Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus (Susanto, 2012).Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (Susanto, 2012). DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatannya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul. Hasil elektroforesis DNA total akan menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteriEscherichia coliyang kemungkinan adalah DNA plasmid.(Alatar,et al,2012).Alatar, AA, et al. 2012. Simple And Rapid Protocol For The Isolation Of PCR-Amplifiable DNA From Medicinal Plants. Genetics and Molecular Research 11 (1): 348-354.Susanto, Agus Hery. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.

ELEKTROFORESIS GEL :)ELEKTROFORESIS GEL

I.TUJUAN

1. Mempelajari teknik elektroforesis gel untuk mengetahui ukuran fragmenDNA tanaman, darah dan plasmid.2.Mengetahui dan memahami prinsip kerja elektroforesis gel.

II.TEORI

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran.Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Bowen 2000: 1).Elektroforesis gel adalah teknik memisahkan suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel dibantu dengan tenaga listrik (Anonim ?: 1).Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Bowen 2000: 1).Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug & Cummings 1994: 215).Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat.Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen 1999: 280).Aplikasi elektroforesis dapat digunakan dalam uji paternitas dan identifikasi pelaku kejahatan (DNAfingerprinting).Elektroforesis juga berperan dalamhuman genome project(Anonim ?: 3).Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik.Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbelldkk.2002: 396--397).Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:1.Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.2.Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.3.Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.(Davisdkk. 1994: 151).Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:1.Ukuran Molekul DNAMolekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.2.Konsentrasi gelSemakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA.Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.3.Bentuk molekulMolekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.4.Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul.Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.5.Pori-pori gelSemakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.6.VoltaseSemakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.7.LarutanbufferelektroforesisBuffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA.(Wolfe 1993: 127;Bowen 2000: 3-4).Markeradalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya.Markerberfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi.MarkerDNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi.Marker-markerDNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contohmarkerDNA adalah lambdaHindIII.Markertersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb.Penggunaan DNAmarkertersebut dikarenakan molekul DNA yang akan diamati memiliki fragmen DNA dengan ukuran 110--20.000 pb.(Birren & Lai 1993: 82; Martin 1996: 77).Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:1.Comb: digunakan untuk membentukwellpada gel agarosa.2.Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.3.Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa.4.Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromidayang bersifat karsinogenik danBrom Fenol Blue.Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkanBrom Fenol Blueberfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren & Lai 1993: 79--81).Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNAfinger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell 1994: 299--310 & 500--501; Fairbanks & Andersen 1999: 278).

III.ALAT, BAHAN DAN CARA KERJA

A.ALAT

Alat yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah aparatus elektroforesis yang terdiri daritray, comb, chamberdan sumber listrik; sarung tangan karet; mikropipet dan tips; alat dokumentasi gel (gel doc) merek BIORAD tipe XR.

B.BAHAN

Bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah bubuk agarosa 1 gr;running buffer;loading buffer; parafilm; sampel DNA (produk PCR); Etidium bromida (EtBr); DNA marker (lambda DNA/Hind III).

C.CARA KERJA

1.Gel agarose dibuat (telah dilakukan oleh asisten) dengan campuran 2 gr agarose + 200 ml 1x TBE, dididihkan dan ditambahkan etidium bromida 2L dicampur dengan baik, kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengancombnya dan dibiarkan sampai mengeras.2.Gel dimasukkan kedalamelectrophoresis chamberdan ditambahkan larutanrunning bufferserta etidium bromida.3.Sampel DNA hasil PCR dicampurkan denganloading bufferkemudian dimasukkan ke dalamwellpada gel dengan menggunakan mikropipet.4.Marka DNA dimasukkan.5.Penutupelectrophoresischamberdipasang danpower supplydinyalakan.6.Setelah pewarna bergerak sampai bagian ujung gel, gel dikeluarkan dan dilihat dengan sinar UV.

IV.HASIL PENGAMATANA.SAMPEL DNA TANAMAN

Agarose 0,8%, 100 volt, 1l/ml EtBr

Keterangan :A. DNA MarkerB. WellC. DNA tanamanD. Gel

B. SAMPEL DNA DARAH

Agarose 1%, 100 volt, 1l/ml EtBr

Keterangan:A. DNA MarkerB. DNA darahC. WellD. Gel

C.SAMPEL DNA PLASMID

Gal Agarose 1%, 100 volt, 0,1l/ml EtBr

Keterangan:A. DNA MarkerB. DNA plasmidC. WellD. Gel

V.PEMBAHASAN

Praktikum elektroforesis gel menggunakan gel agarosa.Gel agarosa diperoleh dari rumput laut dan biasanya digunakan dalam konsentrasi 0,5--2%.Alasan memakai agarosa dibandingkan poliakrilamida adalah agarosa mudah untuk disiapkan karena proses pembuatannya mudah.Gel agarosa dibuat dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutanbuffer, kemudian dipanaskan dan tunggu sampai mengeras.Gel agarosa juga bersifat non-toxic(Bowen 2000: 1).Selain itu praktikum elektroforesis gel juga menggunakan alat-alat yang mempunyai fungsi dan peranan masing-masing.Alat-alat tersebut adalah mikropipet, apparatus elektroforesis, power supply, sumber sinar UV, dan sarung tangan lateks.Mikropipet berfungsi untuk memindahkan sampel dan larutan lainnya daritubeke dalamwell-wellpada aparatus elektroforesis.Apparatus elektroforesis terdiri atascomb(sisir) yang membentukwell(sumur) pada gel agarosa,trayyang merupakan wadah cetakan gel, danchamberyang merupakan medium tempat berlangsungnya proses elektroforesis.Power Supply (DC)sebagai sumber energi untuk aparatus elektroforesis.Sumber Sinar UV berfungsi untuk membantu mengamati hasil band yang tampak sehingga terlihat lebih jelas. Sarung tangan lateks berfungsi untukmelindungi tangan agar tidak bersentuhan langsung dengan etidium bromida yang bersifat karsinogenik atau penyebab kanker (Birren & Lai 1993: 79--81).Praktikum elektroforesis gel dimulai dengan pembuatan gel agarosa.Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarosa karena dilakukan oleh asisten praktikum.Secara umum, proses pembuatan gel agarosa dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutanbuffer, dipanaskan di dalammicrowave, tambahkan etidium bromida, dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengancomb-nya dan tunggu sampai mengeras.Bubuk agarosa yang digunakan sebanyak 1 gr dan larutanrunning bufferTBE (Tris- Borate- EDTA) sebanyak 100 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Bowen 2000: 3).Penambahan etidium bromida dilakukan dengan tujuanmewarnai asam nukleat.Etidium bromida adalah mutagen dan harus ditangani dengan hati-hati.Penanganannya harus dilakukan dengan sarung tangan karet (Bowen 2000: 4).Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahanrunning buffer.Penambahanrunning bufferdilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner et al. 1991: ?).Runningelektroforesis dilakukan pada tegangan 80 Volt selama 30 menit.Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan elektroforesis.Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Bowen 2000: 4).Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA hasil amplifikasi lewat proses PCR denganloading bufferyang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalamwell dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Bowen 2000: 3).DNA amplifikasi yang dipindahkan hanya DNA khamir dan plasmid.Hal tersebut berkaitan dengan terbatasnya jumlah well yang ada.Pemindahan sampel DNA hasil amplifikasi dilakukan oleh dua orang praktikan secara bergantian.Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA denganloading buffertidak meluber ke bagianwellyang lain.DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin 1996: 9).Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik.Gel dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna dan dilihat dengan sinar UV.Hasil dokumentasi dilakukan dengangel doc.Gel docadalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis.Gel docyang digunakan bermerek BIORAD tipe XR.Komponengel docterdiri dari lampu UV, kamera dan komputer.Lampu UV berfungsi menerangi bagian dalam dalam darigel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuansoftware(Davisdkk.1994: 157--158)DNA marker yang digunakan saat praktikum adalahlambdaDNA/Hind III.DNA marker tersebut mencakup delapan fragmen DNA (125 bp-23130bp) dan digunakan dengan alasan dapat melihat pasangan basa yang lebih banyak dibandingkan DNA marker yang lain(Davisdkk.1994: 157--158).Hasil pengamatan elektroforesis pada sampel darah praktikan tidak memperlihatkan adanyaband-bandmeskipun telah dirunningberulang kali, namun pada sampel darah yang diambil dari asisten memperlihatkanband-band.Sampel 1 sampai sampel 4 merupakan sampel darah asisten, sedangkan sampel 5 sampai sampel 8 merupakan sampel darah praktikan.Hasil elektroforesis DNA tanaman dengan gel agarosa 1% tidak menunjukkan adanyaband, baik paralel 1 maupun paralel 2 sehingga asisten melakukanloadingulang dengan gel agarosa 0,8% dan dijadikan dalam satu gel dengan ukurancombyang lebih kecil.Hasil perlakuan tersebut memperlihatkanbandberada di atasmarkernamun tampak kurang jelas.Hasil elektroforesis DNA plasmid terlihatbandhanya pada sampel DNA plasmid kelompok 3 dan 4, sedangkan pada sampel DNA plasmid kelompok lainnya tidak menunjukkan adanyaband-bandHasil elektoforesis gel yangband-bandnya tidak terlihat dan kurang jelasnyaband-bandyang terbentuk menyebabkan hasil tersebut tidak dapat digunakan untuk mengukur ukuran fragmen DNA.Hal tersebut kemungkinan dikarenakan banyak faktor, antara lain proses pengisolasian yang tidak benar, proses PCR yang kurang bekerja, keterbatasan fasilitas yang tersedia, dan telah terkontaminasinya sampel DNA.Kekurang telitian praktikan dalam proses pengerjaannya pun menjadi faktor ketidakberhasilan praktikum.

VI.KESIMPULAN

1. Ukuran fragmen DNA dapat diketahui dengan teknik elektroforesis gel.2.Prinsip kerja elektroforesis adalah pergerakan molekul organik dari kutubnegatif ke kutub positif berdasarkan ukuran fragmen.III.DAFTAR ACUAN

Anonim. ?.Gel Electrophoresis. ?. www.bergen.org.27 April 2007,pk.17.10.Birren, B. & E. Lai. 1993.Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide.Academic Press, Inc.,San Diego: xviii + 235 hlm.Bowen, R. 2000.Principles of gel electrophoresis. 3 Januari 2000: 4 hlm.http://www.vivo.colostate.edu.27 April 2007, pk. 17.50.Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002.BIOLOGI. Ed ke-5. Terj.dariBIOLOGYoleh Lestari, R,dkk. Penerbit Erlangga, Jakarta: xxi + 438 hlm.ColoradoStateUniversity. 2000. Principle of gel electrophoresis.3 Januari2000: 1.http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbook/genetics/biotech/gels/principles.html, 16 Mei 2008, pk. 08.30.Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994.Basic methods: Molecular biology. 2nded. Appleton & Lange, Norwola: xii + 777 hlm.Faibanks, D.J. & W.R. Andersen. 1999.Genetics: The continuity of life.Brooks/Cole Publishing Company,New York: xix + 820 hlm.Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics.8th ed. John Wiley & Sons Inc.,New York: xviii + 713 hlm.GenScript Corp.(?). Marker LambdaHindIII. (?): 1 hlm.http://www.genscript.com/site2/images/MM1212.jpg,16 Mei 2008, pk. 08.25.Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994.Concept of genetics.4th ed. PrenticeHall, Englewood Cliffs: xvi + 773 hlm.Martin, R. 1996.Gel electroforesis: Nucleid acids.Bros Scientific PublishersLtd.,Oxford: xiii + 173 hlm.Russell, P.J. 1994.Fundamentals of genetics.HarperCollinsCollegePublishers,New York: xvi + 528 hlm.TerritorioScuola. (?).Gel electrophoresis apparatus. (?): 1 hlm.http://commons/thumb/a/a6/Gel_electrophoresis_apparatus.JPG/288px-Gel_electrophoresis_apparatus.JPG,16 Mei 2008, pk. 08.40.Wolfe, S. L. 1995.Introduction to cell and molecular biology. WardworthPublishing Company, Belmont: xvii + 820 hlm