ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh:

Nama : Annisa Dwinda FatimahNIM : B1J011082Kelompok : 1 Rombongan : II Asisten : Marsekal Muhammad Karana

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2013

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Elektroforesis adalah sutu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas

ukurannya. Elektroforesis menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu

medium yang mengandung sempel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat

digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul,

misalnya DNA yang bermuatan negatif (Triwibowo, 2008). Menurut Winarno dan

Agustinah (2007) elektroforesis adalah suatu cara pemisahan campuran dan beberapa

senyawa dengan melakukan suspensi ke dalam air dan kemudian diberikan aliran

listrik. Gel yang ditempatkan ke dalam sumur elektroforesis yang mengandung

larutan buffer dan dialiri listrik, molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH

netral akan bergerak kearah positif. DNA bergerak melalui gel pada kecepatan yang

berbeda tergantung ukurannya.

Menurut Alberts et al. (2002), kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh

beberapa faktor, antara lain:

1. Ukuran molekul DNA. Semakin besar berat molekul DNA, maka semakin

cepat laju migrasinya

2. Konsentrasi agarosa. Semakin rendah konsentrasi agarosa, semakin cepat

laju migrasi DNA.

3. Konformasi DNA.

4. Voltase yang digunakan. Semakin tinggi voltase, semakin cepat laju

migrasi DNA.

5. Adanya etidium bromide di dalam gel

6. Komposisi larutan buffer.

Kualitas DNA dapat ditentukan oleh elektroforesis. Selain itu, elektroforesis

dapat digunakan untuk analisis protein (Alberts et al., 2002). Gel yang biasa

digunakan yaitu gel agarose dan gel poliakrilamida. Gel agarose untuk memisahkan

fragmen-fragmen DNA yang ukurannya mempunyai rentang ratusan hingga sekitar

20.000 pasangan basa. Gel poliakrilamida biasa digunakan untuk fragmen-fragmen

DNA yang lebih kecil (Old dan Primrose, 1989). 

Umumnya sampel dijalankan dengan bantuan matriks seperti kertas, selulose-

asetat, gel pati, agarosa atau gel poliakrilamid (Sigma, 1988). Pemisahan dibantu

dengan poliakrilamid atau agarosa, sesuai dengan Sigma (1988) yang menyatakan

bahwa agarosa dan poliakrilamid dapat digunakan untuk memisahkan molekul

berdasarkan ukurannya. Elektroforesis dilakukan melalui proses (a) running, untuk

menjalankan sampel melewati matriks (gel) sehingga dapat terpisah berdasarkan

bobot molekulnya, kemudian (b) fiksasi dengan menggunakan TCA untuk

memfiksasi zona hasil running, (c) pewarnaan untuk mewarnai zona tempat jalannya

sampel sehingga dapat dilihat hasil pemisahan berdasarkan bobot molekulnya

(Sigma, 1988).

B. Tujuan

Tujuan praktikum kali ini adalah untuk melakukan cara kerja elektroforesis

gel agarosa.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Bahan yang digunakan adalah DNA marker, sampel DNA buah, sampel DNA

bakteri, agarosa, larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial;

100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml), akuades,

Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe

4000; EDTA 120 mM), dan larutan Etidium Bromid (EtBr).

Alat yang digunakan adalah gelas ukur 1000 ml, labu erlenmeyer 50 ml,

tabung mikrosentrifuga, sarung tangan, seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-

Rad dan Axygen Scientific), kertas parafilm, seperangkat alat elektroforesis, UV

transluminator, kaca mata UV, dan kamera digital.

B. Metode

1. 500 ml larutan buffer TAE 1x dibuat dengan cara mencampurkan 10 ml TAE 50x

ke dalam 490 ml akuades.

2. Gel agarosa 1% dibuat dengan cara menimbang agarosa 0,6 g untuk dilarutkan ke

dalam bufer TAE 1x hingga volume 60 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga

larut sempurna.

3. Baki gel agarosa disiapkan, selotip dilekatkan di tiap ujung baki gel agarosa.

4. Sisir elektroforesis dipasang di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi

hampir menyentuh dasar baki.

5. Suhu larutan agarosa diperiksa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan,

jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-600C, ditambahkan 1 μl etidium

bromid.

6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian larutan dituangkan ke dalam

baki gel agarosa, larutan dibiarkan hingga berubah menjadi gel yang padat.

7. Sisir diambil dengan hati-hati, selotip dilepaskan dari ujung-ujung baki.

8. Baki yang telah berisi gel agarosa dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis

yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x.

9. Sekitar 5 cm kertas parafilm disiapkan di dekat tangki elektroforesis.

10. 10 μl sampel DNA dan 2 μl loading dye 6x dimasukkan ke dalam sumuran gel

agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara

merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.

11. Catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan

dibuat.

12. Kabel dihubungkan dari sumber arus ke tangki elektroforesis.

13. Sumber arus dinyalakan, voltase dan waktu running diatur hingga diperoleh

angka 100 V dan 40 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber

arus.

14. Elektroforesis dijalankan (running) dengan cara menekan tombol run pada

sumber arus.

15. Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang

ditandai oleh adanya bunyi alarm. Sumber arus dimatikan dan baki diangkat dari

tangki elektroforesis.

16. Gel dikeluarkan dan diletakkan di atas UV transluminator.

17. UV transluminator dinyalakan, pita-pita DNA yang tervisualisasi diamati.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

B. Pembahasan

Berdasarkan pengamatan didapatkan bahwa baik sampel DNA buah, maupun

sampe DNA E.coli menunjukkan hasil yang positif. Pita-pita DNA terlihat jelas pada

UV transiluminator. Hal ini menunjukkan bahwa telah terjadinya migrasi DNA oleh

proses elektroforesis. Molekul DNA yang bermuatan negatif bergerak ke arah positif

(Alberts et al., 2002). Pita DNA visualisasi hasil elektroforesis kemudian ditentukan

dengan membandingkan ukuran pita tersebut dengan marker. DNA marker

merupakan sekuens basa nukleotida dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan

untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan elektroforesis (Douaihy

et al. 2012).

Elektroforesis adalah sutu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas

ukurannya. Elektroforesis menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu

medium yang mengandung sempel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat

digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul,

misalnya DNA yang bermuatan negatif (Triwibowo, 2008). Menurut Winarno dan

Agustinah (2007) elektroforesis adalah suatu cara pemisahan campuran dan beberapa

senyawa dengan melakukan suspensi ke dalam air dan kemudian diberikan aliran

listrik. Gel yang ditempatkan ke dalam sumur elektroforesis yang mengandung

larutan buffer dan dialiri listrik, molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH

netral akan bergerak kearah positif.

DNA bergerak melalui gel pada kecepatan yang berbeda tergantung

ukurannya. Kualitas DNA dapat ditentukan oleh elektroforesis. Selain itu,

elektroforesis dapat digunakan untuk analisis protein (Alberts et al., 2002). Menurut

Clark and Switzer (1977) sistem gel elektroforesis memiliki beberapa keuntungan

tersendiri, yaitu: (1) mempunyai daya pemisah yang lebih besar, (2) besarnya pori

dapat diatur dengan menggunakan kadar bis akrilamid, (3) dapat digunakan untuk

preparatif protein. Aspek ini merupakan bagian penting, sebab gel dapat

mempertinggi fraksi yang mengatur pergerakan elektroforesis. Menurut Alberts et al.

(2002), kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor, antara lain:

1. Ukuran molekul DNA. Semakin besar berat molekul DNA, maka semakin cepat

laju migrasinya

2. Konsentrasi agarosa. Semakin rendah konsentrasi agarosa, semakin cepat laju

migrasi DNA.

3. Konformasi DNA.

4. Voltase yang digunakan. Semakin tinggi voltase, semakin cepat laju migrasi

DNA.

5. Adanya etidium bromide di dalam gel

6. Komposisi larutan buffer.

Proses elektroforesis membutuhkan agar atau gel sebagai medium untuk

pemisahan DNA. Ada dua tipe gel dalam proses elektroforesis yaitu agarosa dan

poliakrilamid. Selain itu, gel pati juga dapat digunakan untuk proses elektroforesis.

Gel pati berasal dari kentang yang fungsinya adalah untuk memisahkan protein.

Keuntungan dari memakai gel pati ini adalah dapat diketahui sifat proteinnya, baik

netral, asam, maupun basa (Sambrook et al., 1989). Perbedaan gel agarosa dan gel

poliakrilamid yaitu gel agarosa untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang

ukurannya mempunyai rentang ratusan hingga sekitar 20.000 pasangan basa,

sedangkan gel poliakrilamida biasa digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang

lebih kecil (Old dan Primrose, 1989). Selain itu, gel poliakrilamid pembuatannya

lebih sulit dan DNA bergerak secara vertikal, berbeda dengan gel agarosa yang

DNAnya bergerak secara horizontal. Sedangkan, gel pati letak sisirnya berada di

tengah, berbeda dengan gel agarosa dan sel pati (Sambrook et al., 1989).

Gel agarose adalah koloid alami yang diekstrak dari rumput laut. Gel agarose

memiliki pori berukuran besar dan kegunaan utamanya untuk memisahkan molekul

yang sangat besar dengan berat molekul lebih dari 200 kiladalton (Sambrook et al.,

1989). Posisi molekul yang terseparasi dapat dilihat dengan pewarnaan gel. Untuk

mendeteksi potongan-potongan DNA berupa larik DNA pada gel agarose digunakan

pewarna yang mengandung fluorescen dengan konsentrasi rendah seperti ethidium

bromide (EtBr) (Fatchiyah, 2006). Besar kecilnya pori-pori pada agarose ditentukan

oleh konsentrasinya, makin tinggi konsentrasi agarose, maka makin kecil pori yang

terbentuk. Pori-pori ini berfungsi sebagai saringan molekul, dimana migrasi fragmen

DNA yang besar akan lebih lambat daripada fragmen yang lebih kecil (Fatchiyah,

2006).

Gel poliakrilamida terbentuk tanpa pemanasan, melainkan dengan

pencampuran larutan akrilamida dengan ammonium sulfat dan TEMED (N,N,N’,N’-

tetramethylethylenediamine). Pencampuran ini akan mengakibatkan monomer

akrilamida mengalami polimerisasi menjadi rantai panjang. Penambahan senyawa

lain N,N’-methylene bis-akrilamida (bis-akrilamida) di dalam proses polimerisasi,

terbentuk cross-linker antar rantai panjang sehingga terbentuk gel yang tingkat

porositasnya ditentukan oleh panjang rantai dan derajat penyilangan antar rantai

(cross-link). Panjang rantai polimer akrilamida ditentukan oleh konsentrasi

akrilamida di dalam reaksi polimerisasi (antara 3.5% dan 20%). Senyawa bis-

akrilamida yang berfungsi sebagai cross-linker ditambahkan dengan perbandingan

1:29 terhadap akrilamida (Muladno, 2002). Elektroforesis gel poliakrilamida

dilakukan pada posisi vertikal. Gel poliakrilamida memiliki tiga keuntungan yaitu:

(1) resolusi dalam pemisahan molekul DNA jauh lebih tinggi sehingga panjang

molekul DNA yang berbeda hanya satu nukleotida dapat dideteksi, (2) gel

poliakrilamida dapat menampung jumlah DNA yang lebih besar daripada gel agarose

dan (3) DNA yang diekstrak dari gel poliakrilamida bersifat sangat murni dan dapat

digunakan untuk analisis lebih lanjut (Muladno, 2002).

Media yang digunakan dalam elektroforesis umumnya dibuat dari gel agarosa

atau gel poliakrilamid. Gel agarosa merupakan polimer dengan struktur dasar

Ggalaktosa dan 3,6-anhidro-L-galaktosa yang diperoleh dari ganggang laut. Gel

agarosa memiliki daya pisah yang lebih rendah dibandingkan gel poliakrilamid,

tetapi mempunyai rentang pemisahan yang lebih besar. Gel agarosa dapat

memisahkan DNA yang berukuran 20 basa sampai 50 kilobasa pada konsentrasi gel

yang berbeda (Sudjadi, 2008). Konsentrasi agarosa yang sering dipakai berkisar

antara 0.8-1.5%. Konsentrasi gel yang sangat encer (0.1-0.2%) dapat meningkatkan

daya pisah elektroforesis tetapi hal tersebut sulit dilakukan karena gel yang encer

sangat mudah pecah. Gel agarosa dilarutkan dalam suatu senyawa buffer. Buffer

yang umum digunakan adalah bufer Tris-Acetic:EDTA (TAE). Buffer TAE

memungkinkan DNA dapat bergerak secara perlahan dalam gel sehingga DNA

tersebut akan terpisah. Buffer TAE juga berfungsi dalam optimalisasi pH dan

konsentrasi ion di dalam gel sekaligus sebagai konduktor arus listrik yang

memungkinkan arus dapat mengalir dalam gel. Senyawa Tris yang terkandung dalam

larutan TAE berfungsi mempertahankan konsentrasi pH larutan. Larutan EDTA yang

terdapat dalam buffer TAE berfungsi mengkelat kation divalent magnesium (Mg2+)

yang mungkin terkandung dalam suspensi DNA (Hartanti 2009).

Sampel DNA yang akan dielektroforesis ditambahkan loading dye yang

berperan sebagai buffer dan pemberat agar DNA dapat tertahan di dalam gel dan

bermigrasi. Selain sampel, dimasukkan juga penanda (marker) dalam sumur gel.

Penanda DNA telah diketahui jumlah pasangan basanya, berfungsi sebagai

pembanding untuk DNA yang diukur. Bila posisi pita DNA sejajar dengan DNA

penanda maka dapat dikatakan memiliki jumlah pasangan basa yang sama.

Pewarnaan DNA di dalam gel agarosa dilakukan dengan menggunakan larutan

etidium bromida (EtBr). Senyawa EtBr bersifat karsinogenik yang dapat

menyebabkan kanker bila terpapar pada kulit (Husniyati, 2012).

Baru-baru ini, elektroforesis resolusi tinggi (HRE) telah diusulkan sebagai

teknik elektroforesis untuk diterapkan pada cairan dengan protein konsentrasi rendah

seperti urin atau cairan cerebrospinal. HRE adalah elektroforesis zonal pada protein

yang bermigrasi berdasarkan ukuran, volume, dan massa. HRE berbeda dari AGE

standar (teknik rutin digunakan dalam serum) dengan menggunakan buffer lebih basa

(pH 8.6 vs 8,5), kandungan barbital yang berbeda (0,18% vs 0,61%), dan tegangan

yang berbeda per jam (40 V / jam vs 36 V / jam) pada 20 ° C. Kondisi analisis yang

berbeda menyebabkan pemisahan globulin yang lebih baik dibandingkan dengan

teknik standar elektroforesis. Selain itu, HRE dapat sepenuhnya otomatis dan kurang

memakan waktu, lebih standar, dan lebih murah dari SDS-USIA (Giori et al., 2011).

IV. KESIMPULAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan

bahwa:

1. Elektroforesis adalah sutu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas

ukurannya. Elektroforesis dilakukan melalui proses running untuk menjalankan

sampel melewati matriks (gel) sehingga dapat terpisah berdasarkan bobot

molekulnya, kemudian pewarnaan untuk mewarnai zona tempat jalannya sampel

sehingga dapat dilihat hasil pemisahan berdasarkan bobot molekulnya.

2. Pita-pita pada sampel DNA buah dan E.coli terlihat jelas pada UV

transiluminator yang menunjukkan adanya migrasi DNA. Namun, tidak semua

kelompok menunjukkan hasil yang sama.

B. Saran

Untuk praktikum selanjutnya sebaiknya lebih diperjelas kembali bagaimana

menentukan hasil praktikumnya.

DAFTAR REFERENSI

Alberts, B., A. Johnson., J. Lewis., M. Raff., K. Roberts dan P. Walter. 2002. Molecular Biology of The Cell. Fourt Edition. Garland Science, a member of the taylor and Francis Group 29 west 35th, New York.

Clark, J. M. Jr and R. L. Switzer. 1977. Eksperimental Biochemestry. Second edition W. H. Freeman and Company San Fransisco. p. 45 - 50.

Douaihy B, Sobierajska K, Jasin´ska AK, Boratyn´ska K, Tolga O, Romo A, Machon N, Didukh Y, Dagher-Kharrat MB and Boratyn´ski A. 2012. Morphological versus molecular markers to describe variability in Juniperus excels subsp. exclsa (Cupressaceae). AoB Plants. 1-14.

Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Laboratorium Sentral Biologi Molekuler & Seluler. Universitas Brawijaya, Malang.

Giori, L., Tricomi, F. M., Zatelli, A., Roura, X., & Paltrinieri, S. 2011. High-resolution gel electrophoresis and sodium dodecyl sulphate–agarose gel electrophoresis on urine samples for qualitative analysis of proteinuria in dogs.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 23(4), 682-690.

Hartanti. 2009. Analisis abnormalitas pada kelapa sawit dengan random amplified polymorphic DNA (RAPD) [laporan praktik lapang]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Husniyati, T. 2012. Analisis Variasi Genetik Populasi Tanaman Karet (Hevea brasiliensis) Sumber Eksplan untuk Perbanyakan in vitro Berdasarkan RAPD. Skripsi. Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation. Bogor.

Old, R.W dan S.B. Primrose. 1989. Prinsip-prinsip Manipulasi Gen. Blackwell Scientific Publications, London.

Sambrook, J., F. Fritsch, & T. Miniatis. 1989. Molecular Cloning Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Sigma Chemical Company. 1988. SDS Molecular Weight Marker in Discontinous Buffer. Techinal Bulletin. MWS-877L.

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta, Kanisius.

Triwibowo, Y. 2008. Biologi Molekuler. Erlangga, Jakarta.

Winarno dan W. Agustinah. 2007. Pengantar Bioteknologi. M-Brio Biotekindo Press, Bogor.