Bakteri Transformasi Keseluruhan Gambar pMSH1 Transformasi Penyisipan G / MmSOD gen ke dalam Escherichia DH5a E. Plasmid

Plasmid

kecil (1-1000 kb)

melingkar

Extrachromosomal DNA

Pertumbuhan adalah independen dari siklus sel inang; amplifikasi produk gen Jenis vektor kloning digunakan untuk membawa gen tidak ditemukan dalam kromosom inang

bakteri yang Mengapa Plasmid adalah Vektor Kloning Baik

kecil ukuran (mudah untuk memanipulasi dan mengisolasi)

melingkar (lebih stabil)

independen dari replikasi sel inang

beberapa salinan mungkin ada (memfasilitasi replikasi)

sering memiliki ketahanan antibodi (deteksi mudah) Transformasi Proses mentransfer fragmen DNA asing ke dalam sel (host) penerima untuk pertumbuhan dan

replikasi

sel inang kami: DH5a E. coli

DNA asing kami: G & MmSOD (yang terkandung dalam pMSH1 plasmid) Keseluruhan Proses Transformasi 1. Vektor plasmid harus dipotong dengan endonuklease restriksi (enzim restriksi) 2. DNA ligase bergabung dengan fragmen DNA & DNA vektor 3. Sel inang dibuat kompeten sehingga dapat plasmid dapat memasukkan 4. Sel kompeten adalah mereka mampu mengambil plasmid 5. Umumnya terjadi melalui kejutan panas dan penambahan kation divalen untuk permeabilize membran 6. Sel berubah tumbuh pada media seleksi Transformasi produk ligasi

Proses mentransfer DNA ke dalam sel eksogen adalah panggilan "transformasi"

Pada dasarnya ada dua metode umum untuk mengubah bakteri. Yang pertama adalah metode kimia menggunakan CaCl2 dan kejutan panas untuk mempromosikan masuknya DNA ke dalam sel. Metode kedua disebut elektroporasi berdasarkan gelombang pendek muatan listrik untuk

memfasilitasi penyerapan DNA. Kompeten sel persiapan

Pilih koloni tunggal dari E. coli DH5 sebuah

Tumbuh dalam media LB tanpa antibiotik; menetaskan pada 37 C 12 - 16 jam

Pada keesokan harinya menyegarkan budaya sampai OD600 0,5 (sekitar 2 jam)

Terus es 10 '

Panen sel dengan sentrifugasi (5000 rpm 10 ')

Resuspend dalam 495 ml TFB dingin 10 'di atas es

Centrifuse (5000 rpm 10 ')

Resuspend di 125 ml es dingin TFB + 8,8 ml DMSO 10 ' Transformasi Tambahkan 10 ml campuran ligasi ke sel kompeten, campur lembut, dan menetaskan di atas es selama 30 menit. 2. Keluarkan tabung dari es dan segera menempatkan mereka di blok C 42 panas selama 45 detik. Kembali tabung untuk es dan menetaskan selama 5 menit. 3. Tambahkan 1 mL media 2YT ke sel, (transfer ke elang tabung steril), dan menetaskan pada 37 C (dengan gemetar) selama satu jam. 4. Lempeng budaya seluruh (100 ml, 75 ml dan 50 ml setiap piring) di piring LB yang mengandung antibiotik yang tepat 5. Menetaskan semalam pada 37 C Transformasi oleh elektroporasi Campur reaksi transformasi: Pertumbuhan di piring agar-agar Seleksi

Sebuah media selektif digunakan untuk menentukan mana sel-sel bakteri mengandung memasukkan plasmid resisten antibiotik dan yang tidak

Sebagai contoh, bakteri yang mengandung plasmid dengan resistensi terhadap antibiotik tertentu (kanamisin dan higromisin) akan tumbuh pada medium yang mengandung antibiotik yang Beberapa kemungkinan produk dari reaksi transformasi: Seleksi Media Skrining rekombinan

Pada contoh di atas, koloni tidak berarti keberadaan DNA rekombinan dalam plasmid. Transformasi sukses Faktor-faktor yang Mempengaruhi Hasil dan Kualitas DNA Plasmid

jumlah Plasmid salinan

Hosti regangan digunakan

Budaya media, seleksi, dan budaya waktu

Ingin panen selama fase log pertumbuhan Transformasi Aplikasi