PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul “ Penentuan Rasio C/N dan Pengembangan Produksi Bioinsektisida oleh Bacillus thuringiensis Menggunakan Media Kultivasi Limbah Industri Tahu” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Pebruari 2012

Ai Nelly

NRP F351080151

ABSTRACT

AI NELLY. Determination of C/N Ratio and development of Bioinsecticide Production by Bacillus thuringiensis Using Tofu waste Cultivation Media. Supervised by MULYORINI RAHAYUNINGSIH and KHASWAR SYAMSU.

Development and application of local product biopesticide, especially based on B. thuringiensis (Bt) still has been considerable potential. This is supported by the local availability of Bt local strains and agro-based raw materials are abundant and not expensive. Research toward utilization of industrial waste of tofu as a medium of cultivation of Bt has been done. In the early stages the Bt strains are isolated and selected. Bt B2 bacteria from the culture collection, protein crystals form bipiramid and cubes, are strains with the highest toxicity against C. binotalis. The optimization of media formulation is performed on a scale of 500 ml with a variation of C/N ratio 3:1, 5:1, 7:1, 9:1 and 11:1. B2 strains provides optimum toxicity value at C/N ratio 7:1 with LC50 value of 0.90 mg/L or 8356 IU/mg. The results of cultivation on the bioreactor 3 L shows substrate utilization efficiency of 67.77 % with LC50 value of 3.56 g/ml or 2112 IU/mg. Characterization of δ-endotoxin with SDS-PAGE indicates protein pattern at all media formulations contain genes Cry 1 (144 kD) and Cry 2 (66.80 kD and 55.51 kD) and Cyt1Aa (25.27). Amino acid δ-endotoxin in 500 ml scale cultivation and 3 L bioreactor show the same composition as many as 15 kinds of amino acids but the quantity of amino acids on the 3 L bioreactor scale smaller than which on 500 ml. Determination of physical factors for the increasing scale on the 40 L bioreactor using a base power per unit volume (Pg/V) still provide power value per unit volume (Pg/V) of 0.037 HP/m3 (weak level of agitation impellers), aeration requirement is 0.7 VVM with agitation speed 111.57 rpm. Cultivation at 40 L bioreactor run at a pH range from 6.5 to 7.0 where the total number of maximum cells is 10.35± 0.03 x 10 8 cfu/ml with a maximum cell growth rate of 0.48 ± 0.01 hours-1, while the number of the highest spore of 3.90±0.06 x 108 cfu/ml with a maximum rate of spore growth is 0.25 ± 0.01 hours-1. Substrate utilization efficiency at 68.21 % with LC50 values is 3.19 g/ml or 2357 IU/mg.

Keywords: Bt, isolation, C/N ratio, scale up, δ-endotoxin

RINGKASAN

AI NELLY. Penentuan Rasio C/N dan Pengembangan Produksi Bioinsektisida oleh Bacillus thuringiensis Menggunakan Media Kultivasi Limbah Industri Tahu. Dibimbing oleh MULYORINI RAHAYUNINGSIH dan KHASWAR SYAMSU.

Pengembangan dan penggunaan biopestisida produk lokal khususnya berbasis B. thuringiensis (Bt) masih memiliki potensi yang cukup besar. Hal ini didukung oleh ketersediaan galur Bt lokal dan bahan baku berbasis agroindustri yang melimpah dan murah. Penelitian ke arah pemanfaatan limbah industri tahu sebagai media kultivasi Bt telah dilakukan. Pada tahap awal dilakukan isolasi dan seleksi galur Bt. Bakteri Bt B2 dari culture collection memiliki bentuk kristal protein bipiramid, kubus dan bulat. Galur ini menghasilkan daya toksisitas paling tinggi terhadap C. binotalis. Penentuan rasio C/N terbaik dilakukan pada skala 500 mL dengan variasi rasio C/N 3:1, 5:1, 7:1, 9:1 dan 11:1. Galur B2 memberikan nilai toksisitas paling tinggi pada rasio C/N 7:1 dengan nilai LC50 sebesar 0,90 mg/L atau 8356 IU/mg. Hasil kinetika kelima rasio C/N menunjukan rentang pH cairan kultivasi antara 7,13 dan 8,20. Jumlah koloni dan spora tertinggi dicapai oleh rasio C/N 9:1 masing-masing sebesar 10,75 x 108 cfu/ml dan 4,10 ± 0,02 x 108 cfu/ml. Laju pertumbuhan sel maksimum sebesar 0,55 ± 0,01 jam-1 pada rasio C/N 9:1 sedang laju pertumbuhan spora maksimum pada C/N 7:1 sebesar 0,29 ± 0,01 jam-1. Efisiensi pemanfaatan substrat tertinggi sebesar 88,05 ± 0,00 % pada Rasio 9:1.

Hasil kultivasi pada bioreaktor 3 L menunjukkan jumlah total sel maksimum sebesar 11,40 ± 0,05 x 108 cfu/ml dengan laju pertumbuhan sel maksimum sebesar 0,57 ± 0,01 jam-1, sedangkan jumlah spora tertinggi sebesar 3,30 ± 0,05 x 108 cfu/ml dengan laju pertumbuhan spora maksimum adalah 0,17 ± 0,05 jam-1. Efisiensi pemanfaatan substrat sebesar 67,77 ± 0,00 % dengan nilai LC50 sebesar 3,56 g/L atau 2112 IU/mg.

Karakterisasi δ-endotoksin dengan SDS-PAGE mengindikasikan pola protein pada semua rasio C/N mengandung gen cry 1 (144 kD), cry 2 (66,80 kD dan 55,51 kD) dan Cyt1 (25,27 kD). Asam amino δ-endotoksin pada kultivasi skala 250 ml dan bioreaktor 3 L menunjukan komposisi yang sama sebanyak 15 jenis asam amino tetapi kuantitas asam amino pada bioreaktor 3 L lebih kecil dibanding skala 500 ml.

Penentuan faktor-faktor fisik untuk penggandaan skala pada bioreaktor 40 L menggunakan basis tenaga per unit volume (Pg/V) tetap memberikan nilai tenaga per unit volume (Pg/V) sebesar 0,037 HP/m3 (tingkat agitasi impeler lemah). Kebutuhan aerasi sebesar 0,7 vvm dengan kecepatan agitasi 111,57 rpm. Pengembangan produksi bioinsektisida pada bioreaktor 40 L memberikan hasil optimum pada jam ke-36 dengan jumlah sel total 10,35 ± 0,02 x 108 cfu/mL, jumlah spora 3,90 ± 0,03 x 108 cfu/mL dengan efisiensi pemanfaatan substrat sebesar 68,21 ± 0,00 % dan nilai LC50 sebesar 3,19 mg/L atau 2357 IU/mg.

Kata kunci: Bt, isolasi, rasio C/N , penggandaan skala, δ-endotoksin

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya Tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PENENTUAN RASIO C/N DAN PENGEMBANGAN PRODUKSI BIOINSEKTISIDA OLEH Bacillus

thuringiensis MENGGUNAKAN MEDIA KULTIVASI LIMBAH INDUSTRI TAHU

AI NELLY

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada Program Studi Teknologi Industri Pertanian

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2012

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Mohamad Yani, M.Eng

LEMBAR PENGESAHAN

Judul Tesis : Penentuan Rasio C/N dan Pengembangan Produksi

Bioinsektisida oleh Bacillus thuringiensis Menggunakan Media Kultivasi Limbah Industri Tahu

Nama Mahasiswa : Ai Nelly NRP : F351080151

Disetujui,

Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Mulyorini Rahayuningsih, M.Si Prof. Dr. Ir. Khaswar Syamsu, M.Sc

Ketua Anggota

Diketahui,

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana

Teknologi Industri Pertanian

Dr. Ir. Machfud, MS. Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr

Tanggal Ujian: Tanggal Lulus:

PRAKATA

Alhamdulillahirrabbil’alamiin. Puji syukur penulis sampaikan ke hadirat Allah SWT yang telah memberikan karunia sehingga penyusunan Tesis dengan judul “Penentuan Rasio C/N dan Pengembangan Produksi Bioinsektisida oleh Bacillus thuringiensis Menggunakan Media Kultivasi Limbah Industri Tahu” telah dapat diselesaikan.

Penyusunan tesis ini merupakan bagian dari salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Dalam masa penelitian dan penyusunan tesis ini, penulis mendapat dukungan bimbingan berbagai pihak. Penghargaan setinggi-tingginya dan ucapan terima sebanyak-banyaknya penulis sampaikan kepada

1. Dr. Ir. Machfud, MS., selaku Ketua Program Studi 2. Dr. Ir. Mulyorini Rahayuningsih, M.Si., selaku Ketua Komisi Pembimbing 3. Prof. Dr. Ir. Khaswar Syamsu, M.Sc., selaku Anggota Komisi

Pembimbing 4. Dr. Ir. Mohamad Yani, M.Eng selaku Dosen Penguji Luar Komisi 5. Teknisi laboratorium dan staf TIP : Ibu Rini, Ibu Ega, Ibu Sri, Pak Edi,

Pak Sugiardi, dan Ibu Nur. Terima kasih bantuannya. 6. Teman-teman lab LDit Indra, Erlin, Sarfat, Bagus, Devi, dan Zora. 7. Teman-teman TIP ’08 Donna, Renny, Mappe, Dessy, Fatma, Deli, Saud,

Andrew, Niken, Citra, Siti, Susi dan Angga yang banyak membantu selama penelitian.

8. Suami, Sujarwo Mawardi dan putri tercinta Fisilmi Kaffah serta Addieni Hanifa atas keleluasaan menuntut ilmu, dukungan dan doa.

9. Abbi dan Ummi atas motivasi, kesabaran dan doa, serta Adik-adik yang selalu memberikan kekuatan.

10. Dr. Bambang S. Pujantiyo, Dr. Iwan Sudrajat, M.SEE dan I-tech BPPT all crew atas dukungan dan kesempatan.

11. Departemen Teknologi Industri Pertanian Fakultas Teknologi Pertanian IPB, yang telah memberikan sebagian bantuan dana penelitian.

12. Teman-teman TIP IPB angkatan 2008. 13. Dan semua pihak yang telah membantu penulisan hasil penelitian.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunannya masih banyak terdapat kekurangan sehingga perlu adanya perbaikan pada penelitian sejenis dimasa yang akan datang. Semoga karya kecil ini dapat berperan pada kemajuan khazanah ilmu pengetahuan.

Bogor, Pebruari 2012 Ai Nelly

RIWAYAT HIDUP

Penulis lahir di Majalengka pada tanggal 28 Agustus 1978, anak pertama

dari tiga bersaudara dari pasangan Bapak H.M. Habuddin S. dan Ibu Hj. Anah

Rohanah. Pendidikan Sekolah Dasar selesai tahun tahun1989 di SDN I Ligung,

dan melanjutkan ke tingkat Sekolah Menengah Pertama di SMPN 1 Ligung

hingga lulus tahun 1992. Selepas SMP, penulis menyelesaikan sekolah di SMAN

1 Majalengka pada 1995. Satu tahun kemudian penulis melanjutkan kuliah di

Institut Teknologi Bandung mengambil jurusan Kimia Fakultas MIPA dan lulus

tahun 2001.

Karir penulis dimulai tahun 2001 dengan bekerja di Badan Pengkajian dan

Penerapan Teknologi (BPPT) -Lembaga Pemerintahan non Departemen dibawah

Menristek- sebagai staf Balai Inkubator Teknologi Kedeputian Pengkajian dan

Kebijakan Teknologi dengan jabatan terakhir sebagai Kepala Seksi Fasilitasi dan

Advokasi.

Pada tahun 2008 Penulis melanjutkan pendidikan program master di jurusan

Teknologi Industri Pertanian IPB dengan sponsor pembiayaan dari BPPT dan

bantuan penelitian yang berasal dari Departemen Teknologi Industri Pertanian

Institut Pertanian Bogor melalui program IMHERE.

Bogor, Pebruari 2012 Penulis

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL .................................................................................... v

DAFTAR GAMBAR ................................................................................ vii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ ix

1 PENDAHULUAN ................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang .................................................................................. 1

1.2 Identifikasi Masalah ......................................................................... 3

1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................. 4

1.4 Ruang Lingkup.................................................................................. 4

1.5 Hipotesis ........................................................................................... 5

2 TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................ 7

2.1 Bacillus thuringiensis ........................................................................ 7

2.2 Kristal Protein (δ-endotoksin)............................................................ 9

2.3 Mekanisme Patogenesis .................................................................... 10

2.4 Limbah Industri Tahu ........................................................................ 11

2.5 Crocidolomia binotalis Zell ............................................................... 13

2.6 Kondisi Kultivasi B. Thuringiensis .................................................... 15

2.7 Penentuan Aktivitas Insektisida Mikroba ........................................... 16

2.8 Penggandaan Skala............................................................................ 17

3 METODE PENELITIAN ..................................................................... 21

3.1 Kerangka Pemikiran ......................................................................... 21

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................... 23

3.3 Alat dan Bahan ................................................................................. 23

3.4 Metode Penelitian ............................................................................ 23

3.4.1 Analisis komposisi media dan isolasi bakteri ........................... 23

3.4.1.1 Analisis bahan baku ..................................................... 23

3.4.1.2 Isolasi B. thuringiensis................................................. 24

3.4.2 Penentuan rasio C/N terbaik .................................................... 25

3.4.2.1 Persiapan inokulum ..................................................... 25

3.4.2.2 Penentuan komposisi rasio C/N terbaik ....................... 26

3.4.3 Penerapan kondisi terbaik pada bioreaktor 3L dan 40L ............ 27

3.4.4 Karakterisasi dan uji daya toksisitas bioinsektisida .................. 29

4 HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 31

4.1 Analisis Komposisi Media Kultivasi ................................................. 31

4.2 Seleksi B. thuringiensis ..................................................................... 33

4.3 Pengaruh Media Kultivasi ................................................................ 36

4.3.1 Jumlah sel hidup............................................................................. 36

4.3.2 Jumlah spora ................................................................................. 38

4.3.3 Uji toksisitas bioinsektisida ............................................................ 39

4.4 Penentuan Rasio C/N Terbaik ........................................................... 41

4.4.1 Pengaruh rasio C/N pada pH cairan kultivasi ................................. 41

4.4.2 Pertumbuhan Bacillus thuringiensis ................................................ 42

4.4.3 Total gula sisa ............................................................................... 46

4.4.4 Pembentukan spora selama kultivasi............................................... 48

4.4.5 Kinetika kultivasi ........................................................................... 49

4.4.6 Penentuan aktivitas bioinsektisida ................................................. 51

4.5 Kultivasi Btk pada bioreaktor 3 L ...................................................... 52

4.6 Karakterisasi bioinsektisida ............................................................... 55

4.6.1 Profil protein kristal ....................................................................... 55

4.6.2 Komposisi asam amino .................................................................. 58

4.7 Pengandaan skala (Scale-up) ............................................................ 60

4.7.1 pH cairan media kultivasi pada bioreaktor 40 L ........................... ... 61

4.7.2 Pertumbuhan sel B. Thuringiensis pada bioreaktor 40 L ............... .. 63

4.7.3 Pembentukan spora dan uji daya toksisitas ................................. ..... 63

4.7.4 Kinetika kultivasi pada bioreaktor 40 L ......................................... .. 64

5 KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 67

5.1 Kesimpulan ....................................................................................... 67

5.2 Saran ................................................................................................. 68

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 69

LAMPIRAN ............................................................................................. 75

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Subspesies Bt yang digunakan sebagai insektisida .................................... 9

2 Komposisi kimia ampas tahu .................................................................... 11

3 Komposisi komponen limbah cair tahu..................................................... 13

4 Jenis dan potensi standar bioassay B. thuringiensis..................................... 17

5 Komposisi rasio C/N pada media kultivasi ............................................... 26

6 Hasil analisis komposisi media kultivasi .................................................. 31

7 Hasil analisis kadar karbon dan nitrogen pada media kultivasi .................. 32

8 Kandungan mikro elemen pada ampas tahu dan limbah cair tahu ............. 33

9 Komposisi bahan penyusun nutrient broth ............................................... 37

10 Pengaruh jenis galur bakteri dan jenis media terhadap daya toksisitas ...... 40

11 Pengaruh komposisi media pada kinetika kultivasi...................................... 49

12 Pengaruh komposisi media pada daya toksisitasnya terhadap ulat terhadap kubis............................................................................................................. 51

13 Daya toksisitas Bt pada ulat kubis dalam berbagai media fermentasi ........ 52

14 Uji daya toksisitas Bt B2 terhadap ulat kubis pada kultivasi 3 L ............... 54 15 Kinetika kultivasi Bt pada bioreaktor 3 L ................................................. 55

16 Analisis asam amino kristal protein .......................................................... 59

17 Kultivasi Bt pada bioreaktor skala 3 L ...................................................... 61

18 Uji daya toksisitas Bt B2 terhadap ulat kubis pada kultivasi 40L ........... 64

19 Kinetika kultivasi B. thuringinesis pada bioreaktor 40L ........................... 65

20 Data kurva standar glukosa .................................................................. ..... 80

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Mikrogram transmisi elektron dari isolat B. thuringiensis dengan spora dan kristal protein ...................................................................... 8

2 Profil kristal protein murni dari isolat HD1 B. thuringiensis subsp. kurstaki dan badan paraspora B.thuringiensis subsp. israelensis........ . 10

3 Diagram alir proses pembuatan tahu .................................................... 12

4 Limbah cair tahu dan ampas tahu ........................................................ 13

5 Kumpulan telur ulat krop kubis .......................................................... 14

6 Diagram alir tahapan penelitian ........................................................... 22

7 Kultur Bt hasil seleksi dari culture collection dan ulat sutera .............. 33

8 Sel vegetatif B. thuringiensis dengan perbesaran 400x ........................ 34

9 Hasil pengamatan spora pada masing-masing kolonoi dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000x ................................................. 35

10 B. thuringiensis masing-masing diamati di bawah SEM (5000x).................................................................................................... 36

11 Pengaruh jenis media terhadap jumlah sel hidup ................................. 38

12 Pengaruh jenis media dan jenis isolat B. thuringinesis terhadap Jumlah spora....... ............................................................................... 39

13 Pengaruh rasio C/N terhadap pH cairan kultivasi ................................. 41

14 Pertumbuhan sel hidup B. thuringiensis .............................................. 43

15 Pengaruh koposisi media pada bobot biomassa kering ......................... 45

16 Hubungan total sel kultur B. thuringiensis pada masing-masing komposisi media ................................................................................. 47

17 Pertumbuhan spora bt selama kultivasi ............................................... 48

18 Parameter kinetika kultivasi pada pada bioreaktor 3 L ............................ 53

19 Profil pita protein δ-endotoksin........ ................................................... 57

20 Kultivasi Bt pada bioreaktor 3 L.......................................................... 60

21 Kultivasi Bt pada bioreaktor 40 L ........................................................ 61

22 Parameter kinetika kultivasi pada bioreaktor 3 L ................................. 62

23 Profil bioreaktor 40 L .......................................................................... 65

24 Kurva standar glukosa ......................................................................... 80

25 Hubungan bilangan tenaga terhadap bilangan Reynold ........................ 109

26 Hubungan tenaga terhadap bilangan aerasi .......................................... 110

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Analisis Bahan Baku Media Kultivasi ................................................. 77

2 Metode Analisis Sebelum dan Setelah Kultivasi .................................. 82

3 Perhitungan Susunan Media Kultivasi ................................................. 85

4 Rekapitulasi Data, Hasil Analisa Uji Anova dan Uji Lanjut Seleksi Bakteri ................................................................................................ 86 5 Rekapitulasi Data , Hasil Analisa Data, Uji Anova dan Uji Lanjut

Penentuan C/N Rasio .......................................................................... 91

6 Rekapitulasi Data Kultivasi pada Bioreaktor 3 L ................................ 105

7 Penentuan Reologi Cairan kultivasi ..................................................... 107

8 Perhitungan Laju Aerasi dan Kecepatan Agitasi untuk Penggandaan Skala Bioreaktor 40 L....................................................... 108

9 Rekapitulasi Data Kultivasi pada Bioreaktor 40 L................................. 113