Bidang Ilmu: Peternakan . '... .,. - . .. ~ . . ~ ~

LAPORAN HIBAH KOMPETITIF PENELITIAN SESUAI PRIORITAS NASIONAL

TEMA: KETAHANAN PANGAN

JllDUL PENELITIAN

Potensi Protein Spesifk Susu kambing sebagai Irnmunomodulator dan Immunogen: Upaya Pengembangan

Pangan Nutrasetika. 1 ~ 9 " 4 3 8

Peneliti Utama: drh.Masdiana Padaga. MAppSc

Anggota PeneIiti: 1r.Manik Eirry Sawitri. MS Dr. Sri Murwani, drh.MP

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG

NOVEMBER 2009

HALAMAN PENGESAHAN LAPORAN PENELITIAN HIBAH BERSAING

I. Judul Penelitian

2. Ketua Peneliti a Nama Lengkap dan Gelar b. Jenis Kelamin c. NIP d. Jabatan Fungsional e. Jabatan Strukhlral

f. Bidang Keahlian g. FakultaslJurusan h. Perguruan Tinggi

: Potensi Protein Spesifik Susu kambing sebagai fmmunomodulator dan Immunogen: U P ~ Y ~ Pengembangan Pangan Nutrasetika.

: drh.Masdiana Padaga M.App.Sc. : P : 19560210 198403 2001 : Lektor Pembina tkllIII-c : Staf pengajarlpeliti

Fakultas Peternakan UB : Teknologi dan Mikrobiologi Pangan : PetemakaruTeknologi Hasil Ternak : Universitas Brawijaya, Malang

3. Pendanaan dan jangka waktu penelitian a Jan& Waktu penelitim yang diusulkan : 8 bulan b. Biaya Total yang diusullcan Tahun 1 : Rp. 98.460.000,-

Tahun 2 : Rp. 97.700.000,- c. Biaya yang disetujui tahun 2009 : Rp. 98.460.000,-

i. T i Peneliti

Malang, 30 Nopember 2009 Ketua Peneliti,

M'% drh.Mudina Padaga. MApp.Sc. NIP. 19560210 198403 2 001

Menyetujui, Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyankat Universitas Brawijaya Ketua,

PERGURUAN TMGGJ

Universitas Bmwijaya Universitas Bmwijaya

Prof. Dr. IT. Siti Chnzaemi, MS NIP.195305141980022001

FAKULTAWJURUSAN

Potarnmcknologi Hasil Ternnk Kedolaeran

- NAMA

' I . 1r.Manik Einy Sawitri. Ms 2. Dr. Sri M u m i , &. MP

BIDANG KEAHLIAN

Teknologi Susu

Biomedik

RINGKASAN Susu merupakan pangan nutmsetika alami yang mengandung bahan-bahan

bioaktiv terutama protein yang mempunyai manfaat penting untuk kesehatan. Diantara protein protein yang telah diidentifikasi, diketahui bahwa a-Lactalburnin dan Lactoferrin mempunyai fungsi sebagai immunomodulator. Pada penelitian ini dilakukan isolasi protein susu kambing dan dibandingkan dengan protein susu sapi untuk mengetahui apakah protein spesifik susu kambing mempunyai fungsi immunomodulator dan bersifat immunogen. Penelitian dilakukan selama 2 tahun melalui 4 tahap percobaan. Penelitian tahun 1 terdiri dari 2 tahap pcrcobaan meliputi (1) isolasi dan karakterisasi protein spesifik (PSI) Susu kambing dan (2) kajian potensi PSI sebagai immunomodulator menggunakan hewan coba.

IIasil penelitian mcnuqjukkan bahwa terdapat variasi kandungan protein susu dari berbagai sampel susu Kambing ( A,B dan C ) dan sampel susu Sapi. Campuran hasil elusi protein susu kambing diperoleh kadar protein yang cukup tinggi yaitu 51625 mg/Liter. Karakterisasi protein dari susu kambing dan susu sapi menggunakan metoda SDS-PAGE dapat diketahui bahwa susu kambing mengandung protein spesifik (PSI) susu yang berbeda dengan protein susu sapi dengan berat molekul36-55 kDa. Pengujian pada hewan coba diberi perlakuan artritis rematoid complete fieud adjuvant (CFA) clan enteritis membuktikan bahwa PSI 36-55 kDa dapat mengurangi peradangan pada jaringan tulang dan usus. Data ini dipe jelas dengan pengujian aktivitas SOD dan Kadar malondial dehida (MDA), dimana SOD meningkat dan kadar MDA jaringan menurun setelah mcndapat tcrapi Psl.

Berdasarkan hasil penelitian, dapdt disirnpulkan bahwa Protein spsiiik (PSI) susu kambing terbukti mampu mencegah proses peradangan, dapat berperan sebagai antiinflamasi dan antioksidan dan bcrfungsi scbagai imunomudulator. Hasil penelitian ini menjadi bahan informasi bahwa susu kambing mengandung kandidat imunomudulator yang digunakan sebagai antioksidan dan antiinflamasi.

SUMMARY

Milk is a natural nutraceutical food that contains bioaotive ingredients especially native pmtcin which is a great health %due. Pmtcin in milk which has been identified are Caseins (a, P and K), a-Lactalbumin, P-Lactoglobulin, Immunoglobulins A, M and G, Lactoferrin, Lactoperoxidase, and Lysozyme. Among these proteins, a-Laolalbumin and Lactoferrin has a special function as immunomodulator. In a milk-processed product, those components will have no function because of heating. Therefore, now there is a development of a new milk-processed product, which contains immunomodulator protein supplement in order to maintain milk function as a nutraceutical food that can the immune system. However, milk protein can also cause allergic reaction for some people. Therefore, to some extent consumers prefere to drink goat's milk as an alternative to cow's milk and it is believed that it can enhance health and cure some diseases. This calls for a scientific provc whether the main components of goat's milk especially protein h a an immunomodulator effect.

Research showed that goat's milk has an advantage compares to cow's milk in terms of health. Goat's milk contains 35% medium chain fatty acids. therefore it is safer to consume especially for the hyper-cholesterol. Goat's milk

protein also has an amino acid composition that is different to other mammalian milk and does not causes allergy. Goat's milk protein also enhances immunity because it contains irnmunomodulator protein. This is the importance of researches to study the potency of specific protein (PSI) in goat's milk as the immunomodulator so that it can be developed to nutraceuticd food.

'The objectives of this research are to study the protein profile of goat's milk compares to cow's's milk, to explore the potential of PSI in goat's milk as an immunomodulator, to prove that the antibody against PSI is specific and has a cross reaction effect with other sources so that it can be used in development of diagnostic kit for nutraceutical food quality.

This research is using experiment method and spanning for 2 years which divided into 4 stages of experiments methods. In ihc first year, 2 stages of the experiment is done, which are: (1) isolation and characterization of specific protein (PSI) in goat's milk compares to cow's milk and (2) potential review of PSI as an irnmunomodulator using rheumatoid arthritis and enteritis male white rat (Rarrus norvegicus). Goat's milk sample is taken from public f m s . Goat's milk is originated from 3 different goat (A.B.C) and sample taking is done duplex.

Experiment results shows that there is a variety of milk protein content from various goat's milk sample (A, B mld C) and cow's milk sample. The mix from goat's milk elution resulted in a high protein content of 51,625 mgL. This shows that protein isolates has fulfill the requirement to be used as bioactive molecule that will be tested as an anti inflammation and anti-oxidant. Using SDS- PAGE method showed that profile of protein of goat differ from cow's milk . it can be seen that goat's milk contain specific protein (PSI) milk with moleculer weight of 36-55 kDa. Next, using this electro elution technique, the protein is isolated and tested its potential as an immunomodulator. Test using experimental animal with arthritis rheumatoid complete Freud adjuvant (CFA) treatment showed that PSI 36-55 kDa is also has the function as an antioxidant, which can lessen inflammations, and as an irnmunomodulator, which is proven from the recovery of bone surface tested microscopically. This macroscopic and microscopic data is clarified with data of enzyme superoxide dismutation (SOD) activity as a scavenger radical, where the PSI therapy enhances the SOD tissue activity. This result proved that goat's milk PSI has the function as an antioxidant by radical scavenger.

The rat induction with indomethacin 15 mgkg BW causes enteritis. The microscopic result @athologyanatomic/PA) showed tissue repairing after PSI therapy in duodenum, jejunum and ilium, which has been damaged because of enteritis. This data is clarified by activity of SOD and Malone Dialdehide (MDA) contain, where the SOD is increased and MDA content is less after PSI therapy. This proved that PSI also has an antioxidant, anti-inflammatory and imunomodulator.

Based on the experiment results, can be concluded that the specific protein (PSI) from goat's milk can prevent inflammation, has an antioxidant and immunomodulator effect. The result of this research is an information that goat's milk is a candidate for immunomodulator which is used as an antioxidant and an ti-inflammatory.

Atas berkat R a k h a t Tuhan Yang Maha Pengasih dan PenyayangPami telah &pat menyelesaikan penelitian dan penulisan laporan penelitian yang bejudul :" Potensi Protein Spesifik Susu Kambing Sebagai Immunomodulator dan Immunogen : Upaya Pengembangan Pangan Nutraselika".

Benama ini kami mengucapkan banyak terima kasih kepada : 1. Di jen Pendidikan T~nggi, Departemen Pendjdikan Nasional, atas bantuan

dana gum Pelaksamn Kibah Kompetitif Penelitian ini. 2. Rektor Universitas Brawijaya yang telah memberikan sarana dan

prasarana dalam penyelesaian penelitian ini. 3. Ketua Lernbaga Penelitian clan Pengabdian Kepada Masyarakat,

Universitas Brawijaya dan staf dalam menyelesaikan administrasi penelitian ini.

4. Ketua Laboratorium Biokimia, Universitas Brawijaya d m staf yang telah membantu secara penuh &lam pelaksanaan penelitian ini.Tak lupa ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Merri Budimi S dan Arisanti A

5. Happi Wahyu R dan Halima T, mahasiswa Program Studi Teknologi llasil Temak, Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya serta semua pihak yang telah membantu dalam penelitian ini yang tak dapat kami sebutkan.

Penelitian tahun peitama ini belumlah dapat dikatakan sempurna oleh karena itu kami harapkan penelitian ini *at berlanjut dengan penelitian hhun kedua, dan sumbang saran yang bersifat membangun kami harapkan.

Peneliti

DAFTAR IS1

......................................................................... HALAMAN PENGESAHAN i . . ................................................................. RINGKASAN DAN SUMMARY I I

.................................................................................................... PRAKATA iv

DAFTAR IS1 ................................................................................................ v . . ....................................................................................... DAFTAR TABEL VII ... .......................................... .................................... DAFTAR GAMBAR ... VIII

BAB I . PENDAHULUAN ....................................................................... 1 2.1. Latar Belakang ......................................................................... I . . 2.2. Urgensi Penelltlan .................................................................... 2

BAB II . TINJAUAN PUSTAKA .................................................................. 4 2.1. Fungsi Immunomodulator Protein Susu .................................. 4 2.2. Susu Kambing sebagai Pangan nutmetika ................... ...... 6

BAB 111 . TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN ............................... 8 3.1. Tujuan ........................................................................................ 8 3.2. Manfaat ..................... ......... .................................................... 8

............................................................... . BAB 1V ME'TODE PENELI'TIAN 9 4.1. Rancangan (Desain Riset) .................................................... 10

.................. 4.2. Metoda Percobam Tahun 1 ............................ .. 10 .................................................. . 4.2.1 Bahan dan Peralatan 10

4.2.2. Percobaan Tahap 1 .................................................... 11 4.2.2. I . Isolasi Protein Susu ..................................................... 11 4.2.2.2. Karakterisasi dan [den t i fh i Protein

............................................. susu dengar1 SDS-PAGE 12 4.2.2.3. Isolasi Protein spesifik (Psi) susu dengan

..................................................... l'eknik Elektroelusi 13 4.2.3. Tahap 2 ...................................................................... 15 4 2.3.1. Uji potensi PSI susu kambing sebagai

.................................................... immunomodulator 15 4.2.3.2. Pengukuran aktivitas superoksida dismutase

(SOD) jaringan ........................................................ 16 4.2.3.3. Pengukuran kadar MDA jaringan ............................... 16 4.2.3.4. Pemcriksaan I listopotologi ....................... .. .......... 18

BAB V . IIASIL DAN PEMBAHASAN ............................................. 19 5.1. Isolasi protein susu sapi dan susu karnbing ............................ 19 5.2. Karakterisasi d m identifikasi Prolein susu

dengan SDS-PAGE ................................................................. 19 5.3. Isolasi Protein spesifik (PSI) susu dengan

Teknik Elekiroelud ................................................................. 21 5.4. Uji potensi PSI susu kambing sebagai

Immunomodulator ................................................................... 21 5.4.1. Imunomudulator pada Artitis Mematoid ............................. 21 5.4.2. Imunomudulator pada Enter~tis ............................................ 24

................... BAB VI . KESIMPULAN DAN SARAN ....... ..................... ., 27

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 28

DAmAR TABEL

. . .................................................................. 2.1 Fungsl blologis protein susu 4 2.2 Peptida bioaktif dalam protein suw dan hngsinya .................................. 5 2.3 Beberapa aktivitas immunomodulator protein susu ................................ 6 5.1 Konsentrasi Protein Sarnpel ................................................................... 19 5.2 Hasil berat molekul pada pita (kDa) ...................................................... 21 5.3 Aktifivitas SOD .................................................................................... 24 5.4 h d a SOD pada Tikus Kontrol . Enteritis dm Terapi .......................... 26 5.5 Kadar malondial dehida Tikus Enteritis ................................................ 26

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

4.1 Bagan Rancangan Penelitian Tahun Ke l : Isolasi dan Karakteriasi Protein spesifik Susu

................... kumbiny. I lusil : I'rolcin bposilik in~~nunor~~odulutor (I'sl) I U ................................................................... 4.2 Metode isolasi protein susu 12

.................... 4.3 Metode analisis profil protein menggunakan SDS-PAGE 13 4.4 Metode lsolasi Protein spesifik (Psl) susu dengan

............................................................................... Teknii Elektroelusi 14 . . ............................................................ 4.5 Pembuatan tikus artnt~s adjuvan 15 ................................................................... 4.6 Skema penelitian enteritis 16

......................... 4.7 Metode pengukuran MDA pada jaringan periartikuler 17 .................................................................... 5.1 Hasil elektroforesis protein 20

5.2 Kaki tikus sehat (kontrol) ...................................................................... 22 5.3 Kaki tikus artritis .................................................................................. 22 5.4 Kaki tikus yang telah diterapi ................................................................. 22 5.5 Perbandingan makroskopis kaki tikus

............................................................. (kontrol, sakit dan pasca terapi) 23 5.6 Hasil . PA jaringan Periartikuler Sendl ................................................. 23 5.7 Perbandingan gambar duodenum, jejenum. ileum, pada tikus

......................... kontrol, enteritis dan pasca terapi secara rnikroskopis 25

BAB l PENDAHULUAN

Adanya perubahan gaya hidup dan pola makan masyarakat yang lebih

memperhatikan kesehaian, memberi dampak pada indusbi pangan yaitu

berkembangnya produk pangan dengan label "pangan nutrasetika" yang diyakini

dapat memberikan efek pada kesehatan. Salah satu aspek kesehatan yang dapat

diperoleh melalui konsumsi pangan nutrasetika adalah meninpkatkan sistem

kekebalan tub& . Susu mempakan pangan nutrasetika alami ymg mengandung bahan-bahan

bioaktiv terutama protein yang mempunyai manfaat penting untuk kesehatan.

Protein susu yang sudah diidentifikasi meliputi Caseins (a, P and K), a-

Lactalbumin, P-Lactoglobulin, Immunoglobulins A, M and G, Lactoferrin,

Lactoperoxidase, dan Lysozyme. Diantara protein-protein tersebut, a-Lactalbumin

dan Lactoferrin rnempunyai fungsi sebagai immunomodulator. Pada produk

olahan susu, komponen tsb akan rusak karena pemanasan sehingga saat ini telah

berkembang pmduk olahan susu yang diberi suplementasi protein

immunomodulator untuk dapat memperbbmkan h g s i susu sebagai pangan

nutrasetika terutama untuk meningkatkan atau mempertahankm sistim immun.

Disisi lain protein yang terdapat dalam susu sapi dapat menyebabkan reaksi alergi

bagi orang-orang tertentu. Hal ini menyebabkan konsumen memilih susu kambing

sebagai altematif pengganti susu sapi bahkan diyakini dapat meningkatkan

keschatan dan menyembuhkan beberapa penyakit. Hal ini tentlmya perlu

pembuktian secara ilmiah tentang kompnen-komponen terutama protein d a l m

susu kambing yang mempunyai efek immunomodulaior.

Beberapa hasil penelitian melaporkan bahwa susu kambing memilki

keunggulan dibandingkan susu sapi temtama ditinjau dari aspek kesehatan. Susu

kambiig mengandung 35% lemak ranw sedang (medium chain fatty acids)

sehingga aman dikonsumsi terutama bagi penderita hiperkolesterol. Selain itu

protein susu kambing memiliki komposisi asam amino yang berbeda dengan susu

dari mamalia lainnya dan tidak menyebabkan reaksi alergi. Protein susu kambing

juga dapat meningkatkan immunitas karena mengandung protein yang bersifat

immunomodulator. Berdasarkan pada ha1 tersebut maka pada penelitian ini akan

dipelajari fungsi protein spesifik (PSI) yang terdapat dalam susu kambing sebngai

immunomodulator dan apakah PSI bersifat immunogenik, sehingga dapnt

digunakan sebagai dasar untuk pengembangan pangan nutrrlsetika.

1.2. Urgensi Penelitian

Saat ini kepercayaan konsumen terhadap manfaat pangan nutrasetika

sangat tinggi. Hal ini terbukti dengan semakin berkernbangnya industri-industri

pengolahan pangan hgsional dan nutrasetika Mrususnya berbasis susu. Pada

umumnya pangan fungsional berbasis susu dipmduksi meialui proses fementasi.

Selma proses fermentasi tejadi biosintesis kberapa senyawa bioaktif dari

peptida-pepticla dan eksopolisakarida. Senyawa-senyawa tersebut telah terbukti

memberikan efek terhadap kesehatan, meskipun mekanismenya belum

sepenuhnya diteliti. Dampak positip yang dapat diperoleh dari fenomena

tersebut, temtama di Indonesia adalah adanya perubahan pola konsumsi yang

mulai memilih pangan yang diyakini dapat memberikan efek kesehatan.

Da lm periode 10 tahun terakhi~, industri petemakan kambing penghasil

susu mulai berkembang karena susu kambig diyakini mempunyai berkgai

manfaat kesehatan antara lain sebagai anti kanker, anti infeksi, dapat

meningkatkan kekebalan, menunmkan kolesterol dan anti alergi. Bebempa

penelitian menunjukan bahwa terdapat perbedaan komponen nutrisi terutama

lemak dan protein pada susu sapi dan susu kambing. Hal .hi kemungkinan yang

menyebabkan susu kambing mempunyai bebempn keunggulan d iband i i an susu

sapi dan konsumen lebii menyukai minum susu kambiig tanpa dipanaskan atau

diolah.

Untuk &pat membuktikan bahwa susu kambiig mempunyai komponen

bioaktif terutama protein spesifik yang mempunyai fungsi immunomodulator

(Psl) sehingga &pat dikembangkan sebagai m b e r pangan nutrasetika maka

sangat penting untuk dilakukan penelitian melalui isolasi clan kaTakterisasi protein

dari susu kambing dan dilanjutkan dengan uji biologis menggunakan hewan coba

tikus (Rarlus nomegigus, galur wistar) yang telah diberi perlakuan menjadi

artritis, dan asrna IJntuk mengetahui apakah PSI bersifat immunogenik maka

perlu dilakukan uji spesifisitas dan reaksi silang dengan komponen protein lain.

J i i penelitian ini dapat membuktikan hipotesa tersebut maka antibodi PSI dapat

dikembangkan sebagai M a n untuk deteksi komponen protein spesifik pada susu

sebagai pangan nutrasetika Pada akhir penelitian diharapkan dapat dihasilkan

data komponen bioaktif susu kambing sebagai immunomodulator dan kit

diagnostik untuk pengujian kualitas pangan nutrasetika.

BAB I1 TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Fungsi Immunomodulator Protein Susu

Susu dad ternak nuninansia terutama susu sapi merupakan bahan pangan

yang memberikan konbibusi cukup besar terhadap keseimbangan nubisi dalam

diet. Komponen utama susu sapi adalah air, laktosa (4,8%), protein (3,2%), lemak

(3,7%) nitrogen non protein (1,9%) dan abu (0,7%). Protein utama yang terdapat

pada susu sapi adalah kasein (go%), whey, dan imunoglobulin. Ketiganya berbeda

s e r a fisiologis dan biologis. Protein whey terdiri dari ldctalbumin dan

laktoglobulin (70-80%) dan sisanya adalah imunoglobulin, glikomakropeptida,

serum albumin, laktoferin, dan berbagai enzim. Fungsi biologis protein susu dapat

dilihat pada Tabel 2.1.

Tabel 2.1. Fungsi biologis protein susu

I laktoferin 1

Protein K k i (a, p, dan k) a-laktalbumin

P-Laktoglobulin Imonoglobulii A, M, danG Glokomakropeptida Laktoferin

- Laktoperoksidase Lisosim

Komponen protein pada susu memiliki beberapa fungsi antara lain

menyediakan asam amino yang dibutuhkan tubuh untuk pertumbuhan dan

perkembangan, selain itu protein susu juga berfungsi sebagai sumber utama

peptida-peptida bioaktif. Peptida bioaktif terbentuk melalui proses hidrolisis

protein secara e nzimatis pada saluran p n c d a n atau karena adanya aktifitas

proteolitik dari bakteri asam taktat yang terdapat dalam usus. Jenis peptida yang

dihasilkan selama proses pencemakan swu tergantung pada proses hidrolisis yang

terjadi dan memilii fimgsi yang lebih spesifk dibandingkan dengan protein.

Fungsi biologis Karier zat besi (Ca, Fe Zn, Cu) Sintesis laktosa dalam kelenjar susu, karier Ca, imunomodulator, antikarsinogenik Karier retinol, mengikat asam lemak, antioksidan Pelindung sistem imun

Antiviral, antibakteri, bifidogenik Mengikat toksin, antimikroba, antiviral, imunomodulator, antilrarsinogenik, antioksidan Anthikrobial Antirnikrobial, sinergis dengan imunoglobulin dan

Sebagian besar peptida tersebut dapat bertahan dalam saluran pencemaan. Tabel

2.2, menunjukkan beberapa peptida bioaktif dan hgsinya.

Tabel 2.2. Peptida bioaktif dalarn protein susu dan fungsinya

Efek terhadap sistem immun secara m u m disebabkan adanya komponen

bioaktiv dalam susu seperti protein whey, kasein, honnon clan faktor pertumbuhan

(Gill, 2000; Cross and Gill, 2000). Sifat-sifat biologis protein susu atau peptida

yang berasal dari protein susu meliputi aktivitas antibakterial (lactofenin),

assimilasi nutrien, regulator h g s i fisiologis. Pada susu juga terdapat hormon,

prolaktin, dan analog yang berperan dalarn perkernbangan jaringan dan organ

serta sebagai imunomodulator.

Beberapa penelitian yang sudah dilakukan selama periode 10 tahun

t e d rnelalui ident i fh i dan karakterisasi komponen susu yang dapat

mempengaruhi fungsi sistem immun menunjukkan bahwa komponen yang paling

berpemn adalah protein ssusu (Gill et al. 2000). Secara in vilto a, P, dad x casein,

whey protein, lactofenin, dan endogenus Igg susu terbukti dapat rnemoduIasi

prolifersi limfosit. Efek ini &pat te jadi pada beberapa spesies ruminan dan non

ruminan. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa potensi immunornodulator

protein susu secara filogenetik tidak terbatas, narnun terdapat variasi pada

penganh antar species (Martin el al. 2000). Caseinophosphopeptides (CPPs)

dilaporkan mempunyai efek antihipertensi. Anticames clan antialergi (Fitzgerald

et al. 2003). Percobaan secara in vivo pada hewan coba tikw menunjukkan bahwa

derivat a-casein, isracidin, dapat mencegah infeksi Staphylococcus aureus (Gill el

a1.2000). Rotein susu juga terbulrti &pat meningkatkan respon antibodi mucosal

terhadap pemberian antigen dan vaksin secara per oral. Percobaan ini dilakukan

menggunakan hewan coba tikus ymg diberi ovalbumin, toksin kholera, toksi

polio dan vaksin flue (Gill et al., 2002% b, c, d; Low et a l , 2001). Beberapa

aktivitas immunomodulator protein rusu secara lengkap disajikan pada Tabel 2.3.

Tabel 2.3. Beberapa aktivitas immunomodulator protein susu

Sumber : (Gill et 81.2000)

Protein as1 casein Isracidin

2.2. Susu Kambiag sebagai Pangan nutrasetika

Pangan nutmsetika didefinisikan sebagai pangan atau komponen pangan

yang dapat mernberikan manfaat kesehafan kepada konsurnen (Marriot, 2000).

Susu kambing sebagaimana halnya susu sapi mengandung komponen-komponen

yang telah terbukti mempunyai manfaat kesehatan (Haenlein, 2000). Menurut

McCullough (2003) kandungan laktosa dan protein susu kambing hampir sama

dengan susu sapi, namun terdapat perbedaan struktur dan protein immnologik.

Effek immunologis Limfosit proliferasi, pembentukan antobodi Proteksi terhadap infeksi bakteri dan kapang, limfosit

selain itu susu kambiig mengandung asam-asam lemak rantai sedang dan globuIar

lernak pada susu k d i g relatif lebih kecil dibandingkan lemak susu sapi.

Sebagai pangan nutrasetika susu kambing dapat memberikan solusi

terhadap penderita alergi terhadap susu sapi atau susu kedelai. Reaksi alergi

terhadap susu biasanya disebabkan oleh laktosa atau protein susu. hkhlburnin

dan kasein pada susu kamb'mg mempunyai struktur yang berbeda dengan susu

sapi sehingga tidak menyebabkan reaksi alergi pada bayi dan an&-anak yang

sensitive terhadap laktalbumin sapi (Lamothe et al., 2007). Susu sapi

mengandung as1 casein yang merupakan allergan utama sampai 33,7%

dibandingkan dengan susu kambiig yang hanya 3,9% (Tornotake et al, 2006) dan

p-casein sebagai antihiprknsi lebii tinggi pada susu kambing (Lamothe et al.,

2007). Namun perlu juga dipertimbangkan bahwa beberapa protein susu kambing

memberikan reaksi silang immunologis dengan protein susu sapi sehingga perlu

behti-hati dalam rnemberikan substitusi susu pada anak-an& dengan kelainan

sistem imrnun (McCullougb, 2003).

Hasil penelitinn menunjukkan bahwa terdapat perbedaan sifat fisiko-kimia

antara lemak susu karnbiig dan susu sapi. Menurut McCullough ( 2003) globula

lemak susu kambing relatif lebih kecil sehingga lebih mudah dicerna dan area

permuknan globula Iemak yang lebih luas pada m u kambing dapat

rneningkatkan aktivitas lipase pankreas. Tomotake et a[.,( 2006) melaporkan

bahwa jumlah total asam lemak rantai pendek dan sedang (C4, C6, C8 dan C10)

rnencapai 16,1 % - 19,7% pada susu kambing dibandingkan susu sapi yang hanya

5,8%. Susu kambing rnengandung asam palmitat (C16) lebih rendah dibandingkan

suSu sapi. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Alferez el al., (2003) dengan

hewan coba tikus, rnenunjukkan bahwa konsumsi susu kambing dapat

meningkatkan ketersediaan zink d m selenium. Dengan mempertimbangkan

beberapa karakteristik susu kambing diantaranya mudah dicerna, sumber energi

yang baik dan tidak menyebabkan alergi maka susu kambing dapat dimanfaatkan

sebagai sumber pangan nubasetika.

BAB 111

TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

3.1. Tujuan

Beberapa tujuan yang akan dicapai &ah :

I . Mengetahui profil protein susu kambing dibandingkan dengan susu sapi.

2. Mengekplorasi potensi protein spesifk susu kambing sebagai

immunomodulator (PSI)

3. Membuktiian bahwa antibodi terhadap PSI bersifat spesifik dan dapat

bereaksi silang dengan PSI surnber lain.

4. Membukrikan bahwa antibodi PSI dapat dikembangkan sebagai reagensi

untuk analisis clan deteksi bahan immunomodulator dalam susu sebagai dasar

pengembangan pangan fungsional.

5. Merancang kit diagnostik untuk pengujian kualitas pangan nutrasetika

3.2. Manfaat

Manfaat yang dapat diperoleh dari hasil penelitian addah

1. Memperoleh dasar ilmu berupa data profil protein susu kambing

2. Mendapatkan protein spesifik susu kambing yang berfungsi sebagai

immunomodulator (PSI)

3. Mendapatkan antibodi terhadap PSI yang akan dikembangkan untuk uji

adanya immunomodulator pada susu dan produk susu sebagai dasar

pengembangan pangan nutrasetika.

4. Menghssilkan kit diagnostik untuk pengujian kualitas pangan nutrasetika

5. Memberikan pertimbangan pada industri pangan berbasis susu untuk

pengembangan pangan nutrasetika berbasis susu sebagai upaya meningkalkan

manfaat susu dan produk olahan susu bagi kesehatan.

Pada akhir Tahun 1 akan dihasilkan profil protein spesitik susu kambing

yang mempunyai fungsi sebagai immunomodulator. Hasil Tahun I ini akan

dipublikasi pada jumal nasional atau internasional.

BAB IV METODE PENELITIAN

4.1. Rancangan (Desain Riset) :

Penelitian ini dilakukan dengan metoda percobaan yang akan dilaksanakan

selama 2 tahun melalui 4 lahap percobaan. Rangkaian percobaan pada penelitian

yang akan dilakukan selama 2 tahun ini akan rnenjawab beberapa pertanyaan

sebagai berikut :

1. Apakah terdapat perbedaan profil protein dalam susu sapi dan susu kambing?

2. Apakah protein spesifik (PSI) susu kambiig &pat berfimgsi sebagai

immunomodulator ?

3. Apakah PSI dari susu karnbing bersifat immunogenik?

4. Apakah antibodi hasil induksi PSI dari susu kambing bersifat spesifik dan dapat

bereaksi silang dengan protein spesifik yang ada pada susu sapi dan produk

olahan susu?

5. Apakah antibodi terhadap PSI dapat dikembangkan sebagai reagensi untuk

deteksi bahan immunomodulator untuk pengembangan pangan nutrasetika ?

Seluruh percobaan dilakukan dengan rancangan tahapan penelitian

sebagai berikut :

Pada tahun 1 telah dilakukan 2 tahap percobaan seperti dijelaskan pada Gambar

4.1 yaitu (1) isolasi dan karakterisasi protein spesifk (PSI) Susu karnbmg

dibandingkan dengan susu sapi d m (2) kajian potensi PSI sebagai

immunomodulator menggunakan hewan caba. Pada akhir tahun 1 dihasilkan

bahan immunomodulator berbasis protein spesifik susu kambig.

I Koleksi sampel susu (sapi dan kambing) I -

Isolasi Protein

ldentiikasi Profil Protein + pada hewan coba

Artritis, colitis dan asma

Gambar 4.1. Bagan Rancangan Penelitian Tahun Ke 1 : Isolasi dan Karakteriasi Protein spesifik Susu kambing Hasil : Protein spesifik Immunomodulator (PSI)

4.2. Metoda Percobaan Tahun 1

4.2.1. Bahan dan Petalatan

Bahan yang diperlukan adalah

Tius putih (Rattus nonegicus) wistar jantan umur 2 bulan berat 100-130

g (Lab Biologi Molekuler Seluler P.MIPA, Malang),

Buffer sitrat pH 4.5,

r Antibodi primer Rat Anti N O S (Santa cruz biotechnology),

Anhbdi selmnder Anti Rabbit IgG Biotin labelled,

w Pewarna Mayer Hematoxylen (Pierce), Eosin, Cromogen DAB (Santa cruz

biotechnology),

PBS (Phospat Buffer Saline),

PBS PMSF, Tris Ha, butmol, Dl (Deionized Water), Hidrogen Peroksida

(H202) 3% @ako,Inc), Aquades, Ethanol 7004 Ethanol SO%, Ethanol

90%, ethanol 95%, Ethanol Absolut, Xylol,

w Parafin, NaCl 0.9%, Entellan, Serum BSA (Bovine Serum Albumin)

(Sigma, USA), Aquades clan PBS-Tween.

Sedangkan peralatan yang di@makan arlalah sepemngkat alat gelas, sentrifuge,

sonikator, refigerator, ttlbung eppendorf, Sodium Dodecyl Sulphate-

Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE).

43.2. Percobaan Tabap 1.

Isolasi dan Karakterisasi Protein spesifik (PSI) Susu sad dan Susu

kambiig.

4.2.2.1. Isalasi Protein Susu

Isolasi protein susu dilakukan dengan metoda Aulani'am (2005). Kedalam

-pel susu ditambahkan PBS PMSF 4 mM, kemudian dilakukan sonifikasi

selama 10 menit dan dilanjutkan dengan sentrihgasi pada 10.000 rpm selama 15

menit. Pelet yang diperoleh dilarutkan dalam Tris HC120 mM d m dishpan pada

suhu -20°C sampai siap untuk analisis selanjutnya. Pelet dithawing kemudian

diambil masing-masing s e h y a k 10 mikroliter secara duplo. Selanjutnya

ditambahkan Tds C1 sebanyak 800 rnikroliter clan ditambah biueret TABM

sebanyak 190 mkoliter kemudian divoltek 1 menit dilarjutkan dengan inkubasi

pada suhu 37" selama 30 menit. Selanjutnya diukur absorbansi masing- masing

sampel pada panjang gelombang 550 nm, pembacaan absobansi dilakukan duplo.

Untuk menghitung konsentrasi protein dihitung dengan menggunakan persamaan

garis dari kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin) Y=5.4663 l o 5 X. Metode

isolasi protein susu dapat dilihat pada Gambar 4.2.

200pL sampel

4 Dltambah PBS-Tween-PMSF eebanyak 8 x volume

1

I Diwnikasi 10 menit

4 DisenMhrs 6000 rpm selama 15 menit

presipitan L e l supematan

4 Ditambah etanol absolute dingin (1:l) I

I + Disimpan dalam refmenerator 12 iam

Dikeringanginkan hingga bau etanol hilang I

1 Ditambah tris-HCl pH 6.8 (1:1) I 4

Dlsimpan pada suhu -20'

Gambar 4.2. Metode isolasi protein susu (Aulani'am, 2005)

4.2.2.2. Karakterisasi dan Identifikasi Protein susu dengan SDS- PAGE

Protein hasil isolasi diidentifhi menggunakan SDS-PAGE (Aulani'am

2005). Kedalam alat SDS-PAGE masukkan running gel melalui dindiig sampai

kUrang dari batas atas, kemudian ditambahkan butanoll ml dan dibiarkan selama

25 menit. Setelah gel membeku, butanol d i b w g , dibersihkan dengan PBS, dan

dikeringkan dengan kertas saring Whotman . Selanjutnya dibuat stacking gel

melewati dinding sampai penuh, mtukkan comb dan ditunggu sarnpai

b e w - b e w set (25 menit). Selanjutnya comb diambii dan dibersihkan dari

sisa-sisa gel dengan larutan buffer. Isolat protein susu sebanyak 2,s p1 dicarnpur

dengan 17,5 p1 Tris HCI dan 20 pl RSB d m dipanaskan 100 '~ selama 5

menit. Selanjutnya 30 p1 dimasukkan kedalam summan gel. Alat dijalankan Jika

reaksi gel sudah sampai bawah kemudian dimatikan dan plate dibuka dan

dipisahkan. Gel yang diperoleh dicuci dengan larutan buffer clan hasilnya

divisualisasikan dengm pewmaan silver atau langsung ditransfer ke rnernbron

nifroselulose. Metode analisis profil protein menggunakan SDS-PAGE dijelaskan

pada Gambar 4.3.

I - dimasukkan dalam tabung mikm - dimbah dengan 20 pL RSB (perbandingan volume 1:l) - dipanaskan pada suhu 100°C sebma 7 menit pada waterbath - diding~n pada suhu ruang

- dlsuntlkkan ke dalarn 10 sumuren @ 30 pL - dilakukan runnlng dengan arus 28 mA, 128 V hingga warns biru berada 2 0,5 cm dari batas bawah plat gel

Gel hasil running ?l dalam lamtan staining sambil dikocok

menggunakan shaker selama 20 menlt direndam dalam larutan destaining sambil dikocok menggunakan shaker hingga pita pada gel tampak jelas

Pita-p~ta pada gel hasil elekmforesis + I I - ditentukan harga R, dan massa molekul relatifnya

masingmasing

Gambar 4.3. Metode analisis profil protein menggunakan SDS-PAGE (Aulani'am, 2005)

4.2.2.3. Isalaai Protein spesifik (PI) sosu dengaa Teknik Elektmelusi

Gel SDS-PAGE ymg tidak diwamai dipotong sepmjang pita yang

dikehendaki. Masing-masing potongan gel dimasukkan ke dalam kantong nilon.

Selanjutnya dimasukkan dalam block glass yang mengandung PBS, setelah itu di

stirer selama 24 jam. Sdap 6 jam dilakukan penggautian PBS. Untuk mengetahui

bahwa protein sudah mengalmi elusi maka potongan gel diwamai dengan

pewmaan silver, bila tidak terdapat pita artinya protein sudah ter-elusi. Metode

isolasi protein secara lengkap dapat dilihat pada Garnbar 4.4.

I Crude protein I v

I Dirunning elekbvforesis SDS Page 1

Pita target dipotong dan gel dipotong kecil-kecil L

r-- 6masukkan ke dalam tielofan I - - -

Dltarnbah buffer tosfat 0,2 M (2 mL) I Dimasukherl ke &Ism chembw elsk!roelu$i yang

berisi buffer fosfat 0.1 M &

Dielekmlusi 250 V, 20 mA, overnight suhu 4'

C supernatan

Dirnasukkan ke dalam tabung rnikro a750 pL 1.

Ditambah etanol dingin (1:l) L w

I Disirnwn overnight dalam refrigenerator I

Ditambah tris-C1 pH 6,8 (1:l) .L

I Disenhifue 10.000ivm 10 menit + .c f

I Disirnpan pada suhu -20' I Gambar 4.4. Metode Isolasi Protein spesifik (PSI) susu dengan Teknik

Elektroelusi (Aulani'am, 2005)

I supematan I pelet

+ dikeringanginkan

*

4.2.3. Tahap 2

4.2.3.1. Uji poteasi PSI susu kambing sebagai immunomodulator Pada penelitian ini fungsi immunomodulator diuji rnenggunakan hewan

model T i (Rattus norvegicw, galw wistar) umur 10 w p a i 12 minggu dengao

berat badan 150 g dan diberi perlakuan artritis rematoid complete fieud adjuvant

(CFA) dan enteritis. Skema pernbuatan artritis adjuvan dan skema penelitian

enteritis dengan induksi indomethacin dapat dilihat pada Gambar 4.5 d m Gambar

4.6. Selanjumya dilakukan terapi dengan PSI dan fungsi immunomodulator diuji

melalui pemeriksaan:

- rad'ial bebas yaitu pemeriksaan MDA (malonaldialdehid) dan SOD

(superoksid disrnutase).

- Histopatologis pada organ spesifik (persendim dan usus) dengan

rnenggunakan pewama Hematoxylen-Eosin (HE)

Tikus Wistar Jantan 10-12 Minggu I

1 Pisulltik CFA 0,l mL intrddermal pads panfzkal ekor 1

[ ~isunt ik CFA 0,l mL intrademal pada kaki kiri dan 1

Gejala artritis adjuvan E?zl Gambar 4.5. Pembuatan tikus artritis adjuvan

Kelompok Perlakuan - Pemberian PSI susu kambing

7% BB makanan sampai penelitian berakhir . Tanpa Pemberian PSI susu I T ]

+ Induksi enteritis dengao indomethacin 15 mgkg BB secara per

oral pada hari ke 7 setelah pemberian PSI susu kambing

Pemeriksaan MU& SOD, dao gambaran hispatologi jaringan usus kecil (duodenum, jejunum, ileum)

4 Pemeriksaan MDA, SOD, dan gambaran hispatologi jahgan

usus kecil (duodenum, jejunum, ileum)

Gambm 4.6. Skema penelitian enteritis

4.23.2. Pengukumn aktivitas superoksida dismutase (SOD) jaringan

Pengukuran SOD dilakukan secara spekcrofotometri pada panjang

gelombang 580 nm menggunakan reaksi warna sebagai indikator. Akfivitas

superoksida dismutase ditentukan dengan interpolasi kurva baku yang sudah

disiapkan terlebih dahulu (Laboratorium Biomedik, 2003).

4.233. Pengukunn kadar MDA jaringan

Pengujian MDA dilakukan dengan mengukur absorbansi menggunakan

spekmfotometer pada panjang gelombang 531 nm. Kadar MDA ditentukan

dengan interpolasi kurva baku (Laboratdum Biomedik, 2003). Mctode

pengukuran MDA pa& jaringan periartikuler dapat dilihat pada Gambar 4.7.

1 100 rngjaringan I

I Ditambah NaCl fis 200 I

Ditambah 550 pL aquades e trikloroasetat atau TCA 100%

Ditambah 250 pL HCI 1 N r z z = l 1 Ditambah 100 1L Na-thio 1

I Dihomogenkan dengan vorteks 1

I Dipanaskan dalam waterbath dengan suhu 100'C selama 20 (

Diangkat dan dibiarkan pada suhu

Disentrifugasi 500 rpm selarna 10 c + Diambil supernatant dan disaring dengan glass

I D l u k u r absorbansinya dengan spektrofotometer pada 53 1.8 nm 1 -- -

Gambar 4.7. Metode pengukuran MDA pada jaringan periartikuler

4.2.3.4. Pemeriksnan Histopntologi

Pada pembuatan sediaan histopatologi, jaringan h m s diftksasi terlebih

dahulu dengan tujuan untuk menghentikan proses autolisis pada sel yang

disebabkan oleh enzim pencemaan pada lisosim yang dilepaskan pada saat sel

mengalami kematian (Labomtorium Biomedik, 2004).

Pewnmaan Hemntoxylen-Eosin

Tahap awal dilakukan deparafiisasi preparat dalam xylol bertingkat 1-3

masing-masing selama 5 menit. Selanjutnya dilakukan rehidrasi preparat

menggunakan etanol beningkat mulai dari etanol 95, 90, 80 dan 70% masing-

masing selama 5 menit dan kemudian direndarn dalam aquades selama 5 menit.

Pewamaan preparat dilakukan menggunakan pewama hematoxylen selama 10

menit untuk mendapatkan hasil yang cukup baik. Selanjutnya dicuci dengan air

mengalir selama 30 menit, kemudian dibilas dengan aquades. Selanjuinya

preparat diiasukkan pada pewarna eosin alkohol selam 5 menit. Tahap

betikutnya adalah dehidrasi dengan memasukkan preparat pada seri etanol

bertingka! dari 80,90 dan 95% hingga etanol absolut 1-3. Selanjutnya clearing

dilakukan dengan memasukkan preparat pada xylol 1,2 dan dikeringanginkan.

Selanjutnya dilakukan mounting dengan entellan.

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Isolasi protein susu sapi dan susu kambing

Susu kambing dan susu sapi diperoleh dari peternakan rakyat. Susu

kambing dikoleksi dari 3 ekor kambig yang berbeda (A.B.C) dan pengambilm

sampel dilakukan duplo. Isolasi protein susu dilakukan dengan metoda Aulani'am

(2005). Data konsentrasi protein susu sapid an susu kambing seperti pada Tabel

5.1.

Tabel 5.1. Konsentrasi Protein Sampel

Tabel 5.1. menunjukkan bahwa terdapat variasi kandungan protein susu

dari berbagai sampel susu Kambing ( A,B dan C ) , sampel susu Sapi ( S) d m

hasil elusi. Pada carnpuran hasil elusi protein suw kanlbing diperoleh kadar

protein yang cukup tinggi yaitu 51625 mglliter. Hal ini rnenjelaskan bahwa isolat

protein memenuhi persyaratan untuk digunakan sebagai molekul bioaktif yang

akan diuji sebagai anti idamasi dan anti mdang.

5.2. Karaktcrisasi dan Ident i fh i Protein susu dengan SDS-PAGE

Sarnpel susu separti Tabel 5.1. selanjutnya dianalisis profil profeinnya

dengan SDS-PAGE, hasil elektroforesis protein susu dapat dilihat pada Gambar

5.1.

Iktsrnnman :

A : Kamblng 1

B : KamMng 2

C : Kamblng 3

s : say

M : marker pro(

Gambar 5.1. Hasil elektroforesis protein susu

Dari Gambar 5.1. dapat diketahui terdapat protein spesifik susu kambig

yang berbeda dengan protein susu sapi yaitu pada berat molekul36-55 kDa. Hasil

perhitungan berat molekul @a) pada pita dapat dilihat pada Tabel 5.2. Protein

spesifik susu lambing dengan berat molekul 32 kDa dan 61.4 kDa ti&

ditemukan pada susu sapi. Demikian juga pmtein spesifik susu sapi dengan berat

molekul 19.3; 30,l; 66,8 dan 86,O kDa tidak ditemukan pada susu kambing. Hd

ini menunjukan bahwa susu sapid an susu kambing mengandung potensial protein

spesifik yang &pat diembangkan rnenjadi m b e r pangan nutmsetika. Pada

percobaan selanjutnya, dilakukan isolasi prokin spesifik (PSI) susu kambing

dengan teknik elektroelusi untnk menguji fungsi imrnunomodulator PSI.

Dari Tabel 5.2 dapat diketahui bahwa pada pita protein susu kambig ke-

3,5,9,12 tidak terdapat pada pita protein susu sapi. Sedangkan pada pita protein

susu sapi ke-6 d m ke-8 tidak terdapat pada pita protein susu kambinng. Menurut

Lamothe et a/., (2007) protein susu kambing mempunyai struktur yang berbeda

dengan susu sapi. Susu sapi mengandung a s 1 casein lebih tin& dibandingkan

susu sapi (Tornotake et al., 2006) dan sedangkan p-casein yang mempuriyai fimgsi

antihiperkmi lebih tinggi pada susu kambiig (Lamothe et a/., 2007). Hal ini

memungkinkan beberapa protein spesifik yang terdapat pada susu kambing

digunakan sebagai bahan bioaktif pada pangan nutrasetika.

Tabel 5.2. Hasil berat molekul pada pita (kDa)

53. Isolasi Protein spesifrk (PSI) susu dengan Teknik Elektroelusi

Gel SDS-PAGE dipotong sepanjang pita yang dikehendaki (pita dengan

berat molekul (36-55 kDa). Masing-masing potongan gel dtnawkkan ke dalam

kantong nilon. Selanjutnya diiasukkan dalam block glass yang mengandung

PBS, setelah itu di stirer selama 24 jam. Setiap 6 jam dilakukan penggantian PBS.

Untuk mengetahui bahwa protein sudah mengalami elusi maka potongan gel

diwarnai dengan pewarnaan silver, bila tidak terdapat pita artinya protein sudah

ter-elusi.

5.4. Uji potensi PSI susu knrnbing sebagai hrnunomodulator

5.4.1. Irnunomudulator pada Artitis Rhcmatoid

Sampel yang telah djelektroelusi disimpan dan digunakan sebagai bahan

uji immunomodulator pada hewan coba artritis. Tikus yang digunakan untuk uji

hewan sebanyak 6 ekor tikus yaitu 2 ekor tikus kontrol, 2 ekor &us artritis dm 2

ekor tikus amitis mendapat terapi protein spesifik. Setelah tikus mempunyai

gejala artritis, maka dilakukan terapi selama 14 hari dengan cara disonde 100 pl

hasil isolasi protein susu kambing sampai 14 hari. Perbandingan gambar hasil kaki

hewan coba yaag sehat, sakit dan terapi &pat dilihat pada Gunbar 5.2, 5.3 dan

5.4.

Gambar 5.2. Kaki tikus sehat (kontrol)

Gambar 5.3. Kaki tikus arhitis

Gambar 5.4. Kaki tikus yang telah diterapi

Gambar 5.5. Perbandingan makroskopis kaki tikus (kontrol, sakit dau pasca tempi)

Pada Gambar 5.2. terlihat bahwa kaki tikus sehaf tidak ada

pembengkakan. Gambar 5.3. menunjukkan terjadi pembengkakan sebagai

konfirmasi bahwa tikus menjadi arthritis rematoid. Pada Gambar 5.4. terlihat kaki

tikus artitis terjadi perbaikan pembengkakan mendebti kaki normal pasca terapi

Psl. Data maksroskopis tersebut dikonfirrnasi dengan data mikroskopis melalui

pewarnaan HE ( Hemaktoxilen Eosin), seperti pada Cambar 5.6

Data Gambar 5.6 tersebut menunjukan bahwa pada gambar kontrol

tam@ gambam tanpa adanya peradangan dengan kondisi pemukaan yang

halus, sedang pada garnbaran Sakit te qadi kerusakan pemukan dengan adanya

penonjola germukaan tulang sedang pa gambaran pasca terapi sudah terjadi

perbaikan permukaan tulang. Hasil tersebut menunjukkan bahwa PSI berfungsi

sebagai antioksidan dapat mengurangi peradangan dan sebagi imunomudulator

I I Kontrol

Gambar 5.6. Hasil. PA jaringan Periartikuler Sendi

Sakit Pasca Terapi

yang terbukti adanya perbaikan permukaan tulang. Data makroskopis d m

mikroskopis ini diperjelas dengan data SOD, dimana PSI ini berfungsi sebagai

antioksidan, antiidamasi dan imunomudulator. Tabel 5.3 menunjukkan adanya

penurunan aktivitas SOD pada tikus sakit dan setelah mendapat terapi PSI

aktivitas SOD meningkat mendekati nilai SOD pada hewan control. Hasil ini

mempunyai arti bahwa PSI susu kambing dapat berfungsi sebagai antioksidan

melalui scavenger mdilcal.

Tabel 5.3. Aktifivitas SOD

Perlakuan 73.45

53.45

5.42. Protein Spesifii sebagai Imunomudulator pada Enteritis

Hewan coba yang diberi perlakuan induksi indomethacin mengalami

enteritis dan selanjutnya dilakukan terapi dengan PSI b i l elektroelusi untuk

menguji fungsi imrnunomodulator pada hewan coba enteritis. Gambaran

mikroskopis tikus kontrol, enteritis dan pasca terapi dengan PSI seperti pada

Gambar 5.6 dimana dapat dijelaskan tejadi perubahan jaringan duodenum,

jejunum dan ileum pada hewan enteritis (b). Terapi dengan PSI dapat

memperbaiki struktur jaringan mendekati ,jaringan normal (c).

-- Duodenum

I I

I I Jejenum

Gambar 5.7. Perbandingan gambar duodenum, jejenum, ileum, pada tikus kontrol, enteritis dan pasca terapi secara milcroskwpis

I I

Data mikroskopis ( Gambar 5.7) ini dipejelas dengan data SOD dan

MDA, dimana PSI susu kambing berfangsi sebagai antioksidan, antiidamasi

dan imunomudulator. Tabel 5.4 menuqukkan adanya penunman aktivitas SOD

pada tikus sakit dan meningkat setelah mendapat terapi protein spesifik. Hasil ini

mempunyai arti bahwa PSI ini dapat berfungsi sebagai antioksidan melalui

scavenger radikal. Demikian juga kadar MDA (Tabel 5.5) menurun rnendekati

Kontrol Enteritis Pasca Terapi

normal setelah mendapat terapi PSI. Kadar MDA jaringan akan meningkat pada

kondisi dimana tejadi kerusakan jaringan.

Tabel 5.4. Kadar SOD pada Tikus Kontrol. Enteritis dan Terapi

- No 1

2

Organ jejunum

duodenum ileum

Perlakuan kontrol negatif (sehat)

3

Kadar SOD 109.354 111.673 117,172

konhl positif (sakit)-1 24 jam setelah induksi indometacin

4

1 1 1 ileum 1 0.235 1 0.240 1 0.238 1 1.951 1

kontrol positif (sakit)-2 7 hari stelah induksi indometacin

Tabel 5.5. Kadar malondial dehida Tikus Enteritis

jejunum duodenum

ileum

Pasca Terapi PSI susu kambing

NO -

1

62.840 59.563 58.658

jejunum duodenum

ileum

53.370 51.621 49.890

jejunum duodenum

ileum

93.675 96.968 102.438 -

Perlakuan

kontrol negatif (sehat)

Absorbansi

jejunum

duodenum

Rata- rata

0.1400

0.1950

1

0.138

0.194

kadar MDA

1.145

1.504

2

0.142

0.196

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN

6.1. Kesimpulsn

1. Protein spesifik dari susu kambing terbukti mampu menueunkan proses

peradangan 2. Protein Spesitik dari susu kambing terbukti sebagai antiinflamasi dan antioksidan

3. Protein spesifk terbukti b e h g s i sebagai imunomudulator.

Hasil penelitian menjadi bahan informasi bahwa susu kambing mengandung

kandidat imunomudulator yang digunakan sebagai antioksidan dan antiinflamasi.

DAETAR PUSTAKA

Alferez M.J.M., Aliaga LL., Barrionuevo M. and Campos M.S. 2003. Effect of Dietary Inclusidn of Goat Milk on the Bioavailability of Zinc and Selenium in Rats. J. Dairy Research (2003) 70 18 1-1 87.

Aliaga I.L., Alferez M.J.M., Nestares M.T., Ros P.B., Barrionuevo M., and Campos M.S. 2005. Goat Milk Feeding Causes an Increase in Biliary Secretion of Cholesterol and a Decrease in Plasma Cholesterol Levels in Rats. J. Dairy Sci. 88: 1024-1 030.

Allen TC, 1994. Hematoxylin and eosin. In (Prophet EB, Mils B, Arringtom JB, Sobii LH, eds). Laboratory methads in histotechnology. Washington : Aimed Forces Institute of Pathology, pp 53-58.

Allen TC, 1994. Mounting media. In (Prophet EB, Mills B, Aningtom JB, Sobin LH, eds). Laboratory methods in histotechnology. Washington : Armed Forces Institute of Pathology, pp 59-6 1.

Aulanni'am. 2005. Protein & Analisisnya. Citra Mentari Group, Malang. ISBN 978508423- X

Ausubel FM, Brent R, Kingston, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, SEruhl K, 1995. Short protocol in molffiular biology. Third edition, John Willey & Sons, Inc : 10.1-10.48; 11.5-11.7.

Chen W.Y., Weng M.H., Chen S.E., PehH.C., Liu W.B., YuT.C., Huang M.C., Chen M.T., Naglrhata H., and Chang C.J. 2007. Profile of Gelatinolytic Capacity of Raw Goat Milk and the Implications for Milk Quality. J. dairy Sci. 90:4954-4965.

Clare D.A., and Swaisgood H.E. 2000. Bioactive Milk Peptides: a Prospectus, J Dairy Sci, 83,1187-1 195.

Cross M.L. and Gill H.S. 2000. Immunomodulatory Properties of Milk. British Journal of Nutrition, 84. Suppl. 1, S81-S89

Dinarello CA, Moldawer LL, 2000. Proinflamatory and anti-inflamatory cytokines in rheumatoid arthritis. Second edition, Thousand Oaks : Amgen, pp 111-1 18.

Fiat A.M., Sarnour D.M. and Jolles P. 1993. Biologically Active Peptides from Milk Proteins with Emphasis on two Examples Concerrung Antithrombotic and Immunomodulating Activities. J. Dairy Sci 76:301-310

FitzGerald RJ, and Meisel H. 2003. Caseinophosphopeptides (CPPs) as fimctional ingredients, In Functional dairy products Edited by Tiina Mattila-Sandholm and Maria Saarela Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC

Geerlings A., Vilim I.C., Zarco F.H., Sanchez M., Vera R., Gomez A.Z. 2006. Identification and Characterization of Novel Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors Obtained h m Goat Milk. J. Dairy Sci. 89: 3326-3335.

Gill H.S., Cross M.L., Rutherfurd K.J. and Gopal, P.K. 2001a. Dietary Probiotic Supplementation to Enhance Cellular Immunity in the Elderly. Brit J Biomed Sci, 58, 94-96.

Gill H.S., Darragh A.J. and Cross M.L. 2001b. Optimising Immunity and Gut Function in the Elderly. JNurr, Health Ageing, 5,80-91.

Gill H.S., Doull F., Rutherfurd K.J. and Cross M.L. 2000, Immunoregulatory Peptides in Milk. Br JNutr, 84 (supplement I), 11 1-1 17.

Gill H.S., Doull F., Rutherfurd K.J., and Cross M.L. 2000. Immunoregulatory Peptides in Bovine Milk. British Journal of Nutrition, 84. Suppl. 1, S81-S89

Gill H.S., Rutherfurd K.J. and Cross M.L. 2001c. Dietary Probiotic Supplementation Enhances Natural Killer Cell Activity in the Elderly: an Investigation of Age-Related Immunological Changes. J Clin Immunol, 2 1,26&271.

Gill H.S., Rutherfwd K.J., Cross M.L. and Gopal P.K. 2001d. Enhancement of Immunity in the Elderly by Dietary Supplementation with the Probiotic Bifidobacterium lactis HN019. Am J Clin Nup, 74,833-839.

Gill H.S., Rutherfurd, K.J., and Cross, M.L. 2000. Bovine milk : A Unique Source of Immunomodulatory Ingredients for Functional Foods. In Funtional Foods 11 - Claims and Evidence. Pp 82-90. Cabridge: Royal Society of Chemistry Press.

Goldsby RA, Kindt TJ, Osbome BA, 2000. Kuby immunology. Fourth edition, New York : W.H. Freeman and Company, pp 1-514.

Haenlein G.F.W. 2001. The Many Medicinal Benefits of Goat Milk. Countryside and Small stock journal; Nov/Dec 2001; 85,6.

Hall 1,1994. Embedding. In (Prophet EB, Mills B, Aningtom JB, Sobii LH, eds). Laboratoly methods in histotechnology. Washington : Armed Forces Institute of Pathology, pp 39-43.

Haryono D. 2008. Mekanisme immunoneuromodulasi Teknik "Assited Drainage" pada Reaksi T i Alergi yang Terpapar Lipopolisaktuida Phorpyromonas gingivalis. Disertasi.

Korhonen H., Pihlanto-Lepptila A., Ran- P. and Tupasela T. 1998. Impact of Processing on Bioactive Proteins and Peptides. Trends Food Sci Technol, 8,307-319.

Lamothe S, Robitaille G, St-Gelais D, and Britten M. 2007. Short Communication: Extraction of B-casein from Goat Milk. J. Dairy Sci. 905380-5382.

Leporanta K. 2001. Developing Fermented Milks into Functional Foods. Innov Food Technol, 10,46-47.

Marriot B.M. 2000. Functional foods : an ecological perspective. Am.J.Clin.Nutr. 71(suppl): 1728s-I 734s.

McCullough F.S.W. 2003. Nutritional Evaluation of Goat's Milk. British Food Journal; 2003; 105,415.

Miller G.D., Jarvis JX., and Mcbean L.D. 2000. Handbook of Dairy Foods and Nutrition. second edition, Boca Raton, London, New York, Washington DC, CRC Press.

Pins J. and Keenan J.M. 2002. The Antihypertensive Effects of a Hydrolysed Whey Protein Isolate Supplement (BioZatelaj)). Cardiovasc Drugs Ther, 16 (Suppl I), 68.

Saxelin M., Korpela R., and Makinen A.M., 2003. Classifying Functional Dairy Products. In Functional dairy products Edited by Tiina Mattila-Sandholm and Maria Saarela. Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC

Tabatabai L.B. 2004. Good News for Goat's Milk Drinkers. Agri Research; 52,lO.

Tomotake H., Okuyama R., Katagiri M., Fuzita M., Yarnato M., and Ota F. 2006. Comparison Between Holstein Cow's Milk and Japanese-Saanen Goat's milk in Fatty Acid Composition, Lipid Digestibility and Protein Profile. Biosei, Biotechnol. Biochem., 70 (1 I), 2771-2774.

Xi-Ming Xu, Jie-Ping yu, Xiao-fei he, Jun-Hua Li, Liang-Liang Yu, Hong-Gang Yu. 2005. Effects of Garlicin on Apoptosis in Rat Model of Colitis. World Journal of Gastroenterology ISSN 1007-932.

Young A, dan R.J. Levi. 1990. Diarrhoea of Famine and Malnutrition-Investigations Using a Rat Model. 2-Ileal hypersecretion Induced by Starvation. Pubmed Central February (21):162-169.

DRAFT ARTIKEL ILMlAHlJURNAL NASlONAUlNTERNASlONAL

JUDUL: PROFIL PROTEIN SPESlFlK SUSU KAMBING SEBAGAI PANGAN NUTRASETIKA

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG

NOVEMBER 2009

PROFIL PROTEIN SPESlFlK SUSU KAMBING SEBAGAI PANGAN NUTRASETIKA

Masdlana Ch Padaga 'I, Manik Eirry Sawitri 'I, den Srl Mumanin

"program Stud1 Teknologl Hesll Ternak, Fakultas Peternakan Un~vers~tas Braw,aya.Malang 2'~ekultas Kedokteran Unlversltas Bram)aye,Malang

ABSTRACT

This research aims to study the protein profib of goat's milk compares to cow's milk, to

explore the potential of PSI in goat's milk as an i~nmunomodulator, to prove that the antibody

against PSI is specific and has a cross reaction effed with other sources so that if can be used

in development of diagnostic kit for nutmceutical food quality. &periment results shows that

there is a variety of milk protein content from various goat's milk sample (A, 8 and C) and cow's

milk sample. The mix from goat's milk elution resulted in a high protein content of 51.625 mgR.

Usipg SDS-PAGE method showed that pmffle of proteln of goat dMer hwn cow's mllk. The

goat's milk contain specific protein (Psl) milk with moleculer weight of 36-55 kDa. Test using

arthritis rheumatoid and entetitis animal models showed that PSI 36-55 kDa has the function as

an antioxidant. which can lessen inflammations. The acfivity of SOD and Malonal D~aldehide

(MDA) contain isdated from the tissues closed to normal condition affer treated with PSI This

results proved fhat goat's milk PSI has the function as an antioxidant by radical scavenger. The

rat induction with indomethaan 15 mgAg BW causes enteritis. l l m micrascopic result

(pathdogyanatomiflA) showed tissue repairing asfter PSI therapy in duodenum, jejunum and

ilium, which has been damaged because of enteritis. This data is clarif~md by This proved that

PSI also has an antioxidant, anti-iflammatory and imunomodulator. It can be concluded fhat

specific pmtein (Pso fmm goaf's milk can prevent inflammation, has an antioxidant and

immunomoduIator effect The results of this research is an informatmn that goat's milk is a

candidate forimmunomodulator which is used as an antioxidant and anti-inflammatory.

KEY WORDS: goat's milk, nutraceutical food, SOD, Malonal Dialdahide (MDA), immunomodulator.

PENDAHULUAN

Pangan nutrasetika didefinisikan ~ b a g a i pangan atau komponen pangan yang dapat memberikan manfaat kesehatan kepada konsurnen (Marriot. 2000). Susu kamblng sebagaimana halnya susu sepi mengandung komponen-komponen yang telah terbukti mempunyai manfaat kesehatan (Haenlein, 2000). Menurut McCullough (2603) kandungan laktosa dan protein susu kambing hampir sama dengan susu sapi, namun terdapat perbedaan struktur dan protein immnologik. selain itu susu kambing mengandung asarn-asam lemak rantai sedang dan globular lemak pada susu kambing relatif lebih kecil dibandingkan lemak susu sapi.

Sebagai pangan nutrasetika susu kambing dapat memberikan solusi terhadap penderita alergi terhadap susu sapi atau susu kedelai. Reaksi alergi terhadap susu biasanya disebabkan oleh laktosa atau protein susu. Laktalbumin dan kasein pada susu kambing mempunyai struktur yang berbeda dengan susu sapi sehingga t i a k menyebabkan reaksi alergi pada bayi dan anak-anak yang sensitive terhadap laktalburnin sapi (Lamothe et al.. 2007).

Susu sapi mengandung as1 casein yang merupakan nllergan utamn snrnpai 33,756 dibandingkan dengan susu kambing yang hanya 3.9% (Tomotake et al. 2006) dan pcasein sebagai antihipertensi leblh Unggi pada swu kambing (Lamothe et al.. 2007).

Hasil penaltian menunjukkan bahwa terdapat perbedaan sifat fisikekimia antara lemak susu kambing dan susu sap1 Menurut McCullough ( 2003) globula lemak susu kambing relatif lebih kecil sehingga lebih mudah dicema dan area perrnukaan globula lemak yang leb~h luas pada susu kambing dapat meningkatkan aktivitas lipase pankreas. Tomotake et el.,( 2008) melaporkan bahwa jumlah total asam lemak rantai pandek dan sedang (C4. C6. C8 dan ClO) mencapal 16,l % - 19,7% pada susu kambing dibandingkan

susu sapi yang hanya 58%. Susu kambing mengandung asam palmitat (C16) lebih rendah dibandingkan susu sapi. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Alferez et a/., (2003) dengan hewan wba tikus, menunjukkan bahwa konsumsi susu kambing dapat meningkatkan keterrediaan zink dan selenium. Dengan mernpertimbangkan beberapa karakteristik susu kambing diantaranya mudah dicerna, sumber energi yang baik dan tidak menyebabkan blergi maka susu kambing dapat dimanfaatkan sebagai sumber pangan nutrasetika.

Beberapa penelitlan yang sudah dilakukan selama periode 10 tahun terakhir melalui identifikasi dan karakterisasi komponen susu yang dapat mempengaruhi fungsi sistem lmmun menunjukkan bahwa komponen yang paling berperan adalah protein susu (Gill et a/. 2000). Secara in vibo a, p, dan x casein, whey protein, lactoferrin. dan endogenus lgg susu terbukti dapat memodulasi prolifersi limfosit. Efek ini dapat tejadi pada beberapa spesles ruminan dan non ruminan. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa potensi immunomodulator protein susu secara filogenetik tidak terbatas, namun terdapat variasi pada pengaruh antar species (Martin et a/. 2009). Caseinophosphopeptides (CPPs) diiaporkan mempunyai efek antihipertensi. Anticaries dan antialefa (Fitzgmld et al. 2003).

Percobaan seura in vivo pada hewan wba tikus menunjukkan bahwa derivat a- casein, isracidin. dapat mencegah infeksi SIaphylocaxus aumus (Gill et a/. 2000). Protein susu juga terbukti dapat meningkatkan respon antibodi mucosal terhadap pernbenan antigen dan vakiilrl secara per oral. Percobaan ini dilakukan menggunakan hewan coba tikus yang diberi ovalbumin, toksin kholera, toksin polio dan vaksin Rue (Gill et al.. 2002a, b, c, d: Low et a/., 2001).

Bahan dan Alat Bahan yang diperlukan adalah Tikus

putih (Rattus norvegicus) wistar jantan umur 2 bulan berat 100-130 g (Lab Biologi Molekuler Seluler F.MIPA. Malang), Buffer silrat pH 4.5, Antibodi primer Rat Anti iNOS (Santa cruz biotechnology), Antibodi sekunder Anti Rabbit IgG Biotin labelled. Kit Apoptag, kit iNOS. Pewama Mayer Hematoxylen (Pierce), Eosin, Cromogen DAB (Santa cruz biotechnology). PBS (Phospat Buffer Saline), PBS PMSF, Tris HCI, butanol, Dl (Deionized Water). Hidrogen Peroksida (H2O2) 3% (Dako,lnc), Aquades. Ethanol 70%. Ethanol 80%, Ethanol 90%, ethanol 9S%, Ethanol Absolut, Xylol, Parafln. NaCl 0.9%, Entellan, Serum BSA (Bovine Serum Albumin) (Sigma, USA), Aquades dan PBS-Tween.

Peralatan yang akan digunakan adalah seperangkat alat gelas, sentrifuge. sonlkator, refrigerator, tsbung eppendorf, Sodium Dodecyl Sulphate- Polyacrylamide Gal Electrophoresis (SDS-PAGE). Alat-alat yang diperlukan unluk pemeliharaan dan perlakuan tikus adalah sekam sterll, kandang. wadah minum, wadah pakan, syringe (volume 1 ml).

Metodolog1 Penelltian Tahap 1 Isolasl Pmteln Susu

lsolasi protein susu dilakukan dengan metoda Aulani'am (2005). Kedalam sampel susu ditambahkan PBS PMSF 4 mM, kemudian dilakukan sonifikasi selama dan d~lenjutkan dengan sentrtfugas~ pada 10.000 rpm. Polet yang diperoleh dilarutkan dalam Tris HCI 20 mM dan disimpan pada suhu - 20°C sampai siap untuk analis~s sdanjutnya.

Karakterisesl dan ldentifikasi Pmtein susu deqan SDS- PAGE

Protein hasil lsolasi dlldentiflkasi menggunakan SDS-PAGE (Aulani'am 2005). Kedalam alat SDS-PAGE masukkan running gel melalul dlndlng sampal kunng dad bates atas, kemudian ditambahkan butanol 1 ml dan

dibiarkan selama 25 menit. Sefeiah gel membeku, butanol dibuang, dibersihkan dengan PBS, dan dikeringkan dengan Whatman paper. Selanjutnya dibuat stacking gel melewati dinding sampai penuh, masukkan comb dan ditunggu sampai benar-benar set (25 menil). Selanjutnya comb diambil dan dibenihkan dari sisesisa gel dengan buffer. Gel yang diperoleh dicuci dengan buffer dan hasilnya divisualisasikan dengan pewamaan silver atau langsung ditransfer ke membmn nitr0s~Iulose.

lsolasi Protein spesifik (Psl) susu dengan Teknlk Elektroelusi

Gel SDS-PAGE yang tidak diwarnai drpotong sepanjang plta yang dikehendakl. Masingmasing potongan gel dimasukkan ke dalam kantong nilon. Selanjutnya d~masukkan dalam block glass yang mengandung PBS, setelah ~ t u di stirer selama 24 jam Setiap 6 jam dilakukan penggantian PBS Untuk nlengetahui bahwa protein sudah mengalami elusi maka potongan gel diwamai dengan pewarnaan silver, bila tidak terdapat plta artinya protein sudah ter-elusi.

Tahap 2 Uji potensl Psl susu kambing sebagal

immunomodulator Pada penelitian in1 fungsi

immunomodulator diuji menggunakan hewan model Tlkus (Raltus norvegicus, gaslr wlstar) berat 150 g dan diberi perlakuan artr~t~s rematoid dan enteritis.

Selanjutnya dilakukan tempi dengan Psl dan fungsi immunomodulator diuji melalui pemenksaan: mediator-medtator s~stem lmmun (immunohistokimia), radikal bebas melalui pemeriksaan MDA (malonaldiaklehid) dan SOD (superoksid dlsmutase),Histopatol~gis Dada organ sp&flL, (pemdian, usus, trachea dan bronchus) dengan HE

Pengukuran aktlvltas superokslda dismutaw (SOD) jaringan

Pengukuran SOD dllakukan 6euara spektrofotometri panjang gelombang 580 nm menggunakan reaksi warna sebagai indikator.

3

Aktivitas supsroksida dlsrnutase diteritukan dengan lnterpolasl kurva baku yang sudah dlslapkan terlebih dahulu (Laboratonurn O~orned~k, 2003)

Pengukuvan kadar MDA jaringan Pengujian MDA dilakukan dengan

rnengukur absorbansi rncnggunakan spekrofotorneter pada panjang gelombang 531 nrn. Kader MDA drtentukan dengan interpolasi k u ~ a baku (Laboratonurn Biornedik, 2003)

Pemeriksaan Histopatulogi Pada pernbuatan sed~aan

histopatolqi, jaringan harus drfiksas~ terlebih dahulu dengan tuluan untuk menghentikan proses autolisis pada sel yang disebabkan oleh enzirn pencemaan oada lisoslrn van9 - - dilepaskan Gda saat sel mengalami kernatian (Laboratoriurn Biornedik, 2004).

HASlL DAN PEMBAHASAN

lsolasi protein susu sapi dan susu kambing

Susu kambing dan susu sapi diperoleh dari peternakan rakyat. Susu karnbing dikoleksi dari 3 ekor karnbing yang berbeda (A B.C) dan pengambilan sarnpel dilakukan duplo. lsolasi protein susu dilakukan dengan rnetoda Aulani'arn (2005). Data konsentrasi protein susu sapi dan susu karnbing sepetti pada Tabel 1.

Tabel 1 menunjukkan bahwa terdapat variasl kandungan protein susu dari berbagai sampel susu karnbing ( A,B dan C ) , sarnpel susu Sap1 ( S) se~ta hasil el us^ Pada carnpuran hasil elusi protein susu karnbing diperoleh kadar protein yang cukup tlnggi yaitu 51625 mg/Liter Hal in1 rnenjelaskan batlwa rsolat protein rnemenuhi persyaratan untuk d~gunakan sebagai molekul b~oakt~f yang akan dluji sebagai anti inflarnas~ dan ant1 radang

Karakterisas! dan lderrtifikasi Protein susu dengan SDS-PAGE

Sarnpel protein susu selanjutnya dianalisis profil protelnnya dengan SDS. PAGE, hasil elektroforesis protein susu dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Hasil elektroforesis protein susu Deri Camber 1 dapat diketahui

terdapat protein spesifik susu karnbing yang berbeda denaan arotein susu saai vaitu oada berat rnolekd 3&55 kDa ~asrl ' p&rhllungan

Tabel 1. Konsenlrasi Protein Sarnpel berat molekul (kDa) pada plta dapat dlllhat

- 5 / Campwan / o.ia / o,nl / 0.207 5782,s -4 surnber pangan nutrasetika. ~ a d a percobaan

selanjutnya, dilakukan isolasi protein spesifik

3 -- . 4

. .

elusi I (Psl) susu kambing dengan teknik elekt;oelusi untuk rnenguji fungsi imrnunomodulator Psi.

4

pada Tabel 5 2 Proteln spesifik susu karnblng dengan berat molekul 32 kDa dan 61 4 kDa tidak ditemukan pada susu sap1 Dernikian juga proteln spesmk susu sapi dengan berat molekul 10 3, 30,1, 66,s dan 86,O kDa tidak diternukan pad8 susu kambing Hal ini

NO

1 -- 2

c .-s--

Sampei

A ' B

0,173

1,oX

Absomnsi (541~m)

0,152

0,042

Prde'n

(ppm)

612.5

3437,5

A1

0.010

Qs151

protein m x '')

6125

-34@7c

0,183

0,039

A2

0.039

Rerata

0,025 --

Q,138

4082,5

Q75,O

40625

9750

menunjukan bahwa susu sapi-dan susu karnblng mengandung potensial protein spesifik yang dapat dikernbangkan rnenjadi

Tabel 2 menunjukan bahwa protein susu dengan berat mol 32 kDa dan 81,4 kDa hanya terdapat pada susu kambing. Demikian juga protein spesifik susu sapi dengan berat molekul 19.3; 30.1; 663 dan 86,O kDa tidak ditemukan pada susu kambing. Menurut Lamothe el a/.. (2007) protein susu kambing mempunyai struktur yeng berbeda dengan susu sapi. Susu sapi mengandung as1 casein lebih tinggi dibandingkan susu sapi (Tomotake et el.. 2006) den sedangkan P- casein yang mempunyai fungsi antihipertensi lebih tinpgi pada susu kambing (Lamothe ot a/., 2007). Hal ini rnemungkinkan beberapa protein spesifik yang terdapat pada susu kambing digunakan sebagai bahan bioaktif pada pangan nutrasetika.

Tabel 2. Hasil berat molekul pada pita (kDa) _

lsolasl Protein speslfik (Pel) susu dengan Teknlk Elektmelusl

Pita ke-

1

Gel SDS-PAGE dipotong wpanjang pita yang dikehendaki (pita dengan berat molekul (36-55 kDa). Masing-masing potongan gel dimasukkan ke dalam kantong nilon. Selanjutnya dimasukkan dalam Mock glass yang mengandung PBS, setelah itu di stlrer da rn8 24 jam, Setlap 0 lam dllakukan penggantian PBS. Untuk mengetahui bahwa protein sudah mengalami elus1 maka

potongan gel dmarnai dengan pewarnaan silver, bila tidak terdapat plta artinya proteln sudah ter-dusi. Protein hasil elust diuji fungslnya sebagai irnmunomodulator untuk membuktikan bahwa susu kambing sebagai pangan nutraset~ka.

BM (kDa)

KESIMPULAN

Terdapat perbedaan profil protein susu sapi dari susu karnbing. Protein spesifik susu kambing dengan berat molekul 36-55 kDa dapat dikembangkan sebagai sumber pangan nutrasetika setelah dilakukan pengujian fungsi immunomodulator

Sapi Kamb~ng

DAPTAR PUSTAKA

(A) (R)- (C) 142.6 1 142.5 142.5 1 1426

Kamb~ng Kambing Alferez M.J M., Aliaga l , L , Barrionuevo M.

and Campos M S 2003 Effect of Dietary Inclusibn of Goat Milk on the Bioavailability of Zinc and Selenium in Rats J. Dalry Research (2003) 70 181-187.

Al~aga I L , Alferez M.J M., Nestares M T , Ros P B , Barrionuevo M.. and Campos M.S 2005 Goat Mtlk Feeding Causes en Increase in Biliary Secretion of Cholesterol and a Decrease in Plasma Cholesterol Levels in Rats. J. Dairy Sci. 88: 1024- 1030.

Allen TC, 1994. Hematoxylin and eosin In (Prophet EB, Mills B. Arr~ngtom JB, Sobin LH. ids). Laboratory methods in histotechnology. Washington : Armed Forces Institute of Pathology, pp 53- 58.

Allen TC, 1994. Mountlng media. In (Prophd EB. Mills B, Aningtom JB, Sobin LH, eds). Laboratory methods in histotechnology. Washington . Armed For- Institute of Pathology, pp 59- 81.

Aulanni'am. 2005. Protein & Analisisnya. Citra Mentari Group, Malang. ISBN 976508423-X

Ausubel FM. Brent R. Kingston, Moore DD, Se~dman JG, Smith JA. Struhl K. 1995 Short protocol in molecular b~ology. Third edition, John Willcy & Sons, lnc : 10.1-10.48, 11.511.7.

Chen W.Y., Wang M.14.. Chen S E., Poh H.C., Liu W.B.. Yu T.C., Huang M C., Chen M T , Nagahata H., and Chang C.J. 2007. Profile of Gelatinolytic Capacity of Raw Goat Milk and the Implications for Milk Quality. J. dairy Sci. 90:4954- 4965.

Clare D.A., and Swaisgood H.E. 2000. Bioactive Milk Peptides a Prospectus, J Dairy Sci, 83, 1187-1 195.

Cross M.L. and Gill H.S 2000. lmmunomodulatory Properties of Milk. British Journal of Nutrition, 84. Suppl. 1. S81-S89

Dinarello CA. Moldawer LL, 2000. Proidlamatory and anti-innamatory cytokines in rheumatold arthritis Second edition, Thousand Oaks : Amgen, pp 111.118.

Fiat A.M., Samour D M and Jolles P. 1993 Biologically Active Peptides from Milk Proteins with Emphas~s on two Examples Concerning Antithrombotlc and lmmunomodulating Activities. J. Da~ry SCI 76:301-310

FitzGerald RJ, and Meisel H. 2003. Caseinophosphopeptides (CPPs) as functional lngedients, In Functional dairy products Edited by Tiina Mattila- Sandholm and Maria Saarela. Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC

Identification and Charactenzatron of Novd Angiotensin-Converting Enzyme lnh~bitors Obtained from Goat Mllk. J Dalry Sci. 89: 3326-3335.

Gill H.S.. Cross kl.L., Rutherfurd KJ. and Gopal, P.K. 2001a Dietary Probiotic Supplementation to Enhance Cellular Immunity in the Elderly. Bril J B~omed Sci, 58. 94-96.

Gill H.S.. Darragh A.J. and Cross M.L. 2001 b. Optimising lmmunity and Gut Function in the Elderly. J Nutr, Health Ageing, 5, 80-91.

Glll H.S., Poull F.. Rutherfurd K,J, and Cross M.L 2000, lrnmunoregulatory Peptic's in Milk. Br J Nutr, 84 (supplement I ) , 111-117.

Gill H.S., Doull F., Rutherfurd K.J., and Cross M L. 2000. lrnrnunoregulatory Peptides in Bovine Milk British Journal of Nutriiion, 84. Suppl. 1, S81-S89

Gill H.S.. Rutherfurd K.J. and Cross M L 2001 c. Dietary Probiotic Supplementat~on Enhances Natural Killer Cell Activity in the Elderly. an lnvest~gat~on of Age-Related Immunological Changes. J Clin Immunol. 21,264-271.

Gill H.S., Rutherfurd K.J., Cross M L and Gopal P.K. 2001d. Enhancement of Immunity in the Elderly by Dietary Supplementabon wlth the Probiobc Bfidobacterium ladis HN019. Am J CCn Nulr, 74,833-839.

Gill H.S., Rulherfurd. K.J , and Cross. M L. 2009, bovine milk . A Unique Source of lmmunomodulatory lngredlents for Functional Foods. In Funtional Foods II - Claims and Evidence Pp 82-90, Cabrldge: Royal Soclety of Chemistry Press.

Geerlings A, Wliar LC., Zarco F.H., Sanchez M., Vera R., Gomez A.Z. 2006.

Goldsby RA. Kindl TJ. Osborne BA, 2000. Kuby Immunology. Fourth edltlon, New York : W.H. Freeman and Company, pp 1-514.

Haenle~n G.F.W. 200t. The Many Medicinal Benefits of Goat Milk. Countrys~de and Small stock journal; NovIDec 2001; 85, 6

Hall J, 1994. Embodding In (Prophat €6, Mills B, Arnngtom JB, Sobin LH, eds). Laboratory mothods ~n h~stotechnology. Washington : Armed Forces lnstltute 07 Pathology, pp 39- 43

Haryono D. 2008. Mekanisme lmmunoneuromodulasi Teknlk 'Assited Drainage" pada Reaksr T~kus Alergi yang Terpapar Lipapolisakarida Phorpyromonas glngivalls Dlsertasl

Korhonen H , Pihlanto-LeppBl'd A,, Rantarnaki P. and Tupasela T. 1998. Impact of Processing on Bloactlve Protans and Peptides. Trends Food Sci Technol, 8, 307-31 9.

Lamothe S. Robitaille G, St-Gelais D, and Britten M. 2007. Short Communication: Extraction of 8-casoln from Goat Milk. J. Dairy Sci. 90:53805382.

Leporanta K. 2001. Developing Fermented Milks into Fu~ctional Fwds. Innov Food Technol. 10,4647.

Mamot B.M. 2000. Functional foods : an ecological peffipectlve. Am J Clln.Nutr. 71 (suppl):l728s-1734s.

McCullough F.S.W. 2003. Nutritional Evaluation of Goat's Milk. British Food Journal; 2003: 105, 415

London, New York, Washington DC, CRC Press.

Pins J. and Ueenan J.M. 2002 The Antlhypertenslve Effects of a Hydrolysed Whey Protein Isolate Supplement (BloZatel@). Cardlovasc Drugs Ther, 16 (Suppl I), 68.

Saxelin M.. Korpela R , and Maklnen A.M., 2003. Classifying Functional Dalry Products. In Functional dalry products Edited by Tlina Mattila-Sandholm and Maria Saarela. Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC

Tabatabal L 6. 2004 Food News for Goat's Milk Drinkers. Agri Research; 52. 10.

Tornotake H., Okuyama R., Katagiri M., Fuzita M., Yamato M., and Ota F. 2006. Comparison Between Holstein Cow's Milk and Japanese-Saanen Goat's milk in Fatty Acid Composition, Lipid Digestibility and Protein Profile. Biosci, Biotechnol. Biochem.. 70 ( I?), 2771- 2774.

Xi-Ming Xu. Jie-Ping yu, Xiao-fei he. Jun-Hua LI, Liang-Liang Yu, Hong-Gang Yu. 2005. Effects of Garlicin on Apoptosls In Rat Model of Collbs. World Journal of Gastroenterology ISSN 1007-932

Young A,. dan R.J. Lovi. 1990. Diarrhoea of Famine and Malnutritioo-l~vestigat~ons Using a Rat Model. 2-Ileal hypersecretion Induced by Starvation Pubmed Central February (21):16'?- 169

Millar Q.D., JaNis J.K., and Mchan L.D. 2000. Handbook of Dairy Foods and Nutr~tion second edit~on. Boca Raton,

SlNOPSlS PENELITIAN TAHAP II HlBAH BERSAING TAHUN ANGGARAN 2009

Potensi Protein Spesifik Susu kambing sebagai lmmunomodulator dan lmmunogen :

Upaya Pengembangan Pangan Nutrasetika

Ketua : drh.Masdiana Ch. Padaga. M.App.Sc. Anggota : I. Ir.Manik Eirry Sawitri. MS

2. Dr. Sri Murwani. drh.MP

Dibiayai Oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional, sesuai dengan Surat Perjanjian

Pelaksanaan Hibah Kornpetitif Penelitian Untuk Publikasi Internasionel Batch ll, Tahun Anggaran 2009 Nomor : 660/SP2HIPPIDP2MN1112009

tanggal 30 Juli 2009

UNlVERSlTAS BRAWIJAYA NOVEMBER 2009

1. Judul Usulan : Potensi Protein Spesifik Susu kambing sebagai

lmmunornodulator dan lmrnunogen : Upayli Pengembangan Pangan

Nutrasetika.

2. Ketua Penelilj

(a) Nama Lengkap : drh.Masdiana Padaga. MApp.Sc

(b) Bidang Keahlim : Teknologi dan Mikrobiologi Pangan

Anggota Peneliti:

2.

I FKUB

Institusi

3

Alokasi waktu (j am/Minggu)

10

Keahlian No

1r.Manik Einy Sawitri. Ms

4. Tema Peneli tian : Ketahanan Pangan

Nama dan Gelar

Dr. Sri Murwani, drh. MP

5. Obyek Penelitian

Penelitian yang akan dilaksanakan pada tahun 2 untuk mempelajh

potensi protein spesifik yang terkandung dalam susu kambing sebagai bahan

irnmnomodulator dan irnmunogen cialam upaya mengembangkan pangan

nutmwtika berbahan baku lokal. Untuk itu maka pokok kegiatan pada

Teknologi susu

Biomedik

penelitan ini adalah :

a. Melakukan konfirmasi potensi PSI sebagai bahan immunomodulator dalam

meningkatkan sistem immun pada hewan coba.

b. Melakukan konfirmasi te rjadinya perubahan immunologis pada hewan model

tikus (Rams norvegicus, galur wistar) yang diberi perlakuan h t i s dan asma

melalui kajian histopatologis, imunohistokiia, dan profil radikal bebas

Fapet UB

c. Mengembangkan kit diagnostik berbasis immunologi yang akan digunakan

sebagai dasar penentuan kualitas pangan nutrasetika.

6. Lokasi penelitian :

Laboratorium susu, PS Teknologi Ifasil Temak, Fapet UB,

Laboratonurn Sentral Ilmu Hayati, 1,aboratorium biokimia, Jurusan Kimia

FMIPA UB dan Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran UB, Malang.

7. Hasil yang ditargetkan :

a. Mendapatkan antibodi terhadap Psl susu kambing yang &pat bereaksi silang

dengau produk rmsu non kambiig

b. Mendapatkan kit diagnostik untuk deteksi immunomodulator dan penentuan

kualitas pangan nutrasetika.

8. lnstitusi lain yang ierlibat:

Laboratorium biokimia, Jurusan Kimia FMIPA UB dan Laboratorium

Biomedii Fakultas Kedokteran UB, Malang

9. Sumber biaya selain Dikti : tidak ada

10. Keterangan lain yang dianggap perlu : - Ketua peneliti telah banyak melakukan penelitian dalam hal rekayasa

produk pangan nutrasetika berbasis susu diantaranya pemanfaatan whey sebagai

limbah proses pembuatan keju untuk menghasilkan minuman kesehatm,

pernbuatan es krim sinbiotik berbahan baku lokal. Memberikan pelatihan tentang

pernbuatan produk susu terfementasi. Penelitian ini akan melibatkan mahasiswa

S1 Teknologi Hasil Ternak Fapet UB dan mahasiswa SI Kimia sebagai bahan

tugas akhir.

I 1. Rancangan (Desain Riset) :

Pada pnelilian tahun 2 akan dilakukan 2 tahap percobaan yaitu (1) kajian

PSI susu kambing sebagai bahan induksi antibodi terhadap PSI ymg akan

dipnakan sebagai reagen deteksi immunomodulator pada produk pangan berbasis

susu, dan (2) Penyiapan kit diagnostik untuk pengujian kualitas pangan

nutrasetika. Skema mncangan penelitian tahun kedua dapat dilihat pada gambar di

bawah.

Rancangan (Desah Riset) :

immunogenisitas u Antibodi PSI <r>

Uji spesifisitas dan reaksi sileng immunogenisitas

Western blot +-rF+ Penylapan kit

diagnostik

KIT DIAGNOSTIK c l r > Gambar I. Skerna uji PSI susu kambing sebagai immunogen untuk menghasilkan

kit deteksi immunomodulator pada produk olahan susu

Rangkaian percobaan pada penelitian yang akan dilakukan pada tahun

kedua ini akan menjawab beberapa pertanyaan sebagai berikut :

1. Apakah antibodi hadl induksi PSI dari susu kambing bersifat spesifik dan dapar

bereaksi silang dengan protein spesiiik yang ada pada susu sapi dan produk

olahan susu?

2. Apakah antibodi terhadap Psl dapat dikembangkan sebagai reagensi untuk

deteksi bahan immunomodulator untuk pengembangan pangan nutrasetika ?

Untuk menjawab pertanyaan tersebut diatas maka pada penelitian ini akan

dilakdan 2 tahap percobaan yaitu (1) kajian PSI susu kambing sebagai bahan

induksi antibodi terhadap PSI yang akao digunakan sebagai reagen deteksi

immunomodulator pada produk pangal berbasis sum, clan (2) Penyiapan kit

diagnostik untuk pengujian kualitas pangan nutrasetika

Metoda Percobaan Tahun 2

Bahan dan Pemlatan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: hewan coba

kelinci jantan, PBS, CFA, SAS 5096, IFA, buffer fosfat pH 7, enzim alkalin

phosphatase.

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Kandang atau bak

pemeliharaan hewan coba (Lab Biologi Molekuler Seluler F.MlPA Malang),

Neraca analitik (Sartorius), Mikropipet (Eppendofl, Yellow Tip, Tube 1.5 ml

(Eppendorf), Dispossable syringe 29.9 G 1 ml (Terumo syringe), sentrifuge,

staining jar, blok parafin, mikrotom, cover glass, obyek glas, mikroskop cahaya

(Nicon), incubator, hot plate, Staining Jar, Dissecting set, Mortal.

Percobaan Tahep 1

Uji Protein spesifk susu kambing hasil purifikasi sebagai immmogen

1. Imunisasi hewan coba

Imunisasi kelinci jantan secara subcutan pada kelompok kontrol dengan

PBS + CFA, sedangkan untuk kelompok PI di imunisasi dengan PSI susu + CFA

(perbandingan 1 : I) masing-masing dengan dosis 150 p1/ subkutan, kelompok P2

diimunisasi dengan PSI susu+ CFA (perbandingan 1 : 1) masing-masing dengan

dosis 100 pl! subkutan.

- Semua kelompok hewan coba diimmsasi ulang (booster) dengan penyuntikan

PSI susuditambah denga IFA dengzin dosis yang sama dengan imunisasi

pertam. - Imwisasi ulang (booster) dilakukan IPA dengan dosis yang sama.

- Pengambilan sampel darah di lakukan pada minggu ke-3 dan minggu ke-7

dengan penambahan IFA dengan dosis yang sama.

- Pengambilan sampel darah dari masing-masing kelinci sebanyak 3 cc melalui

vena auricularis dilakukan pada ~ninggu ke-l 3,4,5,6,7,8,9,10 dan 11

selanjutnya purifkasi serum dan analisis titer antibodi PSI susu dengan elisa

indirect.

2. Preparasi Serum

Pengambilan darah untuk memperoleh anti-PSI susu dilakukan melalui

vena auricularis pada kelompok kelinci lokal jantan yang telah di induksi dengan

isolat PSI susu masing-masing pada minggu ke-l sampai minggu ke-1 l setelah

imnnisasi, kemudian dilakukan pemisahan serum dengan rneroda senrrfugasi

(1500 rpm selama 20 menit). Presipitat dibuang, supemataunya dipindahkan ke

dalam microtube dan disimpan pada suhu - 2 0 ' ~ ttntuk selanjutnya dilakukan

purifikasi.

3. Purifikasi Anti PSI Susu dari Serum

Serum ditambah dengan SAS 50% dengan perbandingan 1:1, kemudian

dihomogenkan dengan mengpakan vortex. Selanjutnya diinkubasi pada suhu

4 ' ~ selama beberapa menit. Serum disenbifugasi dengan kecepatan 3000 rpm

pada suhu 4 ' ~ selama 30 menit. Supernatan dibuang, presipitat dicuci dengan

SAS 50% (lox volume pelet), kemudian dihomogenkan deogau menggunakan

vortex. Selanjutnya disentrikgasi dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 ' ~

selama 30 menit. Prcsipitat ditambah denyan 0,05 M buffer fosfat pH 7 sampai

volume 1 rnl. Diiarjutkan dialisis dalam 0.01 M buffer fosfat pH 7, semaIam pa&

suhu 4Oc . 4. Uji spesifisitas anti-PSI susu hasil induksi isolat PSI susu melalui metode dot

blot. Kmakterisasi anti PSI susu juga dilakukan berdasarkan spesifisitas reaksi

dengan isolat Psl. Analisis melalui metode dot blotting.

e. Uji spesifisitas anti-PSI susu hasil ~nduksi iwlat PSI sum melahi metode

Western blot.

Western Blot dilakukan dengan lnenggunakan fiagmen pita PSI yang telah

di-g dalarn SDS- PAGE ditrar~sfcrkan pada membran nitrosellulosa.

Membm diblok dengau larutan 3 % BSA dengan anti-PS. sebagai antibodi

primer. Kemudian dicuci dalam Tris- C1 yang mengandung 0,05 % Tween 20.

SeIaujufnya membm diinkubasi dengan antibodi sekunder ( anti-Rabbit IgG

label AP, pengencerdn 1 : 1000 ) dan d~tambahkan substrat western blue.

Percobnan Tahap 2

Pada tahap kedua akan dilakukan penyiapan Kit Diagnostik berbasis

immunologi dengan teknik direct immunobloting (Aulani'am 2004).

Antibodi yang sudah diuji spesifisifasnya dan ada reaksi silang dengan

produk olahan susu dilakukan labeling dengan enzim allcalk phosphatase (Ap).

Produk akhir adalah antibodi terhadap protein spesifik yang berlabel enzim Ap

yang secara langsung dapat digunakan sebayai perangkat deteksi kualitas pangan

nutrasetika.