1.Genetic modification (GM) Sering disebut juga “gene technology” atau “genetic engineering” adalah suatu teknik modern biotechnology. GM adalah suatu proses perubahan genetik yang dibuat dari organisme tertentu. Organisme yang diproduksi dengan cara ini dikenal sebagai genetically modified organisms (GMO).

Di dalam dunia Pertanian: diterapkan untuk perbaikan sifat-sifat tanaman seperti hasil yang tinggi, nilai gizi yang lebih baik, tahan terhadap hama dan penyakit, serta menambah kualitas pengolahan makanan.

Jawaban : Telah lama para pemulia tanaman berhasil memproduksi tanaman dengan sifat-sifat tertentu. Namun karena masing-masing tanaman mempunyai puluhan hingga ribuan gen, mka proses breeding secara tradisional sangat memakan waktu dan kurang akurat. Dengan bioteknologi ilmuan dapat dpt mengidentifikasi gen dg cepat.

Melalui GM, satu sifat dapat ditransfer ke suatu tanaman untuk mendapatkan sifat tertentu yang menguntungkan. Misalnya insect resistance or herbicide tolerance dari tanaman dan organisme lain dapat disisipkan ke dalam suatu tanaman penting. Shgg dapet mengurangi kerugian tanaman dan pemakaian pestisida.

Terdapat 4 pokok pnelitian dan aplikasi plant genetic engineering for resistance to plant pathogens: a.Enhancing resistance with plant genes (Gen tanaman tahan dan gen yang menunujukkan reaksi tahan diidentifikasi dan direkayasakan ke dalam tanaman untuk melindunginya dari penyakit tanaman)

b.Pathogen derived resistance: Tanaman dapat dilindungi dari penyakit dengan transgenes (gen yang direkayasa ke dalam tanaman) yang berasal dari patogen itu sendiri.

c. Antimicrobial proteins: peptida dan protein yang bersifat antimicrobial yang dihasilkan oleh tanaman yang berpotensi untuk memperkuat ketahan tanaman terhadap jamur dan bakteri patogen.

d. Plantibodies: Meskipun tanaman mempunyai mekanisme untuk melindungi dirinya dari serangan patogen, tapi tak seperti hewan yang mempunyai sistem kekebalan. Dengan GM, tanaman dapat direkayasa untuk mengekspresikan antibodi terhadap suatu protein penting dalam patogenesis sehingga menghasilkan suatu bentuk ketahanan terhadap patogen

2.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR pada dasarnya adalah penggandaan/ replikasi DNA dengan bantuan enzim polimerase dan primer yang sesuai dengan DNA target. Diagnosis dengan PCR mempunyai sensitifitas 100 kali lebih tinggi dibandingkan dengan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam melakukan PCR 1.Pemilihan/desain primer

Sepasang primer merupakan oligonukleotida pendek (+20 nukleotida) yang dibuat menggunakan software analisis DNA berdasarkan informasi sekuen suatu organisme. Primer spesifik dibuat khusus untuk mendeteksi satu spesies atau strain dari suatu organisme, sedangkan primer degenerate atau universal dibuat untuk mendeteksi organisme antar spesies dalam satu genus hingga lintas familia (Gibbs dan Mackenzie, 1997). Primer yang baik adalah primer yang bereaksi hanya dengan sekuen target yang akan diamplifikasi saja.

2.Pemilihan enzim polymerase

Keberhasilan proses PCR sangat ditentukan oleh jenis enzim polymerase yang digunakan. Enzim polimerase yang kuat mampu memberikan hasil amplifikasi DNA target yang panjang dan spesifik.

3.Optimasi ekstraksi DNA atau RNA

Optimasi ekstraksi DNA atau RNA sangat diperlukan untuk mendapatkan sediaan DNA atau RNA yang murni. Tingkat kemurnian DNA atau RNA akan menentukan keberhasilan dalam deteksi virus tanaman khususnya RTV. Amplifikasi PCR dapat terhambat oleh adanya inhibitor di dalam ekstrak tanaman, misalnya senyawa fenolik tertentu dan polisakarida

4.Optimasi reaksi PCR Tiga langkah utama dalam reaksi PCR adalah a) pemisahan DNA target menjadi helaian tunggal, 2) penempelan primer yang spesifik, dan 3) ekstensi primer menggunakan DNA polimerase (Saiki et al., 1988). Langkah ini diulang 30 - 45 kali, sehingga menghasilkan sejumlah fragmen DNA dengan ukuran yang ditentukan oleh dua primer. Proses optimasi diperlukan untuk menentukan kondisi optimum campuran reaksi PCR terutama konsentrasi DNA, primer dan enzim polymerase, kondisi suhu penempelan primer dan jenis mesin PCR yang digunakan.

DNA Sequencing

Analisis Phylogenetic Tree yang menggambarkan hubungan kekerabatan RTBV dengan lainnya

Analisis Phylogenetic Tree yang menggambarkan hubungan kekerabatan RTSV dengan lainnya

Untuk melakukan identifikasi virus sampai dengan level spesies diperlukan teknologi lanjutan menggunakan teknik sekuensing DNA. DNA hasil analisis PCR dimurnikan kemudian dapat secara langsung disekuen atau dilakukan kloning di dalam plasmid vektor dan plasmid yang mengandung DNA insert sebagai bahan untuk disekuen. DNA hasil sekuensing harus dianalisis terlebih dahulu menggunakan software analysis DNA untuk menentukan urutan nukleotida atau asam amino. Urutan nukleotida maupun asam amino dapat dibandingkan dengan nukleotida atau asam amino yang telah ada di dalam database Genbank sehingga dapat diketahui spesies virus yang didentifikasi. Perbandingan nukleotida dan asam amino dapat digunakan untuk menentukan hubungan kekerabatan antara virus yang disekuen dengan virus sejenis yang sudah ada di dalam Genbank melalui analisis filogenetic tree.

RFLP

RFLP merupakan salah satu solusi untuk mengidentifikasi virus tanpa harus melakukan sekuensing. RFLP telah banyak digunakan untuk menentukan keragaman atau membedakan strain dalam banyak sampel virus tanaman, termasuk RTV dari lapangan

Setelah mengetahui urutan DNA suatu virus dari hasil sekuensing, selanjutnya dapat dipetakan enzim rekstriksi yang ada di dalam DNA target PCR. Dengan memilih enzim restriksi tertentu maka DNA hasil PCR dapat diotong sehingga menghasilkan pola potongan seperti yang diharapkan. Pada dasarnya teknik ini merupakan gabungan antara PCR dan RFLP sehingga sering disebut PCR-RFLP. Prinsip dasarnya adalah pemotongan untaian DNA hasil PCR dengan menggunakan satu atau lebih enzim restriksi sehingga akan diperoleh pita-pita polimorfis bila divisualisasi di dalam gel elektroforesis

tambahan

Tungro disebabkan oleh infeksi ganda dua jenis virus yang berbeda yaitu Rice tungro bacilliform virus (RTBV) dan Rice tungro spherical virus (RTSV)

Proses PCR berjalan berdasarkan cara replikasi DNA dengan bantuan enzim DNA polimerase dan perubahan sifat fisik DNA terhadap suhu yang terjadi secara simultan dari primer yang komplementer dengan DNA target (Innis et al., 1990). Teknik PCR menjadi dasar deteksi virus tanaman, meskipun teknik lain seperti enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) juga masih penting dan banyak digunakan, namun PCR mempunyai sensitifitas yang lebih tinggi.

PLANT TISSUE CULTURE Perbanyakan tanaman dari: protoplas, sel, jaringan, organ, maupun tanaman itu sendiri

yang ditumbuhkan pada suatu lingkungan yang bebas dari mikroorganisme/steril, misalnya nutrien yang steril didalam suatu tabung reaksi dll. Ptc biasanya digunakan untuk perbanyakan tanaman dan penyediaan tanaman sehat:

… eliminasi virus dari tanaman terinfeksi (sakit).

Metode Tissue Culture untuk Eradikasi Virus

1.Inkubasi tanaman atau kultur pada suhu yang relatif tinggi (32-40o C) dikombinasikan dengan pemotongan yang sangat kecil ujung tunas.

2.Menggunakan meristem apikal yang pada umumnya bebas virus, namun agak sulit dalam menumbuhkannnya.

3.Dapat juga menggunakan satu atau dua primordia daun, lebih mudah penumbuhannya.

FUSI PROTOPLAS

Protoplast Culture Pemisahan secara Enzymatik dari selulose dinding sel utama yang menyelubungi sel tanaman akan menghasilkan sebuah protoplast. Apabila protoplast dikulturkan, dinding sel baru akan terbentuk dan menjadi sel tanaman seperti semula.

Namun demikian, selama periode protoplast yang kehilangan dinding sel, terdapat kemungkinan:

1. Penambahan bahan genetik asing ke dalam protoplast,

2. Dapat difusikan dengan protoplast lain dari spesies atau kultivar tanaman lain untuk membentuk sel hibrida; cara ini disebut Parasexual Hybridization

4. kapas transgenik