BAB I

BAB I

PENDAHULUAN

Virologi adalah suatu ilmu yang khusus mempelajari tentang segala sesuatu mengenai virus dan utamanya untuk mengetahui penyakit-penyakit yang ditimbulkannya. Untuk dapat mempertanggung jawabkan hasil-hasil pemeriksaan di dalam pengolahan, pengawetan, pengemasan dan pengiriman bahan/sampel pemeriksaan harus dilakukan dengan sebaik-baiknya. Cara-cara pemeriksaan virus yang lazim/biasa dilakukan di laboratorium antara lain meliputi:1. Pemeriksaan mikroskopis

2. Pemeriksaan dengan melakukan isolasi dan identifikasi

3. Pemeriksaan secara serologis

A. Alat-alat yang diperlukan untuk laboratorium Virologi:

1. Centrifuge biasa, centrifuge suhu dingin dan centrifuge kecepatan tinggi2. Tabung serologi, rak tabung serologi

3. Plastic plate

4. Lemari es biasa, deep freezer suhu -20oC dan -70 oC

5. Penangas air 37 oC dan 56 oC - 65 oC

6. Lemari pengeram 35 oC dan 37 oC

7. Timbangan

8. Lampu sorot telur

9. Bor telur

10. Mikroskop biasa, mikroskop phase kontras dan mikroskop fluorescent

11. Spuit

12. Sterilisator kering dan basah

B. Sterilisasi alat

Cara sterilisasi yang dilakukan tergantung pada macam-macam dan sifat bahan yang disterilkan (ketahanan terhadap panas, bentuk bahan yang disterilkan: padat, cair, dan gas). Sterilisasi yang lazim dilakukan di laboratorium, antara lain:1. Sterilisasi dengan udara panas (kering)

2. Sterilisasi dengan uap air panas

3. Sterilisasi dengan uap air panas jenuh

C. Bahan pemeriksaan untuk mendiagnosa penyakit virus

Bahan pemeriksaan yang diterima di laboratorium terutama untuk isolasi virus adalah air cucian tenggorok, air ludah, faeces, nanah, keropeng, serum dan otak. Bahan-bahan pemeriksaan ini harus diolah dahulu sesuai dengan jenis bahan pemeriksaan sebelum disuntikkan pada hewan percobaan, telur berembrio atau ditanam pada biakan jaringan.

D. Pengambilan bahan pemeriksaan

Pengambilan bahan pemeriksaan sebaiknya diambil pada waktu 1-3 hari dari penyakitnya.

E. Pengiriman bahan pemeriksaan

Semua bahan pemeriksaan harus diterima dalam botol atau tabung yang steril. Pada umumnya bahan pemeriksaan harus dikirim cepat dan dalam keadaan yang dingin sedangkan bahan pemeriksaan yang berasal dari penderita cacar baik macula, keropeng ataupun faeces tidak perlu dingin. Darah untuk pemeriksaan serologi tidak boleh dikirim dalam keadaan beku dan sebaiknya tiba di laboratorium dalam waktu 24 jam setelah pengambilan bahan atau serumnya dipisahkan terlebih dahulu dan dibubuhi larutan merthiolate 1/2500 sebanyak 1 tetes pada 1 mL serum.

Pengiriman bahan pemeriksaan biasanya harus disertai keterangan klinis yaitu dari permulaan sakit, penyakit yang diduga, gejala-gejala penyakit, nama penderita, tempat tinggal dan tanggal pengambilan bahan.BAB II

CARA-CARA PEMERIKSAAN VIRUS

A. Pemeriksaan Mikroskopis

Preparat untuk diagnosa virus ini harus baik dan dibuat tipis dan untuk fiksasi dalam pembuatan coupes umumnya digunakan larutan Zenker, yang kemudian diwarnai yang sesuai dengan jenis pewarnaan untuk setiap preparat.

1. Pewarnaan Giemsa

a. Alat-alat

: Gelas sediaan

Pipet Pasteur

Ose

b. Bahan

: Asam asetat glasial 7,5% dalam formalin 40%

Larutan Giemsa (8 tetes Giemsa stock, 5 mL aquadest)

c. Cara kerja

: Buat preparat hapus tipis dan keringkan

Tetesi denga asam asetat glasial 7,5%

Cuci dengan air

Tetesi dengan larutan Giemsa

Panaskan hingga keluar uap biarkan 10 menit

Panaskan lagi dan biarkan selama 10 menit

Cuci dengan air dan keringkan di udara

Periksa di bawah mikroskop dengan memakai objektif 100 kali

d. Hasil

:Untuk virus Rikettsia berwarna ungu dengan warna dasar ungu muda.

2. Pewarnaan Seller

a. Alat-alat

: Gelas sediaan

Pinset

Ose

b. Bahan

: Larutan A: Basic fuchsin 1% dalam alkohol

Larutan B: Methylen Blue 1% dalam alkohol

Campuran larutan A dan larutan B (1 bagian larutan A dan 2 bagian larutan B lalu disaring)

Atau campuran lain:

Larutan A: Methylen blue 2% dalam alkohol

Larutan B: Basic fuchsin 2% dalam alkohol

Campuran larutan A dan larutan B (3 bagian larutan A dan 1 bagian larutan B lalu disaring)

c. Cara kerja

: Buat preparat sentuh atau preparat hapus

Fiksasi dengan Methanol selama 5 menit

Cuci dengan air

Celupkan dalam zat warna Seller 3-7 detik

Cuci dengan air dan keringkan di udara

Periksa di bawah mikroskop

d. Hasil

:Negri bodies berwarna merah di dalam sitoplasma sel syaraf dengan warna dasar biru muda dan inti sel berwarna biru tua.

B. Isolasi

Isolasi dapat dilakukan dengan cara:1. Menggunakan hewan percobaan (tikus, marmut, kelinci, kera)

2. Penanaman pada telur berembrio umur 5-7 hari, 11-13 hari dan 13-14 hari

3. Menggunakn biakan jaringan ginjal kera, ginjal kelinci dan amnion manusia dari pelbagai cell lines

Bahan-bahan pemeriksaan yang biasa diterima dalam laboratorium untuk isolasi adalah:

a. Air cucian tenggorok dan air ludah

b. Faeces

c. Keropeng

d. Nanah atau air kelembung

e. Otak/jaringan lain

f. Rektum dan hapus tenggorokan

g. Nyamuk

C. Pemeriksaan Serologi

Tes-tes serologik untuk penyakit virus dapat dipakai untuk:1. Melihat terbentuk/tidaknya atau ada/tidaknya kenaikan titer zat anti selama sakit

2. Mencari virus/antigen di dalam bahan pemeriksaan seorang penderita

3. Melakukan identifikasi/menentukan tipe virus yagn berhasil diisolasi

Jenis-jenis tes serologik virus adalah sebagai berikut:1. Tes Aglutinasi

Untuk melihat kenaikan titer zat anti aglutinin. Yang umum dipakai ada 2 yaitu:

a. Tes Paul Bunnel

Tes aglutinasi untuk mendiagnosa penyakit mononukleosis infeksiosa dengan mencari kenaikan titer aglutinin heterofil.

b. Tes Weill Felix

Dipakai untuk mendiagnosa penyakit Rickettsiosis yaitu dengan mereaksikan serum penderita tersangka Rickettsiosis dengan suspensi bakteri Proteus vulgaris atau Proteus mirabilis yang diisolasi dari urine penderita atau dari laboratorium.2. Tes Presipitasi

Pada tes ini antigen/antibodi didifusikan di dalam gel agar (dengan konsentrasi 1-2%), oleh karena itu tes ini disebut juga Immuno Gel Diffusion Method. Bila antigen dan antibodi sesuai maka pada perembesan antara kedua komponen tersebut akan membentuk suatu garis presipitasi putih yang dapat dilihat dengan mata biasa.

Tes ini dipakai untuk:

a. mencari antigen/virus dalam bahan pemeriksaan

b. mencari kenaikan titer zat anti presipitasi dalam serum penderita

Tes ini biasa dilakukan pada penyakit-penyakit seperti Influenza, Polio, Variola dan Hepatitis.

3. Tes Ikatan Komplemen (CFT)

CFT dalam virologi berguna untuk:a. mencari virus/antigen dalam bahan pemeriksaan

b. melihat kenaikan titer zat anti ikatan komplemen

c. menentukan tipe virus yang sudah berhasil diisolasi

Zat anti ikatan komplemen pada penyakit virus biasanya dibentuk sangat lambat, pada minggu ke-2 sesudah gejala pertama penyakit timbul. Jadi pada survey serologik, hasil CFT yang positif berarti orang-orang ini baru mendapat infeksi walaupun tidak menunjukkan gejala-gejala (suatu secent infection). Sedangkan zat anti netralisasi dan zat anti hemaglutinasi biasanaya dibentuk segera sesudah terjadi infeksi.

Prinsip CFT: Apabila antigen direaksikan dengan antibodi yang sesuai maka dengan penambahan komplemen terbentuk suatu kompleks antigen antibodi komplemen (ag-ab-komplemen).

4. Tes Netralisasi

Berbeda dengan tes serologik yang lain, tes netralisasi harus dilakukan dengan cara in vivo yaitu bisa dalam telur berembrio, biakan jaringan atau hewan percobaan.

Guna tes netralisasi:

a. melihat kenaikan titer zat anti netralisasi

b. menentukan tipe virus yang berhasil diisolasi

5. Tes Penghambatan Hemaglutinasi (HI)

Berdasarkan daya hemaglutinasi, maka virus dapat dibagi menjadi 3 golongan:

1. Golongan Orthomyxovirus

Diikat oleh eritrosit karena memiliki antigen hemaglutinin di dalam envelopnya, dan hemaglutinin ini merupakan bagian integral dari virusnya. Artinya hemaglutinin itu menduduki seluruh envelop sehingga bila diputar hemaglutinin/envelop bisa dipisahkan dengan mudah dari virusnya. Golongan ini sesudah mengadakan hemaglutinasi, maka secara spontan (tanpa diolah) mengadakan elusi (disosiasi, virus dilepaskan dari eritrosit), akibatnya: virus yang dilepaskan ini bila ditambah suspensi eritrosit baru masih bisa mengadakan hemaglutinasi lagi

tapi eritrosit yang melepaskan virusnya kalau ditambah dengan virus baru (meskipun homolog), tidak bisa mengadakan hemaglutinasi. Ini disebabkan karena reseptor eritrosit yang semula (mukhopolisakarida) sudah dirusak oleh enzim meuramidase yang ada dalam envelop virusnya.

2. Golongan Poxvirus

Mengadakan hemaglutinasi dengan eritrosit hewan tertentu pada konsentrasi tertentu, disebabkan:

hemaglutinin yang ternyata jumlahnya sangant kecil karena ukuran virus kecil dan terdiri dari kompleks fosfolipida protein, sulit dilepaskan dari virusnya, walaupun diputar berkali-kai

kalau mau mengadakan elusi, harus dipanaskan pada 370C dulu, tidak bisa spontan seperti pada golongan 13. Golongan Arbovirus

Hemaglutininnya identik dengan virusnya sendiri, jadi tak mungkin dipisahkan, sehingga sekali terjadi hemaglutinasi keadaan ini menetap (irreversible). Jenis eritrosit yang dipakai berbeda-beda, juga konsentrasinya tergantung jenis virusnya.6. Fluoresensi Antibodi Tes (FAT)

Prinsip: mereaksikan virus (Ag) dengan suatu Ab yang telah dilabel (dikonyugasi) lebih dahulu dengan suatu zat fluoresein misalnya fluoresein isothiosianat (FIT). FAT ini biasanya dipakai untuk mencari Ag/virus di dalam jaringan/bahan pemeriksaan dalam jumlah yang sangat minim. Ada 2 cara pemeriksaan FAT:1. Langsung (direk)

Jaringan otak tersangka rabies + konyugat dan silihat mikroskopik. Cara ini sering menimbulkan FAT non-spesifik sehingga jarang dipakai.2. Tidak langsung

Jaringan otak anjing (ag) + ab yang tidak dilabel ag-ab-kompleks. Lalu kompleks ini direaksikan dengan labeled-ab yang harus berasal dari hewan yang sama seperti ab pertama. Maka ag-ab-kompleks akan bertindak sebagai ag, reaksi FAT positif, dengan fuoresensi hijau.

7. Enzym Linked Immuno sorbent Assay (ELISA)Prinsip: penambahan enzim tertentu akan menyebabkan hidrolisis, dan derajat hidrolisis enzim ini sebanding dengan ada/tidaknya atau banyak sedikitnya ag/ab yang sedang dicari.8. Radio Immuno Assay (RIA)Teknik RIA yaitu untuk mengukur aktivitas imunologik bukan aktivitas biologik. Teknik ini telah banyak diasaptasi untuk menemukan dan mengukur antigen atau antibodi virus. Tes ini memiliki kepekaan dan spesifisitas yang lebih tinggi, dapat digunakan untuk mengukur zat yang kadarnya sangat rendah dalam darah atau bahan lain serta dapat diselesaikan dalam waktu yang relatif singkat.

9. Counter Immuno Electrophoresis (CIEP)Prinsip: antigen dan antibody dalam lapangan atau medan listrik mempunyai pergerakan elektroforesis yang berbeda. Cara imunoelektroforesis dua arah berhadapan ini, dalam virologi mulai dikembangkan untuk mencari HbsAg dalam serum penderita Hepatitis B. Caranya relatif sederhana, cepat dan peka yaitu:

a. Agarosa dilarutkan dalam buffer pH 8,4 atau lebih lalu diletakkan pada gelas dan biarkan menjadi gel.

b. Deretan sumur-sumur yang sederajat digali dalam agarosa dan sumbat-sumbat agarosa diangkat secara steril.c. Antigen rujukan atau bahan-bahan pemeriksaan dimasukkan kedalam sumur-sumur yang paling dekat katoda dan antibodi ditambahkan pada deretan sumur dekat anoda.

d. Gelas alas selanjutnya dihubungkan dengan ruang-ruang elektroforesis dengan sumbu kertas dan diberi arus yang konstan.

Cara ini didasarkan pada prinsip bahwa pH alkali, antigen HbsAg bermuatan negatif dan bergerak ke anoda, sedangkan gamma globulin dekat pada titik isoelektriknya bergerak ke arah katoda. Garis presipitin terbentuk apabila konsentrasi antigen dan antibodi spesifiknya yang ekuivalen bertemu. Hasil tes imunoelektroforesis dua arah berhadapan akan menunjukkan garis-garis presipitin antara contoh-contoh serum manusia yang diperiksa dengan antibodi HBs.Walaupun teknik ini terutama digunakan untuk menemukan antigen HbsAg, tetapi dapat juga digunakan untuk sistem-sistem lain dimana virus atau antigen v tersebut bermuatan negatif.BAB III

PEMBUATAN LARUTAN

A. Pembuatan larutan Hanksa. Larutan stock Hanks I:

Timbang: - NaCl

80 gr

- MgCl26H2O 1 gr

- MgSO47H2O

1 gr

Larutkan dengan aquadest hingga 1 liter

Sterilkan pada suhu 1200C selama 30 menit

b. Larutan stock Hanks II:

Timbang: - Na2HPO412H2O80 gr

- KH2PO4

1 gr

Larutkan dalam 960 mL aquadest, homogenkan

Sterilkan pada suhu 1200C selama 30 menitc. Pembuatan larutan Hanks (Hanks oplos):

Sediakan botol 1 liter yang berisi 960 mL aquadest

Masukkan ke dalamnya masing-masing 100 mL stock Hanks I dan 100 mL stock Hanks II

Tambahkan 10 mL glukosa 10%

Tambahkan 4 mL sodium bicarbonat 8,8%

Tambahkan pula aquadest steril hingga 1 liter

Bubuhi penstrep hingga 200 U/mL

B. Pembuatan larutan Earles

a. Pembuatan Earles I:

Timbang: - NaCl

68 gr

- KCl

4 gr

- CaCl2

2 gr

- MgSO47H2O

2 gr

Larutkan dengan aquadest hingga 1 liter

Bagi menjadi 10 botol masing-masing 100 mL

Sterilisasi pada 1200C selama 30 menit dalam autoclave

Simpan dalam lemari es

b. Pembuatan Earles II

Timbang NaH2PO4 1,4 gr

Larutkan dalam aquadest hingga 1 liter

Bagi menjadi 10 botol masing-masing 100 mL

Sterilisasi pada 1200C selama 30 menit dalam autoclave

Simpan dalam lemari es

c. Pembuatan Earles Medium

Masukkan 560 mL aquatridest steril ke dalam botol 1 liter

Tambahkan:- 100 mL larutan Earles I

- 100 mL larutan Earles II

- 10 mL larutan Glukosa 10%

- 100 mL larutan Laktalbumin 5%

Homogenkan, kemudian tambah aquatridest hingga 1000 mL

Tambah serum kuda 20 mL

Tambah larutan penstrep 20.000 Unit/mL sebanyak 12,5 mL Tambah Phenol Red 0,5% sebanyak 4 mL

Tambah 1 mL larutan MgCl2 2,5M (untuk golongan enterovirus)

C. Pembuatan Eritrosit Ayam 0,5%

Masukkan 2 mL natrium sitrat 3,8% ke dalam spuit

Isap darah vena ayam (di bawah sayap) sampai 10 mL

Masukkan ke dalam tabung sentrifuge

Putar 2000 rpm selama 10 menit

Buang plasmanya, kemudian endapan eritrositnya dicuci dengan NaCl 0,85% sebanyak 3 kali

Endapan eritrosit dibuat konsentrasi 10%

Kemudian buat eritrosit dengan konsentrasi 5%

PAGE 14