BAB IPENDAHULUAN

Kromatografi berasal dari bahasa Yunani Kromatos yang berarti warna dan Graphos yang berarti menulis. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusun cuplikan antara dua fasa. Satu fasa tinggal pada system dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya, dinamakan fasa gerak, memperkolasi melalui celah-celah fasa diam. Gerakan fasa menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan.Ada banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sederhana. Kromatografi ada bermacam-macam diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, penukar ion, penyaringan gel dan elektroforesis. Namun dalam makalah ini kita akan mengulas suatu teknik kromatografi yaitu kromatografi penyaringan gel.Kromatografi gel merupakan metode kromatografi baru, meliputi kromatografi eksklusi, kromatogeafi penyaring gel, dan kromatografi permeasi gel. Kromatografi ini paling mudah dimengerti dan paling mudah dikerjakan. Selain kesederhanaannya, teknik ini sangat berguna. Metode ini dapat digunakan terhadap suatu cuplikan yang larut dan penggunaan utama kromatografi gel biasanya dalam salah satu dari tiga hal ini. Pertama, kromatografi gel sangat berguna untuk untuk pemisahan spesies dengan berat molekul tinggi (BM >2000), terutama yang tak terionkan. Selain dari resolusi dari setiap makromolekuler seperti protein dan asam nukleat, kromatografi gel dapat digunakan untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari polimer sintetis. Kedua, campuran sederhana dapat dipisahkan secara mudah dengan kromatografi gel, terutama jika penyusun campuran itu memiliki berat molekul yang sangat berbeda. Untuk hal ini dapat dilakukan dalam jumlah besar. Ketiga, kromatografi gel sangat cocok untuk kerja awal, pemisahan eksplorasi dari cuplikan yang tak diketahui. Pemisahan ini memberikan gambaran isi cuplikan, sehingga dapat diketahui dengan cepat apakah cuplikan itu memiliki berat molekul rendah atau berat molekul tinggi.Kekurangan yang paling menonjol adalah kapasitas puncak yang terbatas. Ini berarti hanya ada sedikit pita yang dapat dihubungkan dengan kromatogram total, karena kromatogram cukup pendek semua senywa terelusi sebelum to. Pada kromatografi gel jarang terlihat lebih dari enam pita pada satu kromatogram. Ini berarti bahwa kromatografi gel biasanya tidak dapat memisahkan secara sempurna suatu cuplikan kompleks, tanpa pemisahan lebih lanjut dengan metode lain. Kekurangan kedua adalah tidak dapat memisahkan senyawa-senyawa yang mempunyai ukuran hampir sama. Hal ini menyingkorkan kromatografi gel dalam banyak masalah pemisahan senyawa yang penting, termasuk pemisahan isomer. Perbedaan pada kromatografi gel adalah prinsip pemisahan yang berbeda dengan yang digunakan metode kromatografi lain. Konsep factor pemisahan , dan factor kapasitas k tidak bisa digunakan. Susunan fasa gerak juga relative tidak penting pada kromatografi gel.

BAB IIPEMBAHASAN

A. PENGENALAN DAN PEMISAHAN KROMATOGRAFI FILTRASI GELKromatografi merupakan suatu teknik purifikasi dimana komponen dari sampel dipisahkan berdasarkan kemampuan masing-masing komponen tersebut untuk berinteraksi dengan fase gerak (mobile phase) dan fase diam (stationary phase) yang dilalui sampel. Walaupun saat ini telah tersedia berbagai tipe kromatografi, pada dasarnya semua memiliki prinsip pemisahan yang sama (Shetty et al. 2006).Kromatografi filtrasi gel yaitu metode pemisahan protein berdasarkan perbedaan ukuran molekul dari suatu protein. Proses pemisahan menggunakan matriks gel berpori yang dipak di dalam kolom dan dikelilingi oleh solven. Sampel yang mengandung campuran molekul besar dan kecil dilewatkan ke dalam kolom. Molekul protein yang lebih kecil dapat menembus ke dalam pori-pori butiran dan karenanya ia akan tertahan selama aliran ke bawah kolom. Molekul protein yang besar tidak dapat menembus ke dalam pori-pori butiran dan melewati kolom lebih cepat. Molekul protein yang berukuran menengah akan mengalir ke bawah pada kecepatan sedang tergantung pada kemampuannya menembus butiran (Lehninger, 1982).

Berdasarkan Ahmed (2005) fase diam dapat berbentuk padat, gel, cair atau campuran padat dan cair, sementara fase gerak dapat berbentuk cair atau gas dan mengalir melewati fase diam. Semua metode kromatografi bekerja dengan dasar keseimbangan yang dicapai antara fase diam dan fase gerak. Kromatografi filtrasi gel sangat cocok untuk biomolekul yang sensitif terhadap perubahan pH, konsentrasi ion logam atau ko-faktor dan kondisi lingkungan yang keras. Pemisahan dapat dilakukan karena adanya bahan-bahan penting yaitu ion atau kofaktor, detergen, urea, guanidin hidroklorida, pada konsentrasi tinggi maupun konsentrasi rendah. suhu 37 oC atau di ruang dingin sesuai dengan persyaratan dari percobaan. Protein murni dapat dikumpulkan dalam berbagai jenis buffer.Menurut Hagel (1998) kromatografi kolom gel filtrasi seringkali digunakan sebagai langkah awal sebelum dilakukan purifikasi lebih lanjut terhadap sampel dengan teknik adsorptif. Selain itu, gel filtrasi juga digunakan pada tahap akhir purifikasi untuk menghilangkan kontaminan yang masih tersisa yang kemungkinan memiliki muatan sama dengan protein target.Pada saat ini kolom-kolom filtrasi gel kinerja-tinggi yang mengandung manik-manik kaku dalam polimer berpori telah tersedia untuk penentuan analit berbobot molekul tinggi. Mekanisme retensi dalam kromatografi eksklusi-ukuran didasarkan pada sejauh mana suatu analit memasuki pori-pori di dalam fase diam.

Seluruh molekul terbesar dikeluarkan dari ruang internal kolom dan yang pertama terelusi dari kolom tersebut. Tersedia kolom-kolom dengan ukuran pori yang berbeda. Untuk menentukan bobot molekul, kolom-kolom tersebut dikalibrasi dengan baku polimer dengan bobot molekul yang diketahui, meskipun koreksi berkaitan dengan viskositas analit harus dilakukan jika salah satu tipe polimer digunakan untuk mengalibrasi suatu kolom yang digunakan untuk menentukan bobot molekul suatu tipe polimer yang berbeda karena perbedaan dalam bentuk tiga dimensi. (Watson, 2005)

Fraksinasi resolusi tinggi oleh filtrasi gel sangat cocok untuk polishing langkah terakhir dalam skema pemurnian. Monomer dapat dipisahkan dari agregat dan sampel dapat ditransfer ke buffer yang cocok untuk penyimpanan. Penyaringan gel dapat digunakan langsung setelah salah satu teknik kromatografi seperti pertukaran ion, chromatofocusing interaksi hidrofobik atau afinitas karena komponen dari buffer apapun tidak akan mempengaruhi pemisahan akhir.Gambar dibawah ini menunjukkan profil elusi teoritis (kromatogram) dari fraksinasi resolusi tinggi dalam filtrasi gel. Molekul yang tidak masuk matriks dielusi dalam volume kosong, Vo saat masuk langsung melalui kolom pada kecepatan yang sama sebagai aliran buffer. Kolom dikemas dengan baik,, pada volume kosong setara dengan sekitar 30% dari total volume kolom. Molekul dengn akses sebagain pada pori-pori elusi matriks dari kolom mengalami penurunan ukuran. Molekul kecil seperti garam yang memiliki akses penuh ke pori-pori bergerak ke bawah kolom, tetapi tidak terpisah satu sama lain. Molekul-molekul ini biasanya mengelusi sebelum satu volume total kolom (Vt) dari buffer telah melewati kolom.

DAPUS KU :

Ahmed H. 2005. Principles and Reaction of Protein Extraction, Purification, and Characteriztion. Florida: CRC Press.Hagel L. 1998. Gel Filtration Chromatography. Di dalam: Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons, Inc.Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta : Penerbit ErlanggaShetty K, Paliyath G, Pometto A, Levin RE. 2006. Food Biotechnology Edisi 2. Suite: Taylor and Francis Groups.Watson, David G. 2005. Analisis Farmasi Edisi 2. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC