chondrogenic diferensiasi sel stem pluripotent a
TRANSCRIPT
CHONDROGENIC DIFERENSIASI SEL STEM pluripotent
DARI kondrosit osteoarthritic DI MATRIX ALGINAT
Sel induk pluripoten diinduksi (iPSCs) memiliki potensi
untuk merevolusi terapi sel, namun tetap
jelas apakah iPSCs dapat dihasilkan dari manusia
osteoarthritic kondrosit (kontrasepsi oral) dan kemudian
diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi kondrosit. Pada saat
studi, kami meneliti potensi diferensiasi
Kontrasepsi oral menjadi iPSCs menggunakan faktor transkripsi didefinisikan
dan menjelajahi kemungkinan menggunakan OC-diturunkan
iPSCs untuk kondrogenesis. Penelitian kami menunjukkan bahwa
iPSCs dapat dihasilkan dari kontrasepsi oral dan bahwa iPSCs
bisa dibedakan dari manusia sel induk embrionik
(hESCs). Untuk mempromosikan diferensiasi chondrogenic, kita
Lentivirus digunakan untuk mentransduksi iPSCs unggulan dalam matriks alginat
dengan mengubah faktor pertumbuhan-β1 (TGF-β1) dan kemudian di
vitro co-kultur ini iPSCs dengan kondrosit. Gene
analisis ekspresi menunjukkan bahwa strategi combinational
mempromosikan diferensiasi iPSCs ditetapkan dalam
kondrosit dalam matriks alginat. Peningkatan ekspresi
tulang rawan-gen terkait, termasuk kolagen II, aggrecan, dan
tulang rawan oligomer matriks protein (COMP), dan penurunan
ekspresi gen dari penanda tulang rawan degeneratif,
faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF), yang diamati.
Hasil histologis mengungkapkan sulfat padat
ekstraseluler matriks dalam budaya co-TGF-β1-transfected
iPSCs dengan kondrosit dalam matriks alginat. Selain itu,
dalam kegiatan chondroinductive vivo juga dievaluasi.
Pemeriksaan histologi menunjukkan bahwa lebih baru tulang rawan
dibentuk dalam budaya co-TGF-β1-transfected iPSCs
dengan kondrosit dalam matriks alginat. Secara keseluruhan, kami
Data menunjukkan bahwa iPSCs dapat dihasilkan dari kontrasepsi oral oleh
defi ned faktor dan hasil strategi combinational di
secara signifikan meningkatkan kondrogenesis dari OC-diturunkan
iPSCs. Karya ini menambah pemahaman kita tentang potensi
solusi untuk masalah penggantian sel osteoarthritic.
Kata kunci: kondrosit, kondrogenesis, diferensiasi,
co-budaya.
pengantar
Artikular tulang rawan (AC) merupakan jaringan avaskular terdiri
kondrosit, bertanggung jawab untuk sintesis matriks berlimpah
dan pemeliharaan (Merceron et al., 2011). ketika rusak
karena kondisi traumatik atau patologis, AC tidak
sembuh secara spontan dalam keadaan fisiologis
yang menghasilkan Osteoarthritis (OA). OA adalah yang paling umum
muskuloskeletal penyakit pada orang tua, dan bisa menjadi
penyebab utama keempat kecacatan pada tahun 2020
(Reginster, 2002; Woolf dan PFL Eger, 2003; Koelling et
al, 2009.). Strategi pengobatan saat ini dibatasi
untuk bantuan jangka pendek gejala dengan farmasi
intervensi dan prosedur bedah (Lohmander dan
Roos, 2007). Dengan demikian, pengobatan kerusakan tulang rawan
menimbulkan tantangan klinis signifikan bisa. kemajuan terbaru
dalam kedokteran regeneratif menunjukkan bahwa menggunakan jaringan
rekayasa berbasis konstruksi untuk meningkatkan OA-tulang rawan
perbaikan dengan memobilisasi sel chondrogenic adalah menjanjikan
Pendekatan untuk restorasi struktur dan fungsi AC
(Dehne et al, 2009;. Hattori dan Ohgushi, 2009; Ahmed
et al, 2011.).
Sejumlah strategi telah digunakan untuk mengidentifikasi
potensial sel sumber untuk AC regenerasi. Hal ini secara luas
sepakat bahwa regenerasi jaringan dari sel-sel autologous dapat
dicapai dengan mengambil keuntungan dari program alami
embrio pengembangan (DeLise et al, 2000;. Tuan, 2004;
Ingber et al, 2006;. Goepfert et al, 2010).. Oleh karena itu,
sel induk autologous akan menjadi pilihan yang ideal (Yoshida
dan Yamanaka, 2010). Sel induk terutama klasifi ed
menjadi dua jenis sel: sel induk somatik dan pluripotent
stem sel. Somatik sel induk berada di berbagai organ
dan menunjukkan multipotency untuk menumbuhkan jaringan yang rusak,
tetapi terbatas pada potensi vitro proliferasi (Yoshida
dan Yamanaka, 2010). Oleh karena itu, sel-sel induk pluripotent berpotensi majemuk
mungkin menjadi sumber baik untuk regenerasi jaringan. hESCs, yang
sel pluripoten fi rst diisolasi dari embrio, memiliki tinggi
proliferasi potensial dan dapat menghasilkan dibedakan
keturunan dari semua tiga lapisan kuman embrio. Namun,
derivasi dari hESCs dari embrio awal menimbulkan
teknis dan etika keterbatasan untuk mereka gunakan dalam penelitian
dan klinik (Gaspar-Maia et al., 2011). direkayasa
sel induk, yang dikenal sebagai iPSCs, dihasilkan dari sel somatik
oleh transduksi defi ned pemrograman ulang transkripsi
faktor, biasanya Oct4, Sox2, KLF4, dan c-MYC, terbuka
baru jalan untuk menghindari kontroversi menggunakan hESCs
(Takahashi dan Yamanaka, 2006;. Takahashi et al, 2007).
Karena iPSCs memiliki tinggi proliferasi dan diferensiasi
kemampuan mirip dengan hESCs, mereka terus besar
potensi regeneratif obat (Itoh et al., 2011).
Bukti terbaru menunjukkan bahwa OC-larut disekresikan
morphogens dapat menginduksi diferensiasi dari chondrogenic
manusia sel induk mesenchymal (MSC) dalam 3-dimensi
(3D) lingkungan sementara mencegah mereka hipertrofik
diferensiasi (Aung et al., 2011). Selain itu, manusia kontrasepsi oral
menanggapi sama non-sakit terdiferensiasi passaged
kondrosit oleh strategi co-budaya (Ahmed et al.,
2010). Selain itu, sebuah laporan baru-baru ini menyarankan bahwa tulang
morphogenetic protein 4-mengekspresikan dedifferentiated
kondrosit pulih fenotipe chondrocytic in vitro
dan bahwa beberapa kondrosit terdiferensiasi dalam
situs cacat bisa menjalani redifferentiation dan bentuk
matriks yang ditampilkan pewarnaan toluidin biru untuk positif
glycosaminoglycans setelah transplantasi ke dalam sendi
(Lin et al, 2008.). Berdasarkan hal diatas ndings fi, kami percaya bahwa
Kontrasepsi oral cenderung untuk melayani sebagai sumber sel untuk generasi
dari iPSCs untuk digunakan dalam rekonstruksi AC rusak.
Dalam penelitian ini, kami menyelidiki apakah iPSCs dapat
dihasilkan dari kontrasepsi oral oleh ekspresi didefinisikan
transkripsi faktor dan apakah OC yang diturunkan iPSCs
dapat diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi kondrosit melalui
kombinasi lentivirus-dimediasi TGF-β1 transduksi
dan co-budaya AC dalam alginat perancah.
Bahan dan Metode
Tissue sumber dan persiapan
Jaringan tulang rawan fragmen Normal dan osteoarthritic
(Ruijin Rumah Sakit, Shanghai, Cina) dikumpulkan
menurut sebuah Institutional Review Board disetujui
protokol. Osteoarthritic tulang rawan sampel, tanpa tanda-tanda
keterlibatan arthritis, diperoleh dari lutut
sendi pasien didiagnosa menurut kriteria
American College of Rheumatology (Altman et al.,
Dengan OA setelah penggantian lutut total) 1990. kontrol yang normal
sampel tulang rawan yang diperoleh dari sendi lutut
pasien diamputasi dengan cedera parah. tissue sampel
yang fi xed dalam paraformaldehyde 4%, decalcifi ed dengan 10
% Asam ethylenediaminetetraacetic (EDTA, pH 7,4, Sigma-
Aldrich, St Louis, MO, USA), dan tertanam dalam paraffi n.
Paraffi n bagian diwarnai dengan hematoksilin / Eosin
(H & E) dan toluidin biru.
Kondrosit isolasi dan budaya
Kondrosit dari tulang rawan osteoarthritic dan sehat
dipanen setelah pencernaan selama 6 jam pada 37 ° C dengan
kolagenase I (152 U / mL; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),
kolagenase II (280 U / mL; Invitrogen), dan dispase (15
U / mL; Invitrogen) dan menjalani ltration berikutnya fi
melalui jala 40 pM sieve (BD Falcon, Franklin Lakes,
NJ, USA) (Koelling et al., 2009). Kontrasepsi oral dikultur
dalam medium Dulbecco yang dimodifikasi Eagle / Ham 's F-12
(DMEM/F-12, Invitrogen) medium dengan
10% janin bovine serum (FBS, Invitrogen). untuk mempertahankan
fenotipe chondrogenic, kondrosit yang normal adalah
dikultur dalam medium chondrogenic mengandung glukosa tinggi
DMEM, 20% FBS, deksametason 100 nM (Sigma-
Aldrich), 50 mg / mL askorbat-2-fosfat (Sigma-
Aldrich), (ITS insulin, transferin, dan asam selenous, BD),
dan 1% penisilin / streptomisin (Invitrogen). Sel yang diunggulkan di coverslips, fi xed dalam
paraformaldehyde 4% dan
diwarnai dengan toluidine biru.
lentiviral produksi
Vektor lentiviral dibangun dan dikemas, dan
titer virus diukur menurut laporan sebelumnya
(Honda et al., 2010). Manusia Oct4, Sox2, KLF4, c-MYC
dan TGF-β1 cDNA (Shanghai Bioteknologi Co, Ltd,
Shanghai, Cina) yang dimasukkan ke dalam pENTR / D-TOPO
entri vektor plasmid (Invitrogen). CDNA di pENTR /
D-TOPO kemudian ditransfer ke pCSII-EF-MCSIRES2-
Venus lentiviral Gateway vektor menggunakan plasmid
LR Clonase (Invitrogen). Vektor lentiviral pseudotyped
dengan virus stomatitis vesikuler glikoprotein G (VSV-G)
diproduksi oleh transfeksi transien dari tiga plasmid
ke sel 293T: kemasan plasmid (pCAG-HIVgp),
glikoprotein-dan VSV-G Rev-mengekspresikan plasmid
(pCMV-VSV-G-RSV-Rev), dan vektor lentiviral
plasmid. Supernatan kultur dipekatkan dengan menggunakan
ultrasentrifugasi, dan pelet virus itu resuspended dalam
Hanks 'seimbang garam solusi. Titer vektor ditentukan
oleh infeksi sel 293T dengan pengenceran seri dari virus
konsentrat ditambah dengan 1 mg / mL Polybrene
(Sigma-Aldrich) dan diikuti oleh fl uorescence-diaktifkan
sel menyortir analisis ditransduksi sel mengekspresikan
EGFP (manusia Oct4, Sox2, KLF4 dan c-MYC). titer
dinyatakan sebagai 293T-pentransduksi unit per mL.
iPSC induksi dan budaya
Sekitar 3 × 105 kontrasepsi oral yang ditransduksi selama 24 jam dengan
koktail lentiviral membawa GFP dan reprogramming
faktor (Oct4, Sox2, KLF4, dan c-MYC), dan berbudaya
selama 6 hari di DMEM (Invitrogen) mengandung FBS 10%.
Kemudian, sel-sel passaged ke feeder layer manusia
ketuban sel epitel (HAmEpiC) dan berbudaya selama 24 jam
di DMEM yang mengandung 10% FBS. Satu hari kemudian, media
diubah menggunakan media ESCs-mendukung dengan
tinggi glukosa DMEM, 15% FBS, 4 ng / mL dasar fi broblast
faktor pertumbuhan (R & D, Minneapolis, MN, USA), 2mm
L-Gin (Sigma-Aldrich), 1 × 10-4 M asam amino nonesensial
(Sigma-Aldrich), 1 × 10-4 M 2-mercaptoethanol (Sigma-
Aldrich) dan 1% penisilin / streptomisin (Invitrogen).
Setelah tiga minggu, iPSC manusia koloni dijemput,
dipisahkan dengan 0,05% tripsin-EDTA (Sigma-Aldrich)
pencernaan, berlapis ke piring budaya baru dan diidentifi kasi.
Semua ESC-seperti koloni dijemput dengan tangan dan klonal
diperluas.
Disutradarai diferensiasi iPSCs manusia ke spesifik c
sel keturunan in vitro
Selama 2-3 hari sebelum pengobatan, EBS yang diselenggarakan dalam
tiga media diferensiasi yang berbeda pada ultra-rendah piring.
Setelah langkah ini prakondisi, yang EBS dipindahkan
untuk gelatin-dilapisi 6-baik piring, berbudaya dalam diferensiasi
Media selama 14 hari dengan media berubah setiap lain
hari dan selanjutnya diproses untuk ekspresi gen
analisis dan histologi. 6-baik piring (Corning) adalah
dilapisi untuk setidaknya 30 menit pada suhu kamar dengan 0,1
% Gelatin (Sigma-Aldrich) di dH2O (1 mL per sumur).
Protokol diferensiasi dilakukan menurut
laporan sebelumnya (Miki et al., 2005). standar budaya
Media adalah DMEM dilengkapi dengan FBS 10%, 2 mM
L-glutamine (Sigma-Aldrich), nonesensial amino 1%
Asam (Sigma-Aldrich), 55 mM 2-mercaptoethanol (Sigma-
Aldrich), 1 mM natrium piruvat (Sigma-Aldrich), dan
1% antibiotik-antimycotic (Invitrogen). untuk pankreas
diferensiasi (endoderm), kami menggunakan standar
medium dengan nikotinamida (10 mM), karena
diferensiasi kardiomiosit (mesoderm), kami menggunakan
media standar dilengkapi dengan 1 mM asam askorbat
2-phosphate (Sigma-Aldrich), dan untuk diferensiasi saraf
(ektoderm), kami menggunakan media standar ditambah
dengan 5 × 10-5 M all-trans retinoic acid (Sigma-Aldrich) dan
fi broblast faktor pertumbuhan-4 pada 10 (R & D) ng / mL.
Sitokimia dan immunofl uji uorescence
Pewarnaan fosfatase alkali dilakukan menurut
dengan instruksi produsen menggunakan Alkaline
Fosfatase Deteksi Kit (Millipore, Billerica, MA,
USA). Untuk uji immunofl uorescence (Miki et al.,
2005), iPSCs dibedakan dan dibedakan mereka
derivatif adalah fi xed dalam aseton dingin selama 30 menit pada 4 ° C,
maka sel dibilas dengan PBS tiga kali dan diinkubasi
di agen protein memblokir selama 20 menit. sampel yang
diinkubasi dengan antibodi primer (Tabel 1) semalam
pada 4 ° C, kemudian dibilas dengan PBS tiga kali dan diinkubasi dengan Cy3-terkonjugasi
antibodi sekunder (R & D) untuk 2
jam pada suhu kamar. Dalam beberapa percobaan, sel-sel
dibilas dengan PBS dan dipasang pada pemasangan air
media yang mengandung counterstain DAPI nuklir (4,6
diamidino-2-phenylindole, Sigma-Aldrich). gambar yang
ditangkap menggunakan mikroskop Axio Observer A1 (Carl
Zeiss MicroImaging, Goettingen, Jerman).
teratoma pembentukan
IPSCs manusia disuntikkan intramuskuler ke obes
diabetes / berat gabungan kekebalan defi sien (NOD /
SCID) tikus (4 × 106 sel per situs). Setelah 4-6 minggu, semua tikus
(n = 3) dikembangkan teratoma, yang dihapus dan
diproses untuk pewarnaan H & E. Semua hewan percobaan yang
dilakukan sesuai dengan Panduan untuk Perawatan dan
Penggunaan Hewan untuk Tujuan Penelitian dan disetujui
oleh Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Perawatan Hewan Komite.
Transfeksi iPSCs dengan Lentivirus-TGF-β1
IPSCs manusia terinfeksi dengan lentivirus membawa RFP
dan TGF-β1 di hadapan polybrene (8 mg / mL) dan
berlapis ke feeder layer dari HamEpiC selama 5 hari, setelah
yang merah-fl iPSCs manusia uorescing dijemput dan
ditransfer ke gelatin-dilapisi 6-baik piring, di mana mereka
dikultur dalam medium DMEM yang mengandung FBS 20%.
Tingkat transfeksi diamati adalah sekitar 70% untuk iPSCs.
Co-budaya iPSCs transfected dengan kondrosit di
alginat matriks
The iPSCs transfected (iPSCs/TGF-β1) dibebaskan dari
substratum budaya dan resuspended pada konsentrasi
dari 0,417 × 106 sel / mL. Kemudian iPSCs/TGF-β1 yang diunggulkan
ke matriks alginat (Invitrogen) oleh pipetting yang
iPSCs/TGF-β1 suspensi (300 uL) ke matriks.
iPSCs/TGF-β1/alginate matriks (iPSCs/TGF-β1/Alginate)
konstruksi diinkubasi untuk 20 menit tambahan untuk memungkinkan
sel lampiran in vitro, dan kemudian komposit yang
unggulan ke piring budaya 24-baik dan dibudidayakan selama 12 jam.
Kondrosit normal dicerna, dihitung dan berlapis
dalam piring budaya 24-baik dengan kepadatan 1,25 × 105 sel dan
dikultur dalam medium chondrogenic selama 12 jam.
Setelah prosedur tersebut dilakukan, yang
Transwell insert (0,4 pM ukuran pori, Corning) yang berisi membangun iPSCs/TGF-β1/Alginate
itu dipasang ke
yang mengandung kondrosit dengan baik, yang digunakan
sebagai kelompok eksperimen (iPSCs/TGF-β1 / Alginat /
kondrosit). The co-kultur tumbuh di chondrogenic
media selama 14 hari.
Selain itu, kelompok paralel berikut adalah
dibudidayakan di media chondrogenic selama 14 hari: nontransfected
iPSCs / matriks alginat group (iPSCs / Alginat),
non-transfected iPSCs / matriks alginat / kondrosit group
(iPSCs / Alginat / kondrosit) dan iPSCs transfected /
alginat matriks kelompok (iPSCs / TGF-β1/Alginate) sesuai
sama prosedur (skematis tersedia dari
penulis atas permintaan).
Western blotting untuk TGF-β1
Untuk confi rm Kehadiran dari TGF-β1 dalam lentivirus-dimediasi
TGF-β1 ditransduksi iPSCs, western blotting dilakukan
menggunakan kelinci antibodi anti-TGF-β1 poliklonal (ab53169,
Abcam, Cambridge, Inggris). Protein diekstraksi dari
non-transfected dan transfected iPSCs, dan protein
konsentrasi ekstrak dinilai menggunakan Bradford
assay kit. Kepadatan optik pada 595 nm diukur
menggunakan spektrofotometer. Konsentrasi protein
adalah kurva standar yang diperoleh dari pengenceran serial
bovine serum albumin. Ekstrak sel, dinormalisasi untuk
total protein, diselesaikan dengan menggunakan polyacrylamide
elektroforesis gel dan elektroforesis ditransfer
ke membran nitroselulosa didukung. Setelah itu,
membran tersebut diblokir di 5% non-lemak susu di
Tris-buffered saline dengan Tween 0,1% (TBST) selama 3 jam
dan diinkubasi dengan antibodi primer (1:500) pada 4 ° C
semalam. Membran kemudian dicuci dengan TBST
tiga kali selama 10 menit masing-masing, diikuti dengan penambahan anti-
kelinci IgG (1:5000) dan chemiluminescence ditingkatkan
(ECL) visualisasi dari band.
Histologis analisis iPSCs-chondrogenic
diferensiasi
Semua sampel dikultur selama 14 hari dan fi xed di 4%
paraformaldehida (pH 7,4, Sigma-Aldrich) semalam di
suhu kamar, dan bagian yang diwarnai dengan toluidine
biru.
Analisis ekspresi mRNA menggunakan reverse
transkripsi-polymerase chain reaction (RT-PCR)
dan kuantitatif real-time PCR
RNA total diisolasi menggunakan Trizol (Invitrogen).
Konsentrasi RNA ditentukan dengan mengukur
absorbansi pada 260 nm dengan spektrofotometer.
Konvensional RT-PCR dilakukan dengan menggunakan superscript
Satu-Langkah RT-PCR system (Invitrogen). Kuantitatif
real-time PCR dilakukan dengan menggunakan SYBR hijau qPCR
Supermix UDG (Invitrogen) dan dianalisis dengan 7300
real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City,
CA, USA). Amplifi kation gen spesifik c dilakukan
menggunakan primer ditunjukkan pada Tabel 2
Ektopik tulang rawan pembentukan
Lima-minggu-tua BALB / c tikus telanjang (Shanghai Jiaotong
University School of Medicine) yang dibius
menggunakan Sumianxin (2 mL / kg, Pertanian Universitas,
Changchun, Cina) secara intraperitoneal. itu
kelompok berikut dikultur dalam media chondrogenic untuk
14 hari in vitro: iPSCs / group Alginat, iPSCs / Alginat /
kondrosit kelompok, kelompok iPSCs/TGF-β1/Alginate dan
iPSCs/TGF-β1/Alginate / kondrosit kelompok sesuai dengan prosedur di atas.
Kemudian, empat kelompok ditanamkan
subkutan ke daerah dorsal dari tikus. semua
hewan percobaan dilakukan sesuai dengan
pedoman hewan institusional. spesimen dari
masing-masing kelompok dipanen 6 minggu setelah implantasi.
Eksplan dipanen dari tikus fi xed, dehidrasi,
dan tertanam dalam paraffi n. Bagian yang mengalami
imunohistokimia analisis kolagen tipe II (diencerkan
pada 1:100, 53047, Abcam).
analisis statistik
Hasil dilaporkan sebagai mean ± SD. Nilai dengan P <0,05
dianggap tidak bisa statistik signifikan.
hasil
Histologis analisis normal dan osteoarthritic
tulang rawan yang diturunkan sel
AC Sehat dipamerkan biasanya empat lapisan sel utuh
termasuk, dangkal transisi, radial dalam, dan
dalam calcifi ed zona (Gambar 1AA), dan seragam-didistribusikan
proteoglikan sebagai komponen matriks ekstraseluler utama
(Gbr. 1Ab). Tulang rawan osteoarthritic menunjukkan hilangnya
organel sel dan adanya garis sel dalam beberapa sel, dan beberapa sel
nekrotik (Gambar 1BA) serta
hilangnya proteoglikan (Gbr. 1BB). kondrosit terisolasi
dari sehat AC dipamerkan putaran khas, poligonal
bentuk (Gambar 1CA) dan memiliki kelimpahan proteoglycan,
matriks ekstraseluler komponen utama dari kondrosit
(Gbr. 1Cb). Kebanyakan kontrasepsi oral memiliki bentuk memanjang (Gbr.
1DA)
dan dipamerkan kehilangan proteoglikan (Gbr. 1dB).
Karakterisasi kontrasepsi oral manusia memprogram
Tujuh hari setelah transduksi dengan pemrograman ulang empat
faktor, koloni dengan morfologi ESC-seperti yang terlihat.
Setelah dua minggu, koloni dengan morfologi ESC-seperti
yang besar dan bulat, dengan batas-batas yang jelas. Untuk rm confi
bahwa pemrograman ulang dari kontrasepsi oral pasien telah terjadi dan
bahwa iPSCs diduga adalah pluripotent, kita diuji dengan
ekspresi penanda ESC dibedakan oleh RT-PCR
dan imunositokimia. RT-PCR hasil terungkap
bahwa dua dari iPSCs manusia diduga menyatakan banyak
diperkirakan penanda dari hESCs dibeda-bedakan, termasuk
OCT-4, SOX-2, REX-1 dan NANOG, yang tidak
dinyatakan dalam iPSCs diduga lainnya (Gbr. 2A). dua dari
tiga koloni dipamerkan fosfatase alkali yang kuat
kegiatan dan ESC-spesifik diekspresikan c penanda permukaan
termasuk NANOG, SSEA-1, SSEA-4, TRA1-60, dan TRA1-81 (Gambar 2B,
gambar yang ditampilkan adalah koloni C1.
Sebuah gambar dari koloni C2 tersedia dari penulis
atas permintaan). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa manusia
iPSCs mengungkapkan penanda pluripotent dan berbagi serupa
ekspresi gen profi le dengan hESCs.
Multipotency kontrasepsi oral manusia memprogram
Selanjutnya, kami mengevaluasi apakah iPSCs manusia bisa
berdiferensiasi menjadi jenis sel dari semua tiga lapisan kuman in vitro
melalui EB-dimediasi diferensiasi. Para iPSCs dari
pasien osteoarthritic dibentuk bola-berbentuk EBS dengan tinggi
efisiensi siensi (Gambar 3AA) dan kemudian mudah dibedakan menjadi
sel dengan morfologi yang beragam. immunocytochemical
analisis dari confi EBS rmed bahwa iPSCs manusia bisa
berdiferensiasi menjadi sel-sel dari semua tiga lapisan kuman, seperti
dibuktikan dengan ekspresi α-foetoprotein (AFP,
endoderm penanda), nestin (penanda ektoderm), dan desmin
(mesoderm marker) (Gambar 3AB, c, d).
Untuk menginduksi keturunan-diarahkan diferensiasi manusia
iPSCs in vitro, sebelumnya dilaporkan protokol diikuti
untuk diferensiasi endoderm, mesoderm dan ektoderm,
dan penanda diferensiasi terkait diuji oleh
konvensional RT-PCR (Miki et al., 2005) (Gambar 3B). manusia
iPSCs diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi pankreas yang
(endodermal) keturunan, dan sel dibedakan menyatakan PDX-1, PAX-6,
NKX2.2, dan insulin. manusia iPSCs
diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi jantung (mesodermal)
silsilah, dan sel dibedakan menyatakan gata-4,
NKX2.5, MLC-2A, dan MLC-2V. Akhirnya, manusia iPSCs
diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi saraf (ectodermal)
silsilah, dan dibedakan sel yang dikemukakan neuralrelated
spidol, seperti NSE, NF-M, MBP, GAD, dan
nestin. Data ini menunjukkan bahwa iPSCs manusia dapat
diinduksi langsung untuk berdiferensiasi menjadi jenis sel ketiga
kuman lapisan.
Pengamatan histologi (Gambar 3C, gambar yang ditampilkan adalah
dari koloni C1, gambar koloni C2 tersedia
dari penulis atas permintaan) menunjukkan bahwa teratoma
memiliki jaringan dari tiga lapisan kuman, termasuk gutlike
dan pernapasan seperti epitel (endoderm), tulang dan
otot jaringan (mesoderm), dan jaringan saraf (ektoderm).
Dalam diferensiasi vitro chondrogenic dari
memprogram kontrasepsi oral manusia
Mikroskop fluoresensi menunjukkan bahwa iPSCs muncul
hijau pada hari ke-5 (Gambar 4AA), sedangkan lentivirus-dimediasi
TGF-β1 iPSCs ditransduksi muncul merah (Gambar 4AB) pada hari
5 dan 14 hari (Gbr. 4ac). Peningkatan TGF-β1 ekspresi
para iPSCs ditransduksi itu confi rmed menggunakan western blotting
(Gbr. 4AD).
Analisis histologi menunjukkan bahwa iPSCs/TGF-β1 /
Alginat / kondrosit memiliki morfologi bulat, suatu
jelas rawan kekosongan dan ekstraseluler sulfat padat
matriks yang ternoda kuat untuk toluidin biru dibandingkan dengan
kelompok yang lain (Gambar 4B).
Real-time PCR dilakukan untuk menentukan status
diferensiasi iPSC pada tingkat transkripsi. Seperti yang bisa
terlihat pada Gambar. 4C, pada hari ke 14, ekspresi tulang rawan
spidol kolagen II, dan aggrecan COMP adalah signifi kan
lebih tinggi di iPSCs / TGF-β1/Alginate/chondrocytes dibandingkan
mereka kontrol budaya masing-masing termasuk iPSCs / Alginat,
iPSCs / Alginat / kondrosit dan iPSCs/TGF-β1/Alginate
(P <0,05), sementara itu kurang dari itu dalam positif
kelompok kontrol (kondrosit) (P> 0,05). ekspresi
faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF), penanda
kondrosit degeneratif, tinggi pada iPSCs / Alginat
dan iPSCs/TGF-β1/Alginate, sementara itu hampir nol
untuk iPSCs / Alginat / kondrosit dan iPSCs/TGF-β1 /
Alginat / kondrosit.
Dalam kondrogenesis vivo kontrasepsi oral manusia memprogram
Imunohistokimia pada 6 minggu mengungkapkan bahwa iPSCs
dalam kelompok berikut termasuk iPSCs / Alginat /
kondrosit, iPSCs/TGF-β1/Alginate dan iPSCs/TGF-β1 /
Alginat / kondrosit yang jelas dikelilingi oleh kolagen II-positif matriks
ekstraseluler, dan iPSCs bernoda
kuat untuk kolagen II di Alginat iPSCs/TGF-β1 / /
kondrosit kelompok dibandingkan dengan kelompok lain (Gbr. 5).
diskusi
The avascularity bawaan, cellularity rendah dan sel yang rendah
omset jaringan AC merupakan rintangan utama untuk
regenerasi alami menyusul cedera, karena itu,
pengembangan pengobatan yang memungkinkan sukses
regenerasi lesi tulang rawan untuk menghindari lanjut
degenerasi cacat artikular fokus utama merupakan
Tantangan (Giovannini et al., 2010). Banyak penelitian telah
meneliti kemampuan berbagai isyarat untuk mengganti atau
memperbaiki jaringan tulang rawan yang sakit atau rusak (Lin et al.,
2008; Goepfert et al, 2010;. Ahmed et al, 2011).. baru
Perkembangan dalam kedokteran regeneratif telah didorong
oleh penemuan iPSCs, yang didasarkan pada kapasitas mereka
berkembang biak dalam keadaan dibeda-bedakan, potensi mereka
untuk berdiferensiasi menjadi berbagai garis keturunan yang berbeda, dan
kemungkinan mereka menjadi terapi pribadi, memberikan
alternatif menarik untuk penggunaan sel induk dalam jaringan
engineering (Kusuma dan Gerecht, 2010). Dalam studi ini,
kami telah berhasil memprogram kontrasepsi oral manusia menjadi penuh
fungsional iPSCs oleh lentivirus-dimediasi transduksi dari empat faktor,
transkripsi Oct4 Sox2, KLF4, dan c-MYC. The iPSCs manusia dari
kontrasepsi oral ditampilkan hESC seperti
morfologi, mengungkapkan gen hESC penanda dan dimiliki
kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi semua tiga lapisan kuman in vitro
dan in vivo. Namun, masih belum jelas apakah OCderived
iPSCs dapat digunakan sebagai sumber sel tulang rawan rekayasa jaringan.
Saat ini, dua metode yang efektif digunakan untuk menginduksi
diferensiasi sel induk menjadi kondrosit:
penerapan faktor pertumbuhan dan co-budaya. Itu
Strategi tradisional telah menambah pertumbuhan spesifik
Faktor langsung ke media sel induk dibudidayakan dalam
3D lingkungan. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa hESCderived
EBS dalam hidrogel 3D mungkin membedakan
terhadap keturunan chondrogenic dalam ned defi kimia
media chondrogenic ditambah dengan TGF-β1 (Hwang
et al, 2006.). Baru-baru ini, hESCs dikultur dalam medium dengan
TGF-β1 menghasilkan tulang rawan-spesifik c matriks dan menunjukkan
Bukti potensi chondrogenic tanpa pembentukan EB
(Nakagawa et al, 2009.). Baru-baru ini, Gong et al. (2010)
menunjukkan bahwa micromass budaya hESCs pluripotent
mengalami langsung, cepat, progresif, dan secara substansial seragam
chondrogenic diferensiasi dalam medium yang mengandung BMP-2
ditambah TGF-β1. Semua ndings fi menunjukkan bahwa TGF-β1 memiliki
cant signifikan berpengaruh pada diferensiasi chondrogenic
dari ESCs manusia dan tikus. Namun, karena TGF-β1
protein tidak stabil karena pendek paruh in vitro, gen
pengiriman mungkin diperlukan untuk memberikan ekspresi protein
untuk waktu yang lama pada konsentrasi yang efektif (Chen et al.,
2011). Dalam penelitian kami, lentiviral-dimediasi TGF-β1 digunakan
untuk menginduksi diferensiasi iPSCs ke kondrosit.
RT-PCR Hasil penelitian menunjukkan ekspresi tulang rawan yang terkait
gen, termasuk kolagen II, aggrecan, dan COMP, dalam
TGF-β1-ditransduksi OC-berasal iPSCs, menunjukkan bahwa
mereka memperoleh potensi chondrogenic. Namun, VEGF
Ekspresi juga terdeteksi dalam TGF-β1-ditransduksi
OC-berasal iPSCs, menunjukkan bahwa TGF-β1-ditransduksi
IPSCs OC-diturunkan memiliki kecenderungan degeneratif. Pasien /
penyakit-spesifik c iPSCs menunjukkan beberapa fitur penyakit
rekapitulasi dalam kultur jaringan setelah diferensiasi diarahkan
dari iPSCs (Saha dan Jaenisch, 2009, Ye et al, 2009;. Liu et
al, 2010.), dan adalah mungkin bahwa proses serupa terjadi
dalam penelitian ini. VEGF ditemukan di zona hipertrofik
tulang rawan di lempeng pertumbuhan dan memainkan peran integral
dalam
endokhondral ossifi kation dan pertumbuhan longitudinal
Kerangka (Gerber et al, 1999;.. Pufe et al, 2004). VEGF adalah
sebagian besar menurunkan regulasi pada orang dewasa AC, tapi ini
angiogenik
Faktor diungkapkan oleh kondrosit sakit, seperti yang
di OA (Pufe et al., 2001). Oleh karena itu, penghambatan VEGF
Ekspresi kemungkinan besar akan berkontribusi pada diferensiasi
OC-berasal iPSCs ke kondrosit.
Co-budaya adalah metode lain yang digunakan untuk
diferensiasi sel induk menjadi kondrosit. Itu
Keuntungan utama dari co-budaya adalah bahwa autokrin
dan parakrin faktor disekresikan oleh satu jenis sel mudah
berinteraksi dengan jenis lain dari sel tanpa langsung sel-sel
kontak, sehingga meniru, sampai batas tertentu, secara in vivo
tulang rawan lingkungan di mana sel-sel yang ditransplantasikan adalah
dikelilingi oleh kondrosit pribumi yang berada dalam
jaringan (Mo et al, 2009;.. Aung et al, 2011). Selain itu,
memungkinkan untuk crosstalk seluler, instruksi, dan stabilisasi fenotipe
selular melalui kontak fisik langsung antara
reseptor permukaan sel yang berbeda, yang dapat menyebabkan
untuk transduksi lebih efisien dari sinyal molekul
koordinasi chondrogenic diferensiasi (Heng et al.,
2004). Co-kultur manusia MSC dengan manusia ACS memiliki
telah ditunjukkan untuk meningkatkan sifat mekanik dan
tulang rawan khusus ECM konten jaringan-rekayasa
tulang rawan terbentuk dari MSC unggulan dalam asam hyaluronic
(HA) dan hidrogel untuk mengurangi ekspresi kolagen
Tipe X oleh MSC, sebuah penanda penting hipertrofi MSC
(Bian et al., 2011). Co-kultur kuda MSC dengan matang
ACS meningkatkan ekspresi gen spesifik tulang rawan-c dan
menghasilkan produksi yang lebih homogen dalam ECM
tulang rawan co-kultur yang baru terbentuk (Lettry et al., 2010).
Selain itu, potensi chondrogenic dari hESCs bisa
ditingkatkan dalam kepadatan tinggi micromass pelet co-kultur
dengan kondrosit manusia iradiasi, dan co-budaya
mengakibatkan penurunan signifi kan potensi osteogenik
(Bigdeli et al., 2009). Dalam penelitian kami, diferensiasi OCderived
iPSCs diinduksi oleh co-kultur dengan ACS,
seperti yang ditunjukkan oleh ekspresi tulang rawan-spesifik c
gen. Meskipun tingkat tulang rawan-spesifik gen c di
co-budaya sistem lebih rendah daripada di transfected
OC-berasal iPSCs, VEGF ekspresi tidak terdeteksi,
mungkin karena penghambatan angiogenesis endogen
oleh faktor-faktor, termasuk metastatin, hadir dalam tulang rawan dewasa
jaringan (Musa et al, 1999;.. Liu et al, 2001).
Salah satu pendekatan yang mungkin untuk mengatasi individu
kekurangan dari sistem gen-transfer dan co-budaya di
diferensiasi OC-berasal iPSCs ke kondrosit
akan mencampur kondrosit manusia dengan TGF-β1-
ditransduksi OC-berasal iPSCs dalam sistem co-budaya.
Dalam co-budaya sistem kami, co-kultur yang TGF-β1-
iPSCs ditransduksi OC-diturunkan dengan ACs mempromosikan
diferensiasi OC-berasal iPSCs ke kondrosit oleh
meningkatkan ekspresi gen spesifik tulang rawan-c, menghambat
VEGF berekspresi dan mencegah degenerasi
kondrosit.
Untuk lebih memvalidasi kapasitas chondrogenic dari
memprogram kontrasepsi oral manusia, dalam studi in vivo dilakukan. di
Pembentukan tulang rawan ektopik bukti, langsung chondrogenic
diferensiasi dikumpulkan oleh imunohistokimia
studi kolagen II. Kolagen II, yang merupakan karakteristik
dari matriks tulang rawan, hadir pada tingkat yang lebih tinggi dalam
iPSCs/TGF-β1/Alginate/chondrocytes kelompok, dibandingkan
dengan yang di iPSCs / Alginat / group kondrosit dan
iPSCs/TGF-β1/Alginate kelompok. pemeriksaan histologis
dari iPSCs mengungkapkan pembentukan tulang rawan jelas tissue
dihasilkan dalam budaya co-TGF-β1-transfected OCderived
iPSCs dengan ACS dalam matriks alginat pada 6 minggu.
kesimpulan
Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahwa iPSCs dapat
dihasilkan dari kontrasepsi oral menggunakan defi faktor ned dan bahwa
in vitro co-budaya TGF-β1-transfected OC-diturunkan
iPSCs dengan ACS dalam hasil matriks alginat di signifi kan
peningkatan kondrogenesis dari iPSCs seperti yang ditunjukkan oleh
ekspresi gen profi les dan pewarnaan histologis.
Selain itu, dalam penelitian in vivo juga mengungkapkan jelas
jaringan tulang rawan yang terbentuk dalam budaya co-TGF-β1-transfected
iPSCs OC-diturunkan dengan ACs dalam matriks alginat.
Strategi combinational akan mempromosikan penggunaan iPSCderived
jaringan dalam rekayasa jaringan.
Ucapan Terima Kasih
Karya ini didukung oleh Program Inovasi
Shanghai Komisi Pendidikan Kota (No.
09YZ107) dan Program Penelitian Intramural dari
National Institutes of Health, National Cancer Institute.
Alginat adalah polimer linier organik polisakarida yang terdiri dari monomer α-L asam guluronat
(G) dan β-D asam manuronat (M), atau dapat berupa kombinasi dari kedua monomer tersebut.
[1] Alginat dapat diperoleh dari ganggang coklat yang berasal dari
genus Ascophyllum, Ecklonia, Durvillaea,Laminaria, Lessonia, Macrocystis, Sargassum,
dan Turbinaria.[1]
Lentivirus adalah salah satu genus virus dari famili Retroviridae yang dapat menyebabkan
penyakit pada manusia dan hewan mamalia.[1][2] Istilah Lentivirus berasal dari bahasa Latin "lenti"
yang berarti "lambat". Pemberian nama Lentivirus dikarenakan virus-virus tersebut dapat
menyebabkan infeksi secara lambat pada inang tertentu.[3] Yang dimaksud dengan infeksi lambat
adalah virus memerlukan waktu inkubasi yang lama (dalam hitungan bulanan atau tahunan)
untuk menyebabkan penyakit dan hal ini diikuti dengan kerusakan pada organ atau jaringan
tertentu hingga menyebabkan efek yang mematikan.[3] Genus ini memiliki beberapa ciri khusus
yaitu bersifat non-onkogenik (tidak menyebabkan kanker), memiliki selubung (envelope),
berukuran 100-130 nm, dan mempunyai materi genetik (genom) berbentuk RNA utas tunggal.[2] Salah satu anggota dari genus Lentivirus yang paling banyak dikenal adalah HIV.[2]
[sunting]Ciri-ciri
Dari segi biologis, Lentivirus hanya menginfeksi inang yang spesifik dan pada sebagain sel
tertentu dapat menyebabkan peleburan dan perbesaran sel yang disebut efek sitofatik. Infeksi
yang ditimbulkan dapat berupa infeksi laten atau persisten. Pada sel yang terinfeksi, terjadi
akumulasi atau penumpukan DNA komplemen (cDNA) virus yang berbentuk linear dan sirkuler.
Proliferasi adalah pertumbuhan atau berkembangbiakan pesat untuk menghasilkan jaringan baru, bagian, sel, atau keturunan
Teratoma adalah sebuah tumor jinak yang terbentuk dari sel germinal yangabnormal.
Teratoma juga dapat terbentuk dari sel-sel pluripoten normal seperti sel
induk embrionik ketika sel-sel itu disuntikkan ke tikus imunodefisiensi.
JARINGAN PENGUAT
Jaringan penguat disebut juga jaringan penyokong atau jaringan penunjang.
Yang termasuk jaringan penguat adalah :
1. Jaringan Ikat
Jaringan ikat terdiri dari serabut, sel-sel dan cairan ekstra seluler.Cairan ekstra seluler dan serabut disebut matriks.Fungsi jaringan ikat adalah mengikat atau mempersatukan jaringan-jaringan menjadi organ dan berbagai organ menjadi sistem organ, menjadi selubung organ dan melindungi jaringan atau organ tubuh.
Berdasarkan struktur dan fungsinya jaringan ikat dibedakan menjadi dua:
a. Jaringan ikat longgar
Ciri-ciri : sel-selnya jarang dan sebagian jaringannya tersusun atas matriks yang mengandung serabut kolagen dan serabut elastis.Jaringan ikat longgar terdapat di sekitar organ-organ, pembuluh darah dan saraf.
Fungsinya untuk membungkus organ-organ tubuh, pembuluh darah dan saraf.
b. Jaringan ikat padat
Nama lainnya jaringan ikat serabut putih, karena terbuat dari serabut kolagen yang berwarna putih. Jaringan ini terdapat pada selaput urat, selaput pembungkus otot, fasia, ligamen dan tendon.
Fasia adalah jaringan ikat berbentuk lembaran yang menyelimuti otot.Ligamen adalah jaringan ikat yang berperan sebagai penghubung antar tulang.Tendon adalah ujung otot yang melekat pada tulang. Fungsinya untuk menghubungkan berbagai organ tubuh seperti otot dengan tulang-tulang, tulang dengan tulang, juga memberikan perlindungan terhadap organ tubuh.
2. Jaringan Tulang Rawan (Kartilago)
Jaringan tulang rawan pada anak-anak berasal dari jaringan embrional yang disebut mesenkim, pada orang dewasa berasal dari selaput tulang rawan atau perikondrium yang banyak mengandung kondroblas atau pembentuk sel-sel tulang rawan. Fungsinya untuk menyokong kerangka tubuh.
Ada 3 macam jaringan tulang rawan :
a.Kartilago hialin
Matriksnya bening kebiruan. Terdapat pada permukaan tulang sendi, cincin tulang rawan pada batang tenggorok dan cabang batang tenggorok, ujung tulang rusuk yang melekat pada tulang dada dan pada ujung tulang panjang.Kartilago hialin merupakan bagian terbesar dari kerangka embrio juga membantu pergerakan persendian, menguatkan saluran pernafasan, memberi kemungkinan pertumbuhan memanjang tulang pipa dan memberi kemungkinan tulang rusuk bergerak saat bernafas.
Gbr. Kartilago hialin (dari embrio babi).
b.Kartilago fibrosa
Matriksnya berwarna gelap dan keruh. Jaringan ini terdapat pada perekatan ligamen-ligamen tertentu pada tulang, persendian tulang pinggang, pada calmam antar ruas tulang belakang dan pada pertautan antar tulang kemaluan kiri dan kanan. Fungsi utama untuk memberikan proteksi dan penyokong.
Gbr. Kartilago fibrosa (dari tulang lutut manusia).
c.Kartilago elastik
Matriksnya berwarna keruh kekuning-kuningan. Jaringan ini terdapat pada dawn telinga, epiglottis, pembuluh eustakius dan laring.
3. J aringan Tulang
Jaringan tulang terdiri dari sel-sel tulang atau osteon yang tersimpan di dalam matriks, matriksnya terdiri dari zat perekat kolagen dan endapan garam-garam mineral terutama garam kalsium (kapur). Tulangmerupakan komponen utama dari kerangka tubuh dan berperan untuk melindungi alat-alat tubuh dan tempat melekatnya otot kerangka.
Tulang dapat dibagi menjadi 2 macam :
a. Tulang keras, bila matriks tulang rapat dan padat.Contoh : tulang pipa.
b. Tulang spons, bila matriksnya berongga.Contoh : tulang pendek.
Blot Western adalah sebuah metode untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan. Imunoblot
menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli atau perubahan oleh jarak
polipeptida atau oleh struktur 3-D protein. Protein tersebut dikirim ke membran, di mana mereka
dideteksi menggunakan antibodi untuk menargetkan protein.