver stain).

Pewarna enzim spesifik atau antibodi boleh juga digunakan untuk mengesan

sesuatu protein.

Kegunaan:

Elektroforesis selalunya digunakan untuk menentukan komposisi protein sesuatu

produk makanan. Sebagai contohnya, perbezaan yang terdapat didalam komposisi

protein dari protein pekatan kacang soya dan pekatan protein weiyang dihasilkan

melalui teknik pemisahan yang berlainan boleh dikesan. Elektroforesis boleh juga

digunakan untuk menentukan ketulenan sesuatu ekstrak protein.

SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan

untuk menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun

protein yang bercas tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang

besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm subunit protein

dengan Rm protein piawai yang diketahui berat molekulnya (Rajah 5). Piawai

protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran

berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul

protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein

tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.

2. Pemfokusan Isoelektrik (Isoelectric Focusing)

Prinsip:

Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis. Dalam

kes ini, protein dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik pada matrik gel

yang telah diwujudkan kecerunan pH menggunakan amfolit (ampholytes). Protein

difokuskan atau migrasi ke lokasi didalam kecerunan dimana pH sama dengan pI

protein tersebut (Rajah 6). Peleraian yang diperolehi adalah diantara yang paling

tertinggi untuk sebarang teknik pemisahan protein dan boleh digunakan untuk

memisahkan protein yang mempunyai pI berbeza kurang dari 0.02 unit pH.

Tatakerja:

Satu kecerunan pH diwujudkan menggunakan amfolit, iaitu polimer kecil (berat

molekul kira-kira 5000 dalton) yang mengandungi kedua-dua kumpulan bercas

positif dan negatif. Suatu campuran amfolit terdiri dari beribu-ribu polimer yang

mempamirkan satubanjaran nilai pK. Amfolit ditambahkan kedalam larutan gel

sebelum pempolimeran dijalankan. Selepas gel terbentuk dan arus dialirkan,

amfolit ini bermigrasi lalu membentuk kecerunan pH; amfolit yang bercas negatif

akan migrasi kearah anod, manakala yang bercas positif kearah katod. Campuran

amfolit boleh diperolehi yang merangkumi banjaran pH yang sempit (2-3 unit)

atau satu banjaran yang lebar (pH 3-10) dan perlulah dipilih untuk digunakan

berdasarkan ciri-ciri protein yang hendak dipisahkan. 

Kegunaan: 

Pemfokusan isoelektrik merupakan kaedah pilihan untuk menentukan titik

isoelektrik sesuatu protein dan sZt. Pemfokusan isoelektrik juga digunakan untuk

membedakan spesis ikan yang berhubungan rapat dengan berdasarkan corak

proteinnya.

ELEKTROFORESIS GEL 

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.

Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan

oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan

berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel.

Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan.

Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula

digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum

digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning,

sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode

karakterisasi lebih lanjut.

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering

dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini

mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan

perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap

campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip

dalam elektroforesis

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked)

yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan

protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel

yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan

konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan

pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan

ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar

(lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari

ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)

pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan

kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel

ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat,

arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif

alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju

perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu

panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk

menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi

dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein

tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar

molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau

pewarna “biru Coomassie” (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan

ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah

“diwarnai” dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika

molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.