6. Pewarnaan Tahan Asam atau ZIEHL NEELSEN

6.1 Judul : Pewarnaan tahan asam atau ZIEHL NEELSEN

6.2 Tujuan Praktikum

6.2.1 Tujuan Umum : Untuk mengetahui prosedur kerja dan sifat pewarnaan bakteri tahan asam

6.2.2 Tujuan Khusus : - Dapat melakukan pewarnaan bakteri tahan asam atau ziehl neelsen dengan baik.

- Dapat mengidentifikan bentuk, warna dan sifat BTA setelah dilakukan pengecatan.

6.3 Landasan Teori :

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifatyang

khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan

air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel

bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi adalah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.

Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding

sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang

kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa,

tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam.

Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karenadapat mempertahankan zat

warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat.Golongan bakteri ini biasanya bersifat

patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri

Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi darisputum penderita TBC. Reaksi hasil

pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain menyerang

manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dankera. Penularannya dapat melalui udara

yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar dan Chan, 1988).

Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai

dengan pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan juga dengan pemanasan.

Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materilipoidal oleh

karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding

sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau

larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan

asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahanasam (Ball, 1997).Mycobacterium

tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentukfilamen. Bakteri ini bersifat aerobik,

tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, danmerupakan bakteri gram positif. Namun,

ketika Mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat

dihilangkan dengan asam. Oleh karenaitu, maka mycobacteria disebut sebagai Basil Tahan Asam

atau BTA. Beberapamikroorganisme lain yang juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies

Nicardia,Rhodococcus, Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium.

Pada dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan dengan arabinogalaktan dan

peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga

mengurangi efektivitas dari antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam

dinding sel mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen,

menjadikan Mycobacterium tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga.

Mikobakteria dapat tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8

untuk tipe pathogen. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid, protein, dan

polisakarida (Thomas, 1999). Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk

batang panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat (2-

8 minggu), suhu optimal 37-38 derajat celcius yang merupakan suhu normal manusia.

Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk, serum, dan bahan

kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 

0,4– 3 μm. Pada media buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu

spesies ke spesies lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat

didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel

secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan

mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif.

Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media nonselektif dan

selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11), media telur

inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz etal., 2001). Mikobakteria

merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari

oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan pertumbuhan. Tidak ada

aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian

besar bakteri. Waktu untuk menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuksaprofit

cenderung tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23˚C, untuk menghasilkan

pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk “cepat asam” dariapada bentuk patogenik.

Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada bakteri lain karena

sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkelreisten terhadap kekeringan

dan bertahan hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi

dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda

pertumbuhan atau seluler lainnya (Fardiaz,1992). Bakteri tahan asam dapat diamati dengan

teknik pewarnaan Ziehl Neelson, KinyounGabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum

(sekret paru-paru atau ludah) untukanalisis tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada

3 jenis sputum yaitu :

Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun pagi.

Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu.

Collection sputum: sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam

Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu minggu.

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat

warna carbolfuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna

pertama yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan

fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah

pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna

ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasanuntuk melebarkan pori-pori

lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat,

yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci

dengan air mengalir untuk menutup pori- pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat

berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin

dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua yaitu

methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994). Menurut Entjang

(2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-Neelsendapat menggolongkan bakteri

menjadi dua, yaitu

1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tahan asam

(acid fast).

2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam

(non acid fast).Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai

sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang tinggi sebenarnya

dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras

dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x sehingga bisa

mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens

(Kurniawati et al., 2005). Larutan kimia yang digunakan adalah alkohol asam 3% , carbol

fuchsin 0,3%, sertamethylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi antara lain asam

alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai fungsi membuka lapisan

lilinagar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus masuk ke dalam sel

bakteri Mycobacterium tuberculosis. Methylen blue berfungsi sebagai cat lawan dan pada

pemberian methylen blue pada bakteri akan tetap berwarna merah denga latar belakang biru atau

hijau (Jutono dkk., 1980)

6.4 Prosedur Kerja :

6.4.1 Bahan :

1. Bahan warna 1 : Carbol fuchsine

2. Peluntur : HCl 3% dalam alkohol dan air

3. Bahan warna 2 : Air methylen blue (counter stain) atau Brilliant green

6.4.2 Cara kerja :

1. Sebagian bahan diambil dari sputum pagi atau sputum yang dikumpulkan.

2. Sputum diletakkan dalam cawan hitam untuk dilihat warna serta susunannya, cari bagian –

bagian yang kuning kehijauan dan keras dibuat sediaan.

3. Ambil 2 gelas objek yang sudah steril, ambil sputum dan letakkan di atas gelas objek, lalu

tipiskan dengan gelas objek yang keua serta tekan kira – kira 5 menit diatas api.

4. Sediaan dikeringkan dan difiksasi selama 3x1 detik, keringkan lalu selanjutnya siap dilakukan

pewarnaan.

5. Tuangi larutan carbol fuchsin selama 5 menit dengan pemanasan sedikit hingga menguap,

(tidak mendidih) selama 2 – 3 menit, maksud pemanasan supaya dapat mewarnai dengan kuat

lalu pewarna dibuang dan disiram dengan air.

6. Lunturkan dalam molot brmulut besar yang berisi HCl 3% dalam alkohol selama 1 -2 detik.

7. Siram dengan air selanjutnya cat dengan air methylen blue selama 1 menit, siram dengan air

kembali kemudian keringkan.

6.5 Hasil Pengamatan

Pada hasil praktikum, bakteri yang tahan asam berwarna merah, karena carbol fuchsine

tidak larut pada pelunturan dengan asam alkohol, sehingga bakteri ini tidak lagi mengambil

warna dari methylen blue. Sifat dari bakteri tahan asam adalah sukar menagmbil zat warna

karena adanya selaput yang menerupai lilin, oleh karena itu dilakukan pemanasan. Tetapi bakteri

iniapabila sudah mengikat zat warna, tidak mudah untuk melepaskannya.

Bakteri tidak tahan asam tidak tahan terhadap pelunturan sehingga warna pertama akan

hilang dan mengmbil warna kedua yaitu air methylen blue oleh karena itu bakteri tidak tahan

asam berwarna biru.

Daftar Pustaka

Mastra, Nyoman, dkk. 2014. Bakteriologi. Denpasar : Politektnik Kesehatan Denpasar

Jurusan Analis Kesehatan.

Rinda. 2014. Bakteri 1. [Online]  http://rindachie.weng.com/menu/labs/bakteri-5.html

(Diakses pada 16 November 2014)

Admin. 2014. Mycobacterium tuberculosis. [Online]

http://id.m.wikipedia.org/wiki/mycobacterium.tuberculosis   (Diakses pada 16 November 2014)

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo Persada.

Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta: UI

Press.