disertasi - repository.unair.ac.idrepository.unair.ac.id/32149/2/full text.pdf · (studi...

DISERTASI

MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L) TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA

MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS

(Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel)

SRI HERNAWATI

PROGRAM STUDI S3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA 2012

Diterbitkan untuk Ujian Tahap II (Terbuka) ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga

Disertasi MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ... SRI HERNAWATI

DISERTASI




SRI HERNAWATI

PROGRAM STUDI S-3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA 2012

ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga


PRASYARAT GELAR DOKTOR




DISERTASI

Untuk Memperoleh Gelar Doktor Dalam Program Studi S3 Ilmu Kedokteran

Pada Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Dan Dipertahankan Di hadapan Panitia Ujian Doktor Tahap II (Terbuka)

Oleh : SRI HERNAWATI

090970133

PROGRAM STUDI S-3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA 2012



LEMBAR PENGESAHAN

Telah Disetujui Untuk Ujian Doktor Tahap II (Terbuka)

pada tanggal 21 September 2012

Oleh

Promotor :

Nip. 19591003 198701 1 001 Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, Drh

Ko Promotor I

Nip : 19550705 198003 1 005 Dr. I Ketut Sudiana, Drs. M.Si

Ko Promotor II

Nip. 19591114 198603 2 002 Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg,M.Si

Mengetahui Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran

Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga

Nip. 19501216 197703 1 002 Prof. Dr. Teddy Ontoseno,dr.SpA(k)Spjp.,AKK



Disertasi ini telah diuji dan dinilai

oleh panitia penguji pada ujian Tertutup (Tahap I)

Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Pada Tanggal 17 September 2012

Panitia Penguji : Ketua : Prof. M.Coen Pramono D.,drg.,S.U.,Sp.BM Anggota : 1. Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, drh 2. Dr. I Ketut Sudiana, MS 3. Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg.,M.Kes 4. Dr. Hari Basuki Notobroto, M.Kes.,dr 5. Dr. Iwan Hernawan, drg.,M.Kes.,Sp.PM 6. Prof. Dr. Aulanni’am, Drh., DES

Ditetapkan dengan Surat Keputusan Dekan Fakultas Kedokteran

Universitas Airlangga Nomor : 182/H3.1.1/KD/2012 Tanggal : 11 September 2012



UCAPAN TERIMA KASIH

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat

dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan disertasi dengan judul

“Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima (Punica granatum L) Terstandar

Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Yang Mengalami

Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2, VEGF, Wild p53 dan Apoptosis”

Penelitian Disertasi ini menjadi salah satu persyaratan yang harus ditempuh oleh

mahasiswa Program Pendidikan S-3 Ilmu Kedokteran di Universitas Airlangga.

Disertasi ini dapat diselesaikan berkat dorongan, bimbingan, arahan, saran

dan perbaikan dari banyak pihak. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati,

perkenankan saya menghaturkan terimakasih yang tulus serta penghargaan yang

setinggi-tingginya kepada yang terhormat :

Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, Drh. selaku promotor yang dengan penuh

perhatian telah meluangkan waktu, memberikan dorongan semangat dengan

penuh kesabaran, memberikan bimbingan dan saran sehingga ujian disertasi ini

dapat diselesaikan.

Dr. I Ketut Sudiana, Drs. M.Si, selaku Ko-Promotor I yang dengan penuh

perhatian dan kesabaran, telah memberikan dorongan, bimbingan dan saran,

sehingga ujian Disertasi ini dapat diselesaikan.

Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg, M.Si. selaku Ko-Promotor II yang dengan

penuh perhatian dan kesabaran, telah memberikan dorongan, bimbingan dan

saran, sehingga ujian disertasi ini dapat diselesaikan.



Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga saya haturkan kepada :

Rektor Universitas Airlangga, Prof. Dr. H. Fasich, Apt. yang telah memberi

kesempatan kepada saya untuk mengikuti pendidikan Program Doktor pada

Program Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas Airlangga Surabaya.

Prof. Dr. Agung Pranoto, dr., M.Kes., SpPD.,KEM.,FINASIN Dekan

Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah memberi kesempatan

kepada saya untuk mengikuti Pendidikan Program Doktor pada Program Ilmu

Kedokteran Pascasarjana Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya.

Direktur Program Pascasarjana, Prof .Dr.Hj.Sri Hajati,SH.,MS., beserta

seluruh pimpinan dan staf Program Pascasarjana Universitas Airlangga atas

kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada saya untuk menjadi mahasiswa

Program Doktor pada Program Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas

Airlangga.

Prof. Dr. Teddy Ontoseno, dr. SpA(k)Spjp.,AKK, selaku Ketua Program

Studi Program Doktor Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas Airlangga yang

telah banyak membantu dalam kelancaran proses pelaksanaan ujian disertasi ini.

Rektor Universitas Jember dan Dekan Fakultas Kedokteran Gigi Universitas

Jember yang telah banyak membantu saya dalam menempuh Program Doktor

pada Program Pascasarjana Universitas Airlangga.

Prof. M. Coen Pramono D., drg., SU., Sp. BM, Dr. Hari Basuki Notobroto,

Mkes, dr, Dr. Iwan Hernawan, drg.,M.Kes.,Sp.PM, Prof. Dr. Aulanni’am, Drh.,

DES, Prof. Dr. Sukardiman., Drs., M.S yang telah banyak memberikan saran dan



bimbingan yang sangat berharga mulai penyusunan pra usulan penelitian hingga

penyusunan disertasi ini.

Para dosen pengajar S-3 Kedokteran dan karyawan di laboratorium

biokimia, laboratorium mikroskop elektron Gramik Fakultas Kedokteran

Universitas Airlangga.

Terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Kementerian

Pendidikan Nasional yang telah memberikan Beasiswa Pendidikan Pascasarjana

demi kelancaran studi saya.

Teman-teman angkatan 2009/2010 pendidikan Program Doktor Bidang Ilmu

Kedokteran pada Program Pascasarjana Universitas Airlangga. Selama ini kita

telah saling menemani, memotivasi, mengingatkan dan memberi masukan yang

semuanya memberi nilai tambah dalam rangkaian penyusunan disertasi ini.

Pada kesempatan ini saya menyampaikan terimakasih ,rasa hormat dan

penuh kasih kepada :

Orangtua saya, ayahanda tercinta Samiruddin (Alm) dan ibunda Sunaryati,

tidak lupa kepada seluruh saudara dan keluarga besar saya ucapkan terimakasih

yang tak terhingga. Terimakasih atas semua kebaikan dan doa yang telah

diberikan.

Suami saya, Rahardja Putranto,drg.,M.Mkes tercinta, yang hingga saat ini

mendampingi saya menjalani kehidupan, memberikan dorongan. Kepada anak-

anakku tercinta Amelia Clarissa Putranto dan Safira Rahmaningtyas Putranto,

terima kasih banyak atas cinta dan pengorbanan yang telah kalian berikan selama

ini.Mama mohon maaf atas berkurangnya waktu kebersamaan selama Mama

menyelesaikan pendidikan.



Saya ucapkan terima kasih pada semua pihak yang telah membantu dalam

terselesaikannya disertasi ini. Saya berharap disertasi ini akan dapat memberikan

manfaat bagi masyarakat, khususnya bagi pengembangan dunia pendidikan dan

kesehatan. Semoga Allah SWT melimpahkan taufik dan hidayah-Nya kepada

semua pihak yang telah membantu penyelesaian disertasi ini. Amien Ya Rabbal

Allamin.

Surabaya, September 2012

Penulis



RINGKASAN Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima

(Punica granatum L) Terstandar Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Yang Mengalami Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2,

VEGF, Wild p53 Dan Apoptosis

Karsinoma sel skuamosa rongga mulut adalah kanker urutan keenam di dunia, setiap tahun angka kejadiannya semakin meningkat. Di negara berkembang, kejadian ini mempunyai angka yang tinggi. Kemajuan di bidang bedah, radiasi dan kemoterapi telah berkembang dengan pesat, tetapi hasilnya masih relatif belum menggembirakan. Pasien yang mempunyai umur panjang kurang dari 50%. Terjadinya kanker bisa disebabkan karena hambatan apoptosis. Apoptosis merupakan suatu mekanisme yang efisien untuk mengeliminasi sel yang tidak diperlukan dan mungkin berbahaya sehingga dapat menyelamatkan organisme. Delima (PGL) salah satu tanaman obat yang memiliki aktivitas sebagai antikanker. Fakta ini mempunyai harapan bahwa ekstrak buah delima (PGL) dapat membunuh sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa rongga mulut mencit melalui penurunan ekspresi BCL-2,VEGF dan peningkatan ekspresi wild p53, apoptosis. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji secara eksperimental mekanisme kerja ekstrak buah Delima (Punica granatum L) terstandar terhadap sel mukosa rongga mulut mencit yang mengalami transformasi melalui ekspresi BCL-2,VEGF, Wild p53 dan Apoptosis. Metode penelitian ini adalah eksperimental laboratories. Hewan coba yang digunakan adalah mencit Strain Swiss Webster (Balb/c), 30 ekor mencit jantan umur 5 bulan, dibagi 5 kelompok. Kelompok kontrol (K0/K-, K1/K+) dan 3 kelompok perlakuan (P1, P2, P3). Paparan benzopirene diberikan untuk hewan coba pada kelompok (K1, P1, P2, P3) dengan dosis 0,04 mg benzopirene / 0,04 ml olium olivarum diberikan 3 kali seminggu selama 4 minggu. Pemberian ellagic acid, PGL, mahkota dewa pada kelompok (P1, P2, P3 ) dengan dosis 75 mg/kg bb mencit, diberikan tiap hari selama 4 minggu per oral. Teknik pemeriksaan dengan teknik imunohistokimia dan tunnel assay analisis data menggunakan uji MANOVA, LSD, uji korelasi dan regresi.

Hasil pemeriksaan dengan teknik imunohistokimia dan pemberian ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat menurunkan ekspresi Bcl-2, dan tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K1. Ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat menurunkan ekspresi VEGF, dan tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K1. Ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild p53, tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan dengan kelompok K1. Pemeriksaan preparat dengan teknik tunnel assay menunjukkan pemberian ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat meningkatkan apoptosis, dan tidak berbeda secara signifikan dengan kelompok



P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan dengan kelompok K0 dan K1. Hasil uji korelasi menunjukkan, ada korelasi positif antara penurunan ekspresi Bcl-2 dengan penurunan ekspresi VEGF, tetapi ada korelasi negatif antara penurunan ekspresi Bcl-2 dengan peningkatan ekspresi wild p53, dan ada korelasi positif antara peningkatan wild p53 dengan peningkatan ekspresi apoptosis.

Kesimpulan penelitian ini adalah bahwa ada mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terhadap apoptosis melalui jalur intrinsik dan ada korelasi positif dua arah antara ekspresi Bcl-2 dengan ekspresi VEGF.



SUMMARY

Mechanism of Action of Standardized Pomegranate Extracts (Punica Granatum L) on Degradation of Mice Oral Cavity Mucosal Cells

Transforming through Expression of Bcl-2, VEGF, p53 Wild and Apoptosis

Squamous cell carcinoma of the oral cavity is the sixth cancer in the world, every year the number of events increases. In developing countries, these events have a high number. The developments in the field of surgery, radiation and chemotherapy have improved dramatically, but the results are still relatively encouraging. In facts, patients who have a long life are still less than 50%. The occurrence of cancer could be due to apoptosis resistance. Apoptosis is an efficient mechanism to eliminate cells that are unnecessary and potentially dangerous so as to save the organism. Pomegranate (PGL) is one of medicinal plants that have anticancer activity. This fact has the expectation that pomegranate extract (PGL) can kill cells undergoing transformation into squamous cell carcinoma of the oral cavity of mice with decreased expression of BCL-2, VEGF and increased expression of p53 wild, apoptosis. The purpose of the research was to experimentally test the mechanism of action of Pomegranate extract (Punica granatum L) standardized to oral mucosal cells of mice undergoing a transformation through the expression of BCL-2, VEGF, p53 and Apoptosis Wild. The research method was experimental laboratories. Experimental animals used were Swiss Webster mice strains (Balb / c), 30 male mice aged 5 months, divided 5 groups. The control group (K0/K-, K1 / K +) and 3 treatment groups (P1, P2, P3). Exposure benzopirene was given to experimental animals in the group (K1, P1, P2, P3) at a dose of 0.04 mg benzopirene / 0.04 ml olium olivarum given 3 times a week for 4 weeks. Usage of ellagic acid, PGL, mahkota dewa on the groups (P1, P2, P3) at a dose of 75 mg / kg bb mice, given daily for 4 weeks per oral. Examination techniques with imunohistokimia technique and tunnel assay data analysis using MANOVA test, LSD, correlation and regression testing. The results of the examinations with imunohistokimia technique and pomegranate extract (PGL) / P2 standardized could reduce the expression of Bcl-2, and did not differ significantly when compared to the K0, P1, P3, but significantly different when compared with group K1. Pomegranate Extract (PGL) / P2 standardized could reduce the expression of VEGF, and did not differ significantly when compared to the K0, P1, P3, but significantly different when compared with group K1. Pomegranate Extract (PGL) / P2 standardized could increase the expression of p53 wild, did not differ significantly when compared to the K0, P1, P3, but differs significantly with the K1. Examination preparations tunnel assay techniques showed the extract of pomegranate (PGL) / P2 standardized to enhance apoptosis, and did not differ significantly by group P1, P3, but differed significantly with the K0 and K1. Correlation test results showed that there was a positive correlation between the decreased expression of Bcl-2 with decreased VEGF expression, but there is a negative correlation between the decreased



expression of Bcl-2 with increased expression of p53 wild, and there is a positive correlation between the increase in p53 wild with increased expression of apoptosis. The conclusion of the research was that there was a mechanism of action of pomegranate extract (PGL) to apoptosis through the intrinsic pathway, and there was a positive correlation in both directions between the expression of Bcl-2 and VEGF expression.



ABSTRAK

Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima (Punica granatum L) Terstandar Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga

Mulut Mencit Yang Mengalami Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2, VEGF, Wild p53 Dan Apoptosis

Karsinoma sel skuamosa rongga mulut adalah merupakan kanker urutan keenam di dunia. Perkembangan kemajuan di bidang bedah, radiasi dan kemoterapi belum memberikan hasil yang signifikan. Pasien karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang berumur panjang kurang dari 50%. Terjadinya kanker salah satu disebabkan oleh karena hambatan apoptosis sel dan mutasi. Delima (PGL) merupakan alternatif dan salah satu tanaman obat yang memiliki aktivitasnya sebagai antikanker. Fakta ini mempunyai harapan bahwa ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat membunuh sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa rongga mulut mencit melalui penurunan ekspresi BCL-2,VEGF dan peningkatan ekspresi wild p53, apoptosis. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji secara eksperimental mekanisme kerja ekstrak buah Delima (Punica granatum L) terstandar terhadap sel mukosa rongga mulut mencit yang mengalami transformasi melalui ekspresi BCL-2,VEGF, Wild p53 dan Apoptosis. Metode penelitian yang digunakan adalah eksperimental laboratories, tiga puluh ekor mencit jantan umur 5 bulan dibagi secara random menjadi 5 kelompok; 2 kelompok control (K0, K1), 3 kelompok perlakuan (P1,P2,P3). Paparan benzopirene dengan dosis 0,04 mg benzopirene/0,04 ml olium olivarum selama 4 minggu, 3 kali seminggu. Pemberian ellagic acid, PGL, mahkota dewa dengan dosis 75 mg/kg bb mencit setiap hari selama 4 minggu. Pemeriksaan dilakukan dengan menggunakan teknik imunohistokimia dan tunnel assay. Hasil penelitian berdasarkan teknik imunohistokimia menujukkan bahwa pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi Bcl-2, VEGF, dapat meningkatkan ekspresi wild p53 dengan teknik pemeriksaan tunnel assay, dan meningkatkan ekspresi apoptosis. Hasil uji korelasi menunjukkan, ada korelasi positif antara penurunan ekspresi Bcl-2 dengan penurunan ekspresi VEGF, ada korelasi negatif antara penurunan ekspresi Bcl-2 dengan peningkatan ekspresi wild p53, dan ada korelasi positif antara peningkatan ekspresi wild p53 dengan peningkatan ekspresi apoptosis. Kesimpulan penelitian ini adalah ada mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terhadap apoptosis melalui jalur intrinsik dan ada korelasi positif dua arah antara ekspresi Bcl-2 dengan ekspresi VEGF. Kata Kunci : Delima, transformasi sel, apoptosis.



ABSTRACT

Mechanism of Action of Standardized Pomegranate Extracts (Punica Granatum L) on Degradation of Mice Oral Cavity Mucosal Cells

Transforming through Expression of Bcl-2, VEGF, p53 wild and Apoptosis

Squamous cell carcinoma of the oral cavity is the sixth cancer in the world. The developments in the field of surgery, radiation and chemotherapy have not yielded significant results. Patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity that have a long life is still less than 50%. One occurrence of cancer was caused by cell apoptosis and mutation. Pomegranate (PGL) is an alternative and one that has the medicinal plants as anticancer activity. This fact has the expectation that pomegranate extract (PGL) standardized to kill the cells undergoing transformation into squamous cell carcinoma of the oral cavity of mice with decreased expression of BCL-2, VEGF and increased expression of p53 wild, apoptosis. The purpose of this study was to experimentally test the mechanism of action of Pomegranate extract (Punica granatum L) standardized to oral mucosal cells of mice undergoing a transformation through the expression of BCL-2, VEGF, p53 and Apoptosis Wild.

The research method used was experimental laboratories, thirty male mice aged 5 months were randomly divided into 5 groups: 2 groups of control (K0, K1), 3 treatment groups (P1, P2, P3). Exposure of benzopirene with a dose of 0.04 mg benzopirene/ 0.04 ml olium olivarum for 4 weeks, 3 times a week. Usage of ellagic acid, PGL, mahkota dewa with a dose of 75 mg / kg bb mice every day for 4 weeks. Examinations were done by using imunohistokimia and tunnel as say techniques.

The results based on the technique of imunohistokimia showed that pomegranate extract (PGL) standardized could reduce the expression of Bcl-2, VEGF, p53, could increase the expression of wild-tunnel as say examination techniques, and could increase expression of apoptosis. Correlation test results showed that there was a positive correlation between the decreased expression of Bcl-2 and decreased expression of VEGF, there was a negative correlation between the decreased expression of Bcl-2 and increased expression of p53 wild, and there was a positive correlation between the increased expression of p53 and increased expression of wild apoptosis.

The conclusion of this study was that there was mechanism of

pomegranate extract (PGL) on apoptosis through the intrinsic pathway, and there was a positive correlation in both directions between the expression of Bcl-2 and VEGF expression.



DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................ i

LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................. iv

UCAPAN TERIMA KASIH ............................................................................ vi

RINGKASAN .................................................................................................. x

SUMMARY .................................................................................................. xii

ABSTRAK .................................................................................................. xiv

DAFTAR ISI .................................................................................................. xvi

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xx

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xxi

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xxvi

DAFTAR SINGKATAN ................................................................................. xxvii

BAB 1 PENDAHULUAN ............................................................................. 1

1.1 Latar Belakang.......................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .................................................................... 7

1.3 Tujuan Penelitian ...................................................................... 7

1.3.1 Tujuan umum penelitian ............................................... 7

1.3.2 Tujuan khusus penelitian .............................................. 8

1.4 Manfaat penelitian .................................................................... 8

1.4.1 Manfaat teoritik ............................................................ 8

1.4.2 Manfaat praktis penelitian ............................................ 9

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 10

2.1 Karsinogenesis ......................................................................... 10

2.1.1 Transform sel ................................................................ 12

2.1.2 Karsinoma Sel Skuamosa Rongga Mulut (KSSRM) .... 13

2.1.2.1 Etiologi dan faktor predisposisi sel skuamosa rongga

mulut (KSSRM) ............................................................ 14

2.1.2.2 Patobiologi molekuler sel skuamosa rongga mulut

(KSSRM) ...................................................................... 16



2.2 Kematian Sel ............................................................................ 18

2.2.1 Apoptosis .................................................................................. 18

2.2.1.1 Apoptosis fisiologis ............................................................. 20

2.2.1.2 Apoptosis patologis ............................................................. 21

2.2.1.3 Jalur Utama Apoptosis ......................................................... 24

2.2.2 Nekrosis .................................................................................. 26

2.3 Proliferasi sel ............................................................................ 28

2.4 Regulasi Apoptosis ................................................................... 29

2.4.1 Bcl-2 ...................................................................................... 29

2.5 Regulasi Proliferasi .................................................................. 31

2.5.1 Wild p53 ................................................................................... 31

2.6 Angiogenesis dan VEGF .......................................................... 34

2.6.1 Angiogenesis ............................................................................ 35

2.6.2 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ......................... 37

2.7 Benzopirene .............................................................................. 38

2.8 Punica granatum L (Delima) ................................................... 42

2.8.1 Klasifikasi, Nama Lain Komposisi Delima (National Plant

Date Centre, 2000) ................................................................... 42

2.8.2 Bahan Aktif Delima (PGL) ...................................................... 43

2.8.3 Aktivitas Delima (PGL) sebagai Antikanker, Antioksidan, dan

Antiinflamasi............................................................................. 47

2.8.3.1 Aktivitas Antikanker ............................................................ 47

2.8.3.2 Aktivitas Antioksidan ........................................................... 52

2.8.3.3 Aktivitas Antiinflamasi ........................................................ 53

2.9 Phaleria macrocarpa (Mahkota Dewa) ................................... 54

2.10 Imunohistokimia ....................................................................... 55

2.11 Tunnel Assay ............................................................................ 58

BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL .......................................................... 60

3.1 Kerangka Konsep ..................................................................... 60

3.2 Penjelasan Kerangka Konsep ................................................... 61

3.3 Hipotesis Penelitian .................................................................. 64



BAB 4 METODE PENELITIAN................................................................... 65

4.1 Jenis dan Rancangan penelitian ................................................ 65

4.2 Unit Eksperimental, Replikasi dan Randomisasi ..................... 67

4.2.1 Unit Eksperimental ................................................................... 67

4.2.2 Replikasi .................................................................................. 68

4.2.3 Randomisasi ............................................................................. 69

4.3 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional Variabel ............ 69

4.3.1 Variabel Penelitian .................................................................... 69

4.3.2 Definisi Variabel Penelitian .................................................... 70

4.4 Unit Analisis ............................................................................. 73

4.5 Alat penelitian .......................................................................... 73

4.6 Lokasi Penelitian ...................................................................... 74

4.7 Pelaksanaan Penelitian ............................................................. 74

4.7.1 Persiapan Penelitian.................................................................. 74

4.8 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data ........................ 76

4.9 Cara Pengolahan dan Analisis Data ......................................... 77

4.10 Kerangka Operasional Penelitian ............................................. 79

BAB 5 HASIL PENELITIAN ...................................................................... 80

5.1 Karakteristik Subyek Penelitian ............................................... 80

5.3 Ekspresi Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Jumlah sel yang

mengalami apoptosis ................................................................ 82

5.4 Korelasi antara Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Apoptosis .......... 102

5.5 Uji Regresi antara Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Apoptosis ....... 104

5.6 Kerangka Hasil Penelitian ........................................................ 105

BAB 6 PEMBAHASAN ................................................................................ 107

6.1 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) terhadap Ekspresi

Protein Bcl-2 pada Sel Mukosa Rongga Mencit akibat

paparan Benzopirene. ............................................................... 109

6.2 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) terhadap Ekspresi

VEGF Pada Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Akibat

Paparan Benzopirene ................................................................ 116



6.3 Efek Ekstrak Buah Delima (PGL) terhadap Ekspresi Protein

wild p53 pada Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Hewan

Coba Akibat Paparan Benzopirene ........................................... 120

6.4 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) Terhadap Perubahan

Ekspresi Jumlah Sel Yang Mengalami Apoptosis Pada Sel

Mukosa Rongga Mulut Akibat Paparan Benzopirene .............. 124

6.5 Temuan baru ............................................................................. 128

6.5.1 Kerangka Temuan Baru ............................................................ 128

6.5.2 Keterangan Kerangka Temuan Baru ........................................ 128

BAB 7 PENUTUP.......................................................................................... 131

7.1 Kesimpulan ............................................................................... 131

7.2 Saran ......................................................................................... 131

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 133

LAMPIRAN ............................................................................................. 142



DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 5.1 Uji Homogenitas Subjek Penelitian Berdasarkan Berat Badan

Awal dan akhir mencit percobaan ................................................. 84

Tabel 5.2 Nilai Signifikansi Uji Normalitas Ekspresi Bcl-2, VEGF, wild

p53 dan jumlah sel yang mengalami apoptosis ............................. 85

Tabel 5.3 Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang Mengekspresikan

Bcl-2 Pada Hewan Percobaan ...................................................... 86


VEGF pada Hewan Percobaan ..................................................... 90


wild p53 Pada Hewan Percobaan .................................................. 94

Tabel 5.6 Rerata dan Simpangan Baku ekspresi sel yang mengalami

apoptosis Hewan Percobaan .......................................................... 98

Tabel 5.7 Uji korelasi antara wild p53, Bcl-2, VEGF terhadap apoptosis .... 102



DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Tahapan-tahapan proses karsinogenesis (Kresno, 2011) ......... 11

Gambar 2.2 Tiga jalur apoptosis yaitu jalur ekstrinsik (death-receptor

pathway), jalur intrinsik yang juga disebut jalur mitokhondria

dan jalur perforin/granzim (Jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik

merupakan jalur utama) (Kresno, 2011) ................................... 24

Gambar 2.3 Struktur Kimia Benzopirene (Vidmar et all., 2004) ................ 41

Gambar 2.4 Reaksi aromatik hidrosilasi dan epoksidasi (Sudiana, 2008) .. 41

Gambar 2.5 Punica granatum L (Delima) ( National Plant Data Center,

2000) .................................................................................. 43

Gambar 2.6 Struktur Kimia Punicalagin (a) dan Ellagic Acid (b) (Seeram

et al., 2005) .............................................................................. 45

Gambar 3.1 Kerangka Konsep ..................................................................... 60

Gambar 4.1 Rancangan Penelitian .............................................................. 65

Gambar 4.2 Kerangka Operasional Penelitian ............................................ 78

Gambar 5.1 Gambaran HPA (pembentukan keratin abnormal, proliferasi

sel-sel epitel skuamous, terlihat sel-sel atipia, sel tidak

beraturan) pada transform sel ke karsinoma rongga mulut

dosis 0.04 ml benzopirene, paparan 3 x seminggu selama 4

minggu dan pembesaran 100 x dengan pewarnaan HE

(penelitian pendahuluan) .......................................................... 81

Gambar 5.2 Gambaran HPA (pembentukan keratin abnormal, bentuk sel

tidak beraturan) pada transform sel ke karsinoma rongga

mulut dosis 0.02 ml benzopirene, paparan tiga kali

seminggu selama empat minggu pembesaran 100 x dengan

pewarnaan HE (penelitian pendahuluan) .................................. 82



Gambar 5.3 Gambaran secara klinis dari hasil penelitian pendahuluan

dengan dosis benzopirene 0,04 ml menunjukkan gambaran

mikroskopis (kemerahan, indurasi, tumor) ............................... 82

Gambar 5.4 Grafik Uji Homogenitas Subjek Penelitian Berdasarkan Berat

Badan Awal dan akhir mencit percobaan ................................. 84

Gambar 5.5 Grafik Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang

Mengekspresikan Bcl-2 Pada Hewan Percobaan .................... 86

Gambar 5.6 Kelompok K0 / Kontrol negatif (mencit normal) → (Positif)

Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal

terhadap ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform

sel ............................................................................................. 87

Gambar 5.7 Kelompok K1 / Kontrol positif (Benzopirene) → (Positif)


terhadap ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform

sel ............................................................................................. 88

Gambar 5.8 Kelompok P1 (Benzopirene + EA) → (Positif) Pengecatan

imunohistokimia dengan antibodi poliklonal terhadap

ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform sel ............. 88

Gambar 5.9 Kelompok P2 (Benzopirene + PGL) → (Positif) Pengecatan



Gambar 5.10 Kelompok P3 (Benzopirene + MD) → (Positif) Pengecatan




Mengekspresikan VEGF pada Hewan Percobaan ................... 90



terhadap ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform

sel ............................................................................................. 91





terhadap ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform

sel ............................................................................................. 92



ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform sel ............. 92

Gambar 5.15 Kelompok P2 (Benzopirene + PGL) → (P ositif) Pengecatan







Mengekspresikan wild p53 Pada Hewan Percobaan ................ 94



terhadap ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform

sel ............................................................................................. 95



terhadap ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform

sel ............................................................................................. 96



ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform sel ......... 96










Mengekspresikan wild p53 Pada Hewan Percobaan ................ 98


Pengecatan teknik tunnel assay dengan antibodi poliklonal

terhadap ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform

sel ............................................................................................. 99


Pengecatan teknik tunnel assay dengan antibodi poliklonal

terhadap ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform

sel ............................................................................................. 100


teknik tunnel assay dengan antibodi poliklonal terhadap

ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform sel ........ 100







Gambar 5.29 Korelasi antara Bcl-2 dengan VEGF ........................................ 101

Gambar 5.30 Korelasi antara Bcl-2 dengan wild p53 .................................... 102

Gambar 5.31 Korelasi antara wild p53 dengan apoptosis ............................. 103

Gambar 5.32 Hubungan antara Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Apoptosis

dengan uji regresi, korelasi positif dan bermakna antara wild

p53 dengan Apoptosis, korelasi negatif dan bermakna antara

wild p53 dengan Bcl-2, korelasi negatif antara wild p53

dengan VEGF, korelasi positif dan bermakna antara Bcl-2

dengan VEGF ........................................................................... 104



Gambar 5.33 Hubungan antara Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Apoptosis

dengan uji regresi, korelasi positif dan bermakna antara wild

p53 dengan Apoptosis, korelasi negatif dan bermakna antara

wild p53 dengan Bcl-2, korelasi negatif antara wild p53

dengan VEGF, korelasi positif dan bermakna antara Bcl-2

dengan VEGF ........................................................................... 104

Gambar 5.34 Kerangka hasil penelitian ....................................................... 105

Gambar 6.1 Kerangka temuan baru ............................................................. 128



DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1 Sertifikasi standarisasi (COA) ekstra buah delima (PGL) dan

ellagic acid .............................................................................. 142

Lampiran 2 Ethical Clearance ..................................................................... 144

Lampiran 3 Hasil uji statistik ....................................................................... 145

Lampiran 4 Prosedur pemeriksaan Imunohistokimia ................................. 168

Lampiran 5 Prosedur pemeriksaan Tunnel Assay ....................................... 170



DAFTAR SINGKATAN / ISTILAH

17p : Kromosom 17 lengan pendek AP-1 : Aktivator protein 1 APAAP : Alkali fosfatase anti alkali fosfatase APAF-1 : Apoptosis protein avtivating factor-1 ADCC : Antibody dependent cell cytotoxicity Bax : Protein BAX pada membran mitokondria BM : Berat molekul bFGF : Basic fibroblast growth faktor Bcl- 2 : Gen yang mengkode protein yang berperan sebagai

anti apoptosis CTL : Cytotoxic T-Lymphocyte CPK : Cystein protein kinase CPSO : Cold pressed seed oil CDK : Cyclin dependent protein kinase CPK-K2 : Cystein protein kinase –K2 CTL : Cytotoxic Tlymphocyte CMC : Carboxy methyl cellulase COX : Cyclooxygenase DNA : Deoxyribonucleic acid DAB : Diaminoenzidine ELISA : Enzyme linked immunoassay FADD : Associated protein death domain Fase G-1 : Gap /jeda antara akhir fase M dengan awal fase S Fase G-2 : Gap / jeda antara fase S dengan awal fase M Fase S : Interfase / fase sentesis Fase M : Fase mitosis FRAP : Ferric reducing antioxidan power HSV : Herpes simplex-1 HIV : Human immudifisiency HPV : Human papilloma HIF : Hipoxia inducible factor HTs : Hydrolyzable tannins HPLC : Hight performance liquid chromatographi



IAP : Inhibitor of apoptosis protein IKK : IkB kinase KSSRM : Karsinoma sel skuamosa rongga mulu LOX : Lipoxygenase MFO : Mixed function oxidase MAPK : Mitogen activated protein kinase MDM2 : Murine double minute 2 mRNA : Messanger ribonucleic acid NK : Natural killer NF-kB : Nuclear factor kappa B NER : Nucleotide excision repair NK-cel : Natural killer cell NIK : NF-kB inducing kinase P21 : Gen p21, protein 21 (p21) dikode oleh gen p21(P21) p53 : Gen p53, protein 53 (p53) dikode oleh gen p53

(P53) PPE : Pomegranate peel extract Protooncogene : Gen yang mengkode protein PGL : Punica granatum Linn PFE : Pomegranate flower ekstrak PPJ : Pomegranate pulp juice PKC : Protein kinase-C PSA : Prostat spesifik antigen PAA : Dihydrophenylacetic acid PAP : Peroksidase anti peroksidase PAH : Polycyclic aromatic hydrocarbon PCNA : Proliferating cell nuclear antigen ROS : Reactive oxygen species RNA : Ribonucleic acid STAT3 : Signal transducer and activator of transkripsi 3 Tumor suppressor gene : Protein yang berperan sebagai faktor pengendalian

pertumbuhan sel Telomerase : Enzim yang berperan pada apoptosis fisiologis TRAIL : Anggota superfamily TNF Tdt : Terminal deoxynucleotidyl transferase



T2 : Ukuran tumor 2-4 cm T3 : Ukuran tumor lebih dari 4 cm TSG : Tumor supressor gene VEGF : Vascular endothelial growth factor VEGFR : Vascular endothelial growth factor receptor



BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Trasformasi sel merupakan sel yang mengalami perubahan perilaku

sebagai akibat adanya transkripsi dari suatu onkogen. Protooncogene yang

mengalami mutasi, gen tersebut dikenal dengan onkogen. Protein yang di

kode oleh gen tersebut akan overaktif dan dapat berkembang menjadi kanker

(Sudiana, 2008; Kresno, 2011)

Karsinoma sel skuamosa rongga mulut merupakan kanker keenam di

dunia, di India dilaporkan setiap tahun 75.000-80.000 kasus baru, di

Singapura dan negara-negara Asia lainnya juga dilaporkan tinggi angka

kejadiannya (Epstein and Waal, 2008; Solomon, 2010). Karsinoma sel

skuamosa rongga mulut merupakan kelanjutan dari kejadian transformasi sel

pada sel skuamosa rongga mulut.

Lebih dari 90% dari karsinoma rongga mulut berasal dari sel skuamosa

dan menjadi masalah kesehatan utama di negara berkembang serta merupakan

penyebab utama kematian. Indeks survival ini terus merosot (50%),

dibandingkan dengan kemajuan dalam hal diagnosis dan pengobatan kanker

(Mehrotra and Yadav, 2006).

Beberapa penelitian di Asia Tenggara, diketahui bahwa mukosa bukal

merupakan daerah karsinoma sel skuamosa yang paling umum yaitu sebesar

50%-72%. Karsinoma sel skuamosa rongga mulut pada dasarnya tidak



menimbulkan keluhan pada tahap awal, pasien dengan karsinoma sel

skuamosa pada mukosa bukal 68% diantaranya merupakan lesi T2 atau T3

dan sebesar 48% menyebar ke nodes limfa (Wahyuni, 2010).

Berbagai upaya penatalaksanaan penyakit kanker masih banyak

menemui kendala yang mengakibatkan kurangnya keberhasilan dalam

mencegah dan mengobati kanker. Pengobatan yang selama ini dilakukan

meliputi pembedahan, penyinaran radioterapi dan penggunaan obat-obat

kemoterapi. Tindakan operasi untuk mengangkat jaringan kanker belum

sepenuhnya menjamin kesembuhan dan ada kecenderungan untuk terjadinya

remultiplikasi sel kanker. Penggunaan radioterapi menimbulkan resiko

terjadinya kerusakan lain di sekitar jaringan yang terkena kanker. Pemberian

kemoterapi antikanker memiliki efek farmakologi kurang selektif, efek

samping yang merugikan dan dilaporkan adanya resistensi beberapa jenis

kanker (Rizali dan Auerkari, 2003; Sismindari, 2005).

Penanganan penyakit kanker yang kurang optimal pada kasus

karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang telah metastasis luas, didapatkan

sekitar 30-65% penderita meninggal dunia dalam kurang waktu 5 tahun.

Karsinoma sel skuamosa rongga mulut merupakan kanker yang sering terjadi

pada rongga mulut. Pemeriksaan DNA menunjukkan hampir 90% kasus

dijumpai adanya mutasi gen p53 (Syafriadi, 2008).

Pada dasarnya penanganan kanker melalui kemoterapi dan dengan obat

herbal tidak jauh berbeda. Keduanya untuk membunuh sel kanker, namun

efek yang ditimbulkan kedua sistem pengobatan ini sangat berbeda. Tanaman



obat dengan sifat alamiahnya akan meningkatkan daya tahan tubuh penderita

terutama sel yang berada di sekitar kanker. Senyawa-senyawa aktif tanaman

obat juga banyak mempunyai fungsi untuk menghambat pertumbuhan sel

kanker dan membunuhnya, memutus pasokan zat-zat makanan dan oksigen

ke jaringan sel kanker. Selain bebagai alasan tersebut di atas, penggunaan

obat herbal dalam menangani sel kanker merupakan cara pengobatan dengan

biaya murah (McCutcheon et a l.,2008). Delima (PGL) adalah Salah satu

tanaman obat yang mempunyai efek farmakologis terhadap penyakit kanker

telah banyak diteliti secara invitro dan sedikit penelitian yang di lakukan

secara invivo .

Penelitian ini tidak mungkin digunakan manusia sebagai subjek

penelitian, sehingga digunakan hewan coba mencit. Hewan coba yang di

gunakan mencit Strain Swiss Webster (Balb/c) jantan, lokasi paparan pada

mukosa bukal sebelah kanan dengan dosis paparan benzopirene berdasarkan

penelitian pendahuluan 0,04 mg benzopirene / 0,04 ml olium ol ivarum,

diberikan 3 kali dalam semingggu selama 4 minggu.

Benzopirene (B(a)P) merupakan senyawa polisiklik ar omatik

hidrokarbon yang bersifat karsinogenik dan paling sering menyebabkan

kanker di rongga mulut (Cotran, 2005). Benzopirene menghasilkan metabolit

reaktif BP-7, 8-diol-9, 10-oxide yang dapat berikatan secara kovalen dengan

basa guanin DNA sehingga terjadi mutasi genetik (Sattar et al.,1999). Hal ini

akan menyebabkan transformasi sel normal menjadi sel kanker. Benzopirene

(B(a)P) yang banyak terdapat dalam asap rokok, asap kendaraan, asap dari



proses pembakaran bahan organik dan makanan yang diasap atau dipanggang.

Benzopirene dapat menimbulkan mutasi gen p53 sehingga menimbulkan

kanker (Martin et al., 2001).

Pada sel yang mengalami transformasi mutasi gen p53 akan mengubah

sifat protein yang diproduksinya sehingga menghilangkan kemampuan wild

p53 baik sebagai antiproliferasi, maupun sebagai pengatur proses apoptosis

(Mendelsohn et al., 2008).

Mutasi gen p53 menyebabkan inaktivasi wild p53 sehingga siklus sel

tidak berhenti pada fase G1 tetapi berlanjut ke fase S dan G2 atau M. Hal ini

berakibat DNA yang mengalami mutasi tetap dilipatgandakan. Sel yang

mengandung DNA mutasi tetap mitosis menghasilkan populasi sel yang

mengandung DNA cacat. Pada proses apoptosis wild p53 berperan memicu

faktor transkripsi terhadap p21 dan memicu aktivitas Bax dan menekan Bcl-2.

Apabila sistem yang menginduksi apoptosis tidak mampu bekerja maka

akan mengalami pembelahan sel yang tidak terkendali, sehingga menjadi

kanker (Sudiana, 2008).

Apoptosis merupakan proses kematian sel dalam rangka

mempertahankan integritas tubuh secara keseluruhan. Program ini memiliki

peran yang penting untuk menjaga homeostatis, perkembangbiakan sel. Salah

satu peran penting apoptosis adalah untuk membatasi proliferasi sel yang

tidak diperlukan, mekanisme yang efisien untuk mengeliminasi sel yang tidak

diperlukan dan berbahaya. Pada sel kanker program apoptosis ini mengalami

gangguan (Salido et al., 2009).



Bcl-2 adalah sebuah onkogen anggota dari keluarga Bcl yang

mempunyai fungsi untuk menghambat proses apoptosi (hambatan kompetitif

terhadap aktivasi Bax). Apabila jumlah protein Bcl-2 sedikit, maka protein

pro apoptosis (Bax) akan menginduksi apoptosis (Kresno, 2011).

Angiogenesis merupakan pertumbuhan pembuluh darah baru dari

pembuluh darah yang sudah ada, merupakan salah satu faktor penting pada

pertumbuhan dan perkembangan sel kanker. Faktor yang mempengaruhi

pembentukan angiogenesis adalah VEGF, VEGF sebagai inducer

angiogenesis dari sebagian besar kanker mengekspresikan VEGF (Hasina et

al., 2001; Kresno, 2011).

Dewasa ini telah dilakukan berbagai upaya penelitian guna pencarian obat

antikanker. Salah satu upaya di antaranya adalah menggali potensi tanaman

obat Indonesia termasuk delima atau Punica G ranatum L inn ( PGL), yang

banyak diteliti secara invitro tapi masih jarang diteliti secara invivo. Apabila

efek ekstrak buah delima (Punica Granatum L) pada mencit (Mus Musculus)

Strain Sw iss W ebster (Balb/c) dapat terungkap, maka ekstrak buah delima

(Punica Granatum L) dapat dijadikan sebagai salah satu alternatif pengobatan

terhadap karsinoma sel skuamosa rongga mulut.

Buah delima merupakan bagian tanaman delima yang memiliki

komponen paling lengkap bila dibandingkan bagian tanaman delima lainnya.

Buah delima banyak mengandung senyawa polyphenol yang terdiri dari

flavonoid, hydrolyzahle tannins (ellagitannins dan gallotannins) dan

condensed tannins (proantho cyanidins). Bahan aktif utama yang terkandung



di dalam buah delima adalah punicalagin dan ellagic acid (EA). Ekstrak buah

delima terstandar yang baik umumnya mengandung 40% atau lebih ellagic

acid. Ekstrak buah delima (PGL) dengan standar 40% ellagic a cid dapat

menghambat perkembangan sel kanker, antiproliferasi, menginduksi

apoptosis dan antioksidan secara invitro (Seeram et al., 2006; Jurenka, 2008).

Ekstrak etanol buah delima dapat meningkatkan apoptosis secara invitro

pada biakan sel karsinoma skuamosa lidah manusia dengan dosis 250 ug/ml

(Kholifa, 2010). Standarisasi 40% ellagic ac id dengan tujuan 40% ellagic

acid dapat menggambarkan kekuatan delima yang bertanggung jawab

terhadap aktivitas farmakologi (Saifudin et al ., 2011). Dosis ekstrak buah

delima yang digunakan dalam penelitian ini adalah 75 mg/kg/hari (Valadares

et al.,2010).

Berdasarkan fakta tersebut, tidak menutup kemungkinan bahwa ekstrak

buah delima (PGL) terstandar dengan komposisi yang lengkap bila

dibandingkan dengan bagian tanaman delima lainnya, dapat dimanfaatkan

sebagai bahan antikanker melalui hewan percobaan yang sedang dalam proses

transformasi ke karsinoma sel skuamosa rongga mulut (KSSRM).

Langkah awal yang akan dilakukan pada penelitian ini adalah

memberikan ekstrak buah delima (PGL) terstandar yang mengandung 40%

ellagic acid kepada hewan coba yang sedang dalam proses kearah karsinoma

sel skuamosa rongga mulut (KSSRM). Pemeriksaan dilakukan terhadap sel

mukosa yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skumosa rongga

mulut pada bagian bukal kanan mencit. Digunakan metode imunohistokimia



untuk ekspresi Bcl-2, VEGF, wild p53 dan metode tunnel assay untuk sel

yang mengalami apoptosis.

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan permasalahan dari penelitian ini adalah :

1.2.1 Apakah pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat

menurunkan ekspresi Bcl-2 pada sel mukosa rongga mulut mencit yang

mengalami transformasi ?


menurunkan ekspresi VEGF pada sel mukosa rongga mulut mencit yang



meningkatkan ekspresi wild p53 pada sel mukosa rongga mulut mencit

yang mengalami transformasi ?


meningkatkan apoptosis pada sel mukosa rongga mulut mencit yang


1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan umum penelitian

Menjelaskan mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terstandar

terhadap hambatan / degradasi sel mukosa rongga mulut mencit Strain Swiss

Webster (Balb/c) yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa.



1.3.2 Tujuan khusus penelitian

Tujuan khusus dari penelitian ini adalah

a. Menganalisis hambatan/degradasi ekstrak buah delima (PGL) terstandar

terhadap sel mukosa rongga mulut mencit Strain Swiss Webster (Balb/c)

yang mengalami transformasi melalui penurunan ekspresi Bcl-2.

b. Menganalisis hambatan/degradasi ekstrak buah delima (PGL) terstandar


yang mengalami transformasi melalui penurunan ekspresi VEGF

c. Menganalisis hambatan/degradasi ekstrak buah delima (PGL) terstandar


yang mengalami transformasi melalui peningkatan ekspresi wild p53

d. Menganalisis hambatan/degradasi ekstrak buah delima (PGL) terstandar

terhadap sel mukosa rongga mulut mencit (Mus musculus) St rain Swiss

Webster ( Balb/c) yang mengalami transformasi melalui peningkatan

apoptosis.

1.4 Manfaat penelitian

1.4.1 Manfaat teoritik

Penelitian ini memberikan kontribusi keilmuan dalam mengungkap

mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terhadap penurunan

onkogenesis pada sel mukosa rongga mulut mencit (Mus musculus) Strain

Swiss Webster (Balb/c) sebagai hewan coba yang mengalami transformasi

sel menjadi karsinoma sel skuamosa rongga mulut akibat paparan

benzopirene.



1.4.2 Manfaat praktis penelitian

Ekstrak buah delima (PGL) dapat meningkatkan apoptosis melalui

jalur intrinsik melalui meningkatkan ekspresi wild p53 , penurunan ekspresi

Bcl-2 dan menghambat angiogenesis melalui penurunan ekspresi VEGF,

sehingga menjadi dasar pengembangan terapi kanker khususnya kanker

rongga mulut.



BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Karsinogenesis

Pertumbuhan kanker merupakan proses mikroevolusioner yang

berlangsung beberapa bulan atau beberapa tahun. Proses pertumbuhan ini

disebut karsinogenesis yang merupakan proses perubahan sekelompok sel

normal menjadi sel kanker akibat pengaruh karsinogen. Karsinogen adalah

bahan yang dapat memicu terjadinya kanker atau keganasan. Karsinogen

dapat mempengaruhi DNA atau suatu protein yang berperan pada pengaturan

siklus pembelahan sel, seperti protooncogene atau tumor s upressor ge ne

(Sudiana, 2008).

Karsinogenesis dimulai dari satu sel kanker yang memperbanyak diri dan

membentuk suatu koloni dalam jaringan yang sama. Perkembangan

berikutnya akan terjadi perubahan genetik (seperti aktivasi oncogene).

Munculnya kanker dapat dipicu oleh beberapa faktor seperti, bahan kimia,

radiasi, dan virus. Faktor-faktor pencetus kanker ini memberikan pengaruh

pada suatu kelompok gen yang disebut gen kanker. Protooncogene secara

normal melakukan fungsi seluler yang berkaitan dengan pengaturan

pembelahan sel, tetapi beberapa faktor pemicu dapat mengubah fungsi

protooncogene menjadi oncogene yang menyebabkan terjadinya pembelahan

sel secara tidak normal dan terus-menerus, akhirnya terjadi kanker. Salah satu

10



cara yang dapat mengubah fungsi protooncogene adalah mutasi (Griffiths et

al.,1993; Kresno, 2011).

Proses karsinogenesis melalui beberapa stadium yang meliputi stadium

inisiasi, stadium promosi dan stadium progresi (fase pr evaskuler dan f ase

vaskuler).

Gambar 2.1 Tahapan-tahapan proses karsinogenesis (Kresno, 2011)

Pada stadium inisiasi zat-zat karsinogenik diaktivasi terlebih dahulu oleh

enzim di dalam tubuh menjadi senyawa metabolit. Senyawa metabolit ini

bersifat reaktif, mutagenik dan mampu berikatan dengan makro molekul

dalam tubuh seperti DNA. Stadium promosi merupakan kelanjutan stadium

inisiasi, stadium ini tidak melibatkan perubahan struktural dalam genom

secara langsung, tetapi biasanya ditandai dengan perubahan ekspresi gen dari

sel yang terinisiasi. Perubahan ini diduga terjadi interaksi perubahan genetik.

Stadium progresi, perubahan genetik semakin bertambah banyak sehingga

menambah koloni sel kanker, di tandai munculnya neoplasma ganas, diikuti



perubahan genetik nyata melibatkan perubahan struktur dalam inti sel.

Stadium progresi bersifat invasif dan seringkali diikuti dengan prosen

pembentukan pembuluh darah baru (angiogenesis) (Mendelsohn et al., 2001;

Sudiana, 2008).

2.1.1 Transformasi sel

Transformasi sel merupakan sel yang mengalami perubahan perilaku

sebagai akibat adanya transkripsi dari suatu oncogene. Oncogene adalah

protooncogene yang mengalami mutasi. Transformasi sel normal menjadi sel

kanker terjadi sebagai akibat terganggunya sistem regulasi atau siklus sel.

Secara fisiologi sel tumbuh dan berdiferensiasi, ada unsur genetik yang

diaktifkan (Switched o n) dan yang lain diinaktifkan (Switched of f) ..

Terganggunya sistem regulasi berakibat sel-sel kanker mampu membelah diri

menjadi lebih lebih banyak dan tidak menghasilkan pertumbuhan sel-sel

progenitor normal. Salah satu unsur penting dalam gangguan sistem regulasi

pertumbuhan sel adalah oncogene (Sudiana, 2008; Kresno, 2011).

Karsinoma in situ (CIS) adalah bentuk awal dari kanker yang

didefinisikan oleh tidak adanya invasi sel kanker ke jaringan sekitarnya,

biasanya sebelum penetrasi ke membram basal. Dengan kata lain, sel-sel

neoplastik berkembang biak di habitat normal (Mendelsohn et al., 2008).

Karsinoma sel skuamous merupakan kelanjutan dari transformasi sel

muncul sebagai akibat dari berbagai kejadian molekuler yang menyebabkan

mutasi genetik yang mempengaruhi kromosom dan gen, yang akhirnya

menuju ke perubahan DNA. Akumulasi berbagai perubahan tersebut memicu



terjadinya disregulasi sel pada batas dimana terjadi pertumbuhan otonom dan

perkembangan yang invasif. Proses neoplastik mula-mula bermanifestasi

secara intraepitel dekat membran basal kemudian terjadi pertumbuhan klonal

keratinosit sel yang berubah secara berlebihan, menggantikan epitelium

normal. Setelah beberapa waktu atau beberapa tahun, terjadi invasi membran

dasar jaringan epitel menandakan awal kanker invasif (Wahyuni, 2010).

2.1.2 Karsinoma Sel Skuamosa Rongga Mulut (KSSRM)

Karsinoma merupakan istilah yang digunakan untuk menyebut

neoplasma ganas yang berasal dari epitel. Neoplasma diartikan sebagai massa

jaringan abnormal, yang tumbuh berlebih, tidak terkoordinasi dan

pertumbuhan terus berlanjut walaupun rangsangan telah hilang. Neoplasma

merupakan sel yang telah berubah struktur dan fungsi, sehingga sel tersebut

mengalami peningkatan jumlah yang abnormal, invasif, dapat menyebar

melalui pembuluh getah bening dan pembuluh darah serta dapat

menimbulkan metastasis di organ yang jauh (King, 2000).

Karsinoma sel skuamosa merupakan kanker yang sering terjadi pada

rongga mulut, secara klinis terlihat sebagai plak keratosis, ulserasi, tepi lesi

indurasi dan kemerahan. Pemeriksaan DNA menunjukkan mutasi p53 paling

umum dijumpai hingga 90% kasus (Syafriadi, 2008).

Karsinoma sel skuamosa secara histologis menunjukkan proliferasi sel-

sel epitel skuamosa. Terlihat sel-sel yang atipia disertai perubahan bentuk ret

peg processus, pembentukan keratin yang abnormal, pertumbuhan proliferasi

basaloid, susunan sel menjadi tidak teratur, dan membentuk tumor nest yang



berinfiltrasi ke jaringan sekitarnya. Menurut WHO dalam (Syafriadi, 2008)

klasifikasi karsinoma sel skuamosa rongga mulut secara histopalogis dibagi :

1. Well di fferentiated (Grade I ) : yaitu proliferasi sel-sel kanker di mana

sel-sel basaloid tersebut masih berdiferensiasi dengan baik membentuk

keratin (keratin pearl).

2. Moderate differentiated (Grade II) : yaitu proliferasi sel-sel kanker di

mana sebagian sel-sel basaloid tersebut masih menunjukkan diferensiasi

membentuk keratin.

3. Poorly differentiated (Grade III) : yaitu proliferasi sel-sel kanker di mana

seluruh sel-sel basaloid tidak berdiferensiasi membentuk keratin,

sehingga sel sulit dikenali lagi.

2.1.2.1 Etiologi dan faktor predisposisi sel skuamosa rongga mulut

(KSSRM)

Faktor-faktor yang diketahui berimplikasi sebagai pemicu potensial atau

promotor karsinoma sel skuamosa rongga mulut adalah tembakau, alkohol,

bahan kimia, radiasi sinar matahari, radiasi, ionisasi, karsinogen yang

berhubungan dengan pekerjaan, polutan lingkungan, obat-obatan, agen

infeksi dan nutrisi (Mehrotra and Syadav, 2006).

Agen infeksi yang erat berhubungan dengan karsinoma sel skuamosa

rongga mulut adalah syphilis, candida dan virus (Suaitha and Gabriel, 2004).

Virus onkogen yang banyak dihubungkan dengan kejadian kanker di rongga

mulut adalah virus Herpes Si mplex-1 (HSV), virus H uman I mmudifesiency

(HIV) dan virus H uman P apilloma (HPV). Hubungan lansung infeksi virus



terhadap kejadian kanker rongga mulut hingga saat ini belum jelas (Sunitha

and Gabriel, 2004).

Karsinogen dari radiasi ada langsung dan tidak langsung. Secara tidak

langsung; radiasi yang memapar tubuh akan mempengaruhi komponen air

yang ada di dalam sel, sehingga terbentuk suatu bahan yang dikenal sebagai

radikal bebas. Radikal bebas yang terbentuk dapat memicu mutasi DNA

sehingga terbentuk klon baru (transform c ell), selanjutnya dapat memicu

terjadinya suatu keganasan (malignant) (Sudiana, 2008 ; Kresno, 2011).

Bahan kimia yang bersifat karsinogenik memiliki sifat yang sama, yaitu

memicu terjadinya mutasi gen. Bahan kimia akan mengadakan ikatan dengan

rantai DNA, sehingga DNA menjadi cacat (defect) (Sudiana, 2008).

Pertumbuhan KSSRM sangat dipengaruhi faktor eksogen dan endogen.

KSSRM dapat terjadi akibat fungsi protein yang abnormal, akibat mutasi gen.

Proliferasi berlebihan dan tidak terkendali dari sel yang abnormal dapat

terjadi akibat gangguan siklus sel. Apoptosis yang mengalami kegagalan juga

berperan terhadap karsinogenesis pada mukosa rongga mulut. Terdapat 4

golongan gen mengatur pertumbuhan normal yaitu protooncogene, tumor

suppressor gene, apoptosis gene serta DNA repair gene (Epstein and Waal,

2008).

Karsinoma sel skuamous rongga mulut dapat diturunkan, akan tetapi

herediter sendiri tidak memainkan peranan utama, kebanyakan dihubungkan

dengan lesi prekanker, khususnya leukoplakia (Syafriadi, 2008).



2.1.2.2 Patobiologi molekuler sel skuamosa rongga mulut (KSSRM)

Perkembangan kanker dipengaruhi oleh banyak faktor dan pada

umumnya merupakan interaksi antara faktor gen dan faktor lingkungan (gen-

environment interaction), khususnya lingkungan mikro yang ada di sekitar

kanker, yaitu hubungan antara perubahan genetik yang menyebabkan kanker

dengan aktivasi reaksi inflamasi pro-kanker (Kresno, 2011).

Patogenesis molekuler karsinoma sel skuamosa rongga mulut merupakan

akumulasi perubahan genetik yang melibatkan gen-gen, protooncogene dan

gen s upresor t umor (TSG), faktor-faktor lain yang terlibat antara lain;

kematian allel pada kromosom lain, mutasi protooncogene dan TSG,

perubahan epigenetik seperti metilasi DNA atau deasetilasi histone (Epstein

and Waal, 2008).

Karsinogenesis skuamosa rongga mulut merupakan proses kejadian

genetik, yang mengubah fungsi normal protooncogene dan tumor suppressor

gene, hal ini dapat mengakibatkan peningkatan produksi faktor pertumbuhan,

peningkatn produksi faktor transkripsi. Hilangnya aktivitas penekan tumor

menghasilkan fenotip sel yang mampu meningkatkan proliferasi sel yang

cacat/abnormal. Secara fisiologis sistem pertumbuhan sel dalam individu

diatur oleh sistem keseimbangan antara apoptosis dan proliferasi. Apabila

pada individu terjadi proliferasi secara berlebihan, maka akan terjadi massa

tumor (William, 2000; Sudiana, 2008).

Keganasan pada umumnya dapat terjadi melalui dua mekanisme yaitu

pertama, pemendekan waktu siklus sel sehingga akan menghasilkan lebih



banyak sel yang diproduksi dalam satuan waktu. Kedua, penurunan jumlah

kematian sel akibat gangguan pada proses apoptosis. Gangguan pada

berbagai protooncogen yang merangsang sel dan gen penekan tumor (TSGs)

yang menghambat penghentian proses siklus sel (Mendelsohn et al, 2008).

Gen p53 merupakan tumor s upresor ge n, yang berfungsi mencegah

replikasi sel pada sel yang cacat atau rusak secara genetik melalui

penghentian siklus sel, sehingga sel mempunyai waktu untuk menginduksi

apoptosis. Gen p53 tidak bisa berfungsi akan menyebabkan proses apoptosis

tidak bisa berjalan sehingga sel yang cacat akan terus berproliferasi

(Lumongga, 2008).

Dalam kaitan dengan pengendalian onkogenesis, apoptosis merupakan

mekanisme penting untuk mencegah proliferasi sel yang mengalami

kerusakan DNA, agar sel-sel dengan lesi DNA tersebut tidak dilipatgandakan.

Apoptosis berfungsi sebagai salah satu kontrol dalam siklus sel. Kegagalan

sel-sel tumor untuk melaksanakan mekanisme apoptosis merupakan salah

satu faktor yang mendasari pertumbuhan kanker yang makin lama makin

besar. Selain akibat instabilitas genetik dan akumulasi kelainan genetik, juga

akibat perubahan terhadap aturan yang ditentukan pada checkpoint siklus sel

untuk menginduksi apoptosis (Budhy, 2004).

Salah satu upaya mengatasi masalah kanker adalah mengembalikan

fungsi gen yang terganggu, salah satu diantaranya adalah mengembalikan

fungsi apoptosis. Hingga saat ini khemoterapi maupun radiasi yang ditujukan

untuk membunuh sel kanker melalui apoptosis, tetapi seperti telah diuraikan



di atas fungsi apoptosis pada kanker seringkali terganggu, sehingga tidak

jarang menyebabkan resistensi terhadap terapi. Karena itu pengetahuan rinci

tentang jalur apoptosis dapat membantu untuk memberikan terapi yang lebih

spesifik (Kresno, 2011).

2.2 Kematian Sel

Kematian sel terjadi setiap saat, kematian dapat bersifat fisiologis

maupun patologis, keduanya adalah akibat serangkaian jejas atau stimulus.

Pertumbuhan dan kematian sel adalah untuk upaya tubuh mencapai

homeostatis jaringan (Pelengaris, et al.,2006). Kematian sel, secara morfologi

dapat menunjukkan gambaran campuran apoptosis dan nekrosis (Yakovlev

and Faden, 2004).

2.2.1 Apoptosis

Apoptosis merupakan mekanisme alamiah yang dialami oleh sel. Ada dua

alasan utama mengapa sel melakukan mekanisme ini. Pertama apoptosis

memang diperlukan untuk proses pertumbuhan atau perkembangan sel,

jaringan atau organ lebih lanjut. Alasan kedua adalah untuk menghancurkan

sel-sel yang dianggap membahayakan bagi integritas organisme itu sendiri,

seperti sel yang terinfeksi oleh virus, sel dengan kerusakan DNA maupun

kanker (Meir, 2000; Nurhayati dan Lusiyanti, 2006).

Apoptosis merupakan kematian sel melalui mekanisme genetik yang

melibatkan kerusakan atau fragmentasi kromosom maupun DNA. Apoptosis

merupakan kematian yang terprogram sebagai respons terhadap rangsang

tertentu. Berbagai rangsangan tersebut diantaranya adalah radiasi,



kemoterapi, infeksi virus, gangguan hormonal, bahan-bahan kimia dan faktor

pertumbuhan (Salido et al., 2009).

Apoptosis merupakan bentuk kematian sel yang diperlukan baik untuk

perkembangan sel normal maupun homeostatis jaringan. Peristiwa ini

dikendalikan secara ketat oleh berbagai gen, baik gen yang bersifat apoptotik

maupun anti apoptotik. Apoptosis terjadi melalui 3 fase yaitu; fase inisiasi,

fase efektor dan fase ekskusi atau degradasi (Kresno, 2011).

Apoptosis adalah program bunuh diri intraseluler, terlaksana dengan

mengaktifkan caspase. Apoptosis diawali oleh aksi termasuk yang dimediasi

oleh reseptor dari kompleks sinyal yang menginduksi kematian DISC (Death

Inducing Signaling C omplex). Komponen utama dari DISC adalah FasL

(CD95L), TRAIL (Tumor Necroting F actor-Related A poptosis I nducing

Ligand). Sekali teraktivasi oleh mekanisme aktifasi atau autokatalisator,

maka kerusakan sel bermula pada caspase 8 yang melepaskan DISC, yang

menyebabkan aksi selanjutnya. Caspase ini juga dinamakan caspase

pengekskusi (Baert, 2008).

2.2.1.1 Apoptosis fisiologis

Kematian sel yang diprogram. Proses kematian sel ini sangat berkaitan

dengan suatu enzim yang dikenal telomerase. Pada sel embrional enzim ini

mengalami aktivasi, sedangkan pada sel somatik enzim ini tidak mengalami

aktivasi, kecuali sel yang bersangkutan mengalami transformasi menjadi

ganas (Salido et al., 2009).



Telomer yang terletak pada ujung kromosom merupakan salah satu faktor

yang sangat penting dalam melindungi kromosom. Pada sel normal, telomer

ini akan mengalami pemendekan pada waktu sel melakukan pembelahan diri.

Bila ukuran telomer mencapai ukuran tertentu (level kritis) sebagai akibat dari

pembelahan berulang, maka sel tersebut tidak dapat melakukan pembelahan

diri lagi. Selanjutnya akan terjadi fragmentasi kromosom dan akhirnya sel

mengalami apoptosis secara fisiologis (Sudiana, 2008).

Pada sel ganas, pemendekan telomer sampai pada level kritis tidak akan

terjadi, karena pada sel ganas terjadi aktivitas dari enzim ribonukleoprotein

(telomerase) secara terus menerus, dimana enzim ini sangat berperan pada

sentesis telomeric DNA, sehingga berbagai elemen yang dibutuhkan pada

pembentukan telomer dapat dibentuk secara terus menerus dan keberadaan

ukuran telomer pada ujung kromosom dapat dipertahankan. Pada sel normal,

aktivitas telomerase waktunya terbatas, tetapi pada sel kanker enzim ini

sangat aktif, sehingga terjadi pemblokiran proses pemendekan telomer pada

waktu pembelahan diri. Oleh karena itu, maka sel ganas dapat bersifat

immortal (Mendelsohn et al., 2008).

2.2.1.2 Apoptosis patologis

Kematian sel karena adanya suatu rangsangan. Proses kematian sel

(apoptosis) ini dapat melalui beberapa jalur, antara lain;

a. Aktivitas wild p53

Terjadinya apoptosis yang dipicu oleh aktivitas wild p53 karena sel

yang bersangkutan memiliki gen yang cacat (gene defect). Kecacatan gen



dalam suatu sel dapat dipicu oleh banyak faktor antara lain bahan kimia,

radikal bebas, maupun virus (oncovirus). Gen yang cacat dapat memicu

aktivitas beberapa enzim seperti PKC dan CPK-K2. Dimana kedua enzim

memicu aktivitas wild p53, wild p53 merupakan faktor transkripsi

terhadap pembentukan p21. Peningkatan p21 yang disentesis akan

menekan semua CDK. Terjadinya siklus pembelahan sel sangat

tergantung pada ikatan kompleks antara CDK dengan cyclin (Kresno,

2011).

CDK yang muncul pada fase M adalah CDK-1. Demikian juga

halnya CDK yang muncul pada fase S adalah CDk-2, CDK-4, CDK-6.

Cyclin adalah suatu protein yang dihasilkan oleh sel, dimana protein ini

dapat muncul dan hilang pada fase siklus sel, cyclin pada fase M adalah

cyclin A dan cyclin B, pada fase G-1 adalah cyclin-D dan cyclin-E.

Sementara pada fase S adalah cyclin-A dan cyclin-E (Sudiana, 2008).

Apabila terjadi peningkatan p21, maka semua CDK akan ditekan,

dengan terjadinya penekanan semua CDK pada fase siklus sel, maka

siklus sel akan berhenti. Saat siklus sel berhenti, wild p53 akan memicu

Bax, protein Bax akan menekan aktivitas Bcl-2 pada membran

mitokondria, sehingga terjadi perubahan permeabilitas membran dari

mitokondria. Perubahan ini mengakibatkan terjadi pelepasan cytokrom-c

ke sitosol. Di sitosol, cytokrom-c akan mengaktivasi Apaf-1 yang

selanjutnya akan mengaktivasi kaskade- kaspase. Kaspase yang aktif ini

akan mengaktifkan DNA-se. Kemudian DNA-se yang aktif menembus



membran inti dan merusak DNA, sehingga DNA sel yang bersangkutan

rusak (fragmentasi) dan akhirnya sel mengalami kematian (apoptosis),


b. Jalur sitotoksik

Terjadinya apoptosis melalui jalur sitotoksik ini dipicu oleh adanya

sel yang memiliki gen cacat (gene defect). Dengan adanya kecacatan gen

ini, maka sel tersebut akan mengekspresikan protein asing. Protein asing

yang dihasilkan dapat bersifat imunogenik, sehingga memicu terjadinya

proses pembentukan antibodi. Antibodi yang terbentuk dapat menempel

dipermukaan sel tertentu. Hal ini terjadi karena ada beberapa sel yang

pada membrannya memiliki FC receptor dan antibodi (khususnya FC

receptor terhadap Ig-G), antara lain sel killer. Dengan adanya reseptor

tersebut, maka antibodi yang berada di permukaan killer, selanjutnya

akan mengikat protein asing yang berada di permukaan sel yang

memiliki gen cacat (Kresno, 2011).

Adanya ikatan sel killer akan melepaskan suatu enzim yang disebut

sebagai sitotoksin. Sitotoksin yang dilepas oleh sel killer tersebut

mengandung perforin dan granzyme. Perforin dapat memperforasi

membran sel yang memiliki gen cacat. Kemudian granzyme dimasukkan

ke dalam sel tersebut. Granzyme yang berada di dalam sitosolik dari sel

yang memiliki gen cacat tersebut akan mengaktivasi kaspase kaskade.

Selanjutnya, kaspase yang aktif ini mengaktivasi DNA-se. DNA-se inilah



yang merusak DNA yang berada di dalam inti, sehingga sel mengalami

kematian (apoptosis) (Mendelsohn, et al., 2008).

c. Kompleks fas dan ligand

Terjadinya apoptosis melalui jalur ligand dan fas dapat terjadi

karena dipicu oleh adanya sel tumor atau sel kanker. Pada sel tumor atau

sel kanker, di permukaannya akan tereksperesi suatu protein yang disebut

fas. Sementara di dalam tubuh terdapat beberapa sel seperti NK-cell

(Natural Killer Cell) dan CTL (Cytotoxic T-Lymphocyte) (Baratawidjaja

dan Rengganis, 2010).

Cytotoxic T -Lymphocyte adalah suatu sel ketahanan tubuh yang

dapat mengekspresikan ligand, sehingga fas di permukaan sel tumor atau

kanker akan diikat oleh ligand yang berada di permukaan NK-cell atau

CTL. Adanya ikatan antara fas-ligand tersebut menimbulkan sinyal

transduksi ke dalam sitosol pada sel kanker, sehingga di dalam sitosol

pada sel tersebut terjadi aktivasi suatu protein yang disebut sebagai Fas

Associated P rotein D eath D omain (FADD). FADD kemudian

mengaktivasi kaskade-kaspase, kaskade-kaspase yang aktif mengaktifkan

DNA-se. DNA-se masuk ke dalam inti dan merusak DNA sehingga sel

mengalami apoptosis (Sudiana, 2008). Untuk mendeteksi jumlah sel

yang mengalami apoptosis diperiksa dengan pemeriksaan tunnel assay

(Sudiana, 2008).



2.2.1.3 Jalur Utama Apoptosis

Jalur utama apoptosis ada dua yaitu jalur intrinsik (mitokondria ) dan

jalur ekstrinsik (death receptor pathway). Kedua jalur terhubung satu dengan

lain, molekul di jalur yang satu dapat mempengaruhi molekul di jalur yang

lain. Selain itu ada jalur tambahan yang melibatkan sitotoksisitas yang

dimediasi oleh sel T dan pembunuhan sel yang bergantung pada perforin

/granzim tetapi yang paling berperan dalam bidang onkologi adalah jalur

intrinsik dan jalur ekstrinsik (Nurhayati dan Lusiyanti, 2006; Kresno, 2011).

Gambar 2.2 Tiga jalur apoptosis yaitu jalur ekstrinsik (death-receptor pathway), jalur intrinsik yang juga disebut jalur mitokondria dan jalur perforin/granzim (Jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik merupakan jalur utama) (Kresno, 2011).

a. Jalur Intrinsik

Jalur intrinsik yang mengawali apoptosis melibatkan sejumlah

besar stimulus yang tidak dimediasi reseptor, yang menghasilkan sinyal



intrasel dan berkaitan erat dengan mitokondria. Stimulus yang mengawali

jalur intrinsik menghasilkan sinyal intrasel yang dapat berupa sinyal

negatif atau sinyal positif. Semua stimulus menyebabkan perubahan pada

pori membran mitokondria sehingga menjadi permeable dan dilepaskan

dua kelompok protein pro-apototik ke dalam sitosol. Kelompok pertama

terdiri atas cytochrome-c, Smac/DIABLO, dan serine protease

HtrA2/Omi. Protein-protein ini mengaktivasi jalur mitochondria yang

bergantung caspase. Cytochrome-c mengikat Apaf-1 dan pro-caspase-9

dan membentuk apoptosom. Smac/DIABLO dan HtrA2/Omi

mempromosikan apoptosis dengan cara menghambat IAP (inhibitor o f

apotosis pr otein). Kelompok kedua adalah AIF, endonuklease G dan

CAD, yang dilepaskan pada saat sel akan mengalami (committed)

apoptosis. Pengontrolan dan pengaturan proses dalam jalur mitochondria

dilakukan melalui keluarga protein Bcl-2 (Kreno, 2011).

b. Jalur Ekstrinsik

Jalur ekstrinsik melibatkan interaksi yang dimediasi oleh reseptor

transmembran, mencakup antara lain reseptor kematian (death-receptor)

keluaga TNF. Receptor dari keluarga memiliki domain ekstra sel yang

kaya akan cystein dan memiliki domain sitoplasmik yang disebut death-

domain yang berperan penting dalam meneruskan sinyal kematian dari

permukaan sel ke jalur persinyalan intrasel. Saat ini telah diketahui ada

beberapa jenis ligand untuk masing-masing reseptor yang karakteristik



dan fungsinya sudah jelas, yaitu Fas/FasR, TNFα/TNFR, Apo3L/DR3,

Apo2L/DR4 dan Apo2L/DR5.

Urutan peristiwa yang terjadi pada jalur ekstrinsik dimulai dengan

pengikatan ligand, misalnya FasL, dengan FasR, disusul dengan

rekrutmen protein-protein adapter sitoplasmik yang merupakan death

domain yang berikatan dengan reseptor tersebut. Dalam hal jalur

FsL/FasR, death domain-nya adalah FADD (Fas associated de ath

domain ), sedangkan pada jalur TNF/TNFR adapter protein yang terikat

adalah TRADD (TNF r eceptor as sociated de ath dom ain). FADD dan

TRADD kemudian berikatan dengan pro-caspase-8 melalui dimerisasi

domain efektor kematian (death efffector dom ain). Pada saat ini

terbentuklah death inducing s ignaling c omplex (DISC) yang

menyebabkan aktivasi autokatalitik pro-caspase-8. Setelah caspase-8

diaktivasi, terjadi stimulasi fase ekskusi. Apoptosis yang dimediasi oleh

reseptor kematian dapat dihambat oleh protein yang disebut c-FLIP yang

mengikat FADD dan caspase-8 sehingga keduanya menjadi tidak efektif

(Kresno, 2011).

2.2.2 Nekrosis

Nekrosis adalah kematian sel, yang terjadi pada kasus jejas berat dan

akut (misalnya anoksia yang mendadak) atau jejas karena faktor fisiko kimia

yang ekstrim (misalnya panas, detergen, basa kuat, dan radiasi). Tetapi

penelitian mutakhir, menunjukkan bahwa kematian nekrotik juga pada masa

perkembangan dan fisiologi sel normal. Khususnya pada beberapa kondisi



patologik (misal iskemia otak) atau kerusakan jantung yang disebabkan oleh

sitokin dan toksin, kematian sel dapat terjadi kedua-duanya melalui nekrosis

dan apoptosis. Secara morfologi, nekrosis ditandai dengan pembengkakan

seluler. Hal ini menyebabkan membran plasma pecah yang berakibat pada

pelepasan isi sitoplasma ke jaringan sekitarnya yang menyebabkan respons

inflamasi. Organel juga bengkak dan pecah, sedang inti masih utuh meskipun

dalam keadaan mmbengkak terjadi penggumpalan kromatin, degradasi DNA.

Degradasi DNA fragmen besar pada waktu nekrosis lebih mengendalikan

serin pr otease daripada kaspase untuk menginduksi aktifitas endonuklease.

Lebih jauh faktor kondensasi kromatin tidak bergantung kaspase AIF ini bisa

berperan juga, seperti merelokalisasi inti selama nekrosis. Keberadaan jalur

kematian sel seperti nekrosis ini diatur oleh program kematian intrinsik yang

khusus yang berbeda dengan apoptosis. Elemen pokok pada nekrosis

fosforilasi oksidatif mitokondria, produksi oksigen reaktif, dan kaskade

proteolitik non kaspase yang tergantung serin protease yaitu calpain atau cat

thepsin. Nekrosis merupakan kematian sebagian jaringan (Pulmeriastuti,

2006).

Nekrosis adalah kematian sel karena adanya kerusakan sistem membran.

Kerusakan membran ini disebabkan adanya aktivitas suatu enzim lisozim.

Aktivitas enzim lisosim dapat terjadi karena adanya kerusakan sistem

membran, oleh suatu faktor tertentu, yang mengakibatkan membran

pembungkus enzim lisozim tersebut mengalami kebocoran. Adanya

kebocoran mengakibatkan lisozim tampah ke sitosol dan akhirnya mencerna



protein-protein, baik yang berada pada sitosol maupun protein penyusun

sistem membran dari sel tersebut (Sudiana, 2008).

2.3 Proliferasi sel

Pada sel normal terdapat keseimbangan antara faktor pertumbuhan sel

dan faktor kematian sel (apoptosis) yang dipengaruhi oleh protooncogene dan

tumor suppresor ge ne. Pertumbuhan sel terjadi karena penambahan ukuran

dan jumlah sel dari populasi sel yang aktif melakukan siklus sel atau aktivitas

proliferasi. Keseimbangan dalam pertumbuhan harus terkontrol. Pada

manusia dewasa jumlah sel relatif tetap. Mitosis pada manusia dewasa

bertujuan untuk menggantikan sel yang mati karena proses apoptosis atau

nekrosis. Kegagalan kontrol keseimbangan mekanisme tersebut dapat

mengakibatkan siklus sel yang tidak terkendali (Mendelsohhn et al., 2008).

Siklus pembelahan sel :

Siklus pembelahan sel pada dasarnya dibagi dua fase :

1. Fase mitosis (M)

2. Fase (fase i nterval), fase antara akhir mitosis dan awal mitosis yang

disebut sebagai interfase. Penggandaan DNA terjadi pada interfase yang

disebut sebagai fase S (sintesis), sedangkan penggandaan sel terjadi pada

fase M (mitosis). Jeda antara akhir fase M dengan awal S disebut fase G-

1, sedangkan jeda akhir fase S dengan awal fase M disebut fase G-2.

Sehingga siklus sel dikenal ada empat fase, yaitu fase M, G-1, S dan G-2.

Pertumbuhan sel kanker berhubungan erat dengan proliferasi, kematian

sel dan derajat diferensiasi. Derajat diferensiasi sel makin jelek, sifat kanker



semakin ganas dan makin cepat pertumbuhannya. Aktivitas proliferasi sel

sangat tergantung pada waktu sel (cell c ycle tim e) yaitu waktu yang

diperlukan untuk suatu proses mitosis ke mitosis berikutnya. Siklus

pembelahan sel dikendalikan oleh suatu protein regulator yaitu cyclin dan

katalisator Cyclin D ependent K inase (CDK). Siklus proliferasi sel atau

pembelahan sel dihambat oleh inhibitor, antara lain ; p2, p21, p27 dan p57.

Inhibitor ini akan mengikat CDK-cyclin complex sehingga menghambat

aktivitas kinase yang akhirnya menghentikan siklus pembelahan sel (Roger

and Robin, 2006).

2.4 Regulasi Apoptosis

2.4.1 Bcl-2

Regulasi dalam apoptosis antara lain adalah anggota keluarga Bcl-2. Ada

18 anggota keluarga Bcl-2 yang diketahui sampai saat ini, dibagi dalam tiga

sub kelompok, yang didasarkan atas strukturnya. Anggota sub kelompok

pertama diwakili oleh Bcl-2 dan Bcl-xl yang memiliki fungsi sebagai anti

apoptosis (Mendelsohn et al., 2008).

Bcl-2 ( B C ell L ymphoma) adalah suatu protein yang berukuran 26 kDa

yang berfungsi sebagai penekan kematian sel yang terprogram (apoptosis).

Bcl-2 menghambat apoptosis dan memperpanjang masa hidup sel saat ada

sinyal apoptosis (Baert, 2008).

Keseimbangan protein anti dan pro kematian sangat mempengaruhi

sel terhadap proses apoptosis. Bcl-2 dan Bax merupakan protein yang penting

dalam menentukan sel untuk proses apoptosis. Bcl-2 merupakan protein yang



mencegah apoptosis atau anti apopt osis dan mempromosikan pertumbuhan

sel, sedang Bax memicu terjadinya apoptosis yang menyebabkan kematian

sel. Keseimbangan antara Bcl-2 dan Bax adalah merupakan hal yang penting

apakah sel akan terus tumbuh atau mengalami apoptosis (Pelengaris et al .,

2006).

Bcl-2 merupakan protein regulator apoptosis sepanjang 25 kDa yang

terletak pada membran mitokondria bagian dalam retikulum endoplasma dan

selubung neklues. Ekspresinya dikaitkan dengan proliferasi sel,

perkembangan jaringan dan morfogenesis (Solomon et al., 2010).

Bcl-2 mengkode protein yang berperan sebagai anti apopt osis.

Dimana protein ini bekerja untuk menekan fungsi protein Bax pada membran

mitokondria karena protein Bax berperan membuka pt-pore, sehingga

cytochrome-c keluar dari mitokondria. Cytochrome-c kemudian mengaktifkan

Apaf-1. Selanjutnya, Apaf-1 mengaktivasi kaskade-kaspase, sehingga sel

mengalami kematian (apoptosis). Dengan adanya aktivasi dari protein Bcl-2,

maka apoptosis tidak terjadi (Sudiana, 2008).

Bcl-2 merupakan protein regulator apoptosis sepanjang 25 kDa yang

terletak pada membran mitokondria bagian dalam, retikulum endoplasma dan

selubung nukleus, ekspresinya dikaitkan dengan proliferasi sel kanker,

perkembangan jaringan sel kanker (Solomon, 2010).

Bcl-2 dikenal sebagai inhibitor apoptosis. Bcl-2 secara spesifik

menghambat kemampuan c-myc untuk menginduksi apoptosis. Ekspresi



Bcl-2 dapat diperiksa melalui reaksi komplek antigen antibodi dengan

pemeriksaan imunohistokimia metode streptavidin-biotin.

2.5 Regulasi Proliferasi

2.5.1 Wild p53

Tumor suppressor protein adalah suatu protein yang berperan sebagai

faktor pengendalian pertumbuhan sel, yang termasuk kelompok ini adalah;

pRb, wild p53. Protein pRb dan wild p53 dapat bekerja di dalam inti sel,

khususnya pada proses pengendalian siklus pembelahan sel, dimana pRb

berperan pada pengendalian faktor transkripsi pada siklus pembelahan sel,

sedangkan wild p53 berperan pada pengendalian CDK pada siklus

pembelahan sel. Selain itu wild p53 juga mempunyai peran dalam pengaturan

kematian sel (apoptosis), yaitu merusak sel yang memiliki urutan nukleotida

yang abnormal (Mendelsohn et al., 2008).

Secara fisiologi pada sel, ada suatu sistem yang mengatur susunan

nukleotida pada rantai DNA yang mengalami perubahan (mutasi). Sistem

tersebut dikenal dengan DNA repair. Kerja dari sistem ini adalah dengan

memperbaiki urutan DNA yang mengalami mutasi. Artinya, apabila terjadi

kerusakan susunan DNA baik disebabkan oleh suatu karsinogen atau

ultraviolet, maka akan muncul suatu respons sel yang disebut sebagai NER

(Nucleotidie Excision Repair). Secara konseptual kerja NER ini dibagi dalam

lima fase, yaitu (1) Damage recognition (b) Incision (c) Excision (d)

Synthesis repair dan (e) Ligation. Oleh karena itu, secara normal sel yang

hanya dapat melakukan proliferasi dan diferensiasi adalah sel yang DNA-nya



memiliki susunan nukleotida yang tidak menyimpang. Apabila perbaikan

DNA gagal, maka akan dilakukan penghentian pertumbuhan sel melalui

penghambatan siklus pembelahan sel, dan selanjutnya terjadi apoptosis.

Selain p21 ekspresinya dikendalikan oleh wild p53, yang bekerja dengan

menghambat semua CDK, juga ditemukan beberapa protein yang berperan

pada siklus pembelahan sel, seperti p15 dan p16. Namun, pengaturan ekspresi

dari protein p15 dan p16 sampai saat ini belum jelas. Akan tetapi, target kerja

dari kedua protein tersebut telah diketahui dengan jelas, yaitu menghambat

CDK-4 dan CDK-6 pada fase G-1. Kinase yang bekerja memicu aktivitas

wild p53 untuk memodulasi protein Bax pada proses apoptosis, antara lain

CPK-2 (Cystein Protein Kinase-2) dan PKC (Sudiana, 2008).

Wild p53 adalah suatu tumor suppressor gene dengan Berat Molekul

(BM) 53 kDa, terletak pada kromosom 17 lengan pendek (17p) dan

mempunyai 11 ekson serta memiliki tiga domain struktural yang

diekspresikan pada semua jaringan tubuh. Struktur wild p53 terdiri atas

daerah N terminal trans-aktivasi, daerah DNA binding dan daerah C terminal.

Daerah N terminal trans-aktivasi bertanggung jawab mengatur stabilitas wild

p53 intrasel. Ikatan dengan MDM2 (Murine D ouble Minute 2) akan

menghambat trans-aktivasi wild p53 dan menyebabkan degradasi wild p53.

Daerah DNA binding spesifik berguna untuk menempel wild p53 pada DNA

di mana penempelan ini berefek menghambat proses transkripsi. Daerah C

terminal berfungsi untuk menempel wild p53 pada rantai tunggal DNA



menyebabkan wild p53 dapat berfungsi untuk aktivasi GADD45 pada proses

perbaikan DNA dan Bax pada apoptosis (Cotran, 2005).

Fungsi protein wild p53 mendeteksi sintesis DNA yang salah atau

kerusakan DNA dan mengatur kelangsungan perbaikan DNA. Salah satu

mekanisme kerja wild p53 adalah menghentikan siklus sel pada fase G1

melalui cell cycl e inhibitor. Wild p53 memicu transkripsi p21, peran p21

bekerja menghambat semua jenis CDK (Cyclin Dependent K inase). Jika

hambatan pertumbuhan sel melalui siklus pembelahan atau perbaikan DNA

kurang sempurna, maka terjadilah apoptosis. Fungsi wild p53 dalam

apoptosis dapat melalui aktivasi Bax dan menghambat aktivitas gen yang anti

apoptosis yaitu Bcl-2 dan Bcl-xl (Kresno, 2011).

Mutasi gen p53 pada umumnya adalah point mutation akan mengubah

sifat protein yang diproduksinya sehingga menghilangkan kemampuan

protein wild p53 baik sebagai materi antiproliferasi, maupun sebagai pengatur

proses apoptosis. Aktivitas wild p53 dapat diatur oleh Murine Double Minute

2 (MDM2). MDM2 dapat mengikat terminal amino (ujung N) dari wild p53,

menyebabkan wild p53 tidak stabil dan dikeluarkan dari inti sel ke

sitoplasma, menekan aktivitas wild p53 dan menyebabkan degradasi wild p53

yang diperantai proteosome. Gene MDM2 diregulasi secara positif oleh wild

p53 sehingga membentuk lingkaran umpan balik (Hui et al., 2004). Ekspresi

wild p53 dapat diperiksa melalui reaksi komplek antigen-antibodi dengan

pemeriksaan imunohistokimia metode streptavidin-biotin.



2.6 Angiogenesis dan VEGF

Kemampuan kanker untuk menginduksi pembentukan pembuluh darah

baru (angiogenesis) sangat berpengaruh pada pertumbuhan kanker dan

metastasis. Aktivitas angiogenesis mengakibatkan ekspansi pertumbuhan

kanker dan meningkatkan resiko metastasis. Pertumbuhan kanker

berlangsung baik bila mendapat cukup suplai darah melalui vaskularisasi

untuk keperluan metabolisme dan proliferasi dan untuk memenuhi kebutuhan

ini kanker meningkatkan kemampuan neovaskularisasi. Kemampuan

angiogenesis dan metastasis menentukan tingkat keganasan kanker, karena

itu analisis kemampuan angiogenesis kanker dapat berperan dalam

menentukan prognosis dan penatalaksanaan penderita kanker (Kresno, 2011).

Angiogenesis adalah pertumbuhan pembuluh darah baru dari

pembuluh darah yang sudah ada, merupakan salah satu faktor penting pada

perkembangan sel kanker. Sel kanker akan meningkatkan jumlah inducer

angiogenesis dan mengurangi jumlah inhibitor angiogenesis yang

disekresikan (Hasina et al., 2001).

Banyak faktor yang berpengaruh pada mekanisme angiogenesis, salah

satu diantaranya adalah; hipoksia (hipoxia inducible factor), misalnya gen

yang menyandi enzim glikolitik seperti aldolase-A, enolase dan LDH-A. Ke

dalam kelompok ini juga termasuk VEGF (vascular e ndothelial gr owth

factor), sesuai namanya merupakan faktor pertumbuhan endotel yang

mendukung pembentukan pembuluh darah baru. Selama pembentukan kanker

terjadi gangguan keseimbangan antara produksi faktor pro dan anti



angiogenik dikenal dengan istilah angiogenik s witch, yang memungkinkan

berlangsungnya proliferasi dan pertumbuhan sel kanker. Banyak faktor yang

memberi kontribusi dalam perubahan keseimbangan itu, diantaranya adalah

faktor pertumbuhan yang diproduksi oleh kanker sendiri, perubahan

linkungan mikro (microenvironment), rekrutmen progenitor sel endotel dari

sumsum tulang dan penekanan inhibitor angiogenesis alami (Mendelsohn et

al., 2008).

2.6.1 Angiogenesis

Angiogenesis atau neovaskularisasi merupakan proses penting untuk

pertumbuhan survival kanker. Proliferasi dan migrasi sel endotel diaktifkan

oleh beberapa faktor angiogenesis seperti tirosin k inase ,reseptor antara lain

vascular endothelial growth factor (VEGF) (Reuben et al.,2011).

Proses angiogenesis diatur melalui persinyalan, melalui berbagai jalur

transduksi sinyal seperti jalur tyrosine kinase. Diantara jalur-jalur itu, dalam

beberapa penelitian akhir-akhir ini terungkap jalur Natch memegang peran

kunci (sebagai koordinator) pada angiogenesis kanker dalam berbagai aspek

yang menyangkut sifat biologik sel endotel selama pembentukan pembuluh

darah. Aktivasi jalur Natch terbukti menghambat proliferasi dan migrasi sel

endotel, dan sebaliknya penekanan aktivitas jalur ini meningkatkan

proliferasi, motilitas dan peningkatan adhesi sel pada kolagen matrik

ekstraseluler, serta mengurangi kemampuan sprouting sel endotel (Kresno,

2011).



Banyak bukti-bukti penelitian yang menyatakan bahwa angiogenesis

atau neovaskularisasi merupakan proses penting untuk pertumbuhan kanker,

bahkan beberapa penelitian mengungkapkan bahwa pertumbuhan kanker

sangat bergantung pada angiogenesis. Beberapa penelitian yang langsung

mendukung teori adalah; 1) ditemukan inhibitor angiogenesis (AGM-1470)

yang menghambat proliferasi sel endotel in vivo maupun in vitro; 2)

ditemukan basic f ibroblast growth f actor (bFGF) yang mitogenik bagi sel

endotel vaskuler dan bersifat angiogenesis kuat. Bukti bahwa bFGF bersifat

angiogenesis diperoleh dari hasil yang mengungkap bahwa injeksi sistemik

bFGF merangsang densitas dan percabangan pembuluh darah dalam kanker

dan menambah volume kanker 2 kali lipat; 3) bukti lain yang mendukung

sifat angiogenik bFGF adalah apabila cDNA dari bFGF ditransfeksikan pada

fibroblast normal, fibroblast tersebut berubah menjadi angiogenesis

tumorigenik; 4) Pertumbuhan tumor otak pada mencit dihambat dengan cara

menekan fungsi reseptor VEGF, sehingga tidak terjadi sinyal angiogenesis


Proses terjadinya angiogenesis : 1) Jaringan yang rusak memproduksi

dan melepaskan faktor pertumbuhan (GF) yang berdifusi ke jaringan di

sekitarnya; 2) Faktor pertumbuhan angiogenik berikatan dengan reseptor

spesifik yang terdapatpada sel endotel pembuluh darah terdekat; 3) Setelah

GF berikatan dengan reseptornya sel endotel menjadi aktif. Sinyal

pertumbuhan diteruskan dari permukaan sel ke nukleus. Sel-sel endotel mulai

membentuk molekul-molekul baru termasuk enzim; 4) Enzim melarutkan



protein dan membentuk lubang-lubang kecil pada membran basal; 5) Sel

endotel mulai berproliferasi dan bermigrasi melalui lubang-lubang menuju

jaringan yang rusak ; 6) Molekul adhesi atau integrin berfungsi sebagai kait

membantu pembuluh darah yang baru; 7) Enzim-enzim misal MMP

diproduksi untuk menghancurkan jaringan didepan ujung pembuluh darah

baru; 8) Sel-sel endotel yang baru menggulung membentuk pembuluh darah

baru; 9) Setiap pembuluh darah saling berhubungan supaya darah dapat

bersirkulasi; 10) Pembuluh darah baru mengalami stabilisasi dengan bantuan

sel-sel otot yang menunjang struktur pembuluh (Kresno, 2011).

2.6.2 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)

VEGF (Vascular endothelial growth factor) adalah suatu protein yang

berukuran 34- 42 kDa, memiliki kemampuan mitogenesis vaskulogenesis dan

angiogenesis (pertumbuhan pembuluh darah dari vaskuler yang sudah ada

sebelumnnya). Angiogenesis merupakan proses yang sangat kompleks,

diregulasi secara ketat oleh beberapa faktor proagiogenik (VEGF) dan faktor

antiangiogenik (Ellis, 2005).

VEGF merupakan regulator vaskulogenesisis maupun angiogenesis.

Sebagian besar jenis sel kanker mengekspresikan VEGF, seringkali dengan

kadar tinggi. Hal ini sejalan dengan bukti-bukti yang menyatakan bahwa

VEGF mudah mengalami perubahan genetik maupun epigenetik. VEGF

bersirkulasi memberikan sinyal melalui reseptor VEGFr-2, reseptor yang

memediasi sprouting angi ogenesis. Adanya temuan bahwa banyak jenis

kanker, termasuk kanker hematologik, mengekspresikan VEGFr (khususnya



VEGFr-1) dan sekaligus memproduksi VEGF mengindikasikan bahwa VEGF

dapat bertindak sebagai faktor pertumbuhan autocrine bagi sel kanker

(Kresno, 2011).

VEGF merupakan famili faktor-faktor pertumbuhan yang terlibat

dalam angiogenesis. VEGF mengikat ke tiga reseptor tirosin k inase yaitu;

VEGFr-1, VEGFr-2, VEGr-3 yang muncul pada sel-sel endotelial, peristiwa

pengikatan ini memicu proliferasi sel endotelial (Reuben et al., 2011).

Peningkatan VEGF dapat diinduksi oleh berbagai faktor lingkungan

mikro atau faktor epigenetik, misal hipoksia, sitokin, faktor pertumbuhan dan

khemokin, maupun kelainan genetik, misalnya mutasi gen p53. PTEN dan

aktivasi onkogen (diantaranya ras, EGFR dan her-2). Pengikatan VEGF pada

VEGFR mengaktifkan kaskade sinyal intraseluler yang berakibat peningkatan

permeabilitas vaskuler, proliferasi, survival, migrasi dan mobilisasi, dalam

hal ini sel-sel progenitor endotel (Mendelsohn et al., 2008).

Ekspresi VEGF dapat diperiksa melalui reaksi komplek antigen-

antibodi dengan pemeriksaan imunohistokimia metode streptavidin-biotin .

2.7 Benzopirene

Benzopirene (B(a)P) adalah senyawa polisiklik hidrokarbon aromatis

(PAH), dengan rumus kimia C20H12 memiliki efek mutagenik yang terdapat

pada batu bara, minyak bumi, asap rokok, gas buangan motor dan makanan

yang dipanggang atau diasap. Benzopirene berupa kristal kuning, berbentuk

jarum, massa molekul : 252,3 dengan titik lebur 179-179,3oC. Benzopirene

adalah salah satu senyawa yang paling banyak diteliti karena sangat



karsinogenik (Guo et al ., 2002). Benzopirene menghasilkan senyawa

metabolit genotoksik BP-7,8 diol- 9,10-oxide. Senyawa genotoksik umumnya

diklasifikasikan berdasarkan susunan kimiawi, terbagi menjadi dua kategori

yaitu pertama senyawa yang secara langsung bersifat genotoksik dan kedua

senyawa yang metabolitnya bersifat genotoksik akibat proses biotransformasi,

bisa bersifat pro-mutagen atau secara langsung bersifat mutagen. Kerja

langsung agen genotoksik sering memiliki perangkat elektrofilik dan

kemudian bereaksi dengan molekul nukleofilik seperti DNA. Genotoksik tak

langsung mempunyai mekanisme melalui aktivasi enzimatik atau

biotransformasi. Sering bersifat lipofilik kemudian sel merubah mereka

menjadi produk larut air. Efek samping konversi ini dihasilkan elektrofilik

yang dapat beeaksi dengan beberapa nukleofilik yang ada yaitu protein, DNA

dan RNA, di sinilah awal terjadinya mutasi genetik (Walum et al., 2000).

Benzopirene merupakan bahan pro-karsinogenik yang akan menjadi

karsinogen jika terbentuk senyawa proximate c arcinogen dan ultimate

carcinogen dengan adanya aktivitas enzimatik. Pada tahap awal, B(a)P di

dalam sel mengalami reaksi epoksidasi pada posisi 7,8 oleh Mixed Function

Oxidase (MFO) yang mengandung bentuk sitokrom p-450 berlokasi pada

membran retikulum endoplasma dan DNA inti sel. Senyawa 7,8 arenoksida

B(a)P akan diubah menjadi senyawa non toksik jika menjadi 7-hidroksil

B(a)P melalui reaksi non enzimatik. Senyawa 7,8 arenoksida B(a)P akan

menjadi karsinogen dikatalis oleh enzim epoksida hidrolase menjadi 7,8 diol,

lalu dioksidasi oleh enzim monooksigenase membentuk ultimate carcinogen



yaitu 7,8 diol - 9,10 oxide yang merupakan senyawa yang sangat reaktif.

Mekanisme onkogenesis yang merupakan proses perubahan proto-oncogene

menjadi oncogene terjadi dengan cara mengikat basa guanin DNA sehingga

terjadi gannguan replikasi DNA mengakibatkan terjadi pertumbuhan kanker

(Guo et al., 2002).

Produk-produk metabolik benzopirene meliputi epoxide intermediates,

dihydrodiols, phenols, quinines dan kombinasi dari produk-produk tersebut.

Benzo (a) pyrene-7,8-hydrodiol-9,10-epoxide adalah toxicant utama

benzopirene dan merupakan electrophilic epoxide yang diproduksi setelah

proses epoksidasi dua langkah (enzim cytochrome P450 dan epoxide

hydrolase). Benzo (a) pyrene-7,8-hydrodiol-9,10-epoxide adalah sebuah

epoxide electrophilic dan terbukti sangat mutagenik (Vidmar et al., 2004).

Benzopirene diserap melalui rute pemaparan oral, inhalasi dan dermal.

Absorbsi dari saluran gastrointestinal mencit dan kucing ditingkatkan ketika

dilarutkan dalam media yang memiliki sifat lipophilic dan hydrophilic (Faust

et al.,1994).

Benzopirene dimetabolisasi pada awalnya oleh sitokrom mikrosomal

P450 sistem monooxygenase ke beberapa arene ox ides, yang bisa tersusun

kembali secara spontan ke fenol, mengalami hidrasi ke trans-dihydrodiols,

atau bereaksi secara kovalen dengan glutathione-S-transferases. Salah satu

metabolik phenolic,6-hydroxybenzo (a) pyrene, dioksidasi menjadi 1,6- 3,6-

atau 6,12-quinones. Phenols, quinones dan dihydrodiols bisa didetoksifikasi

dengan konjugasi ke glucuronides dan sulfate esters dan quinones bisa juga



membentuk glutathione c onjugate. Selain konjugasi, dihydrodiol ini

mengalami metabolisme oksidatif. Benzo (a) pyrene 7,8-dihydrodiol sebagian

dioksidasi menjadi 7,8-diol-9,10-epoxide, senyawa yang dianggap sebagai

metabolit karsinogenik utama Benzopirene (Faust et al.,1994).

Chemical Formula : C20H

12

Chemical Structure :

Gambar 2.3 Struktur Kimia Benzopirene (Vidmar et al., 2004)

Reaksi benzopirene setelah dipaparkan pada mencit seperti di bawah ini :

Gambar 2.4 Reaksi aromatik hidrosilasi dan epoksidasi (Sudiana, 2008)



2.8 Punica granatum L (Delima)

2.8.1 Klasifikasi, Nama Lain Komposisi Delima (National Plant Data Centre,

2000)

Klasifikasi delima adalah sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Subkelas : Rosidae

Ordo : Mytales

Famili : Lythraceae

Genus : Punica

Spesies : P. granatum L

Delima memiliki sebutan yang berbeda-beda tergantung dari daerah

mana buah berasal. Beberapa nama untuk delima adalah :

Inggris : Wild pomegranata

Sumatera : Glima (Aceh), Glimau mekah (Gayo), Dalimo (Batak),

Delima (Melayu)

Jawa : Dlima (Jawa Tengah) Dhalima (Madura)

Nusa Tenggara : Jeliman (Sasak), Talima (Bima), Dila daelak (Roti),

Lekokae (Timor).



Gambar 2.5 Punica granatum L (Delima) (National Plant Data Center,

2000) Ada 3 jenis delima yaitu; delima merah, delima putih dan delima hitam,

buahnya berwarna ungu tua yang sering dipakai sebagai penelitian adalah

delima merah. Delima merah kaya dengan kandungan anthocyanin

(pelargonidin dan c yanidins) dan merupakan antioksidan. Anthocyanin

dijumpai pada buah-buahan dan sayuran yang berwarna biru, ungu dan merah

(Seeram et al.,2005).

Jus delima merah memiliki antioksidan, antiinflamasi yang kuat dan

bersifat kemopreventif dan kemoterapi pada sel kanker prostat, kanker usus

besar secara invitro. Sifat antioksidan (menyumbang 92%), sifat antioksidan

yang kuat bersifat kemopreventif dan kemoterapi ( Seeram et al.,2005; Malik

et al.,2005).

2.8.2 Bahan Aktif Delima (PGL)

Berbagai kandungan fitokimia telah berhasil diidentifikasi dari bagian

tanaman delima. Kelompok utama fitokimia delima adalah polyphenol yang

banyak ditemukan pada buahnya. Polyphenol delima terdiri dari flavonoids

(flavonols, flavanols dan ant hocyanins), hydrolyzable t annins (ellagitannins

dan gallotannins) dan condensed tannins (proanthocyanidins). Fitokimia lain



yang ditemukan pada delima adalah organic dan phenolic a cid, sterols dan

triterpenoids, fatty acids, triglycerides dan alkaloids (Seeram et al., 2006).

Hydrolyzable tannins (HTs) sebagai bagian utama polyphenol dalam jus

delima memiliki aktivitas antioksidan sebesar 92% (Gil et al ., 2000).

Punicalagin merupakan bagian HTs paling dominan, bertanggungjawab

terhadap hampir separuh dari aktivitas antioksidan jus delima, daun, batang

dan buah delima mengandung lebih dari 18 struktur HTs (Seeram et al .,

2006).

Flavonoid yang terkandung dalam delima telah terbukti memiliki

aktivitas antioksidan dengan melindungi membran sel dari pengaruh radikal

bebas. Senyawa yang termasuk flavonoid, yaitu lutheolin, quarcetin dan

kaempferol banyak ditemukan pada kulit delima, sedangkan anthocyanidins

banyak ditemukan pada bijinya (Seeram, et al., 2006).

Punicalagin, merupakan salah satu senyawa ellagitannins yang banyak

ditemukan pada selaput buah dan batang delima. Punicalagin yang

terkandung dalam jus delima memiliki aktivitas antioksidan hingga 89%.

Walaupun tidak dapat langsung diabsorbsi oleh tubuh karena ukurannya yang

besar, punicalagin akan mengalami hidrolisis di dalam usus sebelum

diabsorbsi. Proses hidrolisis yang ditandai dengan pembentukan ellagic acid

akan menyebabkan konsentrasi ellagic ac id yang stabil dalam hingga lebih

dari 6 jam setelah pemberian (Seeram et al., 2006).

Ellagic acid yang terbentuk akan dimetabolisme menjadi urolithin sekitar

12 jam setelah diabsorbsi dan urolithin dapat dideteksi dalam darah dan urin



hingga 48 jam setelah pemberian dosis tunggal. Ekstrak buah delima dan jus

delima memiliki metabolisme dan bioavailabilitas yang sama. Kandungan

ellagic ac id di dalam produk yang berasal dari delima digunakan sebagai

standart untuk menjamin bahwa produk tersebut mengandung ekstrak buah

delima yang asli.Standart ellagic ac id yang banyak digunakan dan optimal

untuk terapi adalah standarisasi 40% ellagic ac id (Jurenka, 2008; Zhang et

al., 2009).

Ellagic acid, suatu soluable polyphenol, telah terbukti memiliki aktivitas

antioksidan, antiinflamasi dan dapat mencegah destruksi gen p53 oleh sel

kanker. Ellagic acid dapat berikatan dengan sel kanker dan membentuk suatu

molekul kompleks, sehingga sel kanker menjadi inaktif. (Seeram et al., 2005).

Gambar 2.6 Struktur Kimia Punicalagin (a) dan Ellagic Acid (b) (Seeram et al., 2005)

Ellagic acid merupakan inhibitor yang cukup potensial terhadap tyrosine

protein k inase, suatu molekul yang memiliki aktivitas yang berhubungan

dengan kemampuan virus tertentu untuk mentransformasi sel normal menjadi

sel kanker. Selain memiliki aktivitas kemoprotektif terhadap berbagai bahan



kimia yang mampu menginduksi kanker, ellagic acid juga memiliki aktivitas

anti bakteri dan antiviral. Fungsi lain dari ellagic acid adalah sebagai bahan

yang mampu melindungi kerusakan sel karena radikal bebas. Kemampuan ini

akan secara sinergis mengalami peningkatan apabila dikombinasi dengan

komposisi lain buah delima yang juga merupakan antioksidan yang cukup

kuat, yaitu anthocyanidin (Seeram et al., 2005; Lansky and Newman, 2007).

Anthocyanidins (pelargonidin dan c yanidins) merupakan antioksidan

yang telah terbukti dapat membantu memperbaiki fungsi pembuluh darah

baik pada manusia maupun hewan. Anthocyanidin banyak dijumpai pada

buah-buahan dan sayuran yang berwarma biru, ungu dan merah seperti

blueberries, blackberries, plum, cranberries, raspberries, strawberries,

delima, bayam merah dan kol merah. Anthocyanidin dapat ditemukan dalam

cairan sel (tidak seperti klorofil dan carotene yang menempel pada membran

sel). Warna pigmen dapat berubah-ubah sesuai dengan pH dari cairan sel.

Cairan sel yang sedikit asam akan membuat pigmen berwarna ungu.

Anthocyodin dapat dimanfaatkan untuk proses pembuatan makanan yang

menghindari pemakaian zat aditif sintetis (Seeram et al., 2006).

Empat kandungan kimia dalam buah delima merah (PGL), yaitu ellagic

acid, caffeic acid, luteolin dan punicid acid secara individual menunjukkan

aktivitas anti kanker pada sel kanker prostat secara invitro. Namun bila

dikombinasikan, keempatnya menunjukkan aktivitas yang berlipat ganda

(Seeram et al., 2006).



Delima (PGL) telah dikenal sejak lama di seluruh dunia karena memiliki

manfaat yang sangat luas bagi kesehatan. Secara garis besar, aktivitas yang

dimiliki oleh delima adalah sebagai antioksidan, antiinflamasi dan antikanker.

2.8.3 Aktivitas Delima (PGL) sebagai Antikanker, Antioksidan, dan

Antiinflamasi

Beberapa penelitian juga telah membuktikan bahwa buah delima (PGL)

memiliki kandungan fitofarmaka yang memiliki nilai pengobatan tinggi yang

dapat dilmanfaatkan untuk memperkaya kasanah bahan obat. Pohon dan buah

delima dapat dibagi menjadi beberapa kompartmen anatomi, seperti biji, sari

buah, kulit, dan bunga, batang dan akar, di mana kandungan masing-masing

bagian memiliki aktivitas farmakologi yang berbeda (Lansky and Nawman,

2007; Jurenka, 2008). Berbagai penelitian terhadap manfaat delima terhadap

berbagai penyakit adalah :

2.8.3.1 Aktivitas Antikanker

Kanker berkembang ketika keseimbangan antara proliferasi sel dan

kematian sel terganggu. Keganasan memerlukan pola terapi yang bersifat non

sitotoksik pada sel normal (Lansky and Newman, 2007) Fraksi polifenol yang

kaya akan flavonoid yang dimiliki delima telah terbukti memiliki aktivitas

anti invasi, antieicosanoid, bersifat menstimulasi apoptosis pada sel kanker

payudara dan prostat serta memiliki aktivitas anti angiogenik, baik invitro

maupun invivo. Jus delima mampu menurunkan ekspresi protein COX-2

sebasar 79% bila diberikan dengan konsentrast 50 mg/L. Dengan konsentrasi



yang sama, tannin delima hanya mampu mengurangi sebesar 55% dan

punicalagin sebesar 48% (Sartippour et al., 2008).

Penelitian secara invitro terhadap cell line kanker prostat telah

membuktikan bahwa ekstrak berbagai tanaman delima potensial dalam

menghambat invasi dan proliferasi sel kanker prostat, menginduksi apoptosis

sel kanker dan menghambat pertumbuhan kanker. Penelitian ini juga

menemukan kombinasi ekstrak buah delima yang berasal dari berbagai bagian

buah lebih efektif bila dibandingkan dengan ekstrak tunggal bagian buah

(Albrecht et al., 2004 ; Lansky and Newman, 2007).

Penelitian tentang pengaruh delima terhadap penurunan prostate spesific

antigen (PSA) juga telah dilakukan. Setelah pemberian delima, terjadi

penurunan PSA hingga 27% yang disertai dengan penurunan proses

proliferasi sel serta peningkatan jumlah sel kanker yang mengalami

apoptosis. Hasil ini mengindikasikan bahwa delima memiliki aktivitas

antiproliferasi, antiinflamasi, antioksidan dan pro apoptosis pada sel kanker

(Pantuck et al., 2006).

Penelitian lain juga membuktikan bahwa delima dapat menghambat

angiogenesis melalui regulasi terhadap vascular e ndothelial gr owth f actor

(VEGF) pada kanker payudara, hal ini disebabkan karena produksi faktor

angiogenik tersebut diregulasi oleh NF-kB (Seeram et al., 2006).

Konsumsi oral delima dalm bentuk ekstrak dapat menghambat

penggandaan kanker paru-paru pada mencit yang diinduksi benzopirene.



Ekstrak delima mendownregulasi aktivasi MAPK, NF-kB, P13K/Akt serta

menurunkan proliferasi sel dan angiogenesis (Khan et al., 2007).

Pada penelitian secara invitro pada kanker prostat ekstrak buah delima

dapat menghambat invasi sel kanker prostat, anti proliferasi, menginduksi

apoptosis dan menghambat pertumbuhan kanker (Jurenka., 2008).

Delima (PGL) memiliki aktivitas antioksidan paling tinggi bila

dibandingkan dengan tanaman lainnya, contohnya red wine, jus blueberry, jus

jeruk dan t eh hijau (Azadzoi and Siroky, 2009). Perbedaan aktivitas tersebut

diduga disebabkan oleh komposisi kandungan senyawa polyphenol yang

berbeda.

Ekstrak buah delima (PGL) menghambat pertumbuhan sel dan

menginduksi terjadinya apoptosis pada sel PC3 karsinoma prostat pada

manusia yang sangat agresif (Bell and Hawthorne, 2008).

Penelitian invitro terhadap cell line kanker prostat telah membuktikan

bahwa ekstrak berbagai bagian tanaman delima (PGL) potensial dalam

menghambat invasi dan proliferasi sel kanker prostat, mengganggu siklus sel,

menginduksi apoptosis sel kanker dan menghambat pertumbuhan kanker.

Penelitian ini juga menemukan bahwa kombinasi ekstrak delima yang berasal

dari berbagai bagian buah lebih efektif bila dibandingkan dengan ekstrak

tunggal bagian buah (Albrecht et al., 2004; Lansky and Newman, 2005).

Whole ekstrak delima (PGL) yang dilakukan penelitian pada sel line

HaCaT, dengan dosis 0,1% dapat menstimulasi peningkatan IFN-γ

(Thongrakard, 2010). Punica granatum ekstrak ethanol yang diberikan secara



oral pada mencit dengan dosis 75 mg/kg/bb/hari selama 10 hari menunjukkan

hasil yang paling efektif sebagai anti mutagenic dan menghambat

perkembangan kanker (Valadares et al., 2010).

Empat kandungan kimia dalam buah delima, yaitu ellagic ac id, caffeic

acid, luteolin dan punicid ac id secara individual menunjukkan aktivitas

antikanker pada sel kanker prostat. Namun bila dikombinasikan, keempatnya

menunjukkan aktivitas berlipat ganda (Seeram et al., 2006).

Penelitian ini juga membuktikan bahwa delima dapat menghambat

angiogenesis melalui regulasi terhadap vascular e ndhothelial gr owth f actor

(VEGF) pada kanker payudara (Tio et al ., 2003). Hal ini disebabkan karena

produksi faktor angiogenik tersebut diregulasi oleh NF-kB (Seeram et al .,

2006).

Ellagic ac id salah satu komponen buah delima (PGL) masuk ke dalam

sel kanker melalui reseptor estrogen subtype ERα dan ERβ, ERα dan ERβ

termsuk reseptor inti sel, memidiasi/mengikat sebagai homodimer atau

heterodimer secara langsungke inti sel (Papoutsi et al., 2005).

Ellagic acid menunjukkan sifat antioksidan, antiproliferatif,

kemopreventif pada berbagai jaringan dan sel kanker pada, payudara, kolon,

prostat, paru-paru, liver, leukemia. Ellagic a cid mengeluarkan efeknya

melalui aktivasi berbagai jalur khusus misalnya; apoptosis, perlindungan

terhdap kerusakn DNA, oksidtif atau oksidasi LDL, perubahan ekspresi faktor

pertumbuhn dan juga melalui ekspresi p53, NF-kB dan gen-gen responsif

famili PPAR (Papoutsi et al., 2005).



Ellagic ac id pada penelitian menggunakan cell line MDA-MB-23

menunjukkan fungsi sebagai anti proliferatif menurunkan ekspresi BCL-xl

begitu juga dengan menggunakan cell line MCF-7 (human breast cancer)

berfungsi sebagai anti proliferatif (Kim et al., 2009).

Polyphenol dari jus delima yang difermentasi menunjukkan efek anti

kanker Terhadap sel-sel payudara manusia secara invitro. Ellagic acid salah

satu konstituen jus delima dan minyak biji dilaporkan bekerja melawan

kanker kulit, pankreas, payudara, prostat, kolon, usus, kandung kemih (Sai

Prakash and Indra Prakash, 2011).

Polyphenol merupakan salah satu komponen buah delima (PGL)

dilaporkan mempunyai kemampuan antikanker serta dapat menstimulasi IFN-

γ, menghambat MAPK (Suryanto, 2007). Polyphenol masuk ke dalam sel

kanker melalui reseptor laminin sebagai media pada proses apoptosis dengan

menstimulasi TRAIL. Reseptor laminin masuk ke sel kanker dan berikatan

dengan sel kanker melalui jalur fas- ligand (Burlado et al., 2010).

Penelitian yang terfokus pada interaksi aktivitas antiproliferasi caffeic

acid, 3,4-dihydrophenylacetic acid (PAA), syringe acid, protocatechuic acid

dan ferulic ac id pada T47D cell line kanker payudara manusia dengan

konsentrasi yang sama atau sedikit lebih rendah daripada yang diharapkan

dapat dikonsumsi secara normal. Hasil yang diperoleh juga mengindikasikan

bahwa phenolic acid yang dimiliki oleh delima mampu menghambat

pertumbuhan sel kanker secara invitro (Kim et al., 2002).



Luteolin merupakan flavonoid, flavonoid berkontribusi terhadap efek

protektif terhadap terjadinya kanker. Flavonoid berfungsi sebagai scavenger

radikal bebas melindungi organisme dari spesies oksigen reaktif (ROS), dari

kasinogenik. Flavonoid terbukti menunjukkan kapasitas antiinflamasi, karena

terjadiny kanker berhubungan dengan proses inflamasi (Seelinger et al .,

2008). Luteolin masuk ke dalam sel kanker melalui reseptor erostgen

(Papoutsi et al., 2005).

Punicid ac id pada buah delima (PGL) menghambat sel kanker melalui

reseptor estrogen (Hoang et al., 2010). Caffeid acid pada buah delima (PGL)

sebagai antikanker melalui reseptor estrogen (Burlando, 2010). Reseptor

estrogen termasuk superfamili reseptor inti, memediasi efek-efek estrogen

dengan mengikat sebagai homodimer atau heterodimer secara langsung ke

DNA dan menunjukkan aktivitas estrogenik / antiestrogenik, berperan

protektif terhadap kanker (estrogen ERβ), punicid acid dan caffeid acid dari

delima memodulasi Erα Sebagai antagonis dari kerja estrogen ERβ dan

merupakan ligan Erα dn ERβ (Papoutsi et al., 2005).

2.8.3.2 Aktivitas Antioksidan

Delima memiliki aktivitas antioksidan paling tinggi bila dibandingkan

dengan tanaman lainnya, contohnya red wine, jus bluberry, jus jeruk dan teh

hijau. Perbedaan aktivitas komposisi kandungan senyawa polyphenol yang

berbeda (Azadzoi and Siroky, 2009).

Seluruh bagian tanaman delima mengandung polyphenol dan memiliki

aktivitas anti oksidan. Bagian tanaman yang pling potensial digunakan



sebagai antioksidan adalah kulit, batang dan kulit batang. Pada buah delima,

membran buah yang mengandung banyak tannins dan anthocyanins memiliki

aktivitas anti oksidan paling tinggi. Gallic ac id, tannins dan anthocyanins

yang terkandung dalam delima dapat bertindak sebagai scavenger dan

chelating agent (Seeram et al., 2006).

Pomegranate pul p j uice (PPJ) pada manusia telah terbukti memiliki

aktivitas antioksidan lebih tinggi daripada jus apel. Dengan menggunakan

teknik atau metode ferric reducing/antioxidant power (FRAP), telah terbukti

bahwa konsumsi 250 ml PPJ setiap hari selama 4 minggu dapat memberikan

efek yang baik pada individu yang telah berumur dan meningkatkan kapasitas

antioksidan plasma dari 1,33 mmol menjadi 1,46 mmol (Gil et al., 2008).

2.8.3.3 Aktivitas Antiinflamasi

Senyawa yang terkandung dalam delima telah terbukti memiliki aktivitas

antiinflamasi dan antikanker. Aktivitas tersebut disebabkn karena pengaruh

delima terhadap NF-kB, cyclooxygenase (COX) dan lipoxygense (LOX) yang

terlibat dalam proses tersebut. Nuclear f actor k appa B (NF-kB) merupakan

faktor transkripsi yang akan teraktivasi sebagai respons terhadap karsinogen.

Delima telah terbukti memiliki aktivitas menghambat aktivasi NF-kB yang

terlibat dalam proses perkembangan berbagai jenis kanker. Delima juga

menghambat aktivitas COX-2, yaitu enzim yang terinduksi oleh aktivitas

agen mitogenik atau inflamatorik (Seeram et al., 2006).

Minyak biji delima terbukti menghambat cyclooxygense dan enzim

lypoxygenase secara invitro. Cyclooxygense, enzim utama dalam konversi



asam atachidonic menjadi leukotrine mediator inflamasi. Studi secara invitro

delima (PFE) memiliki efek inhibitor signifikan terhadap MMPs pada

penderita osteorthritis (Jurenka, 2008).

Berdasarkan uraian di atas diharapkan bahwa ekstrak buah delima dapat

dimanfaatkan sebagai agen antikanker pada karsinoma sel skuamosa rongga

mulut (KSSRM), hal ini di landasi bahwa ekstrak buah delima mempunyai

aktivitas antikanker pada kanker lain dan juga mempunyai komponen bahan

aktif lebih banyak sebagai antikanker dibanding ekstrak buah mahkota dewa,

yang hanya ada pada polyphenol saja. Disisi lain, ekstrak buah delima telah

terbukti memiliki aktivitas antioksidan, antiinflamasi, antiangiogenesis.

2.9 Phaleria Macrocarpa (Mahkota Dewa)

Adalah salah satu tanaman obat tradisional Indonesia, sebagai obat anti

kanker yang sudah di jual di pasar. Obat anti kanker ekstrak biji mahkota

dewa di jual oleh PT Mahkota Dewa Jakarta, dalam penelitian ini dipakai

sebagai kontrol. Kandungan zat aktif biji mahkota dewa antara ; alkaloid,

terpenoid, saponin, polyphenol. Polyphenol dapat menghambat pertumbuhan

kanker pada leukemia L1210 dan menginduksi apoptosis. Polyphenol juga

dapat menstimulasi produksi IFN-γ, yang penting dalam memacu aktivitas

CTL dan sel NK, mempunyai potensi sitostattika dan imunostimulator,

dilaporkan juga dapat menghambat aktivasi NF-k B (Suryanto, 2007).

Mahkota Dewa termasuk dalam famili Thymelaeaceae, memiliki aktifitas

antimikroba, hal ini berkaitan dengan toksisitas tanaman yang cukup tinggi

dan harus hati-hati dalam penggunaan dosis. Senyawa polyphenol mempunyai



efek memblok reseptor growth factor, menginhibisi MAPK (Mitogen

Activated Protein Kinase), mahkota dewa cukup bermakna untuk

meningkatkan indeks apoptosis peningkatan dosis diikuti kenaikan indeks

apoptosis karena kandungan polyphenol yang tinggi (Suryanto, 2007).

Ekstrak biji mahkota dewa menunjukkan efek antiproliferasi terhadap sel

kanker HM3KO dengan Ica 19.95 kurang lebih 3,57 ug/ml. sehingga dapat

dijadikan sebagai agen kemopreventif terhadap kanker (Kintoko et al., 2007).

Ekstrak biji mahkota dewa dosis 250 ug/ml dan 500ug/ml dapat

menaikkan ekspresi protein p53 secara bermakna dibanding dengan

kelompok kontrol (Wahyuningsih, 2006). Penelitian efek ekstrak etanol biji

mahkota dewa pada cell line ca kolon bersifat sitotoksi melalui peningkatan

caspase-3, peningkatan dosis menyebabkan peningkatan ekspresi caspase-3

aktif (Widyasari et al., 2011).

2.10 Imunohistokimia

Imunohistokimia adalah suatu pemeriksaan imunologik dengan

menggunakan antibodi sebagai probe yang sifatnya spesifik bertujuan untuk

mendeteksi suatu antigen dan letaknya didalam jaringan biopsi (Rantam,

2003). Imunohistokima dapat digunakan untuk mendeteksi antigen pada sel

yang terfiksasi dengan menggunakan monoklonal antibodi apabila tidak

terdenaturasi walaupun dalam konsentrasi rendah, antigen tetap dapat

berikatan dengan antibodi. Prinsip metode ini adalah perpaduan antara reaksi

imunologi dan kimiawi yaitu reaksi antigen-antibodi dan reaksi antara enzym

dan substrat. Antibodi yang digunakan adalah spesifik untuk antigen tersebut



dan dilabel dengan enzim. Enzim yang dapat digunakan untuk melabel adalah

peroksidase (tehnik peroksidase-anti pe roksidase / PAP), alkali fosfatase

(tehnik alkali fosfatase-anti alkali fosfatase /APAAP) dan β-galaktosidase.

Reaksi enzimatik ditandai dengam indikator warna atau kromogen, yaitu

naftol yang berwarna biru dan DAB (3,3 diaminobenzidine) yang berwarna

kecoklatan (Rantam, 2003; Sudiana 2005).

Prinsip dasar pemeriksaan imunohistokimia sama dengan

imunofluoresensi berdasarkan ikatan antigen antibodi yang dapat dideteksi

apabila antibodi yang mengikat telah diberi label. Pada imunohistokimia

labelisasi menggunakan aktifitas enzim, yang akan menghasilkan warna

setelah diberi tambahan kromogen. Warna akan tampak pada daerah

kompleks enzim antibodi di dalam jaringan yang terlihat dengan pemeriksaan

mikroskop cahaya. Pemeriksaan imunohistokimia dapat dilakukan dengan

berbagai tehnik pewarnaan antara lain metode peroksidase anti peroksidase,

avidin bi otin, kompleks dan streptavidin biotin. Metode peroksidase ant i

peroksidase (PAP) merupakan varian dari metode uji imunoperoksidase

dimana prinsip kerjanya sama dengan pemeriksaan imunofluoresen. Hanya

pada uji imunohistokimia pemberian antibodi berlabel enzim tidak secara

langsung dimana antibodi yang terikat terdeteksi melalui labeled antiglobulin.

Teknik imunoperoksidase lebih menguntungkan dibanding imunofluoresen

karena pembacaan menggunakan mikroskop medan gelap. Sedian tercat

sedemikian rupa sehingga hubungan struktur jaringan atau sel lebih mudah

diamati Keuntungan lain sediaan yang sudah jadi dapat disimpan secara



permanen dan dapat diadaptasikan untuk pemeriksaan mikroskop elektron

(Wasito, 2001).

Prosedur pemeriksaan avidin-biotin didasarkan ikatan avinitas avidin

biotin. Biotin dapat dilekatkan secara kimia dengan antibodi primer

menghasilkan senyawa blotnilated yang ditambahkan pada irisan jaringan

akan menunjukkan tempat antigen pada jaringan. Uji avidin-biotin

mempunyai reaktan dengan afinitas yang lebih tinggi dan memberikan

peningkatan sensitivitas yang cukup tinggi dibandingkan PAP. Metode

streptavidin biotin banyak digunakan dalam bidang imunologi, karena

berbagai kelebihan antara lain biotin yang mudah berikatan dengan berbagai

protein dan ikatan yang amat kuat antara streptavidin dengan biotin.

Keuntungan lain adalah dapat mengeliminasi ikatan lain yang non spesifik,

sehingga tidak terjadi berbagai reaksi non spesifik yang sering terjadi pada

ikatan dengan avidin. Oleh karena itu streptavidin biotin dianggap lebih

bagus bila dibandingkan dengan avidin biotin kompleks, karena streptavidin

mempunyai kemampuan mengikat biotin lebih banyak dan sangat kuat,

sehingga hasil pewarnaan menjadi lebih jelas. Streptavidin bi otin juga

menguntungkan dibanding PAP, karena menggunakan reagen pelabel yaitu

conjugated s treptavidin enzyme sebagai ganti PAP kompleks yang berbeda

untuk setiap sistem organ (Wasito, 2001).

Pemeriksaan metode imunohistokimia dibagi 2 macam yaitu, metode

langsung apabila antibodi monoklonal yang digunakan untuk mendeteksi

suatu marker pada sel langsung dilabel dengan enzym dan metode tak



langsung bila antibodi monoklonal tidak dilabel dengan enzim, tetapi dengan

antibodi sekunder yang dilabel enzim atau menggunakan bahan perantara

seperti biotin-streptavidin atau biotin-avidin (Rantam, 2003; Sudiana, 2005).

2.11 Tunnel Assay

Tunnel assay adalah salah satu metode pemeriksaan sel apoptosis yang

spesifik di mana teknik ini mampu mendeteksi putusnya rantai tunggal dan

rantai ganda DNA yang berhubungan dengan apoptosis. Rantai DNA yang

putus dideteksi secara enzimatis melalui labelling terhadap gugus 3-OH,

fragmen DNA dilabel dengan digoxigenin-nucleotide yang kemudian diikat

oleh anti-digoxigenin antibody. Ikatan konjugat pe roxidase antibody secara

enzimatik akan membentuk warna dari substrat kromogenik yang permanent,

jelas dan terlokalisir sehingga menjadi deteksi apoptosis yang sensitive pada

sel. Sehingga dapat dibedakan antara sel nekrosis dengan apoptosis melalui

deteksi pemutusan rantai DNA dan kondensasi kromatin yang berhubungan

dengan apoptosis. Pada nekrosis juga terjadi putusnya rantai DNA dan tidak

menutup kemungkinan terbentuknya gugus 3-OH, tetapi gugus ini tidak

terbentuk sebanyak pada sel apoptosis, sehingga andaikata cacat sekalipun

akan membentuk warna yang sangat terang atau sangat muda, sehingga untuk

membedakan adalah dengan terdapatnya pewarnaan fokal in situ di dalam

apoptotic nuclei dan apoptotic bodies, demikian pula dengan sel yang sedang

membelah juga tidak menghasilkan gugus 3-OH dalam jumlah besar sehingga

tidak tercat. Reagen ini dapat menyambung ujung 3-OH secara in situ dengan

nukleotida yang dilabel dan tidak dilabel secara kimia. Nukleotida yang



terkandung dalam reaction buffer disambung dengan ujung 3-OH dari DNA

secara enzimatis dengan bantuan enzim TDT (Terminal de oxynucleotidyl

transferase) yang berfungsi sebagai katalisator reaksi penyambungan trifosfat

nukleotida ke ujung 3-OH. Pelabelan nukleotida dengan digoxigenin secara

acak bertujuan untuk memicu ikatan antibody anti digoxigenin dengan

digoxigenin. Fragmen DNA yang telah disambung dengan nukleotida yang

dilabel digoxigenin diikat anti digoxigenin p eroksidase c onjugate sehingga

dengan penambahan substrat kromogenin pada sel yang mengandung ujung

3-OH akan berwarna hijau flouresens dengan penambahan mikroskop

fluoresens (Spector et al., 1998).



BAB 3

KERANGKA KONSEPTUAL

3.1 Kerangka Konsep

yang diteliti tidak diteliti menghambat

Gambar 3.1 Kerangka Konsep.

60

Wild p53 ↑

Bax ↑

Kaskade-Kaspase ↑

Bcl-2

Cytocrom-C

Apaf-1 ↑

DNA-se ↑

Apoptosis

PLC

Phospholipase A2

Phosphootydil Colin

p21 ↑

CDK

Siklus sel berhenti

Lisophos-photydil C

Prostaglandin

Cox-2

Asam Arakidonat

Angiopoitin

VEGF

Angiogenesis↓

FADD

Kaskade-kaspase ↑

DNA-se ↑

Delima (PGL)

Fas-ligand

R. Estrogen

PI2P

PI3P

ER

Ca2+

R. Laminin



3.2 Penjelasan Kerangka Konsep

Transformasi sel pada hewan percobaan dapat diperoleh dengan

melakukan paparan benzopirene 0,04 mg/0,04 ml olium ol ivarum pada

mukosa bukal rongga mulut mencit sebelah kanan 3 kali seminggu selama 4

minggu. Benzopirene menghasilkan metabolit reaktif BP-7,8-dihydrodiol -

9,10-epoxide yang akan berikatan secara kovalen dengan DNA pada sel dari

mencit sehingga terjadi mutasi. Gen yang mengalami mutasi mempunyai

kemampuan proliferasi dan diferensiasi yang sangat tinggi.

Gen yang mengalami mutasi khususnya gen-gen yang mengkode protein

yang berperan pada pengaturan siklus pembelahan sel (kelompok

protooncogene dan kelompok tumor supressor gene).

Kelompok protooncogene, gen Bcl-2 mengkode protein yang berperan

sebagai anti apoptosis, dimana protein bekerja untuk menekan fungsi protein

Bax pada membram mitokondria. Jika terjadi mutasi pada Bcl-2, maka Bcl-2

akan overaktif sehingga protein Bax tidak berfungsi. Adanya aktivasi dari

Bcl-2 maka apoptosis tidak akan terjadi.

Kelompok tumor s uppressor ge ne suatu protein yang berperan sebagai

faktor pengendalian pertumbuhan sel, termasuk kelompok dari protein ini

antara lain protein 53 (p53) yang dikode oleh gen p53 (P53). Wild p53 dapat

bekerja di dalam inti sel, khususnya pada proses pengendalian siklus

pembelahan sel, sebagai faktor traskripsi terhadap pembentukan p21 yang

akan menghambat semua CDK dan mempunyai peran dalam pengaturan

kematian sel (apotosis).



Ekstrak buah delima (PGL) terstandar masuk ke dalam sel yang

mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa melalui reseptor estrogen

mengaktifkan wild p53, wild p53 memicu faktor transkripsi terhadap p21, p21

yang disentesis akan menekan semua CDK dan siklus pembelahan sel

berhenti. Saat siklus sel berhenti, wild p53 akan memicu Bax, protein Bax

(pro apoptosis) akan menekan Bcl-2 (antiapoptosis) pada membran

mitokondria, sehingga terjadi perubahan permeabilitas membran dari

mitokondria. Perubahan ini mengakibatkan terjadi pelepasan cytochrome-c ke

sitosol. Di sitosol cytochrome-c akan mengaktivasi Apaf -1 yang selanjutnya

akan mengaktivasi kaskade-kaspase. Kaspase yang aktif akan mengaktifkan

DNA-se, kemudian DNA-se yang aktif menembus membran inti dan merusak

/ frragmentasi DNA yang mengalami mutasi / cacat dan akhirnya sel dengan

DNA yang mengalami mutasi akan mengalami kematian (apoptosis). Ekstrak

buah delima (PGL) terstandar akan masuk ke dalam sel yang mengalami

transformasi ke karsinoma sel skuamosa rongga mulut mencit melalui

reseptor laminin, terjadi ikatan fas-ligand antara sel yang mengalami

transformasi dengan ekstrak buah delima (PGL) terstandar. Adanya ikatan

fas-ligand menimbulkan sinyal transduksi ke dalam sitosol pada sel yang

mengalami transformasi, sehingga di dalam sitosol terjadi aktivasi suatu

protein yang disebut Fas-Associated Protein Death Domain (FADD). FADD

kemudian mengaktivasi kaskade-kaspase, kaskade-kaspase yang aktif,

mengaktifkan DNA-se. DNA-se masuk kedalam inti sel yang mengalami

transformasi dan merusak DNA sehingga sel mengalami apoptosis.



Aktivitas lain dari ekstrak buah delima (PGL) terstandar masuk ke dalam

sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa melalui reseptor

estrogen akan memicu aktivasi phaspholipase C (PLC) mengubah

phosphotydil i nositol d iphosphat (PI2P) menjadi phasphotydil i nositol

triphosphat (PI3P). Adanya ikatan phasphotydil i nositol triphosphat (PI3P)

dengan reseptor di membram endoplasmic r eticulum menyebabkan pintu

calcium di membram endoplasmic reticulum terbuka, sehingga Ca 2+

Kajian ini sangat penting mengingat banyak penyakit kronis yang

menimbulkan kerugian bagi manusia, salah satu di antaranya adalah adalah

kanker (Celik et al., 2009).

dilepas

ke sitosol mengaktifkan phaspholipase A2, phaspholipase A2 memecah

phasphotydil c olin menjadi lisophasphotydil c olin dan asam ar akidonat.

Asam ar akadinot melalui jalur siklooksigenase / COX-2 mengeluarkan

prostaglandin yang akan memicu angiopoitin mengeluarkan VEGF, VEGF

merupakan faktor yang memicu pembentukan angiogenesis dan bertindak

sebagai faktor pertumbuhan autocrine bagi sel kanker. Ektrak buah delima

(PGL) terstandar dapat menghambat VEGF sehingga angiogenesis tidak

terbentuk, tanpa angiogenesis yang merupakan fenomena kompleks dan

mutlak diperlukan untuk pertumbuhan dan survival sel kanker. Sel kanker

tidak akan bisa berkembang dan akan mengalami kematian.



3.3 Hipotesis Penelitian

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah :

3.3.1 Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi Bcl-2

pada rongga mulut mencit Strain Swiss Webster (Balb/c) yang mengalami

transformasi.

3.3.2 Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi VEGF

pada rongga mulut mencit Strain Swiss Webster (Balb/c) yang mengalami

transformasi.

3.3.3 Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild

p53 pada rongga mulut mencit Strain Sw iss W ebster (Balb/c) yang

mengalami transformasi.

3.3.4 Ekstrak buah delima(PGL) terstandar dapat meningkatkan apoptosis pada

rongga mulut mencit Strain Sw iss W ebster (Balb/c) yang mengalami

transformasi .



BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis dan Rancangan penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian true eksperimental

laboratorium. Rancangan penelitian menggunakan rancangan acak lengkap.

Sampel maupun perlakuan diusahakan dalam keadaan terkendali dan terukur

sehingga pengaruh perlakuan lebih dipercaya. Pengelompokan subjek

penelitian dapat dilihat pada gambar 4.1

Gambar 4.1 Rancangan Penelitian

Keterangan :

S : Subyek penelitian

PGL : Punica granatum Linn (delima)

E.A : Ellagic acid

M.D : Mahkota Dewa

R : Random

65

1 Minggu 4 Minggu 4Minggu Akhir Minggu ke 9

S RA

K0

Benzopirene

OO

RA

CMC

CMC/K1

EA/P1

PGL/P2

MD/P3

OK0

OK1

OP1

OP2

OP3



K0 : Kelompok kontrol. Mencit 6 ekor yang tidak dipapar benzopirene

dan tidak diberi ekstrak buah delima. Dipapar olium olivarum (OO)

0,04 ml pada mukosa bukal di rongga mulut sebelah bukal kanan

3 kali seminggu selama 4 minggu. Kemudian diberi CMC-Na 0,3%

per oral satu kali setiap hari selama 4 minggu. Pada akhir minggu

ke 9 dibiopsi jaringan mukosa rongga mulut mencit kemudian

dikorbankan.

K1 : Kelompok perlakuan. Mencit 6 ekor dipapar benzopirene 0,04 mg

/0,04 ml olium ol ivarum pada mukosa bukal di rongga mulut

sebelah kanan 3 kali seminggu selama 4 minggu. Kemudian diberi

CMC-Na 0,3% per oral satu kali setiap hari selama 4 minggu Pada

akhir minggu ke 9 dibiopsi jaringan mukosa rongga mulut mencit

kemudian dikorbankan.

P1 : Kelompok perlakuan. Mencit 6 ekor dipapar benzopirene 0,04 mg

/0,04 ml olium olivarum pada mukosa bukal rongga mulut sebelah

kanan 3 kali seminggu selama 4 minggu. Kemudian diberi ellagic

acid per oral. Dengan dosis 75 mg/kg/bb/hari dilarutkan dalam

CMC-Na 0,3 % satu kali setiap hari selama 4 minggu. Pada akhir

minggu ke 9 dibiopsi jaringan mukosa rongga mulut mencit

kemudian dikorbankan.

P2 : Kelompok perlakuan. Mencit 6 ekor dipapar benzopirene 0,04 mg

/0,04 ml olium ol ivarum pada mukosa bukal di rongga mulut

sebelah kanan setiap 3 kali seminggu selama 4 minggu. Kemudian



diberi ekstrak buah delima (PGL) per oral. Dengan dosis 75 mg/kg/

bb/hari dilarutkan dalam CMC-Na 0,3% satu kali setiap hari selama

4 minggu. Pada akhir minggu ke 9 dibiopsi jaringan mukosa

rongga mulut mencit kemudian dikorbankan.

P3 : Kelompok perlakuan. Mencit 6 ekor paparan benzopirine 0,04 mg

/0,04 ml olium ol ivarum pada mukosa bukal dirongga mulut

sebelah kanan bawah setiap 3 kali seminggu selama 4 minggu.

Kemudian diberi ekstrak buah mahkota dewa per oral dengan dosis,

75 mg/kg/bb/hari dilarutkan dalam CMC-Na 0,3 % satu kali setiap

hari selama 4 minggu. Pada akhir minggu ke 9 dibiopsi jaringan

mukosa rongga mulut mencit kemudian dikorbankan.

O0 : Observasi pada kelompok K0

OK1 : Observasi pada kelompok K1

OP1 : Observasi pada kelompok P1



4.2 Unit Eksperimental, Replikasi dan Randomisasi

4.2.1 Unit Eksperimental

Unit Eksperimental adalah sel epitel skuamosa mencit mukosa bukal

sebelah kanan bawah di rongga mulut mencit (Strain Swiss Webster (Balb/c)

jantan, secara fisik dipilih yang sehat, umur 5 bulan, berat badan berkisar 30-

50 gram. Sampel diperoleh dari unit hewan percobaan Universitas

Gajahmada, Yogyakarta dengan pertimbangan mencit adalah hewan coba



yang cocok untuk model karsinoma sel skuamosa rongga mulut (KSSRM)

(Arumdina, 2008).

4.2.2 Replikasi

Jumlah ulangan atau replikasi ditentukan dengan menggunakan rumus

sebagai berikut :

Keterangan :

r : jumlah replikasi

Zα : 1,96 ( Bila α = 0,05 )

Zβ : 0,842 (Bila β = 0,20 )

σ : Simpangan baku kelompok kontrol (2,582)

d : Selisih nilai rerata kelompok yang mengalami apoptosis antara

kelompok kontrol dan perlakuan (8,00-1,20) (Arundina, 2008).

f : Jumlah hewan percobaan yang droup out (failed) sebesar 20 %.

Penghitungan jumlah replikasi (r) : .

Berdasarkan hasil penghitungan, jumlah replikasi atau ulangan minimal,

bila diperhitungkan dengan faktor koreksi, maka jumlah replikasi untuk

masing-masing kelompok perlakuan adalah 6 ekor mencit. Bila terdapat 3

kelompok perlakuan dan 2 kelompok kontrol, maka dibutuhkan besar sampel

6 x 5 = 30 ekor mencit (Mus musculus) Strain Swiss Webster (Balb/c).



4.2.3 Randomisasi

Penelitian ini direncanakan menggunakan 30 ekor mencit jantan,

berumur 5 bulan yang telah disapih dari induknya. Mencit diadaptasikan

terlebih dahulu selama 1 minggu sebelum diberi perlakuan. Dalam masa

adaptasi, seluruh mencit mendapatkan pakan dasar dan pemeliharaan standar

hingga umur dan berat badan memenuhi syarat untuk digunakan dalam

penelitian ini. Dari seluruh mencit yang digunakan, 12 ekor digunakan

sebagai kelompok kontrol, dan 18 ekor mencit yang tersisa disiapkan untuk

perlakuan. Selanjutnya 30 ekor mencit tersebut diambil dengan teknik simple

random sampling dan dibagi menjadi 5 kelompok yaitu kelompok K0, K1,

P1, P2, P3 seperti yang terlihat pada rancangan penelitian di atas.

4.3 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional Variabel

4.3.1 Variabel Penelitian

Variabel bebas :

a. Ekstrak buah delima (PGL) terstandar

Variabel penghubung

a. Ekspresi wild p53

b. Ekspresi Bcl-2

c. Ekspresi VEGF

Variabel tergantung

a. Sel yang mengalami apoptosis

Variabel kendali

a. Waktu penyuntikan



b. Tatalaksana pemeliharaan

c. Pakan dan minum hewan coba

d. Dosis dan cara pemberian ekstrak buah delima

4.3.2 Definisi Variabel Penelitian

a. Mencit adalah mencit (Mus m usculus) Strain Sw iss W ebster (Balb/c)

jantan, secara fisik sehat, umur 5 bulan, berat badan berkisar 30-50 gram.

Sampel diperoleh dari unit hewan percobaan Universitas Gajah Mada

Yogyakarta.

b. Hewan model karsinoma sel skuamosa rongga mulut (KSSRM) adalah

mencit (Mus m usculus) Strain Sw iss Webster (Balb/c) yang telah

mengalami transformasi ke (KSSRM) pada sel epitel skuamosa pada

mukosa ronngga mulut, akibat paparan (penyuntikan) benzopirene.

c. Standarisasi 40% ellagic ac id dengan tujuan 40% ellagic a cid

mempresentasikan kekuatan delima yang bertanggung jawab terhadap

aktivitas farmakologi delima (Saifudin et al., 2011).

d. Estrak buah delima adalah hasil ekstraksi seluruh bagian buah delima

(punica gr anatum L ) dalam bentuk serbuk dan telah terstandarisasi

mengandung 40% ellagic ac id yang diproduksi oleh Xi”an Biof B io-

Technology Co,Ltd ( Room 1-1111,High-tech Venture Park,No .69 J inye

Road Gaoxin Distric of Xi’ an, People Republic of China) (Certificate of

analysis terlampir ) (Lampiran 1 dan 2).



e. Ellagic acid adalah kristal ellagic acid merupakan salah satu komponen

bahan aktif ekstrak buah delima (PGL) yang memiliki aktivitas terapetik

untuk berbagai penyakit.

f. Ekstrak mahkota dewa (Phaleria m acrocarpa) adalah hasil ekstraksi

seluruh bagian buah mahkota dewa ,dalam bentuk serbuk .

g. Dosis adalah jumlah ekstrak buah delima, ellagic ac id, mahkota dewa

yang diberikan kepada subjek penelitian, sebesar 75 mg/kg bb/po/hari

(Valadares et al., 2010).

h. Lama dan waktu pemberian ekstra delima adalah lamanya waktu

pemberian ekstrak buah delima,ellagic ac id,mahkota dewa pada mencit

(Mus m usculus) Strain Sw iss Webster (Balb/c) sebagai hewan model

(KSSRM), yaitu selama 4 minggu,diberikan setiap hari (Valadares et al.,

2010).

i. Dosis benzopirene adalah jumlah benzopirene dalam pelarut oleum

olivarium yang dipapar/disuntikkan pada rongga mulut mencit, lokasi

mukosa bukal sebelah kanan bawah yaitu 0,04 mg/0,04ml setiap 3 kali

seminggu selama 4 minggu (berdasarkan penelitian pendahuluan).

j. Ekspresi wild p53 adalah pengukuran ekspresi wild p53 dengan cara

menghitung jumlah sel yang mengalami transformasi yang menghasilkan

wild p53 dengan teknik imunohistokimia menggunakan antibodi

poliklonal anti wild p5 3. Penghitungan dilakukan terhadap sel yang

imunoreaktif tercat coklat pada membran sel atau sitoplasma pada



sepuluh lapang pandang yang berbeda dengan menggunakan mikroskop

cahaya pembesaran 400x.

k. Ekspresi Bcl-2 adalah pengukuran ekspresi Bcl-2 dengan cara


Bcl-2, pemeriksaan dengan teknik imunohistokimia menggunakan

antibodi poliklonal anti Bcl-2. Penghitungan dilakukan terhadap sel yang

imunoreaktif tercat coklat pada membran sel atau sitoplasma pada

sepuluh lapang pandang yang berbeda dengan menggunakan mikroskop

cahaya pembesaran 400x.

l. Ekspresi VEGF adalah pengukuran ekspresi VEGF dengan cara


VEGF dengan teknik imunohistokimia menggunakan antibodi poliklonal

anti VEGF. Penghitungan dilakukan terhadap sel yang imunoreaktif

tercat coklat pada membran sel atau sitoplasma pada sepuluh lapang

pandang yang berbeda dengan menggunakan mikroskop cahaya

pembesaran 400x.

m. Jumlah apoptosis adalah pengukuran ekspresi apoptosis dengan cara


apoptosis pada pemeriksaan dengan teknik tunnel assay. Penghitungan

dilakukan terhadap sel yang imunoreaktif tercat coklat pada membran sel

atau sitoplasma pada sepuluh lapang pandang yang berbeda dengan

menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x.



4.4 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit (Mus

musculus) strain Sw iss Webster (Balb/c) jantan, sehat berumur 5 bulan

dengan berat badan berkisar 30-50 gram, pakan mencit pellet per G

diproduksi oleh PT. Comfeed Indonesia,air minum mencit, ekstrak buah

delima (PGL) terstandar ,ellagic ac id, mahkota dewa, benzopiren, (Sigma),

aqua, CMC-NA 0,3%, oleum olivarum, alkohol 100%, alkohol 90%, alkohol

70 %, hematoksilin eosin,(HE),aseton, xylol, etanol, PBS, tripsin, alkohol.

aquadestilata, streptavidin-biotin, H2O2 0,5%, substrat, phosphotase buffer,

antibodi pol iklonal (sigma) untuk wild p53, Bcl-2, VEGF (Bioworld

Technology, USA, Cat No. BSI530), Envision Detection Kit Sy stem

Peroxidase (DAKO REAL, K5007), antibody di luent (DAKO, S 0809),

meyer he matoksilin, aseton, streptavidin biotin peroksidase, substrat,

apoptag detection Kit (Milipore corporation, Catalog no S1707), ether.

4.5 Alat penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah; kandang mencit terbuat

dari plastik ditutup kawat kasa dan dilengkapi tempat makan dan botol

minum, sonde mencit, seperangkat alat bedah, meja operasi, mortir

,timbangan analitik, mikroskop, kaca obyek, kaca penutup, botol kecil tempat

jaringan, kertas lebel, alat tulis, disposible s yringe,, counter, mikropipet,

microwell plat, alat sentrifugasi, mikroplate, alat inkubasi, tissue paper,

inverted mikroskop, sarung tangan.masker, gelas obyjek biasa dan yang



berlapis poly-L-Lysine, cover gl ass, mikropipet, mikrometer, mikroskop

cahaya merk Olympus CX31.

4.6 Lokasi Penelitian

Penelitian dilakukan di beberapa laboratorium yang berbeda. Pembuatan

hewan model, pemeliharaannya (Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran

Universitas Airlangga, pembuatan preparat, pemeriksaan imunohistokimia

dan tunnel assay dilakukan di Unit Mikroskop Elektron dan Laboratorium

Terpadu, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga, Surabaya.

4.7 Pelaksanaan Penelitian

4.7.1 Persiapan Penelitian

a. Ekstrak buah delima terstandar mengandung 40% ellagic acid

Ekstrak buah delima terstandar yang mengandung 40% ellagic acid

dan ellagic acid 90% diproduksi oleh Xi,

b. Persiapan sedian

an Biof Bio-Technology Co,Ltd

(Room 1-111, High- tech V enture Park, No. 69 Jinye R oad, Gaoxin

Distric of Xian, People Republic of China (Lampiran 1 dan 2 ).

Ekstrak buah delima terstandart yang akan diberikan pada hewan

percobaan disuspensikan dengan sodium c arboxy m ethyl c ellulose

(CMC) 0,3 % (Palanisamy et al ., 2007) di dalam mortar agar

homogenitas larutan dapat dijaga. Sediaan juga selalu dibuat baru

sebelum diberikan. Pembuatan sodium CMC 0,3% dilakukan dengan

cara menaburkan sodium CMC sebanyak 0,3% gram dalam aquadest

panas 100 ml dan diaduk dengan bantuan magnet stirrer sampai larut.



Berdasarkan dosis ellagic acid sebesar 75 mg/kgbb/po/hari (Valadares

et al ., 2010), maka dosis ekstrak buah delima terstandar yang

mengandung 40% ellagic acid (EA) adalah :

40 gram EA / 100 gram ektrak buah delima

400 mg EA/1000 mg ektrak buah delima

Bila dosis EA = 75 mg/kgbb/po/hari, maka ekstrak buah delima

yang diperlukan adalah : 75/100 x 1000 mg extrak buah delima = 187,5

mg ekstrak buah delima/kgbb/po/hari.

Dengan cara penghitungan yang sama, maka dosis EA untuk

sediaan yang mengandung 90,51% EA adalah :

90,51 gram EA / 100 gram ekstrak buah delima

905,1 mg EA / 1000 mg ekstrak buah delima

Bila dosis EA = 75 mg/kgbb/po/hari, maka EA yang diperlukan

adalah : 75 / 905,1 mg x 1000 = 82,86 mg ekstrak buah

delima/kgbb/po/hari.

Contoh :

Untuk berat badan mencit = 30 gram, ekstrak buah delima yang

diperlukan :

bb = 30 gram → (EA = 90%), penghitungannya :

30/1000 x 82,86 = 2,5 mg/po/hari.

bb = 30 gram → (EA = 40%), penghitungannya :

30/1000 x 187,5 = 5,625 mg/po/hari.

Volume pemberian = berat badan mencit / 1000 x dosis ekstrak.



Misalnya untuk bb mencit 30 gram → (EA = 90%) = 2,5 mg

ekstrak buah delima disuspensikan dalam sodium CMC 1cc / 1 ml.

c. Pembuatan hewan model

Pada penelitian ini digunakan 30 mencit (Mus m usculus) Strain

Swiss Webster ( Balb/c) jantan, secara fisik dipilih yang sehat, umur 5

bulan, berat badan berkisar 30-50 gram. Mencit diambil secara random.

Setiap 6 ekor Mencit ditempatkan dalam kotak yang berbeda, diberi

tanda dengan cat di ekor dan ditentukan macam perlakuan yang

diterapkan. Sebanyak 24 ekor mencit disiapkan sebagai hewan model

karsinoma sel skuamosa rongga mulut (Arundina, 2008). Setelah mencit

diadaptasikan. mencit dipapar dengan 0,04 mg benzopirene / 0,04 ml

olium olivarum (benzopirene 10 mg dilarutkan dalam olium olivarum 10

ml) pada rongga mulut mukosa bukal sebelah kanan. 0,04 mg

benzopirene/0,04 ml olium olivarum, dosis hasil penelitian pendahuluan.

d. Pengambilan dengan biopsi karsinoma sel skuamosa rongga mulut

Pengambilan sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel

skuamosa rongga mulut mencit dianestesi dengan ether, kemudian

dikorbankan. Sebagai bahan pemeriksaan ekspresi wild p53, B cl-2,

VEGF dan penghitungan jumlah sel yang mengalami apoptosis.

4.8 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data

Data yang dimasukkan sebagai hasil penelitian dikumpulkan dalam

bentuk data primer. Untuk menjamin reliabilitas dan validitasnya, penelitian

dilakukan di laboratorium yang standar dan mempunyai :



a. Peralatan lengkap dan pengalaman yang memadai dalam pembuatan

hewan model dan tatalaksana pemeliharaan hewan coba.

b. Peralatan dan pengalaman memadai dalam pemeriksaan dengan teknik

imunohistokimia dan tunnel assay di Reliabilitas dan validitas penelitian

akan dicapai melalui langkah-langkah berikut :

1. Menjamin reliabilitas pada evaluasi obyek pengamatan yang sama

maka peneliti menggunakan tenaga peneliti atau tenaga laboratorium

yang sama.

2. Menjamin validitas pada penilaian variabel maka penelitian dipilih

alat dan bahan uji yang mempunyai sensitivitas dan spesifitas yang

tinggi, konsisten dan dapat dipertanggungjawabkan.

3. Peneliti konsultasi pada tim promotor dan tenaga ahli atau konsultan

dan mengelola, mengawasi, memantau sendiri berbagai tahap

pelaksanaan penelitian. Hal tersebut meliputi pengadaan hewan coba,

penilaian gejala, pengambilan spesimen, pengadaan bahan, pemakaian

dan pemeliharaan bahan dan alat, pemeriksaan dan pengumpulan data

penelitian.

4. Penelitian baru dilakukan apabila proposal penelitian telah

mendapatkan kelayakan etik dari komisi etik penelitian.

4.9 Cara Pengolahan dan Analisis Data

Pengumpulan data dilakukan dalam lingkungan yang terkontrol dan

terkendali dengan asumsi semua kondisi diusahakan sama dan dapat

dikendalikan. Urutan analisis data :



a. Uji Normalitas : untuk menguji variabel yang diperiksa dalam penelitian

berdistribusi normal.

b. Uji Homogenitas : Untuk meyakinkan bahwa data antar kelompok

memiliki matriks kovarians yang homogen. Uji statistik yang digunakan

adalah Box’s test .

c. Uji Multivariat Analisis Varians (MANOVA) : Bila data berdistribusi

normal, dilakukan uji means antar kelompok dengan menggunakan

MANOVA.

d. Uji Komparasi Ganda atau Least Significans Difference (LSD) :

digunakan untuk membandingkan pengaruh perlakuan antar kelompok

perlakuan terhadap masing-masing variabel dependent. Tingkat

kemaknaan uji statistik yang dipergunakan dalam penelitian ini sebesar

0,05.



4.10 Kerangka Operasional Penelitian

Gambar 4.2 Kerangka Operasional Penelitian

Paparan Benzopirene (Mukosa bukal kanan RM mencit)

(4 minggu, 3 x per minggu)

4 minggu setelah paparan Benzopirene (KSSRM)

K0 K1 P2 P3

Ekpresi wild p53, Bcl-2, VEGF, apoptosis

Adaptasi (1 minggu)

Mencit (Balb/c)

Dikorbankan

Dibiopsi (akhir minggu ke 9)

Analisis Data

P1

Mahkota Dewa tiap hari (4 mgg)

Delima tiap hari (4 mgg)

Ellagic Acid tiap hari (4 mgg)



BAB 6

PEMBAHASAN

Pengobatan terhadap karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang selama ini

dilakukan meliputi pembedahan, penyinaran, radioterapi dan penggunaan obat-

obat kemoterapi. Data terkini menunjukkan bahwa tindakan operasi untuk

mengangkat jaringan kanker belum sepenuhnya menjamin kesembuhan dan ada

kecenderungan terjadinya remultiplikasi jaringan tersebut. Penggunaan radioterapi

menimbulkan resiko terjadinya kerusakan lain disekitar jaringan yang terkena

kanker. Pemberian kemoterapi antikanker memiliki efek farmakologi kurang

selektif, efek samping yang merugikan telah dilaporkan adanya resistensi

beberapa jenis kanker (Rizali dan Auerkari, 2003; Sismindari, 2005). Kondisi

tersebut sampai saat ini belum bisa diatasi secara memuaskan, sehingga

penanganan terhadap kanker perlu dilakukan penelitian terhadap obat berbahan

dasar herbal yang dapat mencegah dan membunuh sel kanker tanpa merugikan

sel yang normal di sekitar sel kanker.

Penanganan kanker tanpa merugikan sel yang normal dalam membunuh sel

kanker, perlu dilakukan penelitian terhadap obat herbal yaitu buah delima (PGL)

hal ini karena senyawa dari ekstrak buah delima menghambat pertumbuhan sel

kanker dan membunuhnya serta memutus pasokan zat makanan dan oksigen ke

jaringan sel kanker. Selain itu penanganan dengan obat herbal dalam menangani

sel kanker merupakan cara pengobatan dengan biaya murah . Ekstrak buah delima

(PGL) terhadap penyakit kanker banyak diteliti secara invitro dan sedikit

107



penelitian secara invivo akan tetapi untuk kejadian karsinoma sel skuamosa

rongga mulut belum pernah diteliti dan mekanisme kerja ekstrak buah delima

(PGL) terstandar terhadap sel kanker dan karsinoma sel skuamosa rongga mulut

juga belum dapat dijelaskan secara tuntas.

Penelitian mengenai obat tradisional, khususnya bahannya yang berupa

tanaman obat, terus berlangsung hingga saat ini bahkan semakin meningkat.

Belum banyak hasil penelitian tanaman obat yang digunakan sebagai obat dalam

pelayanan kesehatan. Obat yang dapat digunakan di masyarakat harus memenuhi

persyaratan aman, bermanfaat dan sudah terstandarisasi. Untuk memenuhi

persyaratan tersebut tanaman obat harus melalui uji pra klinik dan klinik. Uji pra

klinik meliputi uji khasiat berdasarkan penelitian eksperimental yang dikerjakan

secara invivo maupun invitro.

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratoris untuk menjelaskan

mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terstandar terhadap hambatan /

degradasi tranformasi sel ke karsinoma sel skuamosa melalui perubahan ekspresi

wild p53, Bcl-2, VEGF dan apoptosis pada sel mukosa rongga mulut bukal

mencit akibat paparan benzopirene.

Benzopirene digunakan pada penelitian ini sebagai bahan kimia untuk

membuat model hewan coba sel yang mengalami transformasi ke arah keganasan

(transform c ell), benzopirene merupakan bahan karsinogen yang lengkap, baik

sebagai inisiator maupun promotor kanker (Wang, 2003). Benzopirene (B(a)P)

dipaparkan ke hewan coba dapat membentuk B(a)P-7,8-diol-9,10-oxide yang

merupakan mutagenik karsinogen yang kuat dan reaktif (Kelley et al.,1997). Diol



oxide ini bersifat sangat reaktif dan akan membentuk ikatan kovalen dengan basa

guanin DNA (Wiese et al., 2001). Transformasi sel pada hewan percobaan dapat

diperoleh dengan melakukan paparan benzopirene 0,04 mg dilarutkan dalam

olium olivarum 0,04 ml pada mukosa bukal rongga mulut mencit sebelah kanan.

6.1 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) Terstandar terhadap Ekspresi

Bcl-2 pada Sel Mukosa Rongga Mencit akibat paparan Benzopirene.

Berdasarkan Tabel 5.3, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak

buah delima (PGL) terstandar menurunkan ekspresi Bcl-2 pada sel mukosa

rongga mulut mencit akibat paparan benzopirene. Penurunan pada kelompok

P2 (benzopirene + PGL) (0,016 ± 0,040) tidak ada perbedaan secara

signifikan dengan kelompok P3 (Benzopirene + MD) (0,000 ± 0,000), P1

(Benzopirene + EA) (0,083 ± 0,075) dan kelompok K0 (tanpa benzopirene)

(0,000 ± 0,000) tetapi berbeda secara signifikan dengan kelompok K1

(benzopirene + CMC) (0,366 ± 0,103).

Gen Bcl-2 mengkode protein yang berperan sebagai antia poptosis dan

merupakan kelompok protooncogene. Bcl-2 bekerja untuk menekan fungsi

Bax (pro apoptosis), menghambat kemampuan c-myc untuk menginduksi

apoptosis. Peningkatan Bcl-2 mempunyai peranan yang sangat penting pada

hambatan apoptosis sel kanker/transformasi sel (Lumangga et al .,2008).

Salah satu kemungkinan mekanisme sel kanker/transformasi sel untuk

meningkatkan ekspresi Bcl-2 adalah Bcl-2 membentuk pori pada membran

yang ditancapnya dan berinteraksi dengan berbagai jenis protein intraseluler

lain yang secara langsung atau tidak langsung terlibat dalam dalam proses



apoptosis. Interaksi ini menunjukkan salah satu peran Bcl-2 adalah

memberikan tempat bagi protein lain, sehingga aktivitas seluler protein

bersangkutan berhenti (misalnya Bax, aktivitasnya akan berhenti). Bcl-2

mengontrol checkpoint dari jalur aktivasi caspase, sehingga kemungkinan

Bcl-2 mengendalikan jalur apoptosis bergantung caspase maupun tidak

bergantung caspase (jalur intrinsik dan jalur ekstrinsik) (Kresno,2011).

Hasil penelitian ini menunjukkan penurunan ekspresi Bcl-2 oleh ekstrak

buah delima terstandar lebih kuat bila dibandingkan dengan ellagic acid , hal

ini membuktikan bahwa ekstrak buah delima adalah penghambat Bcl-2 yang

efektif Estrak buah delima (PGL) / whole ekstrak lebih kuat efeknya daripada

bentuk bahan aktif tunggal, ini menunjukkan adanya efek sinergistik atau

tambahan dari bahan aktif lainnya di dalam buah delima (PGL) (Seeram et

al., 2005).

Apabila jumlah protein Bcl-2 sedikit, maka protein pro apoptosis (Bax)

mempunyai kesempatan lebih besar untuk berikatan dengan protein BH3 dan

ikatan ini merupakan inisiasi awal dari proses apoptosis (Shore et al., 2008),

kemungkinan ekstrak buah delima terstandar juga mempunyai aktivitas

menginduksi BH3 untuk melepas ikatan antara Bax dengan Bcl-2 sehingga

terjadi penurunan pada ekspresi Bcl -2.

Protein BH3-only adalah protein yang mempunyai fungsi untuk

menerima rangsangan yang berasal dari luar sel seperti obat. Rangsangan

tersebut menyebabkan protein BH3-only aktif dan bekerja secara langsung



membebaskan ikatan antara protein Bax dengan Bcl-2 dan menurunkan

ekspresi Bcl-2 (Marzo et al.,2008).

Penurunan ekspresi Bcl-2, akan meningkatkan aktivitas Bax (pro

apoptosis) Bax berperan membuka Pt-pore, sehingga cytochrome-c keluar

dari mitokondria. Cytochrome-c kemudian mengaktifkan Apaf-1, selanjutnya

Apaf-1 mengaktivasi kaskade-kaspase sehingga sel mengalami kematian

(apoptosis) (Kresno, 2011).

Biovaibilitas ekstrak buah delima lebih baik bila dibandingkan dengan

pemberian senyawa tunggal secara individual. Hal ini menggambarkan

pengaruh multifaktor dan efek sinergis berbagai senyawa yang terkandung

dalam buah delima (Seeram et al.,2005). Keberadaan polyphenol dalam buah

delima dapat meningkatkan kelarutan dan absorbsi ellagic acid dalam saluran

pencernaan. Selain itu polyphenol yang terdapat dalam ekstrak buah delima

juga memiliki kemampuan untuk menghambat metabolisme ellagic acid oleh

mikroflora intestinal, melalui aktivitas antibakterial yang dimiliki ekstrak

buah delima, sehingga ekstrak buah delima mempunyai kemampuan

penurunan ekspresi Bcl-2 lebih kuat dibanding ellagic ac id (Seeram et al .,

2006).

Ellagic acid, senyawa dimer yang merupakan derivat gallic acid, berada

dalam buah delima dalam bentuk bebas sebagai ellagic acid-glycosides atau

terikat dalam bentuk ellagitannins (Seeram et al ., 2004). Pemberian per oral

pada tikus, 15% ellagic acid diekskresikan melalui urin dan feses. Rendahnya

aktivitas dan konsentrasi ellagic ac id dalam plasma disebabkan karena



kelarutannya yang rendah dalam air. Selain itu diduga disebabkan karena

ellagic acid mudah mengalami transformasi dan degradasi sebelum

diabsorbsi. Metabolisme ellagic a cid yang tidak larut dalam intestinal

disebabkan oleh aktivitas mikroflora yang berada dalam intestinal (Seeram et

al., 2004).

Hasil penelitian pada kelompok K0 (normal tanpa paparan benzopirene

dan tanpa perlakuan) menunjukkan ekspresi Bcl-2 (0,000) tidak terekspresi,

hal ini disebabkan secara fisiologis sistem pertumbuhan sel dalam individu

diatur oleh sistem keseimbangan antara apoptosis dan proliferasi. Terjadi

keseimbangan antara Bcl-2 dan Bax (Sudiana, 2008).

Kelompok P3 (benzopirene + mahkota dewa (MD), sebagai kelompok

pembanding dan merupakan obat herbal yang sudah ada di pasaran,

menunjukkan hasil (0,000) tidak terekspresi Bcl-2, kandungan dari mahkota

dewa (phaleria m acrocarpa) antara lain ; alkaloid, terpenoid, saponin dan

polyphenol komponen terbesar pada mahkota dewa. Pada beberapa penelitian

menunjukkan ekstrak mahkota dewa dapat menstimulasi IFN-gamma yang

penting dalam memicu aktivitas CTL dan sel NK, mempunyai fungsi

sitostatika untuk membunuh sel kanker dan berfungsi sebagai

imunostimulator. Polyphenol dapat berfungsi sebagai fas-ligand yang akan

memicu apoptosis sel melalui fas-receptor, polyphenol menginduksi

terjadinya apoptosis melalui jalur TNF-α, polyphenol dapat memblok reseptor

growth f actor dan menghambat MAPK pada jalur sinyal Reseptor T irosin

Kinase (RTKS). Peningkatan dosis ekstrak mahkota dewa diikuti kenaikan



indeks apoptosis. Fakta- fakta ini yang menunjukkan hasil penurunan

ekspresi Bcl-2 mahkota dewa lebih bagus dari ekstrak buah delima (PGL)

maupun ellagic acid. Dari beberapa penelitian toksisitas dari mahkota dewa

tinggi dan harus hati-hati dengan dosis (Suryanto, 2007).

Ekstrak mahkota dewa dalam membunuh kanker bekerja melalui

kandungan bahan aktifnya flavonoid, alkaloid, saponin. Flavonoid diketahui

memicu apoptosis sehingga Bcl-2 menurun, alkaloid memicu apoptosis

dengan meninngkatkan permeabilitas membran mitokondria sehingga terjadi

pelepasan cytochrome-c. Saponin juga dapat memicu apoptosis tapi belum

diketahui titik tangkapnya. Ekstrak mahkota dewa bersifat sitotosik pada cell

line Ca colon melalui pengaktifan caspase-3, peningkatan ekspresi caspase-3

sesuai dengan peningkatan dosis (Widyasari et al., 2008).

Mahkota dewa merupakan tanaman obat yang beracun, kulit dan daging

buahnya dalam keadaan segar memiliki rasa pahit, demikian juga bijinya

diduga memiliki senyawa yang kerjanya mirip dengan oxytosin dan

sintosinon kedua senyawa ini diketahui dapat mengganggu perkembangan

embrio, karena dapat merangsang kontraksi otot sehingga sangat berbahaya

bagi orang hamil. Mahkota dewa diduga juga mengandung senyawa yang

bersifat toksik dan teratogenik yang dapat berbahaya bila dikonsumsi dalam

jangka waktu yang panjang (Suatma et al., 2008)

Pemberian dosis tinggi ekstrak buah delima utuh, ellagitannin atau

punicalagin secara berulang, sebagaimana dosis umum yang dilakukan dalam

sistem pengobatan tradisional tidak bersifat toksik (Cerda et al., 2003 ; Vidal



et al ., 2003). Penelitian menggunakan ekstrak buah delima (PGL) terstandar

yang diberikan pada tikus yang mengalami fibrosis hati diberikan secara

kronis setiap hari selama 28 hari menunjukkan tidak terjadi efek samping

pada ginjal, morfofungsi ginjal tidak berubah (Yuniarti, 2012).

Hasil uji korelasi menunjukkan bahwa pemberian ekstrak buah delima

(PGL) terstandar mempunyai korelasi positif yang bermakna terhadap

penurunan ekspresi Bcl-2 dengan penurunan ekspresi VEGF, hal ini

menunjukkan adanya komunikasi antara Bcl-2 yang mempunyai fungsi untuk

menghambat proses apoptosis dengan VEGF yang merupakan inducer

pembentukan angiogenesis. Angiogenesis adalah pertumbuhan pembuluh

darah baru dari pembuluh darah yang sudah ada dan merupakan fenomena

yang kompleks yang mutlak di perlukan untuk pertumbuhan dan survival dari

sel kanker, kanker yang berkembang akan meningkatkan ekspresi VEGF

untuk membentuk angiogenesis, ada hubungan dua arah antara Bcl-2 dan

VEGF.

Mekanisme Bcl-2 meningkatkan angiogenesis melalui peningkatan siklus

proliferasi sel. Proliferasi sel yang berlebihan akan memicu peningkatan

proses desakan antar sel. Proses desakan antar sel yang meningkat akan

memicu pengeluaran phospholipase A2, phospholipase A2 akan memicu

phosphotydil colin menjadi lisophosphotydil colin dan asam arachidonat.

Asam arachidonat melalui jalur siklooksigenase-2 (COX-2) mengeluarkan

prostaglandin yang akan menyebabkan sekresi angiopoitin, angiopoitin akan

mengaktivasi VEGF, VEGF akan menstimulasi pembentukan angiogenesis



(Cho, 2007). Dengan pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar Bcl-2

dapat dihambat sehingga VEGF juga dapat dihambat .

Hasil uji korelasi juga menunjukkan pemberian ekstrak buah delima

(PGL) mempunyai korelasi negatif yang bermakna antara penurunan ekspresi

Bcl-2 dengan kenaikan ekspresi wild p53, hasil ini dapat dijelaskan, wild p53

merupakan faktor transkripsi terhadap pembentukan P21, peningkatan P21

akan menekan CDK. Wild p53 juga akan memicu aktivitas Bax (pro

apoptosis), protein Bax akan menekan Bcl-2 (anti apoptosis).

6.2 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) Terstandar terhadap Ekspresi

VEGF Pada Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Akibat Paparan

Benzopirene .

Berdasarkan Tabel 5.4, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak

buah delima (PGL) kelompok P2 (benzopirene + PGL) (0,183 ± 0,098) dapat

menurunkan ekspresi VEGF pada sel mukosa rongga mulut mencit akibat

paparan benzopirene, penurunuan ekspresi VEGF pada kelompok P2 tidak

berbeda secara signifikan dengan kelompok K0/K- (tanpa benzopirene +

CMC) (0,133 ± 0,103), P3 (benzopirene + MD) (0,150 ± 0,104), P1

(benzopirene + EA) (0,267 ± 0,103) tetapi berbeda secara signifikan dengan

kelompok K1 / K + (benzopirene + CMC) (0,350 ± 0,104).

VEGF merupakan inducer angi ogenesis yang di jumpai pada berbagai

jenis kanker, VEGF menunjukkan spesifitas sel sasaran yaitu spesifik bagi sel

endotel. VEGF selain meningkatkan proliferasi dan migrasi sel endotel juga

berperan meningkatkan permeabilitas pembuluh darah, menyebabkan faktor



koagulasi keluar dari pembuluh darah dan melapisi jaringan perivaskuler,

khususnya fibrinogen sehingga mengakibatkan terbentuknya fibrin

perikanker yang memudahkan migrasi sel endotel dan fibroblast yang

mensekresi proteoglikan yang membentuk stroma matang bagi kanker.

Angiogenesis atau neovaskularisasi merupakan proses penting untuk

pertumbuhan survival kanker (Hasina et al., 2001; Kresno, 2011). Proliferasi

dan migrasi sel endotel diaktifkan oleh beberapa faktor angiogenesis seperti

Tirosin K inase reseptor antara lain vascular endothelial gr owth f actor

(VEGF) (FGF), angigenin, angiopoitin. VEGF dijadikan sebagai indikator

prediksi perkembangan sel kanker (Reuben et al., 2011).

VEGF merupakan stimuli utama untuk pertumbuhan kanker dan

neovaskularisasi. Perkembangan proses angiogenesis kanker dengan memicu

faktor pertumbuhan kemudian merangsang migrasi endotel dan proliferasi sel.

Pembuluh darah pada kanker memperlihatkan morfologi yang abnormal,

sementara pembuluh darah yang normal diorganisir oleh arteriola, kapiler,

dan venul yang mudah dibedakan (Dvorak, 2005). Penelitian dengan tehnik

imunohistokimia menunjukkan VEGF terlokalisir pada sel kanker dan endotel

(Roskoski,2007).

Proliferasi sel yang berlebihan pada sel kanker akan memicu pengeluaran

asam arachidonat melalui jalur siklooksigenase (COX-2), akan mengeluarkan

prostaglandin yang akan memicu angiopoitin mengeluarkan VEGF dan

memicu pembentukan angiogenesis (Cho, 2007). Angiogenesis adalah

pertumbuhan pembuluh darah baru dari pembuluh darah yang sudah ada, ini



merupakan fenomena kompleks yang mutlak diperlukan untuk pertumbuhan

dan survival sel kanker. Tanpa pembuluh darah baru yang menyediakan

nutrisi untuk kanker, kanker tidak akan tumbuh dan berkembang lebih besar

dari diameter 2-3 mm (Kresno, 2011).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak buah delima (PGL)

terstandar memiliki kemampuan menurunkan ekspresi VEGF, dengan

dihambatnya VEGF pembentukan angiogenesis akan terhambat sehingga

pasokan nutrisi ke sel kanker akan terputus, sel kanker tidak akan

berkembang dan mati.

Delima dapat menghambat angiogenesis melalui regulasi terhadap

vascular e ndothelial gr owth f actor (VEGF). Hal ini disebabkan karena

produksi faktor angiogenik tersebut diregulasi oleh NF-kB (Seeram et al .,

2006).

Delima juga menghambat aktivitas siklooksigenase (COX-2), yaitu suatu

enzim yang terinduksi oleh agen mitogenik, inflamasi, sehingga akan

menurunkan sekresi prostaglandin, prostaglandin tidak memicu angiopoitin

untuk mensekresi VEGF, skresi VEGF dihambat sehingga angiogenesis tidak

terbentuk (Seeram et al.,2006).

Caffeic ac id yang merupakan salah satu kandungan bahan aktif buah

delima (PGL) dapat menghambat aktivasi STAT3 (Signal t ransducer and

aktivator of t ranscription 3 ). STAT 3 merupakan aktivator transripsi gen

VEGF pada berbagai kanker manusia. Aktivitas STAT3 berperan besar dalam

overproduksi VEGF (Jung et al.,2007).



Pada penelitian ini, aktivitas yang dimiliki ekstrak buah delima (PGL)

terstandar terhadap penurunan ekspresi VEGF lebih kuat dibanding ellagic

acid. Hal ini disebabkan karena ekstrak buah delima (PGL) terstandar

merupakan campuran berbagai senyawa yang kompleks, beberapa penelitian

membuktikan bahwa senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak buah

delima (PGL) terstandar memiliki kemampuan saling meningkatkan efek

biologis masing-masing, contohnya ellagic ac id dan quarcetin (keduanya

juga terdapat dalam buah delima) yang diberikan secara bersama-sama

menunjukkan hambatan yang lebih kuat terhadap pertumbuhan sel kanker

daripada bila diberikan secara individual (Seeram et al.,2005).

Keberadaan polyphenol dalam buah delima dapat meningkatkan

kelarutan dan absorbsi ellagic ac id dalam saluran pencernaan, selain itu

polyphenol yang terdapat dalam ekstrak buah delima juga memiliki

kemampuan untuk menghambat metabolisme ellagic acid oleh mikroflora

intestinal menjadi urothilin A dan B melalui aktivitas antibakteri yang

dimiliki ekstrak buah delima (Seeram et al., 2006).

Hasil penelitian pada kelompok P3 (benzopirene + mahkota dewa) obat

herbal yang sudah ada di pasaran menunjukkan penurunan ekspresi VEGF

yang lebih kuat dibanding ekstrak buah delima (PGL) dan ellagic acid, hal ini

mungkin disebabkan karena kandungan dari mahkota dewa (phaleria

macrocarpa) antara lain; alkaloid, terpenoid, saponin dan polyphenol,

flavonoid, Flavonoid, alkaloid, saponin dapat memicu apoptosis Peningkatan

dosis ekstrak mahkota dewa diikuti kenaikan indeks apoptosis (Widyasari et



al.,2008). Fakta-fakta ini yang menunjukkan hasil penurunan ekspresi VEGF

mahkota dewa lebih bagus dari ekstrak buah delima (PGL) maupun ellagic

acid.








jangka waktu yang panjang (Suatma et al., 2008).




et al., 2003).

Hasil penelitian pada kelompok K0 (tanpa benzopirene dan tanpa

perlakuan) VEGF terekspresi, hal ini karena beberapa sel normal,

diantaranya fibroblast, endotel dan keratinosit memproduksi VEGF dalam

jumlah kecil, peningkatan kadar VEGF terjadi bila diperlukan angiogenesis

(Kresno, 2011).

Terdapat korelasi positif antara penurunan ekspresi Bcl-2 dan penurunan

ekspresi VEGF. Peningkatan ekspresi Bcl-2 akan meningkatkan proliferasi

sel yang berlebihan pada sel kanker dan akan memicu sekresi VEGF, VEGF



akan memicu pembentukan angiogenesis. Angiogenesis akan memberi suplai

makanan, oksigen pada sel-sel kanker sehingga ekspresi Bcl-2 akan

meningkat, proliferasi sel akan meningkat, metastasis sel kanker akan

meningkat. Pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat

menghambat / menurunkan ekspresi Bcl-2 dan ekspresi VEGF, sel kanker

akan di degradasi melalui apoptosis dan memutus suplai makanan.

6.3 Efek Ekstrak Buah Delima (PGL) Terstandar terhadap Ekspresi wild

p53 pada Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Hewan Coba Akibat

Paparan Benzopirene

Berdasarkan Tabel 5.5, hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak buah

delima (PGL) terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild p53 pada mukosa

rongga mulut mencit akibat paparan benzopirene, kelompok P2 (benzopirene

+ PGL) (0,350 ± 0,164) tidak berbeda secara signifikan dengan kelompok P3

(benzopirene + MD) (0,383 ± 0,194), P1 (benzopirene + EA) (0,333 ± 0,216),

K0 (tanpa benzopirene) (0,450 ± 0,333). Kelompok P2, P3, P1, K0 berbeda

secara signifikan dengan kelompok K1 (benzopirene + CMC) (0,133 ±

0,081).

Wild p53 merupakan protein kelompok tumor supressor gene yaitu suatu

protein yang berperan sebagai faktor pengendalian pertumbuhan sel, bekerja

di dalam inti sel, khususnya pada proses pengendalian siklus pembelahan sel.

Wild p53 merupakan faktor transkripsi terhadap pembentukan p21,

peningkatan p21 yang disentesis akan menekan semua CDK, terjadinya siklus

pembelahan sel sangat tergantung pada CDK. CDK ditekan dan tidak



berfungsi sehingga siklus pembelahan sel akan berhenti. Wild p53 akan

memicu aktivitas Bax (pro apoptosis), aktivitas Bax akan menekan Bcl-2 (anti

apoptosis), sehingga terjadi pelepasan cytochrome-c dan akan mengaktifkan

Apaf-1 selanjutnya mengaktivasi kaskade-kaspase. Kaspase yang aktif

megaktifkan DNA-se, menembus membran inti sehingga merusak DNA yang

mutasi sehingga DNA sel yang mutasi rusak (fragmentasi) dan akhirnya sel

mengalami kematian (apoptosis).

Gen p53 diketahui bermutasi pada sekitar 70% kejadian kanker (William,

2000). Pada karsinoma sel skuamosa rongga mulut, pemeriksaan DNA

menunjukkan mutasi wild p53, di jumpai hingga 90% kasus (Syafriadi,

2008). Mutasi wild p53 sebagai pointmutation, menghasilkan protein dengan

struktur berubah yang mengisolasi protein wild p53, sehingga menginaktivasi

aktivitas fungsi wild p53 (William, 2000).


terstandar memiliki kemampuan untuk meningkatkan ekspresi wild p53,

peningkatan wild p53 akan memicu faktor transkripsi pembentukan p21,

peningkatan p21 akan menekan semua CDK, sehingga siklus sel berhenti.

Siklus sel berhenti wild p53 akan memicu Bax, aktivitas Bax akan menekan

Bcl-2 sehingga apoptosis dapat terjadi.

Ellagic acid dapat meningkatkan ekspresi reseptor kematian (apoptosis),

antara lain peningkatan reseptor TRAIL R2/ DR2. Ekspresi DR5 diatur oleh

wild p53 sehingga bisa dihubungkan dengan wild p53, peningkatan wild p53

akan meningkatka reseptor DR5. DR5 mengikat stimulasi kematian dan



menyebabkan aktivasi pro-caspase 8. Cross talk antara jalur khusus apoptosis

jalur ekstrinsik (melalui reseptor jalur kematian) dan intrinsik (melalui jalur

mitokondria) (Mohammad, 2002)

Ektrak buah delima (PGL) terstandar lebih kuat efeknya terhadap

peningkatan ekspresi wild p53 dibandingkan ellagic ac id, hal ini

membuktikan ekstrak buah delima (PGL) lebih efektif untuk meningkatkan

wild p53.

Ekstrak buah delima (PGL) yang mengandung beberapa bahan aktif,

kerjanya lebih unggul dan bekerja secara sinergis dari satu bahan aktif buah

delima. Empat kandungan bahan aktif dari buah delima (PGL), yaitu ellagic

acid, caffeic a cid, luteolin, punicid ac id secara individual menunjukkan

aktivitas antikanker pada sel kanker prostat. Namun bila dikombinasikan,

keempatnya menunjukkan aktivitas yang berlipat ganda (Seeram et al., 2006).

Peningkatan ekspresi wild p53 pada ellagic acid lebih rendah karena ellagic

acid mudah mengalami transformasi dan degradasi sebelum diabsorbsi,

kelarutannya rendah dalam air, metabolisme ellagic ac id tidak larut dalam

intestinal (Seeram et al.,2004).

Kelompok P3 (benzopirene + mahkota dewa (MD), sebagai kelompok

pembanding dan merupakan obat herbal yang sudah ada di pasaran,

menunjukkan hasil menunjukkan hasil ekspresi wild p53 lebih kuat

dibandingkan dengan ellagic acid dan ekstrak buah delima (PGL). Hal ini

mungkin karena kandungan dari mahkota dewa (phaleria macrocarpa) antara

lain ; alkaloid, terpenoid, saponin dan polyphenol komponen terbesar pada



mahkota dewa. Pada beberapa penelitian menunjukkan ekstrak mahkota dewa

dapat menstimulasi IFN-gamma yang penting dalam memicu aktivitas CTL

dan sel NK, mempunyai fungsi sitostatika untuk membunuh sel kanker dan

berfungsi sebagai imunostimulator. Polyphenol dapat berfungsi sebagai fas-

ligand yang akan memicu apoptosis sel melalui fas-receptor, polyphenol

menginduksi terjadinya apoptosis melalui jalur TNF-α, polyphenol dapat

memblok reseptor growth f actor dan menghambat MAPK pada jalur sinyal

Reseptor T irosin K inase (RTKS








jangka waktu yang panjang (Suatma et al., 2008)

). Peningkatan dosis ekstrak mahkota dewa

diikuti kenaikan indeks apoptosis. Fakta- fakta ini yang menunjukkan hasil

peningkatan ekspresi wild p53, mahkota dewa lebih bagus dari ekstrak buah

delima (PGL) maupun ellagic acid (Suryanto, 2007).




et al., 2003).



Hasil uji korelasi pemberian ekstrak buah delima (PGL) menunjukkan

hasil korelasi yang positif dan bermakna antara wild p53 dengan apoptosis.

Kenaikan ekspresi wild p53 diikuti kenaikan jumlah sel yang mengalami

apotosis. Wild p53 akan memicu aktivitas Bax (pro apoptosis ) dan akan

menekan Bcl-2 (anti apoptosis), sehingga kenaikan ekspresi wild p53 diikuti

kenaikan ekspresi apoptosis.

6.4 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) Terstandar Terhadap Perubahan

Jumlah Sel Yang Mengalami Apoptosis Pada Sel Mukosa Rongga Mulut

Akibat Paparan Benzopirene

Berdasarkan Tabel 5.6, Hasil penelitian menunjukkan pemberian ekstrak

buah delima (PGL) terstandar terhadap peningkatan apoptosis pada sel

mukosa rongga mulut mencit akibat paparan benzopirene. Hasil penelitian ini

menunjukkan bahwa ekstrak buah delima (PGL) menaikkan apoptosis pada

kelompok P2 (benzopirene + PGL) (0,366 ± 0,196) tidak berbeda secara

signifikan dengan kelompok P3 (benzopirene + MD) (0,317 ± 0,172), P1

(benzopirene + EA) (0,233 ± 0,081), kelompok P2 menunjukkan hasil

menaikkan apoptosis paling tinggi dibandingkan kelompok lain. Kelompok

P2, P3, P1 berbeda secara signifikan dengan kelompok K0 (tanpa

benzopirene + CMC) (0,083 ± 0,132 ) dan kelompok K1 (benzopirene +

CMC) ( 0,050 ± 0,054).

Kanker ditandai dengan proliferasi sel yang yang tidak terkendali, terjadi

ketidakseimbangan antara proliferasi dengan apoptosis. Sel menjadi

immortal, invasi dan metastasis ke organ-organ lain. Apoptosis adalah suatu



proses kematian sel terprogram yang terjadi secara teratur untuk

menghilangkan berbagai sel yang tidak diperlukan tanpa respons inflamasi

(Geweis, 2003). Apoptosis terjadi secara normal selama masa perkembangan

dan penuaan. Mekanisme tersebut merupakan mekanisme homeostasis untuk

menjaga dan memelihara populasi sel di dalam jaringan. Apoptosis juga

berfungsi sebagai mekanisme pertahanan seperti pada reaksi imun atau ketika

sel rusak karena suatu penyakit atau gen toksik. Karakteristik apoptosis

adalah terjadi fragmentasi DNA, kondensasi kromatin, pengerutan sitoplasma

dan sel akan mati tanpa lisis sehingga tidak merusak sel atau jaringan

sekitarnya (Geweis, 2003; Elmore, 2007).

Apoptosis merupakan proses kematian sel dalam rangka mempertahankan

integritas tubuh secara keseluruhan. Program ini memiliki peran yang penting

untuk menjaga homeostatis perkembangbiakan sel. Salah satu peran penting

apoptosis adalah untuk membatasi proliferasi sel yang berlebihan pada sel

kanker (Salido et al ., 2009). Target-target multifungsional dan aktivasi

beberapa jalur khusus apoptosis penting dalam terapi kanker untuk mencegah

perkembangan resistensi obat dalam terapi kanker (Mohammad, 2002).

Setiap sel akan merespon semua stres atau stimulus yang diterimanya

melalui berbagai macam cara baik melalui aktivasi sinyal kehidupan sampai

inisiasi kematian sel. Tujuan dari proses tersebut adalah menjaga

homeostasis, sehingga sel yang tidak diperlukan akan dieliminasi. Mekanisme

tersebut tergantung pada berbagai macam faktor dan kemampuan sel untuk

mengatasi stres atau stimulus (Samali et al ., 2010), stimulus yang diberikan



pada penelitian ini adalah pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar ,

menunjukkan dapat meningkatkan apoptosis.

Apoptosis merupakan suatu mekanisme yang efisien untuk

mengeliminasi sel yang tidak diperlukan dan mungkin berbahaya sehingga

dapat menyelamatkan organisme. Pada proses apoptosis dapat terjadi

kegagalan, yang akan menyebabkan terjadinya kanker, karena sel yang

mengalami mutasi terus menerus akan replikasi secara tidak terkendali. Wild

p53 merupaka tumor supresor gen yang akan teraktivasi jika sel memiliki gen

yang cacat (gene defect). Fungsi dari wild p53 ini mencegah replikasi sel pada

sel yang rusak atau mutasi secara genetik melalui penghentian siklus sel pada

fase G1 atau interfase, sehingga sel mempunyai waktu untuk repair. Selain

itu gen ini juga berfungsi untuk mencetuskan apoptosis . (Lumangga, 2008;

Kresno, 2011).


terstandar memiliki kemampuan meningkatkan apoptosis yang paling tinggi

dibanding kelompok lainnya. Estrak buah delima (PGL) terstandar akan

meningkatkan wild p53 akan memicu aktivitas Bax (pro apoptosis) dan

menekan Bcl-2 (anti apoptosis), sehingga terjadi pelepasan cytochrome-c dan

akan mengaktifkan Apaf-1 selanjutnya mengaktivasi kaskade-kaspase.

Kaspase yang aktif mengaktifkan DNA-se. DNA-se menembus membran inti

dan merusak DNA yang mutasi sehingga DNA-sel yang mutasi di

fragmentasi dan akhirnya sel dengan DNA yang mutasi mengalami kematian

(apoptosis).



Pengontrolan dan pengaturan proses apoptosis melalui jalur intrinsik

(jalur mitokondria) dilakukan melalui Bcl-2, yang dikenal dengan inhibitor

apoptosis. Mekanisme Bcl-2 menghambat apoptosis dengan membentuk pori

pada membran yang ditancapnya dan berinteraksi dengan berbagai jenis

protein intraselular lain yang secara langsung maupun tidak langsung terlibat

dalam proses apoptosis. Bcl-2 memberi tempat berlabuh bagi protein lain

sehingga protein bersangkutan terhenti aktivitasnya,misal Bax maka aktivitas

Bax akan berhenti (Kresno, 2011). Dengan adanya penurunan ekspresi Bcl-2

pada penelitian ini, apoptosis untuk sel yang mengalami transformasi ke

karsinoma dapat terjadi.

Ellagic ac id dapat menghambat ekspresi protein IAP dan ekspresi

protein XIAP pada penelitian secara invitro, sebagian besar kanker

menunjukkan over ekspresi protein IAP dan XIAP. Protein IAP untuk

melindungi sel kanker dari stimuli kematian sehingga beberapa terapi

antikanker menargetkan menghambat ekspresi IAP untuk membunuh sel

kanker. XIAP supresor apoptosis paling kuat, XIAP mengikat dan

menghambat caspase-3, caspase -7 dan caspase-9, dengan efek ellagic acid

yang dapat menghambat XIAP, apoptosis bisa terjadi (Mohammad, 2002).

Kelompok K0 (tanpa benzopirene dan tanpa perlakuan) apoptosis rendah,

pada kelompok K0 merupakan kelompok normal, secara fisiologis, sistem

pertumbuhan sel dalam individu diatur oleh suatu keseimbangan, yaitu

keseimbangan antara apoptosis dan proliferasi (Sudiana, 2008).



Hasil uji korelasi pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar

terdapat korelasi positif antara wild p53 dengan apoptosis. Kenaikan ekspresi

wild p53 akan diikuti kenaikan ekspresi apoptosis. Hal ini membuktikan

bahwa mekanisme kerja peningkatan apoptosis oleh ekstrak buah delima

(PGL) melalui jalur intrinsik dengan aktivitas wild p53.

6.5 Temuan Baru

6.5.1 Kerangka Temuan Baru

Gambar 6.1 Kerangka Temuan Baru 6.5.2 Keterangan Kerangka Temuan Baru

Transformasi sel akibat paparan benzopirene menghasilkan metabolit

reaktif yang akan berikatan secara kovalen dengan DNA sehingga terjadi

mutasi pada gen p53 sehingga wild p53 tidak berfungsi. Ekstrak buah delima

(PGL) terstandar memicu aktivitas wild p53, merupakan faktor transkripsi

terhadap pembentukan p21. Peningkatan p21 akan menekan semua CDK

pada siklus sel, maka siklus sel akan berhenti. Saat siklus sel berhenti, wild

Delima (PGL)

R. Estrogen

Bax ↑

Bcl-2

VEGF ↓

Angiogenesis ↓

Wild p53 ↑

Apoptosis



p53 akan memacu antivitas Bax sehingga terjadi perubahan permeabilitas

membran dari mitokokondria. Perubahan ini mengakibatkan terjadi pelepasan

cytokrom-c ke sitosol, cytokrom-c akan megaktivasi Apaf-1, yang akan

mengaktifkan kaskade-kaspase. Kaskade-kaspase akan mengaktifkan DNA-

se, akan menembus membran inti dan merusak DNA yang cacat/mutasi.

Sehingga DNA sel yang cacat / mutasi akan fragmentasi (rusak) dan akhirnya

mengalami kematian (apoptosis).

Ekstrak buah delima (PGL) terstandar masuk ke dalam sel melalui

reseptor estrogen, ikatan antara delima dengan trasformasi sel melalui ikatan

fas-ligand. Ikatan fas-ligand akan memicu aktivasi phospholipase C (PLC)

mengubah phosphotydil i nositol diphosphat (PI2) menjadi phosphotydil

inositol t riphosphat (PI3P) dengan reseptor di membran endoplasmic

reticulum menyebabkan pintu calcium di membran endoplasmic r eticulum

terbuka, sehingga Ca+ dilepas ke sitosol mengatifkan phospholipase A2,

phospholipase A2 memecah phosphotydil c olin menjadi lisophosphotydil

colin dan asam ar akidonat. Asam ar akidonat melalui jalur sikooksigenase

2/COX-2 mengeluarkan prostaglandin,prostaglandin memicu angiopoitin

untuk mengeluarkan VEGF, VEGF merupakan inducer yang akan memicu

pembentukan angiogenesis dan angiogenesis bertindak sebagai faktor

pertumbuhan autocrine bagi sel kanker. Ekstrak buah delima (PGL)

terstandar menghambat produksi VEGF mengakibatkan pembentukan

angiogenesis menurun/tidak terbentuk, suplai makanan, oksigen terputus ke



sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa sehingga sel

yang mengalami transformasi akan mengalami kematian.

Menemukan jalur apoptosis dari mekanisme kerja ekstrak buah delima

(PGL) melaui peningkatan ekspresi wild p53, menurunkan ekspresi Bcl-2

dan dapat menurunkan ekspresi VEGF sehingga angiogenesis menurun.

Angiogenesis mutlak diperlukan untuk pertumbuhan dan survival sel kanker.

Hasil penelitian ini juga membuktikan bahwa induksi pada mekanisme

apoptosis merupakan faktor esensial untuk mengatasi sel kanker dan memutus

suplai nutrisi dari sel kanker sehingga sel kanker bisa mati.



BAB 7

PENUTUP

7.1 Kesimpulan

Mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terhadap apoptosis melalui

jalur intrinsik dan ada korelasi positif dua arah antara ekspresi Bcl-2 dengan

ekspresi VEGF.

1. Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi Bcl-2

yang mempunyai korelasi positif dan bermakna dengan penurunan ekspresi

VEGF, penurunan ekspresi Bcl-2 mempunyai korelasi negatif dan bermakna

dengan peningkatan ekspresi wild p53.

2. Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild

p53 dan mempunyai korelasi positif dengan peningkatan ekspresi

apoptosis.

6.2 Saran

1. Perlu melakukan penelitian lanjutan untuk menentukan kandungan

senyawa lain dalam ekstrak buah delima (PGL) terstandar yang memiliki

kemampuan meningkatkan potensi dan aktivitas ellagic ac id sebagai

antikanker.

2. Melakukan penelitian lebih lanjut tentang pemanfaatan ekstrak buah

delima (PGL) terstandar, baik dalam optimalisasi bentuk sediaan maupun

pemanfaatannya dalam uji preklinik maupun klinik bagi penderita

kanker.

131



3. Melakukan penelitian lebih lanjut tentang pemanfaatan ekstrak buah

delima (PGL) terstandar ke fitofarmaka.



DAFTAR PUSTAKA

Albrecht M, Jiang W, Kumi, Diaka J, 2004. Pomegranate extracs potently suppress proliferation, xenograft growth and invasion of human prostate cancer cells. J Med Food 7 : 247-283.

Arundina I, 2008. Efek fraksi n-heksana etil asetat artemesia vulgaris L terhadap

ekspresi protein ras, p53, PCNA, C-MYC dan apoptosis pada sel mukosa rongga mulut yang mengalami transformasi akibat induksi benzopirene. Disertasi. Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga Surabaya. Hal: 11-19.

Azadzoi KM and Siroky M, 2010. Oxidative stress and molecular reaction in

arteriogenic erectile dysfunction. Chonnam Medical Journal 45 (1) :1-8.

Baert AL, 2008. Apoptosis in encyclopedia of diagnostic imaging Vol 2,

Spreinger –Verlag Berlin Heindelberg .New York 94-98. Baratawidjaya KN dan Rengganis I, 2010. Texbook imunologi dasar. Fakultas

Kedokteran Universitas Indonesia, Edisi ke -9. Hal 124-126, 460-463.

Bell C and Hawthorne S, 2008. Ellagic acid, pomegranate and prostate cancer

Mini review, 2008. J Pharm Pharmacol 60 (2) : 66-71. Budhy TI, 2004. Karsinogenesis karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang

terinfeksi epstein-barr virus (EBV) berdasar ekspresi p53, c-myc dan Bcl-2. Disertasi . Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga Surabaya. Hal ; 33- 43

Budhy TI, 2008. Protein spesifik karsinoma sel skuamosa rongga mulut sebagai

marker deteksi dini. Majala Kedokteran Gigi, vol 23,No 3, September 2008.

Burlado B, Verota L, Lura C, Bottini E, 2010. Monographes of herbal principle.

Massa CRS Pres pp 5-15. Celik I, Atilla Temur and Ismail Isik, 2009. Hepatoprotective role andantioxidant

capacity of pomegranate (punica granatum) flower infusion againts trichloroacetic acid-exposed in rats. J Food and Chemical 47 (1): 145- 149.

Cerda B, Ceron II, Tomas-Barberan FA, Espin JC, 2003. Repeated oral

administration of high doses of the pomegranate, ellatannin, punicalagin to rats for 37 day is not toxid. J Agric Food Chen, 51: 3493-34501.



Cerda B, Soto C, Albaladejo MD, Martinez P, Sanchez-GasconF, Tomas- Balberan F, Espin JC, 2006. Pomegranate juice supplementation in chronic obstructive pulmonary disease : a 5-week randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Clin Nutr; 60(2):33-40.

Cho WC, 2007. Nasopharyngeal Carcinoma Molecular Biomarker Discovery and

Progres. Molecular Cancer 6:1 -8 Cotran RS, Kumar V, Collin T.1999. Neoplasia in pathologic basic of disease.

Sixth Edition, Philadelphia : W.B Saunders Company, pp : 260-325. Cotran RS. Kumar V, Collins T, 2005 Pathologic basic of disease 7th

ed. Philadelphia. WB Saunders Company : 260-325.

Edderkaoui M, Odinokova I, Ohno I, Gukovsky I, Go V L W, Pandol S J, Gukovkaya A S, 2008. Ellagic acid induces apoptosis through inhibitian of nuclear factor kB pancreatic cancer cells. Journal of Gastroenterologi ISSN 1007-9327 21: 14 (230 :3672-3680.

Dvorak HF, 2005. Angiogenesis update. J Thromb Haemost 3 : 1835 -1840. Elmore S, 2007. Apoptosis a rewiew of programmed cell death. Toxicol Pathol

35-495-516. Epstein J and Waal IV, 2008. Oral cancer. Texbook of oral medicine, Burket

Eleventh Edition. BC Decker Inc Hamilton Press :153-167. Faust RA,1994.Toxicity Summary For Benzo (a) pyrene. Prepared for oak ridge

reservation environmental restoration program. martin marieta energy Sistems, Inc, For The US. Department Of Energy Under Contrac N0 DE-AC05-840R21400 : 1-6.

Geweis A, 2003. Introduction to apoptosis. Aporeview 1-26. Gil C, Wei J, Yang J, 2008. Pomegranate juice is potentially better than aple

Juice in improving antioxidant function in elderly subject. Nutr Res : 28: 72-77.

Guo N, Faller DV, Vaziri C. 2002. Carcinogen Induced S-phase arrest is Chk 1

mediated and caffeine sensitive. Cell Growth Differentiation : 13:77-86

Griffiths, EJF, Miller DT. Suzuki, Lewontin W, Gilbert M. 1993. An introduction

to genetic analysis, 5 Ed. W. H. Preeman and Company. New York.p ; 841.



Hasina R, Mark W, Lingen, 2001. Angiogenesis in oral cancer.D Center.Department of Pathology, Loyola University Medical J of Dental Education, Vol 65. Hal:11.

Heyne, K.1987.Tanaman berguna indonesia, jilid II, Cetakan Pertama,

diterjemahkan oleh Badan Litbang Departemen Kehutanan, Yayasan Sarana Wana Jaya, Jakarta :1029.

Hong MY, Seeram NP, Heber D, 2008.Pomegranate polyphenols down-regulate

exspression of androgen-synthesizing genes in human prostate cancer cells overexpressing the androgen receptor. Journal of Nutritional Biochemistry. David Geffen School Medicine University of California, Los Angeles : 20-30.

Hoang N, Tran A, Bae YS, Song BH, 2010. Pomegrnate (punica granatum )seed

linolenic acid isomers concentration dependent modulation of estrogen receptor activity. J Biological Eduction, Kyungpook National University Teagu, Republic of Korea. Vol 35 ; 1-16.

Hui L, Abbas T, Pielak RM, Joseph T, Borgonetti J, Fosta DA, 2000.

Phospolipase D elevates the level of MDM2 and supresses DNA damage induced increases in p53 molecular and celuler biology. 24(13) : 5677-5686.

Jung JE, Kim HS, Lee CS, Park DH, Myung Y, Lee MJ, Lee JW, Park JW, Kim

MS, Ye SK, Chung MH, 2007. Caffeic acid and its synthetic derivad cape supressor tumor angiogenesis by blocking STAT3-mediated VEGF expression in human carcinoma. Department of Pharmaology College of Medicine, Soul National University, Soul 110-799. Korea. Carcinogenesis Vol 28 n0 8 :1780-1787.

Jurenka J, 2008. Therapeutic applications of pomegranate (Punica granatum L) :

A Review Alternative Medicine Review, 13 (21) : 128-144. Kelley DJ, Mestre JR, Subbaramaiah K, Sacks PG, Schantz SP, Tanabe T, Inoue

H. Ramonetti JT, Dannenberg AJ, 1997. Benzo (a) pyrene up regulates cyclooxygenase-2 gene expression in oral epithelial eells. Carcinogenesis 18 ( 4) : 795- 799.

Khan N, Afaq F, Kweon MH, Kim KM, Mukhtar H, 2007. Oral consumpsion of

pomegranate fruit extract inhibits growth and progression of primary lung tumors in mice. Departement of Dermatology, University of Wisconsin-Madison, Medical Sciences Center. 67 (7): 3475- 3482.

King RJB. 2000. Cancer Biology. Prentice Hall Pearson Education ,pp 50-158.



Kintoko, Hawariah A, Pihie L, 2008. Efek proliferasi ekstrak kloroform dari phaleria macrocarpa pada titisan sel kanker manusia. Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan. Universitas Kebangsaan Malaysia, pp 1- 6.

Kim H K, Yang T H, Cho H Y, 2009. Antifibrotic effect of green tea on invitro

and invivo models of liver fibrosis. J Gastroenterol 15 (41) : 5200-5205.

Kresno SB, 2011. Texbook Ilmu dasar onkologi. Edisi kedua. Badan Penerbit

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesi. Hal 66-129. Kholifa M,2010,Pengaruh konsentrasi ekstrak etanol buah delima (Punica

granatum Linn) terhadap peningkatan apoptosis sel kanker lidah manusia Sp-C1 invitro. Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Surakarta.Biomedika,Vol 2 No 2, hal :72-80.

Lansky EP and Newman RA, 2007. Punica granatum (pomegranate) and its

potential for preventif and treatment of inflammation and cancer. J Ethnopharmaceol 109: 177-206.

Lumangga F, 2008. Apoptosis. J departemen Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan. Hal 1-7. Malik A, Afaq F, Sarfaras S, Vaqar M, Andhani, Deeba N S, Mukhtar H 2005.

Pomegranate fruit juice for chemoprevention and chemotherapy of prostate cancer. Dermatology, 1300 University Avenue, MSC B25, Madison. Proc Natl Acad Sci 102 : 35-42.

Martin KR, Trempus C. Saulnier M, Kari FW, Barret JC, French JE. 2001.

Dietary N-acetyl L-cystein modulates benzopyrene induced skin tumor in cancer-prone p53 haplo insufficient Tg.c (vH-Ras) mice carcinogenesis, 22 (9) ; 1373-1378.

Maoli T, Wei-Chen G, Cheng su C, Gung Lin J, Chung Yeh C, Chu Cheng K,

Gung Chung J, 2005. Ellagic acid induced p53 /p21 ekspression, G1 arreest and apoptosis in human bladder cancer T24 cells. School of Chinese Medicine. Department of Microbiology, China Medical University. Anti cancer research 25 :971-980.

Marzo L and Naval J, 2008. Bcl-2 family members as molecular targets in cancer

therapy. J Biochen Pharm 76: 939-46. McCutcheon A, Udani J, Brown DJ, 2008. Scientific and clinical monograp for

pom wonderful pomegrante Juice.American Botanical Council .pp 1- 15.



Mehrota R and Syadav. 2006. Oral squamous cell carcinoma, etiology, phatogenesis and prognostic of genomic alteration. Indian Journal of cancer Departement of phatology. Motilai Nehru Medical colleg. University of Alhabad. Pp : 162.

Mendelsohn J, Holley PM, Israel MA, Gray JW, Thompson CB, 2008. The

moleculer basis cancer. 3ed Elsevier Saunders, Philadelphia. Apoptosis, Autophagy and Necrosis. Pp : 205-220.

Meier, P, Finch, A and Evan G, 2000. Apoptosis in development. Nature

407(6805) : 796-801. Mestas J, Hughes C, 2004. Of mice and not men; differences between mouse and

human immunology.J Immunol.172 : 2731:2738. Mohammad HF, 2002. Ellagic Acid-Mediated CK2 Inhibition, A Natural

multifunction strategy to trigger cervical cancer cell death Invitrio and Invivo. Disertation On Department Of Chemistry, Cleve Land State University. pp 1-24.

National Plant Data Center, 2000. USDA, Baton Rouge, LA. pp70874-4490,

USA. Nurhayati S dan Lusiyanti Y, 2006. Apoptosis dan respon biologik sel sebagai

faktor prognosa radioterapi kanker. Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi. Batan. Vol 7 : 57-66.

Palanysamy D, Syamala, Kannan E and Bhojraj S, 2007. Protective and

therapeutic effect of the indian medical plant pterocaurpus santa linus on D-galactosamine-induce liver damage. Traditional Med. 2 (20) : 51-57.

Pantuck AJ, Leppert JT, Zomorodian N, 2006. Phase II study of pomegranate

juice for men with rising prostate- spesific antigen following surgery or radiation for prostate cancer. Clin Cancer Res 12, : 87-94.

Papoutsi Z, Kassi E, Tsiapara A, Fokiakis N, George P, Chrousos, Moutsatsou P,

2005. Evalution of Estrogen / Antiestrogenic Activity of Ellagic Acid Via The Estrogen Reseptor Subtypes Erα Erβ.Departement of Pharmacy. University of Athena.J.Agric Food Chem. 53:7715-7720.

Pelengaris S, Khan M, 2006. DNA replikasi and cell cycle In The Molecular

Biology of Cancer.Toronto : Blackwell Publishing .pp 88-119. Pindborg JJ, 2000. Texbool kanker dan pra kanker rongga mulut. EGC. Jakarta.

Hal :1- 38.



Pressentin MM, Kosinska W, GuttenplanJB.2003.Mutagenesis induced by oral carcinogen in lac mouse tongue and other oral tissue. carcinogenesis. 20 (11): 2167-2170.

Pulmeriastuti H, 2006. Ekspresi fas, granzyme dan caspase 3 pada apoptosis sel

bursa fabrictus ayam pada infeksi virus gumboro. Disertasi. Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga Surabaya. Hal 8-39.

Rantam, A. F., 2003, Pewarnaan imuhistokimia dari limfosit. Metode Imunologi

Surabaya : Airlangga University Press, hal 129-144. Reuben SC, Gopalan A, Danielle M, Bishayee A, 2011. Modulation of

angiogenesis by dietary phytoconstituents in the prevention and intervention of breast cancer. J Pharmaceuticl Sciences, College of Pharmacy Northeast Ohio Medical University Rootstown, OH, USA.56 ;14-29

Rizali, E dan Auerkari EI.2003.Teknik pewarnaan silver (AgNOR) sebagai salah

satu cara menentukan aktivitas proliferasi sel tumor dan apoptosis, Jurnal Kedokteran Gigi Indonesia 10 (3), Hal:41-45.

Robert A, Vicall FB, Claporols C, Meunier B. 2006. The animalarial drug

artemisinim alkylates heme in infected mice. PNAS. 102 (38): 13676-13680.

Roger JBK and Robin MW, 2006. Mutation DNA repair and genetic instability in

cancer biology III Edition. Gosport: Ashford Colour Press : 112. in Infected Mice. PNAS. 102 (108) :13676-13680.

Roskoski R, 2007. Vascular endotel growth factor (VEGF) signaling in tumor

progression .Critical Reviews in Oncology Hematology 62: 179-213. Safriadi M, 2008. Patologi mulut tumor neoplastik dan non neoplastik rongga

mulut.Textbook of Patologi Mulut.C.V Andi : 73-83. Sai prakash CV nd Indra prakash, 2011. Bioactive chemical constituents from

pomegranate (punica granatum) juice, seed nd peel-A review. International Jof Research in Chemistry and Environment Vol 1(1-8) ISSN22 : 48-9649.

Saifudin A, Rahayu V, Teruna H Y.2011. Texbook standardisasi bahan Obat

alam.Edisi pertama.Graha Ilmu. Hal ;1- 26. Salido GM, Rosado JA.2009.Apoptosis; involvement of oxidative stress and

intracellular Ca2+ homeostasis.Dept of Physiology.University of Extremadure. Spain.



Samali A, Fulda S, Adrienne MG, Osamu H, Srinivasula SM, 2010.Cell stress and cell death.Int J Cell Biol :11-15.

Sartippour MR, Seeram NP, Rao JY, Moro A, Harris DM, Henning SM, Firouzi

A, Rettig MB, Aronson WJ, Pantuck AJ, Heber D, 2008. ellagitannin-rich pomegranate extract inhibit angiogenesis in prostate cancer invitro and invivo. Int J. Oncol 32 (2) : 43-50.

Sattar A, Hewer A. Philips DH. Camphell FC. 1999. Metabolic proficiency and

benzo (a) pyrene DNA adduct formation in APC mouse adenomas and uninvolveld mucosa. Carcinogenesis. 20 (6) : 1097-1101.

Seeram NP, Lee R and Heber D, 2004. Bioavailability of ellagic acid in human

plasma after consumptionof ellagitannins from pomegranate (Punica Granatum L) juice Clinica Chimica Acta 348 (2004) 63-68.

Seeram NP, Adam LS, Henning SM, Niu Y, Zhang Y, Nair MG, Heber D. 2005.

Invitro antiproliferative, apoptosis and antioxidant activitics of punicalagin, ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are enhanced in combination with other polyphenol as found in pomegranate juice. J of Nutr Biochem 16 : 360-367.

Seeram NP, Schulman RN, Heber D, 2006. Pomegranate ancient roots to modern

Medicine 1st

Ed. Taylor and Francis Group, New York .pp 2-99.

Seelinger G, Merfort I, Wolfle U, Cristoph M, Schempp, 2008. Anti-carcinogenic effects of the flavanoid luteolin.J Medical and Pharmaceutical Services, Berlin, Germany. University Medical Center Freiburg. 13 : 2628-2651.

Schubert YS, Lansky EP, Neeman I, 199. Antioxydant and eicosanoid enzyme

inhibition properties of pomegranate seed oil and fermented juice flavonoids. J Ethnopharmacol 66 :11-17.

Shore GC, Ngayem M, 2008. Bcl-2 Proteins and Apoptosis. Choose Your Partner.

Cell 135 : 1004-7. Solomon MC, Carnelio S, Gudattu V.2010. Molecular analysis of oral squamous

cell carcinoma : a tissue microarray study. Department of Oral Pathlogy, Manipal College of Dental Science, Manipal University Manipal, Karnataka -576 104. India. Vol : 47 : 166-172.

Spector DJ, Robert DG, Lesli AI, 1998. Cell laboratory manual, subcellular

localization of gene and their product, Vol 3, Publisher, Cold Spring Harbor Laborator1y Press. New York, USA : 151-161.



Sismindari, 2005. Target biologi sebagai tantangan pada penemuan dan pengembangan obat antikanker, Fakultas Farmasi. Universitas Gajah Mada. Hal : 1-5.

Suatma, Haryono A, Widyastuti N, 2008. Efek toksik buah mahkota dewa

(Phaleria macrocarpa) Pada mencit (Mus Musculus) Swiss Webster .Jurnal Biotika Vol .5 No.1 Juni 2008 hal. 42-48.

Suryanto T, 2007. Pengaruh pemberian ekstrak phaleria macrocarpa terhadap

indeks apoptosis sel adenokarsinoma mamma dan perkembangan massa tumor payudara mencit CH3. Disertasi. Pascasarjana Universitas Diponegoro Semarang. Hal 8-12.

Subiyantoro P, 2010. Deteksi Metilasi p 14 Karsinoma sel skuamosa rongga

mulut. Disertasi. Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga. Surabaya. Hal 7- 10.

Sudiana, IK., 2005. Teknologi ilmu jaringan dan imunohistokimia Surabaya :

Agung seto. Sudiana IK, 2008. Patobiologi molekuler kanker.Textbook Penerbit Salemba

Medika : 27-90. Sunitha Carpelio and Gabriel Rodrigues, 2004. Oral cancer a glance. The Journal

of Dental Sience. Volume 1 Number 2. Solomon MC, Carnelio S, Gudattu V, 2010. Molecular analysis of oral squamous

cell carcinoma : a tissue microarray study. Oral Pathology J, Manipal. College of Dental Science, Manipal University, Vol 47 ; 166-172.

Thongrakard V and Tencomnao T, 2010. Modulatory effects of thai mecicinal

plant Extract on proinflammatory cytokines-induced apoptosis in human keratocyte HaCaT cells. Center for excellence in omics-nano medical technology development project, departement of clinical chemistry, faculty of allied health sciences Chulalongkom University, Bangkok. Thailand : 103 -130.

Umeda D, Yano S, Yamada K and Tachibane, 2007. The Polyphenol

Epigallocatechin-3-Gallate Signaling Pathway Through 67-kDa Laminin Receptor.

Valadares MC, Pereire ERT, Benfica PL, Paula JR, 2010. Assessment of

mutagenic and antimutagenic effects of Punica Granatum. In Mice Brazillian Journal of Pharmaceutical Sciences vol 46 : 120 -125.



Vidmar J, Gigard S, Kindzierski W, Schulz J, 2004. Review of approaches for setting an objective for mixtures in ambient air using polycyclic aromatic hidrocarbon (PAHs). Air Polic Section Alberta Environment 11th Floor, Baker Centre 10025-106th

Street Edmonton, Alberta T5J1G4 :1-40.

Vidal A, Fallarero A, Pena BR, Medina ME, Gra B, Rivera F, Gutierrez Y, Vuorela PM, 2003. Studies on the toxicity of punica granatum L (Punicacea) whole fruitt extracts J Etnopharmacol, 89: 295-300.

Wahyuni F, 2010. Karsinoma sel skuamosa yang didahului inflamasi kronis non-

spesifik. Departemen Penyakit Mulut,Universitas Sumatera. Hal:3-9. William, 2000. Molecular Pathogenesis of oral squmous carcinoma. J Clin Oral

Pathology Birmingham Dental Hopital and School 53 ;165-172. Wiese FW, Thompson PA, Kadlubar FF, 2001. Carcinogen substrat specificity of

human Cox 1 and Cox 2. Carcinogenesis 22 (1 ) ; 5-10. Walum, E, K. Stenberg and D. Jansen. 2000. Understanding cell toxicology

principles and practice. Ellis Horwood Limited. England : 129-136. Wang Y. 2003. Public health goal for benzopirene in drinking Water Wasito R. 2001. Penggunaan imunohistokimia untuk diagnosis penyakit. Kursus

Singkat Imunohistokimia di PAU. Universitas Gajah Mada. Yogyakarta. Hal 5-10.

Widyasari A, Retnoningsih D, Lassie N, 2008. Ekstrak etanol biji mahkota dewa

(Phaleria Macrocarpa (Scheff)Boerl) meningkatkan ekspresi caspase-3 aktif pada cell line CA Colon WIDR. Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. PKMI-2-7-1.

Yakovlev AG and Faden AI, 2004. Mechanism of neural cell death : implication

for development of neuroprotective treatment strategies. The American Society for Exsperimental Neuro Therapeutic, 1 : 5-16.

Yuaniarti WM,2012.Efek antifibrotik ekstrak buah delima (Punica granatum L )

pada fibrosis hati.Disetasi.Program Pascasarjana Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga,hal 100-109.

Zhang S, Won YK.Ong CN, Shen HM. 2009. Anti cancer potential of

sesquiterpene lactoner bioctive and molecular mechanism. Curr Med. Chem Anti Cancer Agent. 5 (3) : 239-249.



Lampiran 1



Lampiran 2



Lampiran 3 NPar Tests

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Kelompok Berat Badan Awal (gram)

Berat Badan stlh paparan

(gram)

Berat Badan stlh perlakuan

(gram)

Kontrol Negatif N 6 6 6

Normal Parametersa,,b Mean 34.9333 36.2617 38.1533

Std. Deviation 2.33295 2.27895 2.31747

Most Extreme Differences Absolute .201 .277 .191

Positive .201 .173 .165

Negative -.191 -.277 -.191

Kolmogorov-Smirnov Z .494 .679 .468

Asymp. Sig. (2-tailed) .968 .746 .981 Kontrol Positif N 6 6 6

Normal Parametersa,,b Mean 36.7033 34.7367 34.6817 Std. Deviation 3.17227 3.68468 4.29698

Most Extreme Differences Absolute .192 .184 .196 Positive .192 .177 .195 Negative -.154 -.184 -.196

Kolmogorov-Smirnov Z .469 .450 .481 Asymp. Sig. (2-tailed) .980 .987 .975

Benzopyrene + EA N 6 6 6 Normal Parametersa,,b Mean 34.8000 33.3650 34.2383

Std. Deviation 3.15468 3.39049 3.16824 Most Extreme Differences Absolute .361 .352 .350

Positive .219 .231 .222 Negative -.361 -.352 -.350


Benzopyrene + PGL N 6 6 6 Normal Parametersa,,b Mean 35.7833 34.8050 35.4683




Benzopyrene + MD N 6 6 6 Normal Parametersa,,b Mean 39.5500 38.8717 40.8300




a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data.



Oneway

Descriptives Berat Badan Awal (gram)

N Mean Std.

Deviation Std. Error

95% Confidence Interval for Mean

Minimum Maximum Lower

Bound Upper Bound

Kontrol Negatif 6 34.9333 2.33295 .95242 32.4850 37.3816 32.50 37.80 Kontrol Positif 6 36.7033 3.17227 1.29507 33.3742 40.0324 33.20 40.90 Benzopyrene + EA 6 34.8000 3.15468 1.28789 31.4894 38.1106 30.50 37.30 Benzopyrene + PGL 6 35.7833 4.73811 1.93432 30.8110 40.7557 30.60 41.00 Benzopyrene + MD 6 39.5500 1.77172 .72330 37.6907 41.4093 37.80 42.50 Total 30 36.3540 3.45316 .63046 35.0646 37.6434 30.50 42.50

Test of Homogeneity of Variances Berat Badan Awal (gram)

Levene Statistic df1 df2 Sig.

5.222 4 25 .003

ANOVA

Berat Badan Awal (gram)

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 90.572 4 22.643 2.218 .096 Within Groups 255.233 25 10.209 Total 345.805 29

Robust Tests of Equality of Means Berat Badan Awal (gram)

Statistica df1 df2 Sig.

Brown-Forsythe 2.218 4 17.517 .109 a. Asymptotically F distributed.

Oneway

Descriptives Berat Badan stlh paparan (gram)

N Mean Std.



Minimum Maximum Lower Bound Upper Bound

Kontrol Negatif 6 36.2617 2.27895 .93038 33.8701 38.6533 33.15 38.50 Kontrol Positif 6 34.7367 3.68468 1.50426 30.8698 38.6035 30.00 38.90 Benzopyrene + EA 6 33.3650 3.39049 1.38416 29.8069 36.9231 29.05 36.67 Benzopyrene + PGL 6 34.8050 4.90675 2.00317 29.6557 39.9543 29.08 41.00 Benzopyrene + MD 6 38.8717 1.87223 .76434 36.9069 40.8365 36.79 41.75 Total 30 35.6080 3.68744 .67323 34.2311 36.9849 29.05 41.75



Test of Homogeneity of Variances Berat Badan stlh paparan (gram)


4.014 4 25 .012

ANOVA

Berat Badan stlh paparan (gram)



Robust Tests of Equality of Means Berat Badan stlh paparan (gram)

Statistica df1 df2 Sig.

Brown-Forsythe 2.271 4 17.887 .102 a. Asymptotically F distributed. Oneway

Descriptives Berat Badan stlh perlakuan (gram)

N Mean Std.



Minimum Maximum Lower Bound Upper Bound

Kontrol Negatif 6 38.1533 2.31747 .94610 35.7213 40.5854 35.03 41.15 Kontrol Positif 6 34.6817 4.29698 1.75423 30.1723 39.1911 29.09 39.00 Benzopyrene + EA 6 34.2383 3.16824 1.29343 30.9135 37.5632 30.01 37.00 Benzopyrene + PGL 6 35.4683 4.86519 1.98620 30.3626 40.5740 30.00 41.32 Benzopyrene + MD 6 40.8300 3.11360 1.27112 37.5625 44.0975 37.45 45.48 Total 30 36.6743 4.23891 .77392 35.0915 38.2572 29.09 45.48

Test of Homogeneity of Variances

Berat Badan stlh perlakuan (gram)


1.971 4 25 .130

ANOVA

Berat Badan stlh perlakuan (gram)





Post Hoc Tests

Multiple Comparisons Berat Badan stlh perlakuan (gram) LSD

(I) Kelompok (J) Kelompok

Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

Kontrol Negatif Kontrol Positif 3.47167 2.11718 .114 -.8888 7.8321

Benzopyrene + EA 3.91500 2.11718 .076 -.4454 8.2754

Benzopyrene + PGL 2.68500 2.11718 .216 -1.6754 7.0454

Benzopyrene + MD -2.67667 2.11718 .218 -7.0371 1.6838 Kontrol Positif Kontrol Negatif -3.47167 2.11718 .114 -7.8321 .8888

Benzopyrene + EA .44333 2.11718 .836 -3.9171 4.8038 Benzopyrene + PGL -.78667 2.11718 .713 -5.1471 3.5738 Benzopyrene + MD -6.14833* 2.11718 .008 -10.5088 -1.7879

Benzopyrene + EA Kontrol Negatif -3.91500 2.11718 .076 -8.2754 .4454 Kontrol Positif -.44333 2.11718 .836 -4.8038 3.9171 Benzopyrene + PGL -1.23000 2.11718 .566 -5.5904 3.1304 Benzopyrene + MD -6.59167* 2.11718 .005 -10.9521 -2.2312

Benzopyrene + PGL Kontrol Negatif -2.68500 2.11718 .216 -7.0454 1.6754 Kontrol Positif .78667 2.11718 .713 -3.5738 5.1471 Benzopyrene + EA 1.23000 2.11718 .566 -3.1304 5.5904 Benzopyrene + MD -5.36167* 2.11718 .018 -9.7221 -1.0012

Benzopyrene + MD Kontrol Negatif 2.67667 2.11718 .218 -1.6838 7.0371 Kontrol Positif 6.14833* 2.11718 .008 1.7879 10.5088 Benzopyrene + EA 6.59167* 2.11718 .005 2.2312 10.9521 Benzopyrene + PGL 5.36167* 2.11718 .018 1.0012 9.7221

*. The mean difference is significant at the 0.05 level. NPar Tests

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Kelompok BCl2 VEGF P53 Apoptosis

Kontrol Negatif N 6 6 6 6

Normal Parametersa,,b Mean .0000 .1333 .4500 .0833

Std. Deviation .00000c .10328 .33317 .13292

Most Extreme Differences Absolute .293 .393 .401

Positive .293 .393 .401

Negative -.207 -.227 -.265

Kolmogorov-Smirnov Z .718 .963 .983

Asymp. Sig. (2-tailed) .681 .312 .289 Kontrol Positif N 6 6 6 6

Normal Parametersa,,b Mean .3667 .3500 .1333 .0500 Std. Deviation .10328 .10488 .08165 .05477

Most Extreme Differences Absolute .293 .183 .293 .319 Positive .207 .183 .207 .319 Negative -.293 -.183 -.293 -.319

Kolmogorov-Smirnov Z .718 .449 .717 .782 Asymp. Sig. (2-tailed) .681 .988 .682 .573



Benzopyrene + EA N 6 6 6 6 Normal Parametersa,,b Mean .0833 .2667 .3333 .2333

Std. Deviation .07528 .10328 .21602 .08165 Most Extreme Differences Absolute .254 .293 .121 .293

Positive .246 .207 .109 .207 Negative -.254 -.293 -.121 -.293

Kolmogorov-Smirnov Z .623 .718 .297 .717 Asymp. Sig. (2-tailed) .833 .681 1.000 .682

Benzopyrene + PGL N 6 6 6 6 Normal Parametersa,,b Mean .0167 .1833 .3500 .3667

Std. Deviation .04082 .09832 .16432 .19664 Most Extreme Differences Absolute .492 .401 .286 .299

Positive .492 .266 .286 .299 Negative -.342 -.401 -.181 -.198

Kolmogorov-Smirnov Z 1.205 .981 .701 .733 Asymp. Sig. (2-tailed) .110 .291 .709 .655

Benzopyrene + MD N 6 6 6 6 Normal Parametersa,,b Mean .0000 .1500 .3833 .3167

Std. Deviation .00000c .10488 .19408 .17224 Most Extreme Differences Absolute .183 .226 .251



a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data. c. The distribution has no variance for this variable. One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test cannot be performed.

General Linear Model

Between-Subjects Factors

Value Label N

Kelompok 0 Kontrol Negatif 6

1 Kontrol Positif 6

2 Benzopyrene + EA 6

3 Benzopyrene + PGL 6

4 Benzopyrene + MD 6

Descriptive Statistics

Kelompok Mean Std. Deviation N

BCl2 Kontrol Negatif .0000 .00000 6

Kontrol Positif .3667 .10328 6

Benzopyrene + EA .0833 .07528 6

Benzopyrene + PGL .0167 .04082 6

Benzopyrene + MD .0000 .00000 6

Total .0933 .15298 30 VEGF Kontrol Negatif .1333 .10328 6

Kontrol Positif .3500 .10488 6 Benzopyrene + EA .2667 .10328 6



Benzopyrene + PGL .1833 .09832 6 Benzopyrene + MD .1500 .10488 6 Total .2167 .12617 30

P53 Kontrol Negatif .4500 .33317 6 Kontrol Positif .1333 .08165 6 Benzopyrene + EA .3333 .21602 6 Benzopyrene + PGL .3500 .16432 6 Benzopyrene + MD .3833 .19408 6 Total .3300 .22614 30

Apoptosis Kontrol Negatif .0833 .13292 6 Kontrol Positif .0500 .05477 6 Benzopyrene + EA .2333 .08165 6 Benzopyrene + PGL .3667 .19664 6 Benzopyrene + MD .3167 .17224 6 Total .2100 .18071 30

Box's Test of Equality of Covariance Matricesa

Box's M 47.417 F 1.406 df1 20 df2 807.650 Sig. .111 Tests the null hypothesis that the observed covariance matrices of the dependent variables are equal across groups. a. Design: Intercept + klp

Multivariate Testsc

Effect Value F Hypothesis df Error df Sig.

Intercept Pillai's Trace .923 66.307a 4.000 22.000 .000

Wilks' Lambda .077 66.307a 4.000 22.000 .000

Hotelling's Trace 12.056 66.307a 4.000 22.000 .000

Roy's Largest Root 12.056 66.307a 4.000 22.000 .000 Klp Pillai's Trace 1.446 3.539 16.000 100.000 .000

Wilks' Lambda .050 7.030 16.000 67.849 .000 Hotelling's Trace 9.530 12.210 16.000 82.000 .000 Roy's Largest Root 8.512 53.201b 4.000 25.000 .000

a. Exact statistic b. The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level. c. Design: Intercept + klp

Levene's Test of Equality of Error Variancesa

F df1 df2 Sig.

BCl2 5.788 4 25 .002 VEGF .144 4 25 .964 P53 1.072 4 25 .391 Apoptosis 4.140 4 25 .010 Tests the null hypothesis that the error variance of the dependent variable is equal across groups. a. Design: Intercept + klp



Tests of Between-Subjects Effects

Source Dependent Variable

Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Corrected Model BCl2 .589a 4 .147 40.880 .000

VEGF .197b 4 .049 4.638 .006

P53 .338c 4 .084 1.845 .152

Apoptosis .469d 4 .117 6.124 .001 Intercept BCl2 .261 1 .261 72.593 .000

VEGF 1.408 1 1.408 132.862 .000 P53 3.267 1 3.267 71.332 .000 Apoptosis 1.323 1 1.323 69.146 .000

klp BCl2 .589 4 .147 40.880 .000 VEGF .197 4 .049 4.638 .006 P53 .338 4 .085 1.845 .152 Apoptosis .469 4 .117 6.124 .001

Error BCl2 .090 25 .004 VEGF .265 25 .011 P53 1.145 25 .046 Apoptosis .478 25 .019

Total BCl2 .940 30 VEGF 1.870 30 P53 4.750 30 Apoptosis 2.270 30

Corrected Total BCl2 .679 29 VEGF .462 29 P53 1.483 29 Apoptosis .947 29

a. R Squared = ,867 (Adjusted R Squared = ,846) b. R Squared = ,426 (Adjusted R Squared = ,334) c. R Squared = ,228 (Adjusted R Squared = ,104) d. R Squared = ,495 (Adjusted R Squared = ,414) Estimated Marginal Means Kelompok

Estimates

Dependent Variable Kelompok


Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound

BCl2 Kontrol Negatif 1.978E-17 .024 -.050 .050

Kontrol Positif .367 .024 .316 .417

Benzopyrene + EA .083 .024 .033 .134

Benzopyrene + PGL .017 .024 -.034 .067

Benzopyrene + MD 1.361E-16 .024 -.050 .050 VEGF Kontrol Negatif .133 .042 .047 .220

Kontrol Positif .350 .042 .263 .437 Benzopyrene + EA .267 .042 .180 .353



Benzopyrene + PGL .183 .042 .097 .270 Benzopyrene + MD .150 .042 .063 .237

P53 Kontrol Negatif .450 .087 .270 .630 Kontrol Positif .133 .087 -.047 .313 Benzopyrene + EA .333 .087 .153 .513 Benzopyrene + PGL .350 .087 .170 .530 Benzopyrene + MD .383 .087 .203 .563

Apoptosis Kontrol Negatif .083 .056 -.033 .200 Kontrol Positif .050 .056 -.066 .166 Benzopyrene + EA .233 .056 .117 .350 Benzopyrene + PGL .367 .056 .250 .483 Benzopyrene + MD .317 .056 .200 .433

Pairwise Comparisons

Dependent Variable (I) Kelompok (J) Kelompok

a 95% Confidence Interval

for Differencea

Mean Difference (I-J)

Std. Error Sig.a

Lower Bound

Upper Bound

BCl2 Kontrol Negatif Kontrol Positif -.367* .035 .000 -.438 -.295

Benzopyrene + EA -.083* .035 .024 -.155 -.012

Benzopyrene + PGL -.017 .035 .635 -.088 .055

Benzopyrene + MD -1.163E-16 .035 1.000 -.071 .071

Kontrol Positif Kontrol Negatif .367* .035 .000 .295 .438

Benzopyrene + EA .283* .035 .000 .212 .355

Benzopyrene + PGL .350* .035 .000 .279 .421

Benzopyrene + MD .367* .035 .000 .295 .438

Benzopyrene + EA

Kontrol Negatif .083* .035 .024 .012 .155

Kontrol Positif -.283* .035 .000 -.355 -.212

Benzopyrene + PGL .067 .035 .066 -.005 .138

Benzopyrene + MD .083* .035 .024 .012 .155

Benzopyrene + PGL

Kontrol Negatif .017 .035 .635 -.055 .088

Kontrol Positif -.350* .035 .000 -.421 -.279

Benzopyrene + EA -.067 .035 .066 -.138 .005

Benzopyrene + MD .017 .035 .635 -.055 .088

Benzopyrene + MD

Kontrol Negatif 1.163E-16 .035 1.000 -.071 .071

Kontrol Positif -.367* .035 .000 -.438 -.295

Benzopyrene + EA -.083* .035 .024 -.155 -.012

Benzopyrene + PGL -.017 .035 .635 -.088 .055 VEGF Kontrol Negatif Kontrol Positif -.217* .059 .001 -.339 -.094

Benzopyrene + EA -.133* .059 .034 -.256 -.011 Benzopyrene + PGL -.050 .059 .408 -.172 .072 Benzopyrene + MD -.017 .059 .781 -.139 .106

Kontrol Positif Kontrol Negatif .217* .059 .001 .094 .339 Benzopyrene + EA .083 .059 .173 -.039 .206 Benzopyrene + PGL .167* .059 .010 .044 .289 Benzopyrene + MD .200* .059 .002 .078 .322

Benzopyrene + EA

Kontrol Negatif .133* .059 .034 .011 .256 Kontrol Positif -.083 .059 .173 -.206 .039



Benzopyrene + PGL .083 .059 .173 -.039 .206 Benzopyrene + MD .117 .059 .061 -.006 .239

Benzopyrene + PGL

Kontrol Negatif .050 .059 .408 -.072 .172 Kontrol Positif -.167* .059 .010 -.289 -.044 Benzopyrene + EA -.083 .059 .173 -.206 .039 Benzopyrene + MD .033 .059 .580 -.089 .156

Benzopyrene + MD

Kontrol Negatif .017 .059 .781 -.106 .139 Kontrol Positif -.200* .059 .002 -.322 -.078 Benzopyrene + EA -.117 .059 .061 -.239 .006 Benzopyrene + PGL -.033 .059 .580 -.156 .089

P53 Kontrol Negatif Kontrol Positif .317* .124 .017 .062 .571 Benzopyrene + EA .117 .124 .354 -.138 .371 Benzopyrene + PGL .100 .124 .426 -.154 .354 Benzopyrene + MD .067 .124 .594 -.188 .321

Kontrol Positif Kontrol Negatif -.317* .124 .017 -.571 -.062 Benzopyrene + EA -.200 .124 .118 -.454 .054 Benzopyrene + PGL -.217 .124 .092 -.471 .038 Benzopyrene + MD -.250 .124 .054 -.504 .004

Benzopyrene + EA

Kontrol Negatif -.117 .124 .354 -.371 .138 Kontrol Positif .200 .124 .118 -.054 .454 Benzopyrene + PGL -.017 .124 .894 -.271 .238 Benzopyrene + MD -.050 .124 .689 -.304 .204

Benzopyrene + PGL

Kontrol Negatif -.100 .124 .426 -.354 .154 Kontrol Positif .217 .124 .092 -.038 .471 Benzopyrene + EA .017 .124 .894 -.238 .271 Benzopyrene + MD -.033 .124 .790 -.288 .221

Benzopyrene + MD

Kontrol Negatif -.067 .124 .594 -.321 .188 Kontrol Positif .250 .124 .054 -.004 .504 Benzopyrene + EA .050 .124 .689 -.204 .304 Benzopyrene + PGL .033 .124 .790 -.221 .288

Apoptosis Kontrol Negatif Kontrol Positif .033 .080 .680 -.131 .198 Benzopyrene + EA -.150 .080 .072 -.314 .014 Benzopyrene + PGL -.283* .080 .002 -.448 -.119 Benzopyrene + MD -.233* .080 .007 -.398 -.069

Kontrol Positif Kontrol Negatif -.033 .080 .680 -.198 .131 Benzopyrene + EA -.183* .080 .030 -.348 -.019 Benzopyrene + PGL -.317* .080 .001 -.481 -.152 Benzopyrene + MD -.267* .080 .003 -.431 -.102

Benzopyrene + EA

Kontrol Negatif .150 .080 .072 -.014 .314 Kontrol Positif .183* .080 .030 .019 .348 Benzopyrene + PGL -.133 .080 .107 -.298 .031 Benzopyrene + MD -.083 .080 .307 -.248 .081

Benzopyrene + PGL

Kontrol Negatif .283* .080 .002 .119 .448 Kontrol Positif .317* .080 .001 .152 .481 Benzopyrene + EA .133 .080 .107 -.031 .298 Benzopyrene + MD .050 .080 .537 -.114 .214

Benzopyrene + MD

Kontrol Negatif .233* .080 .007 .069 .398 Kontrol Positif .267* .080 .003 .102 .431



Benzopyrene + EA .083 .080 .307 -.081 .248 Benzopyrene + PGL -.050 .080 .537 -.214 .114

Based on estimated marginal means *. The mean difference is significant at the ,05 level. a. Adjustment for multiple comparisons: Least Significant Difference (equivalent to no adjustments).

Multivariate Tests

Value F Hypothesis df Error df Sig.

Pillai's trace 1.446 3.539 16.000 100.000 .000 Wilks' lambda .050 7.030 16.000 67.849 .000 Hotelling's trace 9.530 12.210 16.000 82.000 .000 Roy's largest root 8.512 53.201a 4.000 25.000 .000 Each F tests the multivariate effect of Kelompok. These tests are based on the linearly independent pairwise comparisons among the estimated marginal means. a. The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level.

Univariate Tests

Dependent Variable Sum of Squares df Mean Square F Sig.

BCl2 Contrast .589 4 .147 40.880 .000

Error .090 25 .004 VEGF Contrast .197 4 .049 4.638 .006

Error .265 25 .011 P53 Contrast .338 4 .085 1.845 .152

Error 1.145 25 .046 Apoptosis Contrast .469 4 .117 6.124 .001

Error .478 25 .019 The F tests the effect of Kelompok. This test is based on the linearly independent pairwise comparisons among the estimated marginal means. Post Hoc Tests Kelompok

Multiple Comparisons LSD

Dependent Variable (I) Kelompok (J) Kelompok


Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound

BCl2 Kontrol Negatif Kontrol Positif -.3667* .03464 .000 -.4380 -.2953

Benzopyrene + EA -.0833* .03464 .024 -.1547 -.0120

Benzopyrene + PGL -.0167 .03464 .635 -.0880 .0547

Benzopyrene + MD .0000 .03464 1.000 -.0713 .0713

Kontrol Positif Kontrol Negatif .3667* .03464 .000 .2953 .4380

Benzopyrene + EA .2833* .03464 .000 .2120 .3547

Benzopyrene + PGL .3500* .03464 .000 .2787 .4213

Benzopyrene + MD .3667* .03464 .000 .2953 .4380

Benzopyrene + EA

Kontrol Negatif .0833* .03464 .024 .0120 .1547

Kontrol Positif -.2833* .03464 .000 -.3547 -.2120

Benzopyrene + PGL .0667 .03464 .066 -.0047 .1380

Benzopyrene + MD .0833* .03464 .024 .0120 .1547

Benzopyrene + Kontrol Negatif .0167 .03464 .635 -.0547 .0880



PGL Kontrol Positif -.3500* .03464 .000 -.4213 -.2787

Benzopyrene + EA -.0667 .03464 .066 -.1380 .0047

Benzopyrene + MD .0167 .03464 .635 -.0547 .0880

Benzopyrene + MD

Kontrol Negatif .0000 .03464 1.000 -.0713 .0713

Kontrol Positif -.3667* .03464 .000 -.4380 -.2953

Benzopyrene + EA -.0833* .03464 .024 -.1547 -.0120

Benzopyrene + PGL -.0167 .03464 .635 -.0880 .0547 VEGF Kontrol Negatif Kontrol Positif -.2167* .05944 .001 -.3391 -.0942

Benzopyrene + EA -.1333* .05944 .034 -.2558 -.0109 Benzopyrene + PGL -.0500 .05944 .408 -.1724 .0724 Benzopyrene + MD -.0167 .05944 .781 -.1391 .1058

Kontrol Positif Kontrol Negatif .2167* .05944 .001 .0942 .3391 Benzopyrene + EA .0833 .05944 .173 -.0391 .2058 Benzopyrene + PGL .1667* .05944 .010 .0442 .2891 Benzopyrene + MD .2000* .05944 .002 .0776 .3224

Benzopyrene + EA

Kontrol Negatif .1333* .05944 .034 .0109 .2558 Kontrol Positif -.0833 .05944 .173 -.2058 .0391 Benzopyrene + PGL .0833 .05944 .173 -.0391 .2058 Benzopyrene + MD .1167 .05944 .061 -.0058 .2391

Benzopyrene + PGL

Kontrol Negatif .0500 .05944 .408 -.0724 .1724 Kontrol Positif -.1667* .05944 .010 -.2891 -.0442 Benzopyrene + EA -.0833 .05944 .173 -.2058 .0391 Benzopyrene + MD .0333 .05944 .580 -.0891 .1558

Benzopyrene + MD

Kontrol Negatif .0167 .05944 .781 -.1058 .1391 Kontrol Positif -.2000* .05944 .002 -.3224 -.0776 Benzopyrene + EA -.1167 .05944 .061 -.2391 .0058 Benzopyrene + PGL -.0333 .05944 .580 -.1558 .0891

P53 Kontrol Negatif Kontrol Positif .3167* .12356 .017 .0622 .5711 Benzopyrene + EA .1167 .12356 .354 -.1378 .3711 Benzopyrene + PGL .1000 .12356 .426 -.1545 .3545 Benzopyrene + MD .0667 .12356 .594 -.1878 .3211

Kontrol Positif Kontrol Negatif -.3167* .12356 .017 -.5711 -.0622 Benzopyrene + EA -.2000 .12356 .118 -.4545 .0545 Benzopyrene + PGL -.2167 .12356 .092 -.4711 .0378 Benzopyrene + MD -.2500 .12356 .054 -.5045 .0045

Benzopyrene + EA

Kontrol Negatif -.1167 .12356 .354 -.3711 .1378 Kontrol Positif .2000 .12356 .118 -.0545 .4545 Benzopyrene + PGL -.0167 .12356 .894 -.2711 .2378 Benzopyrene + MD -.0500 .12356 .689 -.3045 .2045

Benzopyrene + PGL

Kontrol Negatif -.1000 .12356 .426 -.3545 .1545 Kontrol Positif .2167 .12356 .092 -.0378 .4711 Benzopyrene + EA .0167 .12356 .894 -.2378 .2711 Benzopyrene + MD -.0333 .12356 .790 -.2878 .2211

Benzopyrene + MD

Kontrol Negatif -.0667 .12356 .594 -.3211 .1878 Kontrol Positif .2500 .12356 .054 -.0045 .5045 Benzopyrene + EA .0500 .12356 .689 -.2045 .3045 Benzopyrene + PGL .0333 .12356 .790 -.2211 .2878

Apoptosis Kontrol Negatif Kontrol Positif .0333 .07986 .680 -.1311 .1978 Benzopyrene + EA -.1500 .07986 .072 -.3145 .0145 Benzopyrene + PGL -.2833* .07986 .002 -.4478 -.1189 Benzopyrene + MD -.2333* .07986 .007 -.3978 -.0689

Kontrol Positif Kontrol Negatif -.0333 .07986 .680 -.1978 .1311



Benzopyrene + EA -.1833* .07986 .030 -.3478 -.0189 Benzopyrene + PGL -.3167* .07986 .001 -.4811 -.1522 Benzopyrene + MD -.2667* .07986 .003 -.4311 -.1022

Benzopyrene + EA

Kontrol Negatif .1500 .07986 .072 -.0145 .3145 Kontrol Positif .1833* .07986 .030 .0189 .3478 Benzopyrene + PGL -.1333 .07986 .107 -.2978 .0311 Benzopyrene + MD -.0833 .07986 .307 -.2478 .0811

Benzopyrene + PGL

Kontrol Negatif .2833* .07986 .002 .1189 .4478 Kontrol Positif .3167* .07986 .001 .1522 .4811 Benzopyrene + EA .1333 .07986 .107 -.0311 .2978 Benzopyrene + MD .0500 .07986 .537 -.1145 .2145

Benzopyrene + MD

Kontrol Negatif .2333* .07986 .007 .0689 .3978 Kontrol Positif .2667* .07986 .003 .1022 .4311 Benzopyrene + EA .0833 .07986 .307 -.0811 .2478 Benzopyrene + PGL -.0500 .07986 .537 -.2145 .1145

Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = ,019. *. The mean difference is significant at the ,05 level.

T-Test

Group Statistics

Kelompok N Mean Std. Deviation Std. Error Mean

BCl2 Kontrol Negatif 6 .0000 .00000 .00000

Kontrol Positif 6 .3667 .10328 .04216

Independent Samples Test

Levene's Test for Equality of Variances t-test for Equality of Means

95% Confidence Interval of the

Difference

F Sig. t df Sig. (2-tailed)

Mean Difference

Std. Error Difference Lower Upper

BCl2 Equal variances assumed

10.652 .009 -8.696 10 .000 -.36667 .04216 -.46061 -.27272

Equal variances not assumed -8.696 5.000 .000 -.36667 .04216 -.47505 -.25828

T-Test

Group Statistics



Benzopyrene + EA 6 .0833 .07528 .03073




Difference


Mean Difference





9.434 .012 -2.712 10 .022 -.08333 .03073 -.15181 -.01486


T-Test

Group Statistics



Benzopyrene + PGL 6 .0167 .04082 .01667




Difference


Mean Difference



6.250 .031 -1.000 10 .341 -.01667 .01667 -.05380 .02047

Equal variances not assumed -1.000 5.000 .363 -.01667 .01667 -.05951 .02618

T-Test

Warnings

The Independent Samples table is not produced.

Group Statistics


BCl2 Kontrol Negatif 6 .0000 .00000a .00000

Benzopyrene + MD 6 .0000 .00000a .00000 a. t cannot be computed because the standard deviations of both groups are 0. T-Test

Group Statistics


BCl2 Kontrol Positif 6 .3667 .10328 .04216

Benzopyrene + EA 6 .0833 .07528 .03073




Difference


Mean Difference



.552 .475 5.430 10 .000 .28333 .05217 .16708 .39959

Equal variances not assumed 5.430 9.143 .000 .28333 .05217 .16559 .40108



T-Test Group Statistics



Benzopyrene + PGL 6 .0167 .04082 .01667




Difference


Mean Difference



3.616 .086 7.720 10 .000 .35000 .04534 .24898 .45102


T-Test

Group Statistics



Benzopyrene + MD 6 .0000 .00000 .00000




Difference


Mean Difference



10.652 .009 8.696 10 .000 .36667 .04216 .27272 .46061


T-Test

Group Statistics


BCl2 Benzopyrene + EA 6 .0833 .07528 .03073

Benzopyrene + PGL 6 .0167 .04082 .01667




Difference


Mean Difference





1.712 .220 1.907 10 .086 .06667 .03496 -.01123 .14456

Equal variances not assumed 1.907 7.707 .094 .06667 .03496 -.01449 .14782

T-Test

Group Statistics


BCl2 Benzopyrene + EA 6 .0833 .07528 .03073

Benzopyrene + MD 6 .0000 .00000 .00000




Difference


Mean Difference



9.434 .012 2.712 10 .022 .08333 .03073 .01486 .15181


T-Test

Group Statistics


BCl2 Benzopyrene + PGL 6 .0167 .04082 .01667

Benzopyrene + MD 6 .0000 .00000 .00000




Difference


Mean Difference



6.250 .031 1.000 10 .341 .01667 .01667 -.02047 .05380

Equal variances not assumed 1.000 5.000 .363 .01667 .01667 -.02618 .05951

T-Test

Group Statistics


Apoptosis Kontrol Negatif 6 .0833 .13292 .05426

Kontrol Positif 6 .0500 .05477 .02236






Difference


Mean Difference


Apoptosis Equal variances assumed

7.857 .019 .568 10 .583 .03333 .05869 -.09743 .16410

Equal variances not assumed .568 6.651 .589 .03333 .05869 -.10694 .17360

T-Test

Group Statistics



Benzopyrene + EA 6 .2333 .08165 .03333




Difference


Mean Difference



2.832 .123 -2.355 10 .040 -.15000 .06368 -.29190 -.00810


T-Test

Group Statistics



Benzopyrene + PGL 6 .3667 .19664 .08028




Difference


Mean Difference



.950 .353 -2.924 10 .015 -.28333 .09690 -.49923 -.06743




T-Test Group Statistics



Benzopyrene + MD 6 .3167 .17224 .07032




Difference


Mean Difference



1.644 .229 -2.627 10 .025 -.23333 .08882 -.43124 -.03543


T-Test

Group Statistics


Apoptosis Kontrol Positif 6 .0500 .05477 .02236

Benzopyrene + EA 6 .2333 .08165 .03333




Difference


Mean Difference



1.250 .290 -4.568 10 .001 -.18333 .04014 -.27277 -.09390


T-Test

Group Statistics



Benzopyrene + PGL 6 .3667 .19664 .08028




Difference


Mean Difference





6.942 .025 -3.800 10 .003 -.31667 .08333 -.50234 -.13099


T-Test

Group Statistics



Benzopyrene + MD 6 .3167 .17224 .07032




Difference


Mean Difference



22.500 .001 -3.614 10 .005 -.26667 .07379 -.43107 -.10226


T-Test

Group Statistics


Apoptosis Benzopyrene + EA 6 .2333 .08165 .03333

Benzopyrene + PGL 6 .3667 .19664 .08028




Difference


Mean Difference



4.324 .064 -1.534 10 .156 -.13333 .08692 -.32701 .06034


T-Test

Group Statistics


Apoptosis Benzopyrene + EA 6 .2333 .08165 .03333

Benzopyrene + MD 6 .3167 .17224 .07032






Difference


Mean Difference



10.417 .009 -1.071 10 .309 -.08333 .07782 -.25672 .09005


T-Test

Group Statistics


Apoptosis Benzopyrene + PGL 6 .3667 .19664 .08028

Benzopyrene + MD 6 .3167 .17224 .07032




Difference


Mean Difference



.015 .905 .469 10 .649 .05000 .10672 -.18778 .28778

Equal variances not assumed .469 9.829 .650 .05000 .10672 -.18834 .28834

Correlations

Correlations

BCl2 VEGF P53 Apoptosis

BCl2 Pearson Correlation 1 .560** -.383* -.359

Sig. (2-tailed) .001 .037 .051

N 30 30 30 30 VEGF Pearson Correlation .560** 1 -.284 -.280

Sig. (2-tailed) .001 .128 .134

N 30 30 30 30 P53 Pearson Correlation -.383* -.284 1 .372*

Sig. (2-tailed) .037 .128 .043

N 30 30 30 30 Apoptosis Pearson Correlation -.359 -.280 .372* 1

Sig. (2-tailed) .051 .134 .043 N 30 30 30 30

**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). *. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed).



Curve Fit Model Description

Model Name MOD_2

Dependent Variable 1 Apoptosis Equation 1 Linear

Independent Variable BCl2 Constant Included Variable Whose Values Label Observations in Plots

Unspecified

Case Processing Summary

N

Total Cases 30 Excluded Casesa 0 Forecasted Cases 0 Newly Created Cases 0 a. Cases with a missing value in any variable are excluded from the analysis.

Variable Processing Summary

Variables

Dependent Independent

Apoptosis BCl2

Number of Positive Values 23 11

Number of Zeros 7 19

Number of Negative Values 0 0 Number of Missing Values User-Missing 0 0

System-Missing 0 0

Model Summary and Parameter Estimates

Dependent Variable:Apoptosis

Equation

Model Summary Parameter Estimates

R Square F df1 df2 Sig. Constant b1

Linear .129 4.149 1 28 .051 .250 -.424 The independent variable is BCl2. Regression

Variables Entered/Removedb

Model Variables Entered

Variables Removed Method

1 P53a . Enter a. All requested variables entered. b. Dependent Variable: Apoptosis



Model Summary

Model R R Square Adjusted R

Square Std. Error of the

Estimate

1 .372a .138 .108 .17070 a. Predictors: (Constant), P53

ANOVAb

Model Sum of Squares df Mean Square F Sig.

1 Regression .131 1 .131 4.501 .043a

Residual .816 28 .029 Total .947 29

a. Predictors: (Constant), P53 b. Dependent Variable: Apoptosis

Coefficientsa

Model

Unstandardized Coefficients Standardized Coefficients

B Std. Error Beta t Sig.

1 (Constant) .112 .056 2.006 .055

P53 .297 .140 .372 2.121 .043 a. Dependent Variable: Apoptosis Regression




1 P53, Apoptosisa . Enter 2 . Apoptosis Backward (criterion:

Probability of F-to-remove >= ,100).

a. All requested variables entered. b. Dependent Variable: BCl2

Model Summary



Estimate

1 .448a .201 .142 .14171 2 .383b .147 .116 .14383 a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis b. Predictors: (Constant), P53

ANOVAc


1 Regression .136 2 .068 3.398 .048a

Residual .542 27 .020 Total .679 29

2 Regression .099 1 .099 4.806 .037b Residual .579 28 .021



Total .679 29 a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis b. Predictors: (Constant), P53 c. Dependent Variable: BCl2

Coefficientsa

Model



1 (Constant) .203 .050 4.092 .000

Apoptosis -.213 .157 -.252 -1.358 .186

P53 -.196 .125 -.289 -1.560 .130 2 (Constant) .179 .047 3.804 .001

P53 -.259 .118 -.383 -2.192 .037 a. Dependent Variable: BCl2

Excluded Variablesb

Model

Collinearity Statistics

Beta In t Sig. Partial

Correlation Tolerance

2 Apoptosis -.252a -1.358 .186 -.253 .862 a. Predictors in the Model: (Constant), P53 b. Dependent Variable: BCl2 Regression




1 P53, Apoptosis, BCl2a

. Enter

2 . P53 Backward (criterion: Probability of F-to-remove >= ,100).

3 . Apoptosis Backward (criterion: Probability of F-to-remove >= ,100).

a. All requested variables entered. b. Dependent Variable: VEGF

Model Summary



Estimate

1 .569a .323 .245 .10960 2 .566b .320 .270 .10779 3 .560c .313 .289 .10640 a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis, BCl2 b. Predictors: (Constant), Apoptosis, BCl2 c. Predictors: (Constant), BCl2



ANOVAd


1 Regression .149 3 .050 4.143 .016a

Residual .312 26 .012 Total .462 29

2 Regression .148 2 .074 6.366 .005b Residual .314 27 .012 Total .462 29

3 Regression .145 1 .145 12.778 .001c Residual .317 28 .011 Total .462 29

a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis, BCl2 b. Predictors: (Constant), Apoptosis, BCl2 c. Predictors: (Constant), BCl2 d. Dependent Variable: VEGF

Coefficientsa

Model



1 (Constant) .200 .049 4.094 .000

BCl2 .420 .149 .510 2.825 .009

Apoptosis -.052 .125 -.074 -.411 .685

P53 -.034 .101 -.061 -.339 .738 2 (Constant) .189 .038 5.034 .000

BCl2 .435 .140 .527 3.102 .004 Apoptosis -.063 .119 -.090 -.532 .599

3 (Constant) .174 .023 7.592 .000

BCl2 .462 .129 .560 3.575 .001 a. Dependent Variable: VEGF

Excluded Variablesc

Model

Collinearity Statistics

Beta In t Sig. Partial

Correlation Tolerance

2 P53 -.061a -.339 .738 -.066 .790 3 P53 -.082b -.475 .638 -.091 .853

Apoptosis -.090b -.532 .599 -.102 .871 a. Predictors in the Model: (Constant), Apoptosis, BCl2 b. Predictors in the Model: (Constant), BCl2 c. Dependent Variable: VEGF



Lampiran 4 Prosedur Pemeriksaan Imunohistokimia Pada akhir minggu ke 9 mencit dikorbankan dengan cara dislocasio cervikal, kemudian dikubur. Spesimen dari biopsi difiksasi dengan baik menggunakan buffer formalin selanjutnya dilakukan dehidrasi dan blok parafin menggunakan metoda baku. Selanjutnya disiapkan kaca obyek yang telah dilapisi poli L-lisin, pemotongaman blok paraffin menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5μ, potongan jaringan ditebarkan/diapungkan pada permukaan bak pemanas berisi air hangat, selanjutnya jaringan yang telah menempel pada slide dilakukan deparafinisasi dan sedian siap untuk dilakukan pewarnaan imunohistokimia. Prosesing jaringan melalui beberapa tahap yaitu; dehydrasi, clearing, impregnasi, embedding. Teknik pewarnaan imunohistokimia yang digunakan adalah teknik biotin streptavidin dengan langkah-langkah sebagai berikut : Prosedur pemeriksaan Bcl-2, VEGF, p53 dengan imunohistokimia Persiapan reagen : Tahap fiksasi H2O2 : 3% Trypsin 0, 025% dalam PBS Larutan kerja DAB : R/.Aquadestilata : 1ml Tetes buffer subsrat : 1 tetes Cara pewarnaan : Deparaffinisasi, caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan berturut- turut ke dalam : 1. Xylol, selama 2 menit, sebanyak 2 kali 2. Kemudian dimasukkan kedalam etanol absolut : 1 menit, sebanyak 2 kali 3. Selanjutnya dimasukkan ke dalam etanol 95 % 1 menit ,sebanyak 2 kali 4. Setelah dimasukkan ke dalametanol 95% , kemudian dimasukkan ke dalam etanol 80 %

selama 1 menit. 5. Dimasukkan lagi ke dalam etanol 70 % selama 1 menit Tahap pencucian 1. Dicuci pada air mengalir selama 10 -15 menit 2. Setelah itu dimasukkan ke dalam larutan H202 3 % : selama 30 menit 3. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit ) 4. Setelah itu dimasukkan ke dalam etanol 70% selama 1 menit. 5. Dicuci pada air mengalir , selama 10-15 menit 6. Dimasukkan ke dalm larutan H2O2 3% : 30 menit 7. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit) 8. Dimasukkan ke dalam larutan Tripsin 0, 025% selama 6 menit pada 37o

9. Dicuci dengan PBS sebanyak3 kali (a : 2 menit) C

10. Dimasukkan ke dalam anti p53, Bcl-2, VEGF (mouse anti rat 1: 50) : 30 menit 11. Dicuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)



Tahap pelebelan 1. Dimasukkan kedalam sekunder antibody (rabbit anti mouse biotinilated antibody Label)

: 30 menit 2. Dicuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit) 3. Dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label :selama30 menit 4. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit) 5. Dimasukkan ke dalam substrat kromogen :selama5 menit 6. Dicuci dengan PBS 3 kali (a :2 menit), kemudian dibilas dengan aquadestilata 7. Dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin : 6 menit 8. Dicuci dengan air mengalir 9. Proses mounting



Lampiran 5

TEHNIK PEMERIKSAAN TUNNEL ASSAY

Prosedure pemeriksaan sel apoptosis dengan apoptag (Tunnel Assay). Persiapan reagen : H2O2 : 3% Proteinase K 60 ug /ml Larutan kerja DAB : R/Aquadestilata : 1 ml Tetes buffer substrat : 1 tetes Cara pewarnaan : Deparaffinisasi, caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan berturut-turut : 1. Sayatan dimasukkan ke dalam xylol selama 2 menit, sebanyak 2 kali 2. Kemudian dimasukkan kedalam etanol absolut sebanyak 1 menit, selama 2 kali. 3. Dimasukkan ke dalam etanol selama 95% selama 1 menit, sebanyak 2 kali 4. Setelah itu dimasukkan kedalam etanol 80% selama 1 menit 5. Dimasukkan lagi ke dalam etanol 70% selama 1 menit 6. Dicuci pada air mengalir selama 10-15 menit 7. Dibilas dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit) 8. Dimasukkan ke dalam proteinase K selama 15 menit 9. Dicuci dengan d H2O 2 sebanyak kali (2 menit) 10. Dimasukkan ke dalam 3% H2O2 selama 15menit 11. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit) 12. Dimasukkan ke dalam equilibrium buffer : 10 menit pada suhu kamar 13. Dimasukkan pada working strength TDT enzyme yang dilengkapi digoxygenin 37°C : 1

jam 14. Dimasukkan pada stop buffer selama15 menit 15. Dicuci dengan PBS sebanyak3 kali (a: 2 menit) 16. Dimasukkan pada anti digoxigenin peroxidase conjugate : 30 menit 17. Dicuci dengan PBS sebanyak3 kali (a : 2 menit) 18. Dimasukkan pada peroxidase substrat selama :10 menit 19. Dicuci dengan d H220. Dimasukkan pada Mayer Haematoxylin selama : 6 menit

O sebanyak 3 kali (a : 1 menit)

24. Dicuci dengan d H225. Proses mounting

O



disertasi - repository.unair.ac.idrepository.unair.ac.id/32149/2/full text.pdf · (studi...

Documents