baba 111
TRANSCRIPT
III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan agustus sampai oktober 2011
di Laboratorium Farmakologi Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi (STIFARM) Padang.
3.2 Metode Penelitian
3.2.1 Alat Yang Digunakan
Alat yang digunakan adalah timbangan analitik, rotary evaporator, gelas
ukur, erlenmeyer, vial, pipet tetes, batang pengaduk kaca, spatel, grinder, pipet
mikro, gelas ukur, timbangan hewan, spatel, jarum oral, timbangan analitik,
mikroskop, wadah (botol), lumpang dan stamfer, kaca objek, gunting bedah,
sarung tangan, masker, jarum ose, pinset, kertas saring, tabung reaksi.
3.2.2 Bahan Yang Digunakan
Bahan yang digunakan adalah biji pinang muda (Areca catechu L.), etanol
70%, aqua destilasi, metanol, heparin 2%, staphylococcus aureus, nutrient agar
(NA), nutrient brooth (NB), NaCl fisiologis, Na CMC 0,5%, minyak emersi,
pewarna Giemsa, metanol, mencit putih jantan dengan berat 20-30 gram.
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Pengambilan Sampel
Sampel yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah biji pinang muda
(Areca catechu L.). Yang diambil di Seberang Padang Utara Kecamatan Padang
Selatan.
18
3.3.2 Identifikasi Sampel
Identifikasi sampel dilakukan di Herbarium Laboratorium Taksonomi
Tumbuhan, Jurusan Biologi Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam
(FMIPA) Universitas Andalas (UNAND), Padang.
3.3.3 Penyiapan Sampel
Buah pinang ( Areca catechu L. ) yang telah dibelah dan dikeluarkan biji
pinang, dibersihkan dan dirajang kemudian dikering anginkan selama 7 hari. Biji
pinang muda dihaluskan hingga berbentuk serbuk dengan menggunakan mesin
penghalus (grinder).
3.3.4 Pembuatan Ekstrak
Simplisia biji pinang muda ( Areca catechu L. ) yang telah dibersihkan
dan dihaluskan dengan grinder tersebut ditimbang sebanyak 1 kg, dimasukkan
dalam botol sampai terendam oleh Etanol 70%, lakukan pengocokkan selama 2
jam, kemudian diendapkan selama 24 jam. Sambil sekali-sekali diaduk. Setelah 5
hari lakukan penyaringan dan diperoleh filtrat I dan ampas. Ampas dilarutkan
kembali dengan pelarut etanol 70%, dikocok lagi selama 2 jam, didiamkan selama
1 jam dan disaring sehingga diperoleh filtrat II dan ampas. Lakukan dengan cara
yang sama sampai diperoleh filtrat III dan ampas. Dari ketiga maserat yang
diperoleh kemudian disatukan, lalu dipekatkan dengan rotary evaporator pada
suhu 40- 500c sampai diperoleh ekstrak kental.
19
3.3.5 Karakteristik Ekstrak (Depkes, 2000)
a. Pengujian organoleptis seperti :bentuk, warna, bau, rasa.
b. Uji tetapan fisika seperti :
1. Susut pengeringan
Penetapan susut pengeringan dilakukan dengan cara
sebagai berikut:
a. Terlebih dahulu bersihkan cawan aluminium.
b. Dimasukkan cawan aluminium ke dalam oven
dengan suhu 1050c selama setengah jam.
c. Setelah itu dinginkan cawan aluminium ke dalam
alat desikator.
d. Kemudian timbang cawan aluminium kosong
tersebut.
e. Ekstrak ditimbang 1-2 gram. Lalu masukkan ke
dalam cawan aluminium dan diratakan, lalu
ditimbang cawan berisi ekstrak tersebut.
Kemudian masukkan ke dalam oven dengan suhu
1050 selama 1 jam.
f. Lalu dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator.
g. Kemudian ditimbang cawan dan ekstrak tersebut
setelah dingin , dilakukan sampai berat yang konstan.
2. Penetapan kadar abu
Timbang 2 gram sampel yang telah dikeringkan dengan
saksama ke dalam krus yang telah dikeringkan dengan
20
saksama ke dalam krus yang telah ditara. Pijarkan secara
perlahan-lahan, kemudian suhu dinaikkan secara bertahap
hingga 600 0 + 25 0 sampai putih selanjutnya didinginkan
dalam desikator dalam persen terhadap berat sampel yang
digunakan
c. Uji Fitokimia
Uji pendahuluan kandungan kimia metabolit sekunder yang
dilakukan terhadap ekstrak kental etanol buah pinang muda (
Areca catechu L. ). Pada 5 ml ekstrak kental etanol ditambahkan
masing-masing 5-10 ml air suling dan kloroform lalu di kocok kuat
dan dibiarkan beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan
air digunakan untuk uji senyawa flavonoid fenolik, dan saponin.
Lapisan kloroform digunakan untuk uji senyawa terpenoid, steroid,
dan alkaloid.
1. Uji Alkaloid.
Ekstrak dilarutkan dengan 10 ml Kloroform ditambah
beberapa tetes Asam Sulfat 2N, dikocok kuat selama 2 menit
kemudian diamkan hingga terjadi pemisahan. Ambil lapisan asam
dan tambah 1-2 tetes pereaksi Mayer atau pereaksi Dragendorff,
jika terbentuk kabut putih sampai endapan putih dengan pereaksi
Mayer atau warna jingga dengan pereaksi Dragendorff
menunjukkan hasil positif untuk alkaloid.
2. Uji Flavonoid
21
Lapisan air diambil dan diteteskan pada plat tetes ditambah
10 butir logam Magnesium dan 2 tetes Asam Klorida pekat.
Terjadinya warna merah muda sampai merah menandakan adanya
senyawa flavonoid.
3. Uji Fenolik
Lapisan air diambil dan diteteskan pada plat tetes ditambah
1-2 tetes larutan Besi (III) Klorida 1%. Bila terbentuk warna hijau
sampai biru, berarti terdapat senyawa fenolik.
4. Uji Saponin
Lapisan air dalam tabung reaksi dikocok kuat, apabila
terbentuk busa yang bertahan selama 5 menit berarti positif adanya
saponin.
5. Uji Terpenoid dan Steroid
Ekstrak dilarutkan dalam Kloroform dan air, kocok dan
diamkan sampai terbentuk dua lapisan, lalu pisahkan. Lapisan
kloroform disaring melalui pipet yang berisi norit. Hasil saringan
dipipet 2-3 tetes dan biarkan mengering. Setelah kering
ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchad (2 tetes Asam Asetat
anhidrat dan 1 tetes Asam Sulfat pekat), terbentuknya warna merah
berarti positif adanya terpenoid dan warna hijau-biru berarti positif
adanya steroid.
3.3.6 Persiapan Hewan Percobaan
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit putih
jantan berumur 2-3bulan, berat badan 20-30 gram. Sebelum digunakan sebagai
22
hewan percobaan, mencit diaklimatisasi dalam ruangan penelitian selama satu
minggu untuk penyesuaian lingkungan, mengontrol kesehatan dan berat badan
serta menyeragamkan makanannya, dan dipuasakan selama 18 jam (minum tetap
diberikan) sebelum percobaan. Hewan yang sakit dengan tanda-tanda bulu berdiri,
aktivitas motorik dan berat badan menurun tidak dipakai dalam penelitian. Hewan
yang digunakan adalah mencit yang sehat yakni berat badan selama diaklimatisasi
tidak mengalami perubahan lebih dari 10% dan secara visual menunjukkan
perilaku yang normal.
3.3.7 Perencanaan Dosis
Dosis sediaan uji diberikan pada hewan percobaan adalah 125 mg/kg BB,
250mg/kg BB dan 500 mg/kg BB yang diberikan secara oral.
3.3.8 Pembuatan Sediaan Uji
Konsentrasi ekstrak dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut :
Konsentrasi = berat badan (kg) x dosis (mg/kg BB)VAO
Konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah 1,25 %, 2,5 %, 5%. Ekstrak
didispersikan dalam Na CMC 0,5% dengan cara 50 mg Na CMC ditaburkan
diatas air panas sebanyak 20 kalinya di lumping panas, biarkan sampai
mengembang selama 15 menit. Kemudian digerus homogen. Setelah itu
dimasukkan ekstrak etanol biji pinang yang telah ditimbang sesuai dosis yang
direncanakan, digerus homogen setelah terdispersi dengan baik lalu dicukupkan
dengan aquadest 10 ml,aduk homogen.
23
3.3.9 Kultur Staphylococus aureus
Staphylococcus aureus (SA) dibiakkan pada nutrient agar (NA) miring.
Dari satu ose kultur SA diinokulasi ke dalam media NA miring, setelah itu
diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam di dalam inkubator. Satphylococcus
aureus yang tumbuh pada media NA miring dipindahkan ke dalam nutrient brooth
(NB), diinkubasi 24 jam pada suhu 37°C. Kemudian disentrifugasi 3000 rpm
selama 25 menit lalu terbentuk pelet dan diresuspensikan dengan NaCl fisiologis
yang setara dengan larutan McFarland 0,5 (Brooks; Hart, Shears, 1997).
3.3.10 Perlakuan Pada Hewan Percobaan
Hewan percobaan dikelompokan secara acak menjadi 4 kelompok yang
terdiri 3 kelompok perlakuan dan 1 kelompok kontrol. Masing-masing kelompok
terdiri dari 5 ekor mencit.
Kelompok kontrol diberi larutan Na CMC 0,5%, kelompok II,III,IV
adalah kelompok yang akan diberikan ekstrak etanol biji pinang muda secara per
oral dengan dosis 125 mg/kg BB, 250mg/kg BB dan 500 mg/kg BB.
3.3.11 Analisis Fagositosis Makrofag
Pada hari ke delapan, mencit pada masing-masing kelompok diinfeksi
dengan SA dan disuntikkan intra peritoneal (IP) 0,5 ml NaCl 0,9%, kemudian
dibiarkan selama 1 jam. Mencit dibunuh dan dibedah, kemudian tambahkan
heparin pada cairan peritoneal. Cairan peritoneal diambil dengan menggunakam
semprit 1 ml. Cairan peritoneal tersebut dibuat preparat apus dan difiksasi dengan
metanol absolut selama 5 menit, diwarnai dengan Giemsa yang telah diencerkan
dengan air suling 20 kalinya, didiamkan selama 20 menit, dibilas dengan air dan
24
dikeringkan. Preparat dilihat di bawah mikroskop cahaya pada perbesaran 1000
kali dengan minyak emersi. Aktivitas dan kapasitas fagositosis sel makrofag
dihitung. Aktivitas atau indeks fagositosis ditetapkan berdasarkan persentase
fagosit yang melakukan fagositosis dari 100 fagosit (Virelli, 2007). Kapasitas
fagositosis ditetapkan berdasarkan jumlah SA yang difagosit oleh 50 fagosit aktif
(Kusmardi, Kumala & Wulandari, 2006).
3.3.12 Analisa Data
Pada penelitian ini data hasil uji diolah secara analisis statistik dengan
menggunakan ANOVA satu arah dan berjarak Duncan.
25
DAFTAR PUSTAKA
Agoes, azwar. 2001. Tanaman Obat Indonesia. Jakarta: Salemba Medika.
Aldi,Y, Evawati dan Eriadi . 2001. Efek Imunodulator Rutin Terhadap Peningkatan Aktivitas Dan Kapasitas Fagositosis Makrofag Pada Mencit Putih Betina (Skripsi Sarjana Farmasi). Padang: Fakultas Farmasi Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan.
Altman, L. J. 1984. Clinical Alergy and Immunology, 1st edition. Boston: GK Hallmedical Publisher.
Anderson, S. A, Price Lorraineand K. Wilson. 1995. Patofisiologi Konsep Klinis Proses-proses Penyakit Edisi ke-4 buku 1. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran.
Ansel, Howard C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi ke-4. Jakarta: UI Press.
Arifin, Helmi dan Riyano, Heppy dan Elka. 2000. Efek Ekstrak Etanol Biji Pinang Muda (Areca catechu L.) Terhadap Aktivitas Sistem Pusat Mencit Putih. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi UNAND.
Baratawidjaja, K. G. 2006. Imunologi Dasar Edisi ke-7. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Bellanti, J. A. 1993. Imunologi III, diterjemahkan oleh A.S Wahab, dan N. Soerapto. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.
Dalimartha, Setiawan. 2009. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid ke-6. Jakarta: Pustaka Bunda, Grup Puspa Swara Anggota IKAPI.
Direktorat Jenderal POM. 1979. Farmakope Indonesia edisi III. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Direktorat Jenderal POM. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Djamal, K. 1988. Prinsip-Prinsip Dasar Bekerja Dalam Kimia Bahan Alam. Padang: Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Kresno, S. B. 1991. Imunologi: Diagnosis Dan Prosedur Laboratorium edisi III. Jakarta : Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Kresno, S. B. 2001. Imunologi: Diagnosis Dan Prosedur Laboratorium edisi II. Jakarta : Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Kusmardi, Kumala, S. dan Wulandari, D. 2006. Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Johar (Cassia siamea Lamk) terhadap Peningkatan Aktivitas dan Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag. Makara Kesehatan.
26
Kusmardi, Kumala, S. dan Triana,E. 2007. Efek Ekstrak Daun Ketepeng Cina(Cassia alata L.) Terhadap Aktivitas dan Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag. Makara Kesehatan.
Shulman, S. 1994 Dasar Biologis Klinis Penyakit Infeksi Edisi V. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.
Subowo. 1993. Imunobiologi. Bandung: Angkasa
Syamsuhidayat, S. S, Hutapea, J. R. 1991. Investaris Tanaman Obat Indonesia Volume 1. Jakarta: BALITBANG Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Tim Agromedia. 2007. Ramuan Tradisional Untuk Mengatasi Aneka Penyakit. Jakarta: Agromedia.
Tizard. I. 1988. Pengantar Imunologi Veteriner Edisi ke-2. Newyork : Saunders Company.
Voight, R. 1994. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi Edisi ke-5. Yogyakarta: Gadja Mada University Press.
Wagner, H. 1985. Immunostimulants From Medical Plants. Jakarta : ISBN
27
LAMPIRAN 1.
Lampiran 1. Gambar Tumbuhan
Gambar 1. Buah Pinang Muda (Areca catechu L.)
Gambar 2. Biji Pinang Muda (Areca catechu L.)
28
Lampiran 1.Gambaran Tumbuhan (Lanjutan)
Gambar 3. Biji Pinang Muda yang sudah dirajang (Areca catechu L.)
29
Lampiran 2. Skema Kerja Ekstraksi Biji Pinang (Areca catechu L.)
Buah dibelah dan dikeluarkan bijinya
Dibersihkan dan dirajang
Diangin- anginkan
Dihaluskan hingga jadi serbuk
timbang 1 kg, rendam dengan etanol
70%
sambil sekali-kali diaduk
disaring
dimaserasi dengan etanol 70%
sambil sekali-kali diaduk
disaring
Diuapkan dengadestilasi
Dipekatkan dengan rotary
evaporator
Gambar 2. Skema Kerja Ekstraksi Biji Pinang (Areca catechu L.)
Lampiran 3. Skema Kerja Kultur Staphylococcus Aureus
30
Biji pinang muda (Areca catechu L.)
Sampel serbuk
Filtrat I Ampas
Filtrat II ampas
Filtrat III ampas
Filtrat I+II+III
ekstrak kental
Gambar 3. Skema Kerja Kultur Staphylococcus Aureus
Lampiran 4. Skema Kerja Penentuan Peningkatan Aktivitas Dan Kapasitas Fagositosis Pada Mencit Putih Jantan
31
staphylococcus aureus (SA) dibiakkan pada (NA) miring
satu ose kultur SA diinokulasi ke dalam media NA miring
Dipindahkan ke dalam nutrient brooth (NB), diinkubasi 24 jam pada suhu 370c
Kemudian disentrifugasikan 3000 rpm selama 25 menit lalu terbentuk pelet
Diresuspensikan dengan NaCl fisiologis yang setara dengan larutan McFarland 0,5
Gambar 4. Skema kerja penentuan peningkatan aktivitas dan kapasitas fagositosis pada mencit putih jantan
Lampiran 5. Skema Kerja Penentuan Jumlah Sel Leukosit Dari Darah Mencit Putih Jantan
32
Adaptasi mencit selama seminggu
Mencit dibagi menjadi menjadi 4 kelompok
Ekstrak biji pinang diberikan dari hari pertama sampai hari ketujuh
Hari kedelapan, disuntikkan SA secara IP dengan 0,5 ml, dibiarkan 1 jam
Mencit dieuthanasi,ditambahkan heparin pada cairan peritoneal, cairan peritoneal diambil 1 ml dan dibuat hapusan
Biarkan kering, tambahkan metanol, biarkan 5 menit, warnai dengan pewarna Giemsa, diamkan selama 20 menit
Preparat dilihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali
gambar 5. Skema Kerja Penentuan Jumlah Sel Leukosit Dari Darah Mencit Putih Jantan
33
Sebelum disuntikkan staphylococcus aureus, teteskan darah ekor pada kaca objek. Ratakan dengan kaca objek lain (apuskan darah), keringkan
Tambahkan methanol, biarkan 5 menit
Tambahkan beberapa tetes larutan Giemsa yang telah diencerkan dengan air suling (1: 20) biarkan 20 menit
Cuci dengan air suling
Lihat dibawah mikroskop, hitung jumlah sel leukosit dengan perbesaran 1000X dengan minyak emersi