pola elektroforesis protein globulin 7s dan 11s dari kacang komak

5/10/2018 Pola Elektroforesis Protein Globulin 7S Dan 11S Dari Kacang Komak - slidepdf....

http:///reader/full/pola-elektroforesis-protein-globulin-7s-dan-11s-dari-kaca

rllff: x J O >/ 0 4 ~

POLA ELEKTROFORESIS PROTEIN GLOBULIN 7S DAN lIS

DARI KACANG KOMAK (Lablab purpureus (L.) sweet)

OlehSITIKHODUAHF02498020

2003

FAKULTASTEKNOLOGIPERT~NINSTITUfPERTANIAN BOGOR

BOGOR



POLA ELEKTROFORE818 PROTEIN GLOBULIN 78 DAN lISDARI KACANG KOMAK (Lablab purpureus (L.) sweet)

OlehSITI KHODIJAH

F 0 2 4 9 8 0 2 0

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat memperoleh gelarS~ANATEKNOLOGIPERTAN~Pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZIFakultas Teknologi PertanianInstitut Pertanian Bogor

2 0 0 3FAKULTASTEKNOLOGIPERT~

INSTITUT PERTANlAN BOGORBOGOR



Siti Khodijah. F02498020. Pola Elektroforesis Protein Globulin 78 dan lIS dariKacang Komak (Lab/ab purpureus (L.) sweet). Dibawah bimbingan Dahrul Syah danArif Hartoyo. 2003.

RINGKASAN

Metode elektroforesis digunakan seeara luas dalam karakterisasi protein,salah satunya adalah penentuan berat molekul protein. Metode yang dilakukan adalah8DSMPAGE untuk mengetahui berat molekul subunit-subunit protein dan metodeNativeMPAGE untuk mengetahui berat molekul protein alaminya. Perbedaan metodeSOS-PAGE dengan Native-PAGE terletak pada perlakuan sampel yaitu mengalamidenaturasi pada 8DS-PAGE dan tidak mengalami denaturasi pada metode Native-PAGE. Perbedaan lainnya adalah penggunaan konsentrasi akrilamid dalam gel.Umumnya Native-PAGE menggunakan konsentrasi akrilamid yang lebih keeil dariSDS-PAGE agar pori gel yang terbentuk berukuran besar. Hal ini disebabkan karenaprotein yang dipisahkan berukuran besar.

Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa globulin 78 kornak DL-40memiliki berat molekul sekitar 183 kOa. Diduga protein alami tersebut memilikikompleks 0 . ' 1 3 1 , a~, aa'p, alP, ala', dan a3. Berat molekul subunit a, u' dan 1 3seeara berturut-turut 64, 57 dan 41 kOa. Begitu pula halnya dengan kornak DL-58,protein alami globulin 78 memiliki berat molekul 175 kOa, yang diduga memilikikompleks a'Pl, o. Jh , aa'p, alP, ala', dan 0.3. Berat molekul subunit penyusunnyatidakjauh berbeda dengan kornak DL-58 yaitu subunit a =64 kOa, cr' = 58 kOa danj3 =41 kOa. Dari konformasi dugaan tesebut, konformasi yang paling mungkinadalah ala' untuk kornak DL-40 dan konformasi alP untuk kornak DL-58.Globulin lIS kornak DL-40 memiliki konformasi dugaan adalah (AIBI)6,(AIBl)6 , (A1Bl~ dan (A:zBl~ dengan berat molekul berturut-turut adalah 312, 288,252 dan 228 kOa. Subunit penyusun globulin lIS kornak DL-40 adalah Al = 35 kOa,Al =25 kOa, BI =17 kDa dan B2 = 13 kOa. Pada komak OL-58 konformasi yangdiduga sarna seperti kornak DL-58 dengan berat molekul yang berbeda yaituberturut-turut 312, 282, 264 dan 234 kDa. Subunit penyusunnya memiliki beratmolekul Al =35 kOa, A2 = 27 kOa, B . = 17 kDa dan B2 = 12 kOa. Konformasi yangpaling mungkin dari konformasi dugaan tersebut sarna untuk. kornak OL-40 dan DL-58 yaitu (A:zBI~.

Dapat disimpulkan bahwa globulin 7S dan 11S dari kaeang kornak memilikipola elektroforesis yang mirip dengan kedelai Hal ini dapat dilihat dari konformasialami protein yang sarna seperti kedelai. Dengan demikian kaeang komak memilikipotensi untuk menggantikan kedelai Namun perlu adanya karakterisasi protein yanglebih luas baik meliputi sifat molekuler lainnya maupun sifat fungsional, sehinggadapat dijadikan saran untuk aplikasi di industri pangan.



mSTITUTPERT~BOGORFAKULTASTEKNOLOGIPERT~

POLA ELEKTROFORESIS PROTEm GLOBULIN 7S DAN lISDAR! KACANG KOMAK (Lablab purpureus (L.) sweet)

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat memperoJeh gelarSARJANA TEKNOLOGI PERTANAIANPada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZIFakultas Teknologi PertanianInstitut Pertanian Bogor

OlehSITI KHODIJAH

F02498020

Dilahirkan pada tanggal14 Agustus 1979di Majalengka

Tanggal Lulus : Maret 2003

Dr. Ir. Dahrul Syab. MSc.Dosen Pembimbing IJr. Anf ".rtoyo. MSi.Dosen Pembimbing II



KATAPENGANTAR

Aku bersaksi bahwa tiada Tuhan selain Allah SWT dan Muhammad adalahutusan-Nya, Alhamdulillah ! Tiada kata yang pantas diungkapkan selain pujian dansyukur pada Allah atas nikmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan tugasakhir ini dengan lancar.

Dalam penyelesaian tugas akhir ini penulis mendapatkan bantuan yang sangatberharga dari berbagai pihak. Oleh karena itu perkenankan penulis menyampaikan

ucapan terima kasih kepada :l. Bapak Dr. Ir, Dahrul Syah, MSc. selaku Dosen Pembimbing I atas kesabaran

dalam membimbing penulis selama masa studi di TPG dan penyelesaian tugasakhir ini.

2. Bapak lr. Arif Hartoyo, MSi selaku Dosen Pembimbing Il atas kesabaran dalammembimbing penulis selama penyelesaian tugas akhir ini.

3. Bapak Dr. lr. Sugiyono, MAppSc. selaku dosen penguji yang telah meluangkanwaktunya.

4. Ayah (Alm) (Semoga kelak Allah mempertemukan kami dalam kenikmatan-Nya)dan Ibu yang telah membesarkan dan mendidik dengan cinta dan kasih sayangserta kakak-kakak tercinta (C'Yuyun, A'Yayan, C'Yiyin, C'Yeyen, A'Yoyon,C'Enday dan C'Ai) yang telah memberikan perhatian dan dukungan. Tak lupakakak-kakak ipar (A'Ukung, C'Euis, K'Deni, M'Madya, A'Lukman danK'Topik) dan keponakan-keponakan yang tak dapat disebutkan satu persatu.

5. Teh Yen yang telah meluangkan waktu mendampingi "ujian" dan Dr. Tauhidatas pinjaman bukunya.



6. Ternan-ternan di Qurrota A'yun dan Mbak atas kebersamaan yang indah selamafit.

7. Pak Wahid, Pak Rozak dan laboran-Iaboran yang lain atas bantuannya.8. Mbak Eno, Mas Hotib, Mas Agus, Mbak Vita, Nina dan Dvv i atas bantuan yang

sangat berharga.9. Sahabat-sahabat dekat Riana, Ari, Nur, Yuliawati, Ira, Heti, Eti, Teti, Eni,

Erning, Atik, Sima, Eno, dan Mike, atas penertiannya.10. Tintin, Sunny, Astari, ternan-ternan di Lab Biokim, Yuli, Tika, Susi, teman-

ternan Kost Teratai (Nope, Iik, Umi, Vivit, Niha, Rie, Aniah dan Ina), Teh Cucu,Ucu, kelompok praktikum 35 (Beti, Yuliasri, Deni), kelompok praktikurn 36(Anis, Bahtiar, Nanang, Opik) dan ternan-ternan di TPG 35 dan 36 yang tak dapatdisebutkan satu persatu.

Penulis menyadari dalam penulisan skripsi ini masih jauh dar i sempurna.Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran dari berbagai pihak,

Bogor, Maret 2003

Penulis

II



DAFTAR lSI

HalamanKATA PENGANTAR .DAFT AR ISI................................................................................................ iiiDAFTAR TABEL. vDAFTAR GAMBAR.................................................................................... VIDAFT AR LAMPIRAN. vuI PENDAHULUAN .

A. LATARBELAKANG................................................................. 1B. TUJUAN PE"NELITIAN". 2

II. TINJAUAN PUSTAK.A . 3A. KACANG KOMAK _......................................................... 3B. GLOBULIN' 7S DAN 11S........................................................... 5C. ELEKTROFORESIS DALAM ANALISIS PROTEIN'........... ..... 8

1. Elektroforesis........................................................................ 82. Elektroforesis Gel Poliakrilamid (PAGE). 93. SDS'_PAGE. 134. Native-PAGE _......................................................... 145. Pewamaan Protein. 15

m. BAHAN DAN METODOLOGI PENELITIAN. 17A. BAHAN DAN ALAT. 17B. METODE PENELITIAN. 17

1. Penelitian Pendahuluan.......................................................... 172. Penelitian Utama. 18

a. Pembuatan separating gel. 18b. Pembuatan stacking gel. 19c. Preparasi dan pemasukan sampel..................................... 19d. Running elektroforesis (pemisahan protein). 20e. Pewamaan gel.................................................................. 20f. Penghilangan wama. 20g. Perhitungan berat molekul. 21

i i i



h. Kesalahan absolut penentuan berat molekul denganmenggunakan elektroforesis, 2 I

IV. HASTL DAN PEMBAHA8AN. 22A. SD8-PAGE. 22B. NATIVE-PAGE.......................................................................... 28C. Konformasi Alami Globulin 78 dan 118 Kacang Komak, 33

v. KE8IM.PULAN . 37A. Kesimpulan, 37B. 8aran............................................................................................ 38

DAFTAR PUSTAKA................................................................................... 39LAMPIRAN................................................................................................. 42

IV



DAFTAR TABEL

HalamanTabel 1. Komposisi kimia kacang komak. 4Tabel2. Komposisi asam amino kacang komak.......................................... 4Tabel3. Komposisi separating gel elektroforesis. 18Tabel4. Komposisi stacking gel elektroforesis. 18Tabel5. Konsentrasi akrilamid untuk pemisahan protein pada berat

molekul tertentu............................................................................ 23Tabe16. Hubungan Rf dengan log BM pada konsentrasisampe169.58 !lg/sumur............... 24Tabe1 7. Referensi berat molekul subunit protein globulin 75dan lIS kedelai 26Tabel 8. Berat molekul subunit-subunit protein globulin 7S

pada kedelai.................................................................................. 26Tabel9. Berat rnolekul subunit-subunit protein globulin 7S

pada komak . 27TabellO. Berat rnolekul subunit-subunit protein globulin 11S

pada kedelai.................................................................................. 28Tabell1. Berat rnolekul subunit-subunit protein globulin lIS

pada kornak _._......................................................... 28Tabel 12. Hubungan Rfdengan log BM pada konsentrasi 30Akrilamid 6 %. 30Tabel13. Berat rnolekul protein alami (native) globulin 75 dan lIS. 32Tabell4. Referensi berat rnolekul protein alami (native) globulin 78

dan 11S kedelai. 33Tabell5. Konformasi dugaan globulin 7S pada komak. 34Tabel16. Konformasi dugaan globulin 118.................................................. 35

v



DAFfAR GAMBAR

HalamanGambar l.Kacang komak DL-40 dan DL-58................................................ 3Gambar 2. Mekanisme pembentukan poliakrilamid. 10Gambar 3. Elektroforegram SDS-PAGE pada konsentrasi sampel

69.58 ug/sumur . 23Gambar 4. Kurva standar SDS-PAGE dengan konsentrasi sampel

69.58 ug/sumur. 24Gambar 5. Elektroforegram Native-PAGE dengan konsentrasi

akrilamid 60/0.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30Gambar 6. Kurva standar Native-PAGE pada konsentrasi

akrilamid 6 % .............................................................................. 31Gambar 7. Model konformasi globulin 7S (jJ-conglycinin) padaKomak DL-40 dan Komak DL-58.... 36

Gambar 8. Model konformasi globulin lIS (glycinin) padakomak. 36

VI



DAFTAR LAMPIRAN

HalamanLampiran 1. Larutan-larutan untuk SDS-PAGE. 41Lampiran 2. Penentuan kurva standar pada SDS-PAGE pada

konsentrasi sampel 79.52 ug/sumur 44Lampiran 3. Penentuan kurva standar pada SOS-PAGE pada

konsentrasi sampel39.76 ug/sumur 45Lampiran 4. Penentuan kurva standar pada Native-PAGE pada

konsentrasi akrilamid 12%.. 46Lampiran 5. Elektroforegram SOS-PAGE pada konsentrasi

sampel 79.52 ug/sumur dan 39.76 ug/sumur 47Lampiran 6. Elektroforegram Native-PAGE pada konsentrasiakrilamid 12% _._................ 48Lampiran 7. Nilai Rfdan BM protein globulin 7S dan lIS yang diperoleh

dari SOS-PAGE pada konsentrasi sampel 79.52 ug/sumur. .... 49Lampiran 8. N ilai Rf dan BM protein globulin 78 dan 11S yang diperoleh

dari SDS-PAGE pada konsentrasi sampel69.38 ug/sumur. .... 50Lampiran 9. Nilai Rf dan BM protein globulin 7S dan 118 yang diperoleh

dari SDS-PAGE pada konsentrasi sampe139.76 ug/sumur. .... 51Lampiran 10. Nilai Rf dan BM protein globulin 78 dan 118 yang diperoleh

dari Native-PAGE pada konsentrasi akrilamid 12 %. 52Lampiran 11. Nilai Rfdan BM protein globulin 78 dan 118 yang diperolehdari Native-PAGE pada konsentrasi akrilamid 6 %. 53Lampiran 12. Perhitungan kesalahan mutlak penentuan berat molekul

dengan 8DS-PAGE dan Native-PAGE................................... 54Lampiran 13. Rata-rata dan deviasi berat molekul yang diperoleh dari

loading sampel sebanyak 8, 7 dan 4,.11pada kedelai. 55Lampiran 14. Rata-rata dan deviasi berat molekul yang diperoleh dari

loading sampel sebanyak 8, 7 dan 4 f.llpada kornak............... 56

VII



I. PENDAHULUAN

A. Latar Beiakang

Indonesia sangat kaya akan sumber-sumber protein nabati potensial yangdapat dikembangkan. Namun pengembangan sumber ini masih dapat dikatakankurang. Hal ini disebabkan karen a kurangnya infonnasi ilmiah yang lengkap danakurat tentang sifat fungsional yang dominan dan in fonnasi-informasikarakteristik yang diperlukan untuk penggunaan dan aplikasi dalam industripangan.

Protein merupakan salah satu komponen yang dapat meningkatkao mutudan sifat organoleptik pangan serta dapat memodifikasi suatu tekstur pangan.Faktor yang dapat meningkatkan mutu tersebut adalah sifat fungsionalnya. Sifatfungsional itu sendiri ditentukan oleh sifat molekuler seperti komposisi asamamino, struktur protein, konformasi, berat molekul dan lain-lain.

Karakterisasi kacang kornak dilakukan dalam rangka meneari sumber-sumber bahan baku yang dapat dijadikan alternatif mengingat banyaknyakeragarnan biji-bijian dan kacang-kacangan di Indonesia. Kacang kornakmemiliki kandungan protein yang tinggi sehingga dapat dijadikan sebagaisumber protein dan memiliki potensi sebagai altematif pengganti proteinhewani. Kandungan gizinya tinggi, berada pada urutan ketiga sete1ah kaeangtanah dan kedelai Karakteristik asam amino penyusunnya hampir mendekatipola protein kedelai.

Protein utama yang terdapat dalam kacang kornak adalah globulin.Karakterisasi protein globulin ini akan sangat membantu dalam penentuan sifatfungsional yang dominan. Deugan demikian dirasa perlu untuk mencariinformasi dasamya. Informasi dasar yang akan dicari adalah berat molekulprotein globulin 78 dan lIS kacang kornak dan subunit-subunitnya, sehinggadapat diketahui konformasi alaminya yang dibandingkan dengan kedelai.Dengan demikian pemanfaatan kornak seeara tepat dapat diketahui.

1



B. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui konformasi alarni globulin7S dan liS dari kacang kornak dengan menggunakan elektroforesis SDS-PAGEdan Native-PAGE.

2



II. TINJAUAN PUST AKA

A. Kacang kornak

Kacang kornak tennasuk dalam ordo Leguminosae rnerupakan suatu bahanmakanan yang memiliki nilai gizi yang tinggi. Selain rnengandung protein yangtinggi juga rnengandung zat-zat gizi lainnya seperti karbohidrat, lernak danvitamin. Menurut Kay (1979), protein yang terkandung dalarn biji tua kuranglebih 21-29 %. 01eh karena itu di Asia selatan, kaeang kornak dijadikan sebagaibahan rnakanan yang merupakan sumber protein.

Biji kornak berada di dalam polong. Setiap polong terdiri dari 2 - 4 bijikornak. Ukuan panjang biji kornak berkisar antara 1 - 2.5 em dan lebar 0.5 em.Gambar kaeang komak dapat dilihat pada Gambar 1. dibawah ini.

Tumbuhan komak diperkirakan bera sal dari India, Asia Tenggara atauAfrika, biasanya dibudidayakan di daerah tropis dan subtropis, Varietas kaeangkornak berbeda-beda. Perbedaannya dapat dilihat dari warna biji yaitu bitam,coklat atau kekuningan (Allen, 1981).

Pemanfaatan kaeang kornak selain sebagai makanan, juga biasa digunakansebagai pakan ternak atau pupuk. Bagian tanaman yang dapat dimanfaatkan untuk

3



dikonsumsi sebagai sayuran adalah daun muda, polong dan biji. Polong muda danbiji dapat pula direbus atau disangrai (Kay, 1979).

Susunan asam amino kacang kornak mendekati pola protein kedelai, yaitukurang mengandung asam amino yang mengandung belerang (rnetionin dansistein), tetapi kaya akan asam amino li sin. sehingga dapat dipakai sebagai"suplemen" dalam pembuatan bahan makanan campuran yang tersusun darikacang-kacangan yang umumnya kekurangan lisin. Komposisi asam aminokacang komak dapat dilihat pada Tabel2.

Kacang kornak termasuk dalam jenis tanaman koro-koroan yang memilikibeberapa keuntungan dibandingkan kacang-kacangan lainnya yaitu mudahdibudidayakan dan produktivitas biji keringnya cukup tinggi sekitar 800-900kg/ha pada lahan kering dan kurang lebih 1700 kg/ha apabila lahan diberipengairan (Robert, 1985).

Kacang komak yang digunakan dalam penelitian ini adalah kacang komakyang dikembangkan diBalai penelitian Kacang-kacang dan Umbi-umbian Malangyaitu varietas 01,40 dan 01,58. Perbedaan nyata dari kedua varietas ini adalahdari warna bunga dan lrulit bijinya. Kornak varietas 01,40 memiliki bunga warnaungu dan lrulit biji berwarna putih. Sedangkan 01,50 bunganya berwarna putihdan kulit bijinya berwarna coklat tua.

Tabel l. Komposisi kimia kacang kornak (setiap 100 g bagian yang dapatdimakan)"

Komponen BijikomakBiji komak muda Biji komak tua

Air Ig) 82.4 9.6Energi (kal) 1260 1403Protein (g) 4.5 24.9Lemak (g) 0.1 0.8Karbohidrat (g) 10.0 60.1Serat (g) 2.0 1.4Abu (g) 1.0 3.2 Van der Maesen (1992)

4



Tabe12. Komposisi asam amino kacang kornak"Asam amino mg/gN Asam amino mgJgNIsoleusin 256 Tiro sin 197Leusin 436 Treonin 207Lisin 366 Alanin 266Metionin 36 Valin 294Sistein 57 Arginin 393Fenilalanin 299 Histidin 186Asam aspartat 727 Asam Glutarnat 978Glisin 240 Pro lin 288

I> Kay (1979)

B. Globulin 78 dan 118

Globulin adalah protein-protein yang mudah larut dalam air dan memilikibentuk sferik kompak. Globulin merupakan protein utama dalam kaeang kornakyang disebut dolichosin (Kay. 1979). Globulin sebagai sumber protein simpanansecara fisiologis berfungsi sebagai simpanan utama nitrogen untuk prosesperkecambahan biji (Hinggins 1984 dalam Purnamasari, 2000). Simpanan proteinini berada pada subseluler kotiledon yang disebut protein bodies yang jugadisebut protein yang memiliki aktivitas biologi (Ikunori, 1983).

Protein utama dalam legume term.asuk kedelai adalah albumin dan globulin.Globulin merupakan protein dominan yaitu sekitar 50 - 90 % dari total proteinbiji dan dapat diklasifikasikan berdasarkan koefisien sedimentasinya yaituglobulin 78 (vicilin, 7.1- 8.7S) dan globulin 118 (legumin, 10.1 - 148) (Utsumiet al., 1997). Menurut John (1997) fraksi globulin berdasarkan lajusedimentasinya dibedakan menjadi empat fraksi yaitu 28, 78, 118 dan 15S.Jumlah globulin tersebut bervariasi tergantung suhu, genetik dan komposisisubunit (Murphy, 1985). Perbedaan struktur dari kedua jenis protein tersebutberkontribusi terhadap variasi sifat fungsional protein legume seperti kelarutan,suhu koagulasi, kandungan sulfur dan nitrogen serta pengikatan flavor (Murphy,1985).

Globulin 78 kedelai diklasifikasikan berdasarkan sifat fisiko kimia menjaditiga fraksi mayor yaitu jJ-cong/ycinin, y-conglycinin dan basic 78 globulin (Hirano

5



et al.,1987 di dalam Utsumi et al., 1997). p.conglycinin merupakan proteinglobulin yang dominan yaitu sekitar 30 ~ 50 % dari total protein biji (Utsumi eta/., 1997). ~conglycinin adalah trimer yang dibentuk oleh tiga subunit (a, ex ', dan0) disatukan dalam kombinasi yang berbeda-beda dengan ikatan kovalen. Beratmolekul berada pada kisaran 150-175 kOa. Sementara itu subunit-subunit yangmenyusuunya memiliki berat molekul 57 kOa untuk ex dan ex' , serta 42 kOauntuk 0 (Tanh dan Shibasaki 1978 dalam Ralet et al., 1996). Sedangkan menurutTanh dan Shibasaki (1977 di dalam Utsumi et a/., 1997) terdapat empat subunityang dapat diidentifikasi dari ~cong/ycinin yaitu subunit ex' (72 kDa), ex (68kDa), 13 (52 kDa) dan 'Y (52 kDa). Agregat-agregat dati subunit-subunit denganberat molekul tertentu dapat terjadi, misalnya pada ~cong/ycinin dengan beratmolekul 140 kD dapat dibentuk dan subunit ex dan ex ' (Petrucelli dan Afion,1996).

y-conglycinin adalah glikoprotein (kandungan karbohidrat 5 %) yang jugamerupakan trimer dengan berat molekul 170 kDa (Sato et al., 1984 didalamUtsumi et al., 1997), terdiri dari tiga subunit yang identik (Yamauchi et al., 1985di dalam Utsumi el al.,1997). Basic 7S globulin juga merupakan glikoproteindengan berat molekul 168 kDa (Yamauchi et al., 1984 di dalam Utsumi et al.,1997), terdiri dari empat subunit yang memiliki berat molekul besar yaitu 26 kDadan empat subunit dengan berat molekul 16 kDa dan dihubungkan dengan ikatandisulfida.

Tanh dan Shibasaki (1978) di dalam Utsumi et al., (1997) dapat mengisolasienam spesies molekuler P-congJycinin dari kedelai dengan komposisi subunite x' 1 32 , a 13 2, ae x' 1 3 , a20 , a2a' , dan a]. Perbedaan subunit a, a ', dan 0 adalahterletak pada jumlah residu sistein, metionin dan triptofan dimana a' masing-masing memiliki satu, empat dan dua, subunit a memiliki masing-masing satusedangkan subunit 0 tidak mengandung residu tersebut (Utsumi et al., 1997).

Globulin lIS (glycinin) adalah protein oligomer yang memiliki beratmolekul 350 kDa terdiri dari enam subunit (ABk Masing-masing subunit terdiridari polipeptida asam dengan berat molekul 37-42 kDa sedangkan polipeptidabasa 17-20 kDa yang disatukan dengan ikatan disulfida (Catsimp oolas et al., 1971

6



dalam Ralet et al., 1996). Menurut Utsumi et al., (1997) subunit asam memilikiberat molekul sebesar 35 kOa sedangkan subunit basa sebesar 20 kOa.

Perbedaan subunit asam dan basa terletak pada posisi Asparagin dan Glisinpada rantai polipeptida. Pada polipeptida asam asparagin terdapat pada ujung Csedangkan pada polipeptida basa terdapat Glisin pada ujung N (Utsumi et al.,1997). Enam subunit (AB) merupakan hexagonal. Beberapa hipotesa mengatakanbahwa subunit asam dan basa saling berseling pada struktur melingkar yangberkontribusi pada kestabilan molekul dari pengaruh interaksi ionik (Badley et al.,dalam Gottschalk, 1983). Disosiasi dari subunit-subunit mudah terjadi Hal inibisa disebabkan karena kelruatan ionik yang rendah, kehadiran agen disosiasi(misal urea), agen reduksi atau adanya asam atau basa dan akibat adanya panas(Alais, 1991).

Globulin 118 tidak mengandung monosakarida sehingga sampel yang sudahdiekstrak dan dikeringkan berwama jernih, lain halnya dengan globulin 78 yangmengandung 5% manosa dan glukosamin (Alais, 1991) sebingga warn a sampelagak coklat. Globulin lIS memiliki stabilitas terhadap panas yang lebih tinggidibandingkan dengan globulin 78 tetapi memiliki sensitifitas yang tinggi terhadapperubahan pH.

Pada penelitian ini digunakan sampel yang sudah berupa globulin keringhasil ekstraksi dan freeze dry. Ekstraksi adalah pemisahan zat terlarut (solut)diantara dua pelarut yang tidak saling bercampur (Nur et al., 1989). Metodeekstraksi protein berdasarkan pengendapan pada titik isoelektriknya seringdigunakan. Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode yang dilakukan olehTanh dan Shibasaki (1976) yang didasarkan pada perbedaan titik isoelektrik:fraksi-fraksi protein. Globulin 7S akan diendapkan pada pH 4.8 sedangkanglobulin 11Spada pH 6.4 yang masing-masing pH tersebut adalah titikisoelektriknya. Pengendapan dan kemudian sentrifugasi pada konsentrasi tertentudapat mengumpulkan protein Iebih banyak. Hal ini disebabkan karena interaksinonkovalen protein-protein (Myers, 1988).

7



c. Teknik Elektroforesis di dalam Analisis ProteinI. Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatuzat berdasarkan migrasi partikel bermuatan atau ion-ion makromolekuldibawah pengaruh medan listrik. Migrasi partikel bermuatan tersebut dapatterjadi karena perbedaan muatan total, ukuran dan bentuk (Pomeranz danMeloan, 1994). Sedangkan menurut Rybicki dan Purves (1996) tingkatmigrasi partikel tergantung pada muatan total, ukuran, bentuk dan jugakekuatan ionik, viskositas dan suhu medium.

Beberapa kegunaan elektroforesis antara lain adalah untukmenentukan berat molekul, mendeteksi terjadinya pemalsuan bahan,mendeteksi terjadinya kerusakan bahan seperti protein dalam pengolahan danpenyimpanan, memisahkan spesies molekul yang berbeda secara kualitatifmaupun kuantitatif serta menentukan titik isoeletrik (NUT dan Adijuwana,1989). Menurut Copeland (1994) metode elektroforesis digunakan secara luasdalam ilmu protein untuk menentukan kemurnian bahan berat molekul danterkadang titik isoelektrik,Molekul biologi seperti asam amino, peptida, protein, nukIeotida danasam nukIeat memiliki grup yang dapat berionisasi pada perbedaan pH ataudalam larutan sebagai kation (+) atau anion (~). Pada pengaruh medan listrik,partikel bermuatan ini akan bermigrasi baik ke katoda maupun anodatergantung muatan total alaminya (Wilson &Walker, 2000). Pemisahanpartikel bermuatan dalam medan listrik disebabkan karena adanya gradienpotensial dan muatan totalnya. Akan tetapi gaya gesek dapat menghambatpergerakan partikel Gaya gesek yang dimaksud adalah ukuran molekul,bentuk molekul dan ukuran pori medium serta viskositas buffer (Wilson danWalker, 2000).

Protein adalah grup amfoterik, dimana muatao totalnya ditentukanoleh pH medium ketika ia dilarutkan, Pada larutan yang memiliki nilai pHyang Iebih besar daripada pI protein akan memiliki muatan total negatif

8



sehingga pada medan listrik akan bermigrasi menuju ke anoda. Sebaliknyajika larutao memiliki nilai pH lebih kecil dari nilai pI maka protein akanbermuatao positif dan akan bergerak menuju ke katoda (Pomeranz danMeloan, 1994; Rybicki dan Purves, 1996). Campuran protein dalam larutanakan bermigrasi pada medan listrik dengan tingkat migrasi yang berbeda-beda menuju salah satu elektroda. Protein akan bermigrasi berdasarkandensitas muatannya (perbandingan muatan dan massa). Jika nilai ini tinggimaka molekul akan bermigrasi lebih cepat (Hames dan Rickwood, 1981).

Kecepatan migrasi suatu partikel pada suatu medan listrik disebutmobilitas elektroforetik. Mobilitas elektroforetik ditentukan oleh gugus-gugusyang terionisasi pada permukaan partikel terutama ukuran dan muatanpartikel. Jenis dan besar gugus yang terionisasi tersebut tergantung padakekuatan ionik dan pH medium. Semakin besar ukuran pertikel semakin kecilmobilitasnya, sedangkan dua partikel dengan ukuran sarna tetapi bentuknyaberbeda akan berbeda pula harga mobilitasnya (Nur dan Adijuwana, 1989).

Elektroforesis zona dengan media agarosa dan poliakrilamid seringdigunakan. Hal ini terutama disebabkan karen a gel yang bersifat poroussehingga dapat memisahkan molekuIberdasarkan ukurannya. Gel yangbersifat porous dapat menahan atau menghalangi pergerakan molekul besarsedangkan molekul kecil akan bermigrasi secara bebas. Gel agarosa umunnyabersifat kaku dan mudah ditangani pada konsentrasi akrilamid rendahdibandingkan dengan akrilamid sehingga digunakan untuk memisahkanmolekul besar seperti asam nukleat, protein-protein besar dan campuranprotein. Sedangkan poliakrilamid mudah ditangani pada konsentrasi tinggisehingga digunakan untuk kebanyakan protein dan oligunukleotida yangmembutuhkan ukuran pori gel yang kecil sebagai hambatan (Rybicki danPurves, 1996; Wilson dan Walker, 2000).

2. Elektroforesis Gel Poliakrilamid (PAGE)

Gel poliakrilamid dibentuk dari polimerisasi akrilamid dengansejumlah kecil metilen bisakrilamid sebagai cross-linking agent yang

9



diinisiasi oleh TEMED (tetrametilen-etilendiamin) dan APS (amoniumpersulfat) (Wilson & Walker, 2000). Radikal-radikal bebas dari amoniumpersulfat akan bereaksi dengan akrilamid sehingga terbentuk akrilamid aktifAkrilamid aktif ini dapat bereaksi dengan cara yang sarna dengan roolekulakrilamid yang lain sehingga dihasilkan suatu rantai polimer yang panjang,Larutan yang mengandung rantai poliroer yang pajang ini tidak membentukgel. Untuk membentuk gel diperlukan N, N'-roetilen-bis-akrilaroid yangbertindak sebagai cross-linking agent. Polimerisasi roenyebabkanterbentuknya "jala" dari rantai akrilaroid. Ukuran pori dari jala tersebutditentukan oleh jumlah akrilaroid yang dipergunakan per unit volume mediumreaksi dan derajat ikatan silangnya (NUT & Adijuwana, 1989). Pada Gambar2. berikut disajikan mekanisme perobentukan gel poliakrilaroid.

CH2=CHCONH2Akrilamid +

CH2(NHCOHC=CH2nN,N,N' ,N' -metilen bisakrilamid~ Katalis radikal bebas

-CH -CHiCH -CH-=+-CHCH-2 I 2 I J .. 2 I

~O ~O n 1 0r r N H2 rCH 2 CH 2I IIf N f I 2 IfC j O co co- C H , - C H - { C H ,6 .: r C H z - ~ H -Gambar 2. Mekanisme pembentukan poliakrilamid (Wilson dan Walker,2000)

Elektroforesis dengan gel poliakrilamid dapat meningkatkan resolusipemisahan komponen karena didasarkan pada saringan molekuler danmobilitas elektroforetik. Molekul yang kecillebih mudah melalui medium geldibandingkan molekul yang besar dan kecepatan pergerakannya pun lebihcepat (Boyer, 1993). Saringan roolekuler tergantung pada kerapatan pori-pori

10



gel dengan ukuran dari molekul yang dipisahkan (Hames & Rickwood,1981).

Ukuran pori gel dapat bervariasi tergantung konsentrasi akrilamid danbisakrilamid. Persentasi gel yang kecil menghasilkan ukuran pori yang besar,sebagai contoh konsentrasi 3 % 30 %dapat digunakan untuk melakukan pemisahan protein, sedangkan konsentrasiakrilamid 10% - 20% dapat memisahkan DNA (Wilson & Walker, 2000).Menurut Boyer (1993), ukuran gel standar untuk memisahkan protein adalah7.5% poliakrilamid. Gel ini dapat memisahkan protein dengan berat molekulantara 10 - 1000 kD, tetapi resolusi yang baik terjadi pada kisaran beratmolekul 30 -300 kD.

Penggunaan gel poliakrilamid sebagai medium penyanggaelektroforesis memiliki beberapa keuntungan diantaranya yaitu :1. Gel yang transparan, sehingga dapat dilihat pada sinar tampak maupun

ultraviolet.2. Dapat diperoleh resolusi atau pemisahan yang baik, disebabkan karena

matriks gel tidak bermuatan.3. Ukuran pori gel dapat diatur sehingga pemisahan senyawa-senyawa dapat

didasarkan pada perbedaan ukuran, bentuk dan muatan molekul.4. Seeara kimiawi gel bersifat fleksibel dan stabil pada kisaran pH yang

luas, kekuatan ion dan suhu.Poliakrilamid gel elektroforesis dapat dilakukan pada dua macam gel

yaitu gel yang berbentuk. batang atau lempeng tip is diantara dua plat kaca(slab gel). Penggunaan mini slab gel memiliki keuntungan dapatmemisahkan sampel Iebih dati satu dalam satu kali elektroforesis yangberbeda dengan gel batang yang hanya dapat memuat satu sampel (Wilsondan Walker, 2000). Selain itu keuntungan lain dalam aplikasi analitis,penggunaan mini slab gel sangat populer karena dapat meningkatkan resolusi,mengurangi waktu dan material yang dibutuhkan (Bollag dan Edelstein,1991).

II



Penggunaan buffer dalam elektroforesis gel dapat digunakan duasistem yaitu kontinyu (homogenus) dan diskontinyu (multiphasic) (Copeland,':1994). Perbedaan mendasar pada sistem buffer diskontinyu adalah gel yangdigunakan dalam satu slab terdiri dari dua gel yaitu stacking gel danseparating gel. Buffer dan konsentrasi akrilamid yang digunakan pada keduagel tersebut berbeda (Boyer, 1993). Pada stacking gel digunakan bufferdengan pH 6.8 dan konsentrasi akrilamid rendah (ukuran pori besar)sedangkan pada separating gel digunakan buffer dengan pH 8.8 dankonsentrasi akrilamid tinggi (ukuran pori kecil) (Wilson dan Walker, 2000).Sehingga protein akan terkonsentrasi pada stacking gel dan akan mengalamiresolusi yang tinggi pada separating gel. Hal ini menghasilkan pemisahanyang baik dan pita yang tajam .

. Fungsi buffer e1ektroforesis adalah untuk mempertahankan pH didalam reservoir dan gel serta sebagai elektrolit pembawa aliran listrik. Olehkarena itu pemilihan buffer barus memenuhi kriteria sebagai berikut :1. Pemilihan buffer harus didasarkan pada tidak adanya interaksi yang

teIjadi antara buffer dengan makromolekul yang dipisahkan.2. pH yang digunakan tidak mengakibatkan denaturasi protein. Kisaran pH

yang digunakan untuk protein biasanya 4.5 - 9.0 (Nur & Adijuwana,1989).

3. Kekuatan ionik. dan konsentarasi buffer hams diperhitungkan dengantepat. Kekuatan ionik yang biasanya digunakan berkisar antara 0.05 -0.15 (Nur &Adijuwana, 1989).



timbulnya panas yang dapat mengakibatkan denaturasi, Sehingga meskipunpita-pita tajam dapat diperoleh, tetapi pergerakan molekul hanya mencapaijarak pendek. \

3. 5DS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfat- Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Metode ini merupakan cara yang relatif murah, mudah dan cepatuntuk melakukan kuantifikasi, perbandingan dan karakterisasi protein.Pemisahan yang dilakukan didasarkan pada berat molekul protein yangdipisahkan. Menurut Nur dan Adijuwana (1989), SOS-PAGE terutamadilakukan untuk mengetahui apakah suatu protein monomerik atauoligomerik, juga untuk menentukan berat molekul dan jumlah rantaipolipeptida sebagai subunit atau monomer.

Prinsip dasar SDS-PAGE adalah molekul bermuatan akan bennigrasidalam medan listrik dengan laju yang ditentukan oleh ukuran dan muatannya,Sebelun protein dijalankan dalam medan listrik, protein akan didenaturasiterlebih dahulu dengan perubahan kondisi yang tajam (misal panas, adanyaagen pereduksi, penambahan deterjen dan lain-lain) dan kemudiau akandibungkus dengan deterjen anionik yaitu SD8 (Copeland, 1994). Muatan aslimolekul protein akan ditimpa oleh moleku1 SOS yang bennuatan negatif(Wilson dan Walker, 2000). Adanya 2-merkaptoetanol dapat membantudenaturasi protein dengan cara mereduksi semua ikatan disulfide (Boyer,1993).

Denaturasi protein adalah suatu keadaan dimana terjadi perubahankonformasi protein. Perubahan ini meliputi proses destruksi ikatan padastruktur sekunder sehingga konformasi native protein berubah tetapi ikatankovalen pada polipeptida tidak mengalami destruksi.

80S adalah deterjen anionik, merupakan grup ion sulfat dan rantaialkil lipofilik yang menyebabkan peptida dan protein tidak saling berikatanyang dinamakan denaturasi SOS kemudian mengelilingi peptida atau proteinsehingga bermuatan negatif Kemudian semua peptida dan protein dalamcampuran akan bermigrasi menuju anoda (Bailey, 1992) yang pergerakannya

13



tidak dipengarubi bentuk. Hal ini disebabkan karena adanya denaturasi yangmengakibatkan bentuk molekul seragam yaitu berbentuk rantai lurus yangkemudian diselimuri oleh SDS sehingga bermuatan negatif (Voet et al.,1999). Dengan demikian pergerakan protein merupakan fungsi dari beratmolekulnya, dimana kompleks SDS-protein yang lebih besar mempunyaimobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan kompleks yang lebih kecil.

Sampel yang dimasukkan ke dalam sumur pada stacking gel akanterkonsentrasi atau tertumpuk dan tidak mengalami pemisaban meskipundibawah pengaruh medan listrik, ini disebabkan karena pori gel berukuranbesar (4% akrilamid) (Wilson dan Walker, 2000). Mobilitas ion pada stackinggel secara berurutan adalah ion klorida, protein kemudian ion glisin. Ketikapergerakan sampai pada separating gel, konsentrasi glisin meningkat akibatpeningkatan pH sehingga mobilitasnya akan meningkat. Berbeda denganprotein yang mobilitasnya menurun akibat adanya ukuran pori yang semakinkeciL Dengan demikian pergerakan ion pada separating gel secara berurutanadalah ion klorida, ion glisin dan protein (Boyer, 1993).

4. Native-PAGE

Pada kondisi ini protein tidak mengalami denaturasi, sehingga seringdisebut sebagai electrophoresis under nondenaturing condition. Metode inidigunakan untuk mengetahui kandungan protein alami pada sampel (Wilsondan Walker, 2000). Pemisahan protein didasarkan pada ukuran dan muatana slinya, sebingga denaturasi protein harus diminimalisasi (Bollag danEdelstein, 1991). Konsentrasi gel yang digunakan biasanya adalah 7.5%akrilamid, Dengan demikian pemisahan protein didasarkan pula oleh saringandari pori gel (Wilson dan Walker, 2000).

Elektroforesis dilalrukan pada kondisi pH tinggi yaitu 8.8. Pada pH iniprotein akan bermuatan negatif sehingga dapat bergerak menuju anoda dalammedan listrik (Bollag dan Edelstein, 1991). Dengan demikian fungsi bufferadalah untuk menjaga kondisi native protein (Campbell, 2001).

14



8eberapa kondisi yang hams diperhatikan pada Native-PAGE antaralain :1. Ukuran gel harus lebih besar dari ukuran pori gel pada SDS-PAGE.

Konsentrasi akrilamid yang biasa dipergunakan adalah 5% - 15% (Bol1agdan Edelstein, 1991).

2. Muatan protein harus dijaga agar tetap bermuatan negatif Kebanyakanprotein akan bermuatan negatif pada pH 8.8, sehingga buffer hamsmemiliki pH 8.8.

3. Kekuatan ionik berpengaruh pada pemisahan protein. Jika kekuatan ionikterlalu rendah maka protein akan mengalami agegrasi secara tidakspesifik, tetapi jika kelruatan ionik terlalu tinggi maka akan timbul panasketika elektroforesis yang dapat mengakibatkan denaturasi protein.Kekuatan ionik yang biasa digunakan adalah pada kisaran 10 - 100 mM(BoUag dan Edelstein, 1991).

4. Suhu ketika prep ara si harus dijaga pada kisaran 0 - 4C untukmenghindari denaturasi dan proteolisis.

5. Pewamaan Protein

. Pewarnaan berfungsi untuk memperjelas pita protein hasil pemisahandengan elektroforesis. Beberapa pewarna yang dapat digunakan untukmendeteksi adanya protein antara lain Coomassie Brilliant Blue R-250(CBB), pewama perak (AgN



merapikan protein dalam gel sehingga dapat menjaga protein dati pencucian(destaining) sehingga tetap berwarna (Wilson dan Walker, 2000).

Ketika proses pencucian, pita protein tetap berwarna biro sedangkanlatar belakang berwarna terang. Hal ini dapat memudahkan identifiasi pitaprotein yang dihasilkan. Larutan destaining yang digunakan terdiri darimetanol, asam asetat glasial dan air dengan perbandingan 10 : 10 : 8 (BoUagdan Edel stein, 1991).

16



In. BAHAN DAN METODOWGI PENELITIAN

A. Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah globulin fraksi7S dan 11S dari kacang kedelai 10kaI , kedelai impor, kornak varietas DL-40 danOL-S8. Sampel globulin tersebut diperoleh dari hasil ekstraksi yang dilakukanoleh Agustine (2002).

Untuk analisis elektroforesis SOS-PAGE dan Native-PAGE dibutuhkanakrilamid, N,N"-metilen bisakrilamid, amonium persulfat (APS), tetraetilen-metilendiamin (TEMEO), tris base. glisin, Hel, gliserol, bromphenol blue, 2-merkaptoetanol, sodium dodecyl sulfat (SDS), coomassie briliant blue R-2S0,methanol, asam asetat glasial, akuades, penanda protein Low Molecular Weight(LMW) dan High Molecular Weight-Native (HMW-Native).

Alat-alat yang diguanakan adalah perangkat alat elektroforesis, tabungeppendorf, mikropipet, magnetic stirer, shaker, gelas piala, timbangan analitik.,pH meter. Iabu takar, gelas ukur, hot plate, dan sudip.

B. Metode

I. Penelitian Pendahuluan

Tujuan penelitian pendahuluan adalah untuk mengetahui jumlahsampel optimum. yang hams diaplikasikan ke sumur. Untuk itu dilakukanelektroforesis SDS-PAGE dengan menggunakan sampel globulin 7S danllS yang diekstrak dengan modifikasi metode Tanh & Shibasaki (1976)dengan volume yang berbeda-beda yaitu 8, 7 dan 4 J.lllsumur. Volume inisetara dengan 79.52 ug/sumur, 69.58 ug/sumur dan 39.76 ug/sumur,Berdasarkan hasil tahap ini, dapat diketahui jumlah optimum sampel untuktahap selanjutnya. Elektroforegram masing-masing konsentrasi sampeldapat dilihat pada Lampiran 5.

17



/

Konsentrasi sampel yang optimum tersebut diaplikasikan pada Native-PAGE pada konsentrasi akrilamid yang berbeda-beda. Untuk itu dilakukanpemisahan protein pada konsentrasi akrilamid 6 % dan 12 %. Pada tahap inidiaplikasikan sample dengan volume 7 ul/sumur. Elektroforegram untukkonsentrasi akrilamid dapat dilihat pada Lampiran 6.

2. Penelitian Utama

Elektroforesis SDS-PAGE dan Native-PAGE dilakukan denganmetode Bollag &Edelstein (1991). Perbedaan kedua metode ini terletak padaIrut an yang digunakan dan persiapan sampel. Tahapan-tahapanelektroforesis adalah sebagai berikut :

a. Pembuatan separating gel

Dua lempengan kaca direkatkan dan diberi pemisah dari plastik yangakan digunakan sebagai cetakan gel (mini slab gel). Larutan A, B danakuades dicampur dalam gelas piala sambil terus diaduk dengan magneticstirer. Kemudian ditambahkan TEMED dan terakhir APS sambil tetapdiaduk, campuran dimasukkan ke dalam lempengan kaca tadi (mini slab)dengan menggunakan mikropipet sampai sekitar 1 em dari atas lempengan.Perlu diperhatikan ketika pemasukkan larutan gel ke dalam slab jangansampai terbentuk gelembung karena akan mengganggu jalannya prosesseparasi. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yangterbentuk. Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30 - 60menno

Komposisi separating gel dapat dilihat pada Tabel 3. Pembuatanlarutan stok, larutan A, lanrtan B, larutan C) APS 10%, buffer sampel, bufferelektroforesis, larutan pewama dan larutan penghilang warna dapat dilihatpada Lampiran 1.

18



Tabel3. Komposisi separating gel elektroforesis untuk dua plat.Bahan Gel 120/0 Gel 60/0Larutan A 4800 J.lI 2400 J.lILarutanB 4000 J . L l 4000 II IAkuades 7980 J . L l 9490 II ITEMED 10 ul IOll1APS 10% 100 ul 100 II I

b. Pembuatan stacking gel

Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan denganmenggunakan tissue. Larutan A, C dan akuades dicampur dalam gelas piala."TEMED dan APS 10% ditambahkan sambil terus diaduk dengan magneticstirer. Larutan gel dipipet ke dalam mini slab diatas separating gel sampaimencapai puncak plat. Sisir kemudian dimasukkan secara cepat untukmenghindari pembentukan gel sebelum sisir dimasukkan. Kehati-hatianpemasukkan sisir juga diperlukan agar udara tidak terperangkap. Stacking geldibiarkan berpolimerisasi selama 30 menit.Komposisi stacking gel dapat dilihat pada Tabel4. berikut ini.

Tabel4. Komposis stacking gel elektroforesis untuk dua platBahan Gel 40/0LarutanA 600 J . L lLarutanB 1500 J . L lAkuades 2790 J . L lTEMED 1 O J . 1 lAPS 10% 100 J . L l

c. Preparasi dan pemasukkan sampelSampel globulin fraksi 7S dan 11S dalam bentuk freeze dry diambil

sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 1 ml buffer Tris-HCI 0.03 M pH 8.8kemudian distirer. Setelah protein terlarut, diambil sebanyak 24 J.lIlarutanprotein dan ditambahkan dengan 6 III 5x sampel buffer. Campuran diaduk

19



kembali dengan stirer, kemudiao dipanaskan selama 2 menit dalam airmeodidih untuk metode SOS-PAGE, sedangkan uotuk metode Native-PAGEtidak mengalami pemanasan, Sebelum sampel dimasukkao ke dalam sumurdengao syringe, sampel didinginkan sebentar dan distirer. Sampeldimasukkan ke dalam sumur sebanyak 7 ul,

d. Running elektroforesis (pemisahao protein)

Reservoir buffer bawah diisi dengan buffer elektroforesis. Sisir darislab dilepaskan, kemudian slab direkatkan pada chamber elektroforesis.Buffer atas dimasukkao pada reservoir atas. Sumur-sumur pada gel diaturagar tidak ada gelembung air yang terdapat di dalamnya, kemudian sampeldimasukkan ke masing-masing sumur. Katup elektroda kemudian dipasangdengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga supayakonstan 125 V. Running (pemisahan protein) dilakukan selama 30 - 40 menitsampai migrasi dye sekitar Iem dari dasar. Setelah selesai, aliran listrikdimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan darielektroda.

e. Pewamaan gel

Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah yang telahberisi pewama eoomassie briliant blue. Kemudian diagitasi dalam rotaryshaker selama 5 - 10 menit karena ketehalan gel yang digunakan adalah 0.75nun Larutan stain dibuang dan diganti dengan larutan penghilang warna(larutan destain)

f Penghilangan warna

Sete1ah tarutao stain dibuang, ditambahkan larutao penghilaog warna(larutan destaining). Penghilangan warna dilakukan dengan mengagitasi geldalam rotary shaker selama semalam

20



g. Perhitungan berat molekul

Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresiantara mobilitas relatif protein marker (penanda protein) dengan log dariberat molekul marker yang telah diketahui.

Mobilitas relatif protein dihinmg dengan membandingkan jarakmigrasi protein diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pitaprotein yang dibandingkan dengan jarak migrasi tracking dye. Mobilitasrelatiftersebut dapat dirumuskan sebagai berikut :

Rf = iarak migrasi proteinJarak migrasi tracking dye

h. Kesalahan mutlak penentuan berat molekul menggunakan elektroforesis

Kesalahan mutlak dihitung dengan eara membandingkan beratmolekul sampel pada pita tertentu dengan berat molekul protein pada pitayang lain yang memiliki jarak pergerakan 0.5 r um . Penentuan 0.5 rom iniberdasarkan kesalaban pengukuran jika menggunakan alat penggaris, dimanakesalahan pengukuran dalam tiap 1 em adalah setengah dari nilai terkeeil(rom). Contob perhitungan kesalaban mutlak dapat dilihat pada Lampiran 12.

Penggunaan nilai muttak ini ditujukan sebagai tolok ukur penentuanberat molekul, apakah berat molekul yang diperoleh memiliki selisih denganreferensi yang masih dalam batas nilai kesalahan mutlak tersebut.

21



IV. BASIL DAN PEMBAHASAN

A. SDS-PAGE

808-PAGE digunakan seeara luas dalam analisis protein terutamapenentuan berat molekul subunit. Penentuan berat molekul protein globulin 78dan 11S kacang kornak dengan 80S-PAGE ditujukan untuk mengetahui beratmolekul subunit-subunit penyusunnya.

Untuk mengetahui subunit-subunit tersebut maka protein hamsmengalami denaturasi sehingga dapat dipetakan dalam elektroforegram denganpita-pita yang berbeda. Dalam analisis ini, penggunaan SOS dan 2-merkaptoetanol dalam buffer sampel serta pemanasan selama 2 menit sebelumdilakukan pemasukkan sampel pada sumur elektroforesis ditujukan untukmendenaturasikan protein.

Denaturasi protein merupakan keadaan dimana terjadi kerusakan strukturriga dimensi protein (struktur sekunder dan tersier / konformasi native) menjadirantai polipeptida yang tidak saling berikatan tetapi ikatan peptida padapolipeptida tersebut tidak mengalami kerusakan.

Elektroforesis dengan poliakrilamid dapat meningkatkan resolusipemisahan komponen karena pemisahan didasarkan pada mobilitaselektroforetik komponen dan saringan molekuler pada pori gel. Saringanmolekuler tergantung pada kerapatan pori-pori gel dan ukuran dari molekul yangdipisahkan. Oleh karena itupemilihan konsentrasi gel menjadi hal yang penting.Konsentrasi akrilamid yang digunakan adalah 12 % dimana diharapkan dapatmemisahkan subunit- subunit globulin yang memiliki kisaran berat molekul 15-60 kOa. Konsentrasi akrilamid untuk. memisahkan protein pada kisaran beratmolekul tertentu dapat dilihat pada Tabel 5.

Dalam satu slab gel. semakin kebawah ukuran porinya akan semakinkecil sehingga komponen dengan berat molekul kecil akan berada pada bagianbawah sedangkan komponen dengan berat molekul besar akan berada padabagian atas. Berdasarkan penelitian pendahuluan, jumlah optimum sampel yang

22



diaplikasikan ke sumur adalah 69.58 ug/sumur, Penentuan jumlah optimumsampel yang diaplikasikan dapat dihhat dari tajamnya pita-pita subunit proteindipetakan dalam elektroforegram Hal ini dapat dilihat pada Gambar 3.

Tabel5. Konsentrasi akrilamid untuk pemisahan proteinpada berat molekul tertentu. C0/0 Akrilamid Berat Molekul (kD)

5.0 200 ~ 607.5 120~ 3010.0 75 - 1812.5 60 - 1515.0 45 - 12

C Copeland (1994)

K ete ra ng an :I =globulin 7S kedelai Iokal2=globulin 7S kedelai i mp o r3 = globulin 7S kornak DL-404 =globulin 7S kornak Dlr58

5 =globulin 11S kedelai lokal6 = globulin lIS kedelai impor7 = globulin lIS kornak Dlr408=globulin llS kornak DL-58

Gambar 3. Elektroforegram SDS~PAGE pada konsentrasi sampel69.58 ug/sumur,

Standar protein yang digunakan adalah penanda protein LMW-SDS (LowMolecular Weight-SDS) yang terdiri dari enam protein yaitu phosphorilase b

23



(8M: 97 kD), albumin (8M: 66 kD), ovalbumin (8M: 45 kD), carbonicanhydrase (8M: 30 kD), trypsin inhibitor (8M: 20.1 kD) dan a-lactalbumin(8M: 14.4 kD). Penentuan berat molekul sampel dihitung dan ekstrapolasikurva standar yang dapat dicari dari hubungan antara mobilitas elektroforetik(Rf) dengan logaritma dari berat molekul (Log BM) sehingga dapat diperolehpersamaan regresi linier. Hasil regresi yang diperoleh adalah y = -1.1150x +2.1146 dengan koefisien determinasi contoh (r) sebesar 0.984, yang berartibahwa 98.4 % diantara keragaman total dari berat molekul (y) dapat dijelaskandari hubungan tinier dengan nilai Rf-nya (x). Pada Gambar 4. dapat dilihat kurvaregresi yang diperoleh.

Tabel 6. Hubungan Rfdengan log BM pada konsentrasisampel 69.58 ug/sumurRf BM LogBMmarker(x) marker (y)0.150 97 1.9870.270 66 1.8200.400 45 1.6530.510 30 1.4770.730 20.1 1.3030.870 14.4 1.158

Kurva Standar2.52ii 1.5

00..J0.50 0

~ y =-1.115x +2.1146. ~ R l=O .9B4

0.5Rf

1

Gambar 4. Kurva standar untuk SOS-PAGE padakonsentrasi sampel 69.58 ug/sumur

24



Perhitungan berat molekul sampel dapat dihitung dengan memasukkannilai mobilitas elektroforetik (Rf) pada persamaan regresi yang diperoleh.Pengukuran mobilitas elektroforetik. dilakukan dengan menghitung jarakpergerakan sampel yang dibandingkan dengan jarak. pergerakan dye. Nilaimobilitas elektroforetik dan berat molekul yang diperoleh pada konsentrasisampe169.58 ug/sumur dapat dilihat pada Lampiran 8.

Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pada globulin 7S kedelai lokalterdapat tiga protein dominan yaitu 58, 52 dan 20 kOa. Sedangkan pada kedelaiimpor terdapat tiga protein domin an yaitu 59, 52 dan 20 kDa. Komak DL-40memiliki tiga pita dominan yaitu 64, 58 dan 41 kOa. Sedangkan komak DL-58memiliki tiga pita dominan yaitu 64, 58 dan 40 kOa. Diduga ketiga subunittersebut berturut-turut adalah subunit ex , e x ' dan ~.

Hasil yang diperoleh sesuai dengan Tanh dan Shibasaki (1978) dalamRallet et a/., (1996) yang menyatakan bahwa subunit ex dan u' memiliki beratmolekul 57 kOa dan subunit p memiliki berat mole1rul 42 kOa. Sedangkanmenurut Tanh dan Shibasaki (1977) didalam Utsumi et al., (1997) menyatakanbahwa berat molekul subunit uadalah 72 kOa, a' adalah 68 kOa dan p adalah52 kOa. N amu n demikian terdapat pula beberapa penelitian lain yangmenemukan berat molekul subunit-subunit protein globulin 7S dan II yangberbeda-beda. Pada Tabel 7. dapat dilihat beberapa literatur tentang beratmolekul subunit-subunit protein globulin 7S dan lIS. Perbedaan tersebutdisebabkan karena komposisi kimia yang sangat dipengaruhi oleh faktor genetik.Oleh karena ituvariasinya luas diantara varietas dan kuhivarnya (Muller, 1983).

Hasil yang diperoleh pada komak OL-40 dan OL-58 menunjukkan beratmolekul yang masih dalam kisaran kesalahan mutlak penentuan berat molekul.K.esalahan mutlak penentuan berat molekul pada SOS-PAGE adalah 9 kOa.Nilai kesalahan mutlak. penentuan berat molekul diperoleh dari hasilperbandingan berat molekul sampel pada pita tertentu dengan pita lainnya yangmemiliki jarak pergerakan 0.5 mm. Pada Lampiran 12. dapat dilihat contohperhitungan kesalahan mutlak pengukuran elektroforesis dengan SOS-PAGEdan Native-PAGE.

25



Tabel7. Referensi berat molekul subunit-subunit protein globulin 7S dan lISpada kedelai.

No. Literatur Berat Molekul Berat MolekulGlobulin 7S Globulin llS1. Nielsen, N. C . 1985 - A= 38 - 48 kDaDaJam Shibles, R., 1985 B = 20kDa2. Murphy, P. A 1985 dalam Shibles, R. a =57kDa A = 42,37 dan 10 kDa

1985 a' =57 kDa B = IOkDa~ =42kDaY =42kDa

3. El-Shemy, H. et al., 2001. a = 76kDa A =45 dan 38 kDaht!J ; !:Illwww. i sc l2ubs.oom a' =72kDa B = 22 kDa~ = 53 kDa

4. Tanh & Shibasaki, 1978 daJam Ral1et a =57kDa A= 37 - 42 kDaet al., 1996 a' =57kDa B = 17 - 20 kDa

~ =42kDa5. Tanh & Shibasaki, 1977 dalam a =72kDa -

Utsumi et a.. 1997 u' =68kDa~=52kDa

6. Utsumi et al., 1997 daIam Damodoran - A= 35 kDa& Paraf, 1997 B = 20kDa7. Catsimpoolas, 1971 dalam Rallet etal., - A= 37 - 42 kD a1996 B= 17-20kDa8. Badley et aI., 1975 daJam Gottschalk, - A= 34.8 kDa1985 B = 17 - 20 kDa

Untuk lebih jelasnya basil yang diperoleh pada globulin 7S pada kedelaidibandingkan dengan referensi dapat dilihat pada Tabel 8. sedangkan padakomak dapat dilihat pada Tabel 9.

Tabel8. Berat molekul subunit-subunit protein globulin 7S pada kedelai,Subu Kedelai Ref , - Selisih Kedelai Ref: SeJisihnit lokal (kDa) (kDa) Impor (kDa) (kDa)(kDa) (kDa)a. 57 57 0 59 57 2*a' 51 57 6* 59 57 2*P 20 42 22 20 42 22

"Tanh dan Slubasa]t i 1977 (dalam Utsumi eI al.,1997)" T a n h da n Shibasaki 1978 (dalam Rallet eI al., 1996); Murphy, 1985" 'S el is ih m a s ih d al am b a ta s k es al ah a n m W l ak p en en tu an herat m o le ku l (9 kDa)

26



Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa berat molekul yang diperolehdibandingkan dengan referensi memiliki nilai yang masih dibawah batas nilaikesalahan mutlak. Begitu pula balnya dengan hasil yang diperoleh pada komak,seperti terlihat pada Tabel 9.

Tabel9. Berat molekul subunit-subunit protein globulin 78 pada kornakSubu Komak Ref. Selisih Komak Ref. Selisihnit DL-40 (kDa) (kDa) DL-S8 (kDa) (kDa)(kDa) (kDa)a 64 51b 1* 64 51b 1*r : t 58 51b 1* 51 51b 1*~ 41 42b 1* 40 42 b 2*

"Tanh dan Shibasaki 1978 dalam Rallet et 0 1 . 19 9 'M 1985, 6), urphY ."'Selisih masih dalam batas kesalahan mml a k pementuan berat moldrul (9 kDa)

Berdasarkan Gambar 3. dapat dilihat bahwa pola elektroforesis 8DS-PAGE globulin 78 dan 118 pada kornak dan kedelai memiliki perbedaan yaituterletak pada berat molekul subunit J 3 yang lebih keeil pada kedelai dan subunita pada komak memiliki berat molekul yang relatiflebih besar daripada kedelai.

Pada globulin 118 kedelai lokal terdapat dua subunit asam yaitu 28 dan26 kDa dan dua subunit basa yaitu 20 dan 14 kDa sedangkan pada kedelai importerdapat satu subunit asam yaitu 29 dan dua subunit basa yaitu 21 dan 14 kOa.Komak 01..,..40memiliki dua subunit asam yaitu 35 kDa dan 25 kDa dan duasubunit basa yaitu 17 dan 13 kOa. Pada kornak 01..,..58juga memiliki dua subunitasam dan dua subunit basa tetapi berat molekul yang diperoleh berbeda yaitu 35dan 27 kDa untuk subunit asam serta 17 dan 12 IDa untuk subunit basa, Hal inisejalan dengan Badley et al., 1975 (dalam Gottschalk, 1985) yang menyatakanbahwa globulin liS memiliki subunit asam dengan berat molekul pada 34.8 kDadan subunit basa pada kisaran 17 - 20 kOa.

Hasil yang diperoleh pada globulin 118 tersebut menunjukkan bahwaterdapat perbedaan antara pola elektroforesis 8DS-PAGE pada subunit globulinlIS kedelai dengan kornak. Perbedaan terletak pada berat molekul subunit asamdan basa pada kedelai yang relatiflebih keeil dibandingkan dengan kornak.

27



Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa berat molekul yang diperolehdibandingkan dengan referensi memiliki nilai yang masih dibawah batas nilaikesalahan mutlak. Begitu pula halnya dengan ha s i l yang diperoleh pada kornak,seperti terlihat pada Tabel9.

Tabel9. Berat molelrul subunit-subunit protein globulin 7S pada kornakSubu Komak Ref. Selisih Komak Ref. Selisihnit DL-40 (kDa) (kDa) DL-58 (kDa) (kDa)(kDa) (kDa)a 64 57b 7* 64 57b 7*a' 58 57b 1 * 57 57b 1 *~ 4 1 4 2 b 1 * 4 0 4 2 b 2 ' * '

"Tanh dan Shibasaki 1978 dalam Rallet et ol., 1996 ; M ,1985) urphy*Selisih masih dalam batas kesalahan mutlak pcnentuan bent molekul (9 kDa)

Berdasarkan Gambar 3. dapat dilihat bahwa pola elektroforesis SDS-PAGE globulin 7S dan 118 pada kornak dan kedelai memiliki perbedaan yaituterletak pada berat molelrul subunit J 3 yang lebih kecil pada kedelai dan subunite x pada kornak memiliki berat molekul yang relatiflebih besar daripada kedelai.

Pada globulin II kedelai Iokal terdapat dua subunit asam yaitu 28 dan26 kDa dan dua subunit basa yaitu 20 dan 14 kDa sedangkan pada kedelai importerdapat satu subunit asam yaitu 29 dan dua subunit basa yaitu 21 dan 14 kOa.Kornak D1..-40 memiliki dua subunit asam yaitu 35 kDa dan 25 kDa dan dnasubunit basa yaitu 17 dan 13 kOa. Pada komak D1..-58juga memilik.i dua subunitasam dan dna subunit basa tetapi berat molekul yang diperoleh berbeda yaitu 35dan 27 kDa untuk subunit asam serta 17 dan 12 kDa untuk subunit basa. Hal inisejalan dengan Badley et al., 1975 (dalam Gottschalk, 1985) yang menyatakanbahwa globulin lIS memiliki subunit asam dengan berat molekul pada 34.8 kDadan subunit basa pada kisa ran 17 - 20 kDa.

Hasil yang diperoleh pada globulin II S tersebut menunjukkan bahwaterdapat perbedaan antara pola elektroforesis SDS-PAGE pada subunit globulin118 kedelai dengan kornak. Perbedaan terletak pada berat molekul subunit asamdan basa pada kedelai yang relatif lebih kecil dibandingkan dengan komak.

27



Pada Tabel 10. dapat dilihat basil SDS-PAGE pada globulin lIS padakedelai dibandingkan dengan referensi Sedangkan pada kornak dapat dilihatpada Tabel 11. Pada tabel tersebut dapat dilihat bahwa berat molekul yangdiperoleh masih dalam batas kesalahan mutlak pengukuran berat molekul (9kDa).

Tabel 10. Berat molekul subunit-subunit protein globulin II Spada kedelai.Sub Kedelai Ref.b Selisih Kedelai Ref.b Selisihunit Lokal (ltDa) (ltDa) Impor (ltDa) (ltDa)(ltDa) (ItO a)

Asaro 1 28 37 9* 29 37 8*Asaro 2 26 37 11 - - -Bas a 1 20 20 0* 21 20 1*

Bas a 2 14 20 6* 14 20 6*'Tanh dan Shibasaki 1978 dalam RaDetet 01., 1996 .M 1985). U Iph y ,*Selisih masih dalam batas kesa1ahan pengukuran bent mold ru J . (9 IDa)

Tabel l l. Berat molekul subunit-subunit protein globulin Ll S pada kornak.Sub Komak Ref ." Selisib Komak R e f : SelisihD1.-4O DL-58unit (ltDa) (ltDa) (ltDa) (kDa) (ltDa) (ltDa)Asam 1 35 31 2* 35 37 2*Asam2 25 37 12 27 37 10Rasa 1 1 7 20 3* 11 20 3*Basa2 13 20 1 * 12 20 8*

'Tanh dID . Shihasaki 1978 dIlam RaIlel et at I 1985 996). Murphy.*Selisih mas i h dalam batas kesa lahan pengukuran berat m o lc ku l (9 ID a)

B. Native-PAGE

Metode Native-PAGE digunakan untuk mengetahui berat molekul alamiprotein. Pada elektroforesis Native-PAGE, sampel tidak mengalami denaturasikarena dapat mengakibatkan ikatan pada struktur sekunder protein mengalamidestruksi. Hal ini akan menyebabkan perubahan konformasi alami proteinsehingga berakibat pula pada berat molekul yang diperoleh. Oleh sebab itu

28



faktor-faktor yang mempengaruhi denaturasi harus dihindarkan, Beberapa faktoryang dapat mengkibatkan denaturasi antara lain : perubahan pH (tidak padakisaran pH 4 - 8). pernanasan lebih dari SOC dan efek-efek lain seperti radiasi,adanya agen pereduksi dan lain-lain (Reithel, 1967), perubahan konsentrasi iondan adanya hidrolisis seeara kimiawi atau enzimatik (Alais, 1991).

Dasar pemilihan konsentrasi gel pada metode ini sarna seperti pada SDS-PAGE. Perbedaannya terletak pada konsentrasi akrilamid gel yang digunakan.Pada SDS-PAGE digunakan konsentrasi gel akrilamid lebih besar, dimanaukuran porinya lebih kecil, sedangkan pada Native-PAGE digunakan konsentrasigel akrilamid yang lebih kecil sehingga dapat diperoleh pori gel yang lebihbesar.

Menurut Boyer (1993) gel dengan konsentrasi akrilamid 7.S % dapatmemisahkan protein dengan berat molekul pada kisaran 10 - 1000 leDa, tetapiresolusi paling baik pada kisaran 30 - 300 leDa. Sementara itu berat molekulglobulin 7S dan 11 S yang akan dipisahkan memiliki berat molelrul pada kisaran150 - 175 leDa untuk globulin 78 (Tanh & Shibasaki 1978 dalam Rallet et al.,1996) dan 350 kDa untuk globulin 11S (Catsimpoolas et al., 1971 dalam Rallet etal " 1996). Oleh karena itu dipilib konsentrasi akrilamid sebesar 6 % yangdiharapkan dapat memisahkan protein dengan berat molekul tersebut. Namunpada penelitian ini dilakukan pula elektroforesis pada konsentrasi akrilamid 12%. Temyata hasilnya tidak dapat memisahkan protein dengan baik. Hasilelektroforegram konsentrasi akrilamid 12% dapat dilihat pada Lampiran 6.

Standar berat molekul yang digunakan adalah penanda protein HMW-Native (High Molecular Weight-Native) yang terdiri dari lima protein yaituthyroglobulin (BM : 669 kD). ferritin (BM : 440 l eD) , catalase (BM : 232 kD).lactose dehydrogenase (BM : 140 kD) dan albumin (BM : 66 kD). Penentuanberat molekul sampel dihitung dar i ekstrapolasi kwva standar yang dapat diearidari hubungan antara mobilitas elektroforetik (Rf) dengan logaritma dari beratmolekul (Log BM).

Pada Gambar 5. berikut ini ditampilkan elektroforegram Native-PAGEpada konsentrasi akrilamid 6 %. Dari gambar tersebut dapat dilihat pola

29



elektroforesis globulin 78 dan lIS pada kornak tidak berbeda nyata dengan polaglobulin pada kedelai, Penentuan pita protein didasarkan pada ketebalannya.

K ete ran gan :1=globulin 7S kedela i lokal2 = = globulin 7S kedelai impor3=globulin 1S kornak DL-404 =globulin 1S kornak DL-58

5 = globulin II S kedelai lokal6 = globulin 11S kedelai impor1 =globulin liS karnak DL-408 = globulin liS kornak DL-58

Gambar 5. Elektroforegram Native-PAGE dengan konsentrasiakrilamid 6%

Persamaan regresi yang diperoleh yaitu y =~1.0987x + 2.9575 dengan t'sebesar 0.9157. Knrva s tandar dapat dilihat pada Gambar 6. berikut ini Nilaikoefisien determinasi contoh (c) yang rendah disebabkan karena adanyaperbedaan bentuk molekul protein ketika elektroforesis berlangsung, sehinggapergerakan sampel tidak seragam. Perbedaan bentuk molekul ini disebabkankarena tidak adanya denaturasi protein sampel, sehingga protein dipisahkandalam bentuk konformasi alaminya yang tidak seragam.Tabell2. Hubungan Rfdengan Log BM pada konsentrasi akrilamid 6 %

Rf BM LogBMmarker(x) marker (y)0.130 669 2.8250.280 440 2.6430.530 232 2.3650.890 140 2.1460.890 66 1.820

30



0.5Rf 1

I3

2.5i 28 ' 1.5...I 1

0.500

Kurva Stan dar

~ y=-1.0987x + 2.9575

R2= 0.9157

Gambar 6. Kurva standar Native-PAGE padakonsentrasi akri1amid 6 %.

Hasil menunjukkan bahwa globulin kaeang karnak dengan kaeangkedelai mempunyai pita dengan berat molekul yang berbeda yaitu pada globulin78 kaeang kedelai lokal sekitar 95 kDa, kedelai impor 158 kDa, sedangkankacang kornak DL-40 sekitar 183 kDa dan kornak DL-58 sekitar 175 kOa.

Hasil tersebut sesuai dengan Tanh & 8hibasaki (1978 dalam RaUet et al.,1996) berat molekul globulin 78 berada pada kisaran 150 - 175 kD, dimanastruk:tur molekulemya merupakan trimer yang dibentuk dari 3 subunit (u,a' dan( 3 ) yang disatukan dengan ikatan kovalen. Kombinasi trimer dari subunit-subunittersebut dapat berbeda-beda. Selain itu dapat pula terjadi agregasi dari subunit-subunit tersebut membentuk ~ongJycinin dengan berat molekul 140 kD(Petrucelli & AD.on, 1996). Hasil yang diperoleh tersebut menunjukkan bahwatidak ada perbedaan nyata antara pola elektroforesis Native-PAGE pada globulin7S kedelai dengan komak.

Globulin lIS kacang kedelai menunjukkan pita dengan berat molekul220 kDa untuk kedelai lokal dan 243 kDa untuk kedelai impor. Pada kaeangkomak. DL-40 adalah 263 kOa dan komak DL-58 adalah 256 kOa. MenurutMwphy (1985) globulin 118 merupakan protein oligomer yang terdiri dari 6subunit asam dan 6 subunit basa yang disatukan dengan ikatan disulfida menjadibentuk hexagonal. Kompleks Asam-Basa dari molekul globulin 118 memilikiberat molekul yang bervarlasi. Pada Tabel 14. dapat dilihat terdapat kompleks

31



Asam-Basa yang memiliki berat molekul 37 kOa yang jika rnernbentukkonformasi (AB :h> maka berat rnolekulnya adalah 222 kOa.

Berat molekul protein alami globulin liS pada kornak DL-40 dan DL-58memiliki nilai yang masih dalam batas kesalahan mutlak penentuan beratrnolekul dengan Native-PAGE seperti terlihat pada Tabel 10. Kesalahan mutlaktersebut masih diperbolehkan sebesar 58.96 kDa. Contoh perhitungannya dapatdilihat pada Lampiran 12.

Pada globulin 11S dapat terjadi polimorfisme dari komposisi subunit-subunit yang menyusunnya. Molekul glyctnin (globulin II S) memiliki gabungansubunit asam dan basa yang bervariasi dan tidak ketat. Menurut lkunori (1983)kombinasi antara subunit asam dan basa tidak dapat didefinisikan, tetapi formasidari masing-masing subunit dapat terjadi secara luas. Dengan demikian adakemungkinan terjadi konformasi subunit asam dan basa yang berbeda-bedamembentuk glycinin dengan berat molekul sekitar 200 kD melihat berat molekulsubunitnya yang rendah.

Tabel13. Berat molekul protein alami (native) globulin 78 dan lIS..Jenis Glob. 78 Ref." 8elisih Glob. lIS Ref" SelisihKaeang (kDa) (kDa) (kDa) (kDa) _fld)a) ..(kI!_alKedelai 95 150-175 55* 230 222 18*LokalKedelai 158 150-175 0 247 222 25*Imp orKomak 183 150-175 8* 265 222 43*DL-40Komak 175 150-175 0 255 222 33*DL-58'7anh dan S I u . " b a s a k i 1978 daWn Rallet dol., 1996 SSbemy dol., 2001);~wphy,1985SelWhmasili dalam batas ke s a J a b an mmlakpeagukuran baatmolekul (S&.96 kDa)

Pada Tabel 14. dapat dilihat beberapa referensi yang menyatakanperbedaan berat molekul konformasi protein pada globulin 7S dan lIS.Konformasi yang berbeda-beda tersebut disebabkan karena perbedaan komposisisubunit-subunit penyusunnya.

32



Tabel 14. Referensi berat rnolekul protein alami (native) globulin 7S dan lISpada kedelai

No. Literatur Berat Molekul Berat MolekulGlobulin 7S Globulin lIS1. Nielsen, N. C. 1985 - CAB)!?"360 kDa

daIam Shibles, R.. 19852. Murphy, P. A . 1985 dalam Kompleks = 150 - 250 kDa (AB)6= 300 - 400 kDa

Shibles, R. 1985 A.A=57kDaAu,s.b = 57 kDaA2B. . = 57kDaA3B4= 62 kDaA,B3 = 30kDaUnknown = 37 kDa

3. El-Shemy. H. e t a l., 2001. Kompleks = 150 - 175 kDa -http://lwww.iscpubs.com4. Tanh & Shibasaki, 1978 dalam Kompleks = 150-175kDa (AB)IF 350 kDa

Rallet e t a J.. 19965. Tanh & Shibasaki, 1978 dalam Kompleks = 150 - 200 kDa -U t s um i e t a ., 19976. Utsumi e t a J. 1997 dalam - (AB)6= 300 - 380 kDaDamodoran & Paraf, 1997

c. Konformasi Alami Globulin 78 dan 118 Kacang KomakKonfonnasi aJami globulin 7S memiliki bentuk trimer, yang terdiri dari

subunit a, a', da n f 3 . Tanh dan Shibasaki (1978 di dalam Utsumi et al., 1997)dapat mengisolasi enam spesies molekuler {:konglycinin dari kedelai dengankomposisi subunit a'f32, af32, aa'{3, al{3, a2a', dan al.

Beberapa konformasi dugaan yang mungkin terjadi pada kornak dapatdilihat pada Tabel15. Konformasi dugaan ini dicari dengan menjumlahkan beratmolekul subunit-subunit yang menyusun konformasi tersebut yang dibandingkandengan berat molekul berdasarkan Native-PAGE. Selisih yang masihdiperbolehkan adalah sekitar 58.96 kDa.

33
http://lwww.iscpubs.com/http://lwww.iscpubs.com/



Tabel 15. Konforrnasi dugaan globulin 78 pada kornakJenis Konformasi BM Berdasarkan BM Berdasarkan SelisihKonformasi Native-PAGEKacang Dugaan (kDa) (kDa) (kDa)Komak a'Pl 140 183 43*DL-40 aPl 146 183 37*aa'p 163 183 20*

alP 169 183 14*ala' 186 183 3*192 183 9*a)Kornak a'Pl 138 175 37*DL-58 ap2 144 175 31*

aa'p 162 175 13*alP 168 175 7*a2a' 186 175 11*192 175 17*a)

.."'SeitSlh masih dalam hatas kesalahan mutlak pengukuran berat moJekul (58.96 kDa)

Berdasarkan Tabel 15. komak DL-40 rnemiliki konformasi dugaanbe rupa a'i32, ai32,aa'p, alP, ala', dan a) dengan berat molekul mas ing -mas ingkonformasi seeara berturut-turut adaJah 140. 146, 163. 169, 186 dan 192 kDa.Selisih antara berat mole1ru1 konformasi dugaan dengan berat molekul yangdiperoleh pada native menunjukkan nilai yang masih dalam batas kesalahanmutIak penentuan berat molekul dengan Native-PAGE. Konformasi dugaanyang paling mungkin adalah yang memiliki selisih berat molekul yang palingkeeil yaitu. konformasi ala'.

Pada kornak DL-58 diperoleh enam konfonnasi dugaan yang mungk i nmenyusun globulin 78.Konformasi tersebut adalah a'i32:,alh, aa'p, alP, ala',dan a 3. Berat molekuI konformasi dugaan secara berturut-tmut adalah 138, 144,162, 168, 186 dan 192 kDa . Selisih berat molekul konfonnasi yang didugadengan berat molekul yang diperoleh dari Native-PAGE menunjukkan nilai yangmasih dalam batas kesalahan mutlak penentuan berat molekul. Konformasi yangpaling mungkin pada komak DL-58 sama seper t i pada komak DL-58 yaitu ala'.

Globulin 118 (glyeinin) memiliki konformasi alami berupa hexagonalyang terdiri dari enam subunit asam dan enam subunit basa (AB)6. Konformasisubunit asam dan basa tersebut saling berseling. Molekul glycinin memiliki

34



gabungan subunit asam dan basa yang bervariasi dan tidak ketat. MenurutIkunori (1983) kombinasi aotara subunit asam dan basa tidak dapatdidefinisikan, tetapi formasi dari masing-masing subunit dapat terjadi secaraluas.

Tabel16. Konformasi dugaan globulin lIS pada kornak

Jenis Konformasi BM Berdasarkan BM Berdasarkan SelisihKonformasi Native-PAGEKacang Dugaan (kDa) (kDa) (kDa)Komak (AtBI)6 312 259 53*DL-40 (AIBz)6 288 259 29*(AzBI)6 252 259 7*

( A z B z k ; 228 259 31*Komak (A1B1)6 312 256 56*DL-58 (AIBz)6 282 256 26*(AZBl)6 264 256 8*( A z B z ~ 234 256 22*..* Sehsih masih dalam batas kesalahan mutlak:pengukuran berat mo1ekul (58.96 kDa)Berdasarkan Tabel 16. beberapa konformasi yang mungkin pada globulin

118 komak DL-40 adalah (A1Blk. (AIB2~ (A~l~ dan (A2B2~ dengan beratmolelrul berturut-turut adalah 312, 288, 252 dan 228 kDa. Berat molelrul yangdiperoleh ini jib dibandingkan dengan berat molelrul yang diperoleh dariNative-PAGE memiliki selisih yang masih dalam batas kesalahan mutlakpengulruran berat molelrul. Pada. komak DL-58 memiliki konformasi yang samaseperti pada komak DL-40 tetapi berat molekulnya berbeda. Berat molekulsecara berturut-turut adalah 312, 282, 264 dan 234 kDa. 8elisih antara beratmolelrul konformasi dengan berat molekul yang diperoleh dari Native-PAGEmemiliki nilai yang masih dalam batas kesalahm mutlak pengulruran beratmolelrul.Model konformasi dugaan globulin 78 (Jj-conglycinin) pada komak DL-40dan komak DL-58 dar i subunit-subunitnya dapat dilihat pada Gambar 7.

35



a'~

r ; T : \ r ; T : \ ~ r : T a " \~ ~ ~ ~

aa'p ~a'

Gambar 7. Model konformasi Globulin 7S (f3-conglycinin) padakornak DL-40 dan kornak DL-58

Tampakatas Tampak samping

Gambar 8. Model konfonnasi Globulin lIS (glycinin)pada komak secara umum.

Pada Gambar 8. dapat dilihat konformasi globulin l1S (g/ycinin) darikedelai secara umum yang diben:tu.k dad subunit-subunit asam dan basamemiliki konfonnasi dua bentuk hexagonal yang disusun saling bertu.mpuk(soy.htm). Sementara itu menurut beberapa hipotesa mengatakan bahwa bentukhexagonal tersebut terdiri dad subunit asam dan basa yang saling berseling.Sampai saat ini belum ditemukan konformasi dari agegasi tiap-tiap subunit asamdan basa. Namun menurut Ikunori (1983) konfonnasi dari tiap subunit tersebutdapat saja terjadi

36



v . KESIMPULAN DAN SARANA. Kesimpulan

Salah satu metode yang digunakan dalam karakterisasi protein adalahelektroforesis. Metode SDS-PAGE digunakan untuk mengetahui subunit-subunitpenyusun globulin sedangkan metode Native-PAGE digunakan untuk mengetahuiprotein alami dati globulin tersebut. Perbedaan metode SDS-PAGE denganNative-PAGE terletak pada perlakuan sampel yaitu mengalami denaturasi padaSOS-PAGE dan tidak mengalami denaturasi pada metode Native-PAGE.Perbedaan lainnya adalah penggunaan konsentrasi akrilamid dalam gel.Umumnya Native-PAGE menggunakan konsentrasi akrilamid yang lebih keeildari SDS-PAGE agar pori gel yang terbentuk berukuran besar. Hal ini disebabkankarena protein yang dipisahkan berukuran besar.

Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa globulin 7S kornak 01..-40memiliki berat molelrul sekitar 183 kOa. Sedangkan kornak 01..-58 memiliki beratmolelrull75 kDa. Diduga konformasi alami pada globulin 7S kornak 01..-40 dankornak 01..-58 sama yaitu a ' f 3 z , a f 3 z , aa.'p, a:2p, a:2a', dan al. Konformasi dugaanyang paling mungkin adalah a:2a' untuk kornak D1..-40 dan konformasi a:2puntukkornak D1..-50.

Globulin liS kornak DL-40 dan DL-58 memiliki konformasi dugaanyang sarna yaitu (AIBl)6, (Al~)6, (A:2Bl)6dan (A:2B:2)6engan berat molelrul yangberbeda yaitu berturut-turut adalah 312,288,252 dan 228 kDa untuk kornak DL-40 dan untuk komak DL-58 berturut-turut 312, 282, 264 dan 234 kOa.Konformasi dugaan yang paling mungkin adalah (A~I)6, karena memiliki selisihberat molekul dengan hasil Nativf>oPAGEyang paling keeil.

Dapat dis im pu lka n b ah w a h as i l analisa protein globulin 7S dan liS darikaeang k omak memiliki pola elektroforesis yang mirip dengan kedelai. Hal inidapat dilihat dari konformasi a1ami yang diperoleh sarna seperti pada kedelai.Dengan demikian kaeang kornak memiliki potensi untuk menggantikan kedelai.Namun perIu adanya karakterisasi protein yang lebih luas baik meliputi sifat

37



molekuler lainnya maupun sifat fuogsional, sehingga dapat dijadikan saran untukaplikasi di industri pangan.

B. Saran

Penelitian tentang pola elektroforesis globulin 7S dan 11S ini masih perludikembangkan. Beberapa saran yang dapat diberikan adalah :1. Dilakukan analisis konformasi globulin kornak dengan metode lain misalnyadengan Sinar X, sehingga dapat diketahui dengan pasti kebenaran darikonformasi dugaan pada penelitian ini.

2. Analisis sifat fungsional sehingga dapat diketahui pengaruh konformasiterhadap sifat fungsional dominan pada kornak.

38



DAFTAR PUSTAKA

Alais, C. dan G. Linden. 1991. Food Biochemistry. Ellis Horwood. New York.Allen, O. N. dan Ethel K A. 1981. The Leguminosae : A Source Book of

Characteristic, Uses and Nodulation. The University of Wisconsin Press.,Madison.

Badley, R.A, D. Atkinson, H. Hauser, D Oldani, 1 . P. Green, dan 1. M. Stubbs.1975. The Structure, physical and chemisal properties of soybean proteinglycinin.Di dalam : Ikunori, K 1983. Storage Protein of Soybean. SeedProtein Biochemistry, Genetic, Nutritive Value (Gottschalk, W. dan H. P.Muller (Ed.j), Martinus NijjhoflDR Junk Publishers. The Hague, Boston,London.

Bailey, P. D . 1992. An Introduction to Peptide Chemistry. John Willey and Sons.Chichester, New York.Bo11ag, D. M. dan S. 1. Edelstein. 1991. Protein Methods. Willey-Liss Inc., NewYork.Boyer. R. F. 1993. Modem Experimental Biochemistry. Second ed. The Benjamin I

Cumming Pub. Co., Inc., California.Catsimpoolas, N., Kenney, 1 . A, Meyer, E. W. dan Szuhaj, B. F. 1971. Molecular

Weight and Amino Acid composition of Glycinin Subunit. Di dalam : Ralet,M. C. ,D. Fouques, T. Chardot dan 1 . C. Meunier. Enzymatic Phosporylationby a Casein Kinase Il of Native and Succilynated Soy Storage ProteinsGlycinin and j}-conglicynin. 1. Agric. Food Chem. 1996,44,69 -75.

Campbell, W. H 1996, 1997, 1999, 2001, Polyacrylamid Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) for Proteins, wcambelmtu.edu.

Class. fst.ohio-state. edulFST8221LectureslSoy.htm.Copeland, R. A. 1994. Methods for Protein Analysis: A Practical Guide LaboratoryProtocol 3l'lied.Chapman and Hall New York, London.El-Shemy, H. A, S. H. Ahmed, H. Saneoka, and K Fujita. 2001.

http://lwww.ic!jpubs. com,Hames, B. D. dan D . Rickwood 1981. Gel Electrophoresis of Protein a Practical

Approach. IRL Press. Oxford. Washington DC.

39



Hinggins, T. J. V. 1984. Synthesis and Regulation of major Protein in Seeds. DiDalam: Purnamasari, V. 2002. Karakterisasi Protein Kacang Komak (Lablabpurpureus (L.) sweet) dan Kacang Benguk (Mucuna prupiens (L.) DC.).Tesis. Program Pascasarjana, IPB, Bogor.

Hirano, H., H. Kagawa, Y. Kamata dan F. Yamauchi. 1987. Structural homologyamong the major 7S globulin of soybean seed storage proteins. Di dalam :Utsumi, S., Y. Matsumura dan T. Mori. 1997. Structure-FunctionRelationship of Soy Proteins. Food Protein and Their Application(Damodoran, S. dan A. Paraf'(Ed.j), Marcel Dekker Inc., New York.

Ikunori, K. 1983. Storage Protein of Soybean. Di dalam : Seed Protein Biochemistry,Genetic, Nutritive Value (Gottschalk, W. dan H. P. Muller (Ed.j), MartinusNijjhof7DR Junk Publishers. The Hague, Boston, London.

John, M de Man PhD. 1997. Kimia Makanan. Penerbit ITB Bandung.Kay, E.D. 1979. Food Legumes. Tropical Products Institut, London.Muller, H. P. 1983. Di dalam : Seed Protein Biochemistry, Genetic, Nutritive Value(Gottshalk, W. dan H P. Muller (Ed.j), Martinus Nijjhof7DRJunk Publishers.

The Hague, Boston, London.Myers, C. 1988. Large Scale Processing of Plant Protein. Di dalam : Characterization

of Protein (Franks, F.(Ed.. Humana Press. Clifton, New Jersey.N U T , A. M. dan H Adijuwana. 1989. Teknik Pem i s a h a n dalam Analisis Biologi. \

PAU-IPB, Bogor.V Petrucelli, S. dan M. C. Anon. pH induced modifications in the thermal-stability oftsoybean protein isolates. 1. Agric. Food Chern. 1996,44,3005 -3009. v

Pomeranz, Y. dan C. L.Meloan. 1994. Food Analysis: Theory and Practice. 3rded.Chapman and Hall ITP an International Thomson Publ Co., New York.

Reithel, F. 1. 1967. Concept in Biochemistry. McGraw-Hill Book. Co., Inc., N ewYork.

Robert, E. A. 1985. Grain Legume Crops. Di dalam : Protein Albumin dan Globulindari Beberapa Jenis Koro-koroan di Indonesia (Subagio, A, W. S. Windratidan Y. Witono) Laboratorium Kimia dan Biokimia Hasil Pertanian. JurusanTeknologi hasil Pertanian. Fakultas Teknologi Pertanian. Universitas Jember,Jember.

Rybicki, E. dan M. Purves. 1996. 80S Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SOS- IPAGE). Di dalam : Molecular Biology Techniques Manual. 3rd ed. (Coyne, ;:V. E., M. D. James, S. J. Reid dan E. P. Rybicki (Ed.. http://web.uct. ac.zalmicrobiology/sdsp age.htm.

40



Sato, W., Y. Kamata, M. Fukuda, dan F. Yamauchi. 1984. Improve isolationmethods and some properties of soybean gamma-conglycinin. Di dalam ;Utsumi, S., Y. Matsumura dan T. Mori. 1997. Structure-FunctionRelationship of Soy Proteins. Food Protein and Their Application(Darnodoran, S. dan A. Paraf'(Ed.j), Marcel Dekker Inc., New York.

Tanh, V. H. dan K Shibasaki. Major Protein of Soybean Seeds. A StraightforwardFractionationand Their Characterization. 1. Agric. Food Chem., 1976, 6, 1117 /-1121. /

Tanh, V. H. dan Shibasaki, K 1977. Beta-conglycininfrorn soybean proteins. Didalam ; Utsumi, S., Y. Matsumura dan T. Mori. 1997. Structure-FunctionRelationship of Soy Proteins. Food Protein and Their Application(Damodoran, S. dan A. Paraf(Ed.. Marcel Dekker Inc., New York.

Tanh, V. H. dan Shibasaki, K 1978. Major Protein of Soybean Seeds. SubunitStructure of !3-conglicynin. Di dalam.: Ralet, M. C. , D. Fouques, T. Chardotdan 1. C. Meunier. Enzymatic Phosporylation by a Casein Kinase II of Nativeand Succilynated Soy Storage Proteins Glycinin and !3-conglicyoin. 1. Agric.Food Chern. 1996,44,69 - 75.

Tanh, V. H. dan Shibasaki, K 1978. Major Protein of Soybean Seeds. SubunitStructure of p-conglicynin. Dj dalam : Utsumi, S., Y. Matsumura dan T.Mori. 1997. Structure-Function Relationship of Soy Proteins. Food Proteinand Their Application (Damodoran, S. dan A. Paraf (Ed.j), Marcel DekkerInc., New York.

Utsumi, S., Y. Matsumura dan T. Mori. 1997. Structure-Function Relationship ofSoy Proteins.Di dalam : Food Protein and Their Application (Damodoran, S.dan A. Paraf(Ed.. Marcel Dekker Inc., New York.

Voet, D. 1., G. Voet dan G. W. Pratt. 1999. Fundamentals of Biochemistry. JohnWilley and Sons, Inc., New York.Wilson, K dan J. Walker. 2000. Principles and Techniques of Practical

Biochemistry. Fifth ed. Cambridge University Press.Yamauchi, F., K Sato dan T. Yamagishi 1984. Isolation and partial characterization

of a salt extractable globulin from soybean seeds. Di dalam : Utsumi, S., Y.Matsumura dan T. Mori. 1997. Structure-Function Relationship of SoyProteins. Food Protein and Their Application (Damodoran, S. dan A. Paraf(Ed.j), Marcel Dekker Inc., New York.

Yamauchi, F., W. Sato dan T. Kamata. 1985. Subunit structure of gammaconglycinin in soybean seeds. Di dalam : Utsumi, S., Y. Matsumura dan T.Mori. 1997. Structure-Function Relationship of Soy Proteins. Food Proteinand Their Application (Damodoran, S. dan A. Paraf (

pola elektroforesis protein globulin 7s dan 11s dari kacang komak

Documents