Download - Dasar Teori Bakteriologi
DASAR TEORI BAKTERIOLOGI
Dalam bekerja di laboratorium, salah satu tugas analis kesehatan adalah memeriksa ….. (par 2)
(p1)
Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan
mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak
berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam
kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-
penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.
Banyak metode atau tahapan standar yang dilakukan dalammengidentifikasi mikroba,
salah satunya berdasarkan sifat kimiawinya. Sel terdiridari berbagai bahan kimia. Bila sel
mikroba diberi perlakuan kimiawi, maka selini memperlihatkan susunan kimiawi yang spesifik.
Sebagai contoh disini adalah bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras
dengan air, dimanasel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitumengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan
Salah satu teknik mengamati bentuk sel sehingg mudah untuk diidentifikasi ialah dengan menggunakan
metode pengecatan gram. Dasar TeoriTeknik pengecatan Gram dikembangkan oleh Hans Christian Gram (dokter
berkebangsaanDenmark, 1884). Pengecatan Gram meru5pakan salah satu langkah awal mengidentifikasi
selbakteri yang memisahkan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram positif (berwarnaungu/biru) dan
bakteri Gram negatif (berwarna merah)Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel
menahan (mengikat) warnaungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif
tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhirpengecatan
tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkoholdan pada tahap akhir pengecatan
terwarnai menjadi merah oleh safranin.Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid)kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarnamerah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal.Setelah
pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasioleh alkohol sehingga dinding
sel tetap menahan warna biru.Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu
lama.Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek
2. Jenis Pewarnaan
Pewarnaan pada bakteri di bagi menjadi tiga, yaitu :
2.1 Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut
sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena
sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui
bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan
sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin. yang man pewarnaan sederhan
ini di bagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan
a. Pewarnaan Asam
Mewrupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan untuk hanya
untuk melihat bentuk sel. adapun zat warna yang di pakai dalam pewarnaan positif adalah biru
metilen, dan air furksin.
Cara kerja untuk melakukan pewarnaan bakteri yaitu sebelum dilakukan pewarnaan dibuat
ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi
bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan
saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan
melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.
Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan
bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau
tinta cina.
Cara kerja pewarnaan negatif, yaitu ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di
ujung kanan salah satu object glass. biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan
nigrosin tadi, lalu dicampurkan Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke
samping kiri Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api.
2.2 Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884
untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-
negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan
Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci
dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-
negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok
berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini
berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar,
berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan
pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi
dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci
sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci.
Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding
akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Jadi bahan zat warna yang di pakai
dalam pewarnaan gram, yaitu kristal violet, larutan iodin, alkohol 90 %, dan larutan safranin.
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi
suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan
bakteri Gram negatif.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
a. Bakteri Gram negatif
Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah
dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu
pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri
gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi
organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding
sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).
b.Bakteri Gram Positif
Bakteri gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses
pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi
antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri.Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm,
berlapis tunggal atau monolayer. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%),
peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50%
berat ringan.
Cara kerja pewarnaan diferensial, yaitu Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan diatas
nyala api bunsen teteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut secara aseptik ambilah
inokulum bakteri yang akan diperksa, lalu letakkan diatas tetesan aquades itu, kemudian ratakan
perlahan-lahan ambil kaca benda yang tegak sehingga apusan menjadi tipis dan merata. Biarkan
sampai kering fiksasi dengan cara melewatkan apusan tersebut diatas nyala api dengan cepat
letakkan apusan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu teteskan
larutan kristal violet pada apusan dan biarkan selama 30-60 detik cuci warna dasar dengan air
mengalir, keringkan teteskan larutan iodin pada apusan, biarkan selama 30-60 detik cuci larutan
iodin dengan air mengalir, keringkan rendam atau basuh dengan alkohol ... % selama ... detik
teteskan larutan safranin, biarkan selama 30-60 detik cuci dengan air mengalir, lalu keringkan
amati dengan mikroskop gambar bentuk morfologi
2.3 Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu
dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb.
Contoh, Pewarnaan khusus :
a. Pewarnaan Endospora
Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang
memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel
vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan
kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan
endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak
jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak
sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana,
endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif
berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur
pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton.