DASAR TEORI BAKTERIOLOGI

Dalam bekerja di laboratorium, salah satu tugas analis kesehatan adalah memeriksa ….. (par 2)

(p1)

Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan

mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak

berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam

kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik

pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-

penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.

Banyak metode atau tahapan standar yang dilakukan dalammengidentifikasi mikroba,

salah satunya berdasarkan sifat kimiawinya. Sel terdiridari berbagai bahan kimia. Bila sel

mikroba diberi perlakuan kimiawi, maka selini memperlihatkan susunan kimiawi yang spesifik.

Sebagai contoh disini adalah bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras

dengan air, dimanasel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati

bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau

pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitumengetahui

reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan

Salah satu teknik mengamati bentuk sel sehingg mudah untuk diidentifikasi ialah dengan menggunakan

metode pengecatan gram. Dasar TeoriTeknik pengecatan Gram dikembangkan oleh Hans Christian Gram (dokter

berkebangsaanDenmark, 1884). Pengecatan Gram meru5pakan salah satu langkah awal mengidentifikasi

selbakteri yang memisahkan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram positif (berwarnaungu/biru) dan

bakteri Gram negatif (berwarna merah)Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel

menahan (mengikat) warnaungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif

tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhirpengecatan

tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkoholdan pada tahap akhir pengecatan

terwarnai menjadi merah oleh safranin.Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu

lipoposakarida (lipid)kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan

berwarnamerah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal.Setelah

pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasioleh alkohol sehingga dinding

sel tetap menahan warna biru.Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu

lama.Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek

2. Jenis Pewarnaan

Pewarnaan pada bakteri di bagi menjadi tiga, yaitu :

2.1 Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut

sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut.

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena

sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk

pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui

bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan

sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin. yang man pewarnaan sederhan

ini di bagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan

a. Pewarnaan Asam

Mewrupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan untuk hanya

untuk melihat bentuk sel. adapun zat warna yang di pakai dalam pewarnaan positif adalah biru

metilen, dan air furksin.

Cara kerja untuk melakukan pewarnaan bakteri yaitu sebelum dilakukan pewarnaan dibuat

ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi

bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan

saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan

melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.

b. Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi

mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan

transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.

Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan

bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga

penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau

tinta cina.

Cara kerja pewarnaan negatif, yaitu ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di

ujung kanan salah satu object glass. biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan

nigrosin tadi, lalu dicampurkan Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke

samping kiri Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api.

2.2 Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies

bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat

kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan

Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884

untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-

negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan

Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci

dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna

penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-

negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk

mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok

berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini

berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar,

berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan

pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi

dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci

sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci.

Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding

akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Jadi bahan zat warna yang di pakai

dalam pewarnaan gram, yaitu kristal violet, larutan iodin, alkohol 90 %, dan larutan safranin.

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi

suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan

bakteri Gram negatif.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

a. Bakteri Gram negatif

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada

metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah

dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu

pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri

gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk

mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi

organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding

sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).

b.Bakteri Gram Positif

Bakteri gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses

pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,

sedangkan bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi

antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel

bakteri.Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm,

berlapis tunggal atau monolayer. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%),

peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50%

berat ringan.

Cara kerja pewarnaan diferensial, yaitu Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan diatas

nyala api bunsen teteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut secara aseptik ambilah

inokulum bakteri yang akan diperksa, lalu letakkan diatas tetesan aquades itu, kemudian ratakan

perlahan-lahan ambil kaca benda yang tegak sehingga apusan menjadi tipis dan merata. Biarkan

sampai kering fiksasi dengan cara melewatkan apusan tersebut diatas nyala api dengan cepat

letakkan apusan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu teteskan

larutan kristal violet pada apusan dan biarkan selama 30-60 detik cuci warna dasar dengan air

mengalir, keringkan teteskan larutan iodin pada apusan, biarkan selama 30-60 detik cuci larutan

iodin dengan air mengalir, keringkan rendam atau basuh dengan alkohol ... % selama ... detik

teteskan larutan safranin, biarkan selama 30-60 detik cuci dengan air mengalir, lalu keringkan

amati dengan mikroskop gambar bentuk morfologi

2.3 Pewarnaan Khusus

Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu

dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb.

Contoh, Pewarnaan khusus :

a. Pewarnaan Endospora

Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang

memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel

vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan

kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan

endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak

jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak

sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana,

endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif

berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur

pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton.