BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Identifikasi E. coli

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dari 10 sampel feses yang

diambil dari pasien diare pada anak dikultur pada media EMBA dan MC serta

dilakukan uji biokima terhadap koloni hasil kultur. Berdasarkan hasil identifikasi

bakteri E. coli dari 10 sampel feses didapatkan 15 isolat bakteri E. coli.

Koloni E. coli pada media EMBA menunjukkan pertumbuhan yang baik

dari koloni biru-hitam gelap dengan kemilau hijau metalik ditunjukkan pada

gambar 2a.

A

b

Gambar 2. Koloni E. coli pada media EMBA (a) dan MC (b)

EMBA adalah media selektif dan media diferensial. Media ini

mengandung Eosin dan metilen biru, yang menghambat pertumbuhan bakteri

Gram positif, maka media ini dipilih untuk bakteri Gram negatif. EMBA juga

mengandung karbohidrat laktosa, dengan adanya karbohidrat laktosa bakteri

Gram negatif terdiferensiasi berdasarkan pada kemampuan mereka untuk

memfermentasi laktosa. Warna media sebelum pemupukan bakteri berwarna

merah keunguan. Perubahan warna hijau metalik pada media EMBA karena

Escherichia coli dapat memfermentasi laktosa yang mengakibatkan peningkatan

kadar asam dalam media. Kadar asam yang tinggi dapat mengendapkan methylen

blue dalam media EMBA (Cheeptham, 2012 dan Lindquist, 2004).

Berdasarkan hasil pengamatan, koloni E. coli pada media MC berwarna

merah ditunjukan pada gambar 2b. Hal ini sesuai dengan protocol manual dari BD

edisi ke-2 yang menyatakan bahwa Koloni bakteri koliform yang terisolasi akan

berwarna merah jambu tua karena media MC Agar mengandung kristal violet dan

garam empedu yang menghambat organisme Gram-positif memungkinkan

organisme Gram-negatif untuk tumbuh.

Berdasarkan hasil pengamatan uji biokimia yang telah dilakukan pada 15

isolat E. coli dari 10 sampel yang telah diambil, hasil uji biokimia indol, MR, VP,

Citrat, motilitas, Urease, TSIA dan gula-gula ditunjukkan pada Tabel 1. Berikut

adalah gambar hasil uji biokimia E. coli.

Gambar 3. Hasil uji indol, MR, VP, motilitas, citrat, urea, TSIA dan Hasil uji

gula-gula (glukosa, laktosa, sukrosa, galaktosa, fruktosa, maltosa dan

manitol) pada E. coli

Tabel 1. Hasil uji biokimia E. coli dari sampel pasien diare anak

S I MR VP C M U TSIA G L S Gal F Mal Man

1a + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

1b + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

2a + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

2b + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

3a + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

3b + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

3c + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

4a + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

4b + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

5 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

6 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

7 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

8 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

9 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

10 + + - - + - A/A H2S -, gas + + gas + + + + + + -

Keterangan:

1. Indol (+) terdapat cincin merah

2. MR (+) larutan berwarna merah

3. VP (-) larutan tetap bening

4. Motilitas (+) pertumbuhan di area

tusukan

5. Citrat (-) tidak terjadi perubahan warna

6. Urea (-) tidak terjadi perubahan warna

7. TSIA A/A , H2S (-) dan gas (+)

8. Glukosa (+) larutan berwarna kuning

9. Laktosa (+) larutan berwarna kuning

10. Sukrosa (+) larutan berwarna kuning

11. Galaktosa (+) larutan terjadi kekeruhan

12. Fruktosa (+) larutan terjadi kekeruhan

13. Maltosa (+) larutan terjadi kekeruhan

14. Manitol (-) tidak terjadi perubahan

warna

Uji indol bertujuan mengidentifikasi kemampuan bakteri menghasilkan

indol dengan menggunakan enzim tryptophanase (Leboffe, 2011). Produksi indol

di dalam media dimungkinkan karena adanya tryptophan. Bakteri yang memiliki

enzim tryptophanase menghidrolisis tryptophan. menjadi indol, piruvat dan

amonia. Hal ini digunakan sebagai bagian dari prosedur IMViC, sebuah tes yang

dirancang untuk membedakan antara anggota keluarga Enterobacteriaceae

(Hemraj, 2013).

Gambar 4. Gambar rantai reaksi uji indol (Hemraj, 2013)

Tryptophan adalah asam amino esensial, yang teroksidasi oleh beberapa

bakteri yang mengakibatkan pembentukan indol, asam piruvat dan amonia. Uji

indol dilakukan dengan inokulasi organisme uji ke dalam tryptophan broth, yang

mengandung tryptophan. Indol yang dihasilkan dideteksi dengan menambahkan

reagen Kovac’s ini yang menghasilkan cincin berwarna merah. Lapisan alkohol

berkonsentrasi warna merah berbentuk cincin terdapat di bagian atas. Hasil indol

positif dinyatakan dengan adanya cincin merah hal ini disebabkan karena Indol

bereaksi dengan aldehida (Sridhar, 2006). Hasil uji indol pada isolat bakteri

E. coli adalah positif yang ditunjukan adanya cincin merah pada bagian atas.

Escherichia coli dan anggota lain dari organisme tingkat rendah

memfermentasi gula melalui jalur asam yang merubah gas CO2 menjadi H2 dalam

jumlah yang sedikit yang dihasilkan melalui fermentasi (McDevitt, 2010). Uji MR

bertujuan untuk mendeteksi kemampuan organisme dalam memproduksi dan

mempertahankan produk akhir asam stabil dari fermentasi glukosa. Beberapa

bakteri menghasilkan sejumlah besar asam dari fermentasi. Methyl Red adalah

indikator pH, yang tetap berwarna merah pada pH 4,4 atau kurang. (Sridhar,

2006) Setelah inkubasi, indikator pH Methyl Red ditambahkan ke dalam kultur

bkteri. Methyl Red berwarna merah pada pH di bawah 4,4 (hal ini menunjukkan

hasil positif) dan kuning pada pH di atas 6,0. Warna oranye menunjukkan pH

menengah dan dianggap hasil negatif (Hemraj, 2013).

Gambar 5. Fermentasi asam oleh E.coli

Hasil pengamatan untuk Uji MR pada isolat bakteri E. coli adalah positif

yang ditunjukkan dengan larutan berwarna merah.

VP adalah tes yang digunakan untuk mendeteksi acetoin dalam kultur cair

bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan menambahkan alpha-naftol dan kalium

hidroksida dengan kaldu Voges Proskauer yang telah diinokulasi dengan bakteri.

Warna merah cherry menunjukkan hasil yang positif, sedangkan warna kuning-

coklat menunjukkan hasil negatif. Tes ini tergantung pada pencernaan glukosa

menjadi acetylmethylcarbinol. Jika glukosa pecah, maka akan bereaksi dengan

alpha-naftol (VP reagen 1) dan kalium hidroksida (VP reagen 2) untuk

membentuk warna merah. Alpha-naftol dan kalium hidroksida adalah bahan kimia

yang mendeteksi acetoin (Sridhar, 2006).

Gambar 6. Gambar reaksi kimia uji VP (Sridhar, 2006)

Asetil-metil carbinol (acetoin) adalah perantara dalam produksi butilen

glikol. Dalam tes ini dua reagen, 40% KOH dan alpha-naftol ditambahkan setelah

inkubasi dan terkena oksigen. Jika terdapat acetoin, acetoin akan teroksidasi

dengan adanya udara dan KOH menjadi diacetyl. Diacetyl kemudian bereaksi

dengan komponen guanidin dari pepton, adanya alpha-naftol menghasilkan warna

merah. Peran alpha-naftol adalah untuk katalis dan penguat warna (Hemraj, 2013).

Hasil pengamatan untuk uji VP adalah negatif yang ditunjukan tidak adanya

perubahan warna terhadap larutan VP.

Media uji motilitas digunakan untuk menentukan motilitas dari suatu

mikroorganisme. Uji motilitas sering kali digunakan dalam diferensiasi dari

Enterobacteriaceae (Shields dkk, 2013). Hasil pengamatan uji motilitas E. coli

adalah positif, hal ini ditunjukan adanya pertumbuhan bakteri disekitar area

penusukan. Pergerakan dari bakteri tersebut karena media semisolid (uji motilitas)

dirancang dengan mengurangi konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4%

pada media yang hanya cukup untuk mempertahankan bentuknya sementara

memungkinkan pergerakan bakteri bergerak (Leboffe, 2011)

Tes Citrat bertujuan mendeteksi kemampuan suatu organisme untuk

memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Bakteri

diinokulasi pada medium yang mengandung natrium sitrat dan indikator pH

bromothymol biru. Media juga mengandung garam amonium anorganik, yang

digunakan sebagai satu-satunya sumber nitrogen. Pemanfaatan sitrat melibatkan

enzim citrat permease, yang memecah sitrat menjadi oksaloasetat dan asetat.

Oksaloasetat lebih lanjut dipecah menjadi piruvat dan CO2. Produksi Na2CO3

serta NH3 dari pemanfaatan natrium sitrat dan garam amonium masing-masing

menghasilkan pH basa. Hal ini menyebabkan perubahan warna medium dari hijau

menjadi biru (Hemraj, 2013).

Gambar 7. Reaksi kimia uji citrat (Sridhar, 2006)

Uji citrat dilakukan dengan inokulasi mikroorganisme ke dalam media

sintetis organik, "Simons Citrate broth" apabila natrium sitrat adalah satu-satunya

sumber karbon dan energi. Bromothymol blue digunakan sebagai indikator saat

asam sitrat dimetabolisme, menghasilkan karbondioksida yang menggabungkan

natrium dengan air untuk membentuk natrium karbonat yang merupakan produk

alkaline yang menghasilkan perubahan warna dari hijau menjadi biru dan hal ini

menunjukkan tes tersebut positif. (Sridhar, 2006). Hasil pengamatan untuk uji

Citrat adalah negatif yang ditunjukan tidak adanya perubahan warna terhadap

media uji citrat.

Hasil pengamatan dari uji urea yang telah dilakukan adalah negatif, hal ini

ditunjukan karena tidak ada perubahan warna pada media uji urea. Uji Urease

berguna untuk mengidentifikasi organisme yang mampu menghidrolisis urea yang

dapat menghasilkan amonia dan karbon dioksida terutama untuk mengetahui

mikrooeganisme tersebut mempunyai enzim urease atau tidak. Urease merupakan

enzim konstitutif yang menghidrolisis urea menjadi karbon dioksida dan ammonia

( NH2 ) 2CO + H2O → CO2 + 2NH3 (Brink, 2013).

Gambar 8. Gambar reaksi kimia uji uerase (Leboffe, 2011)

Urea dihidrolisis menjadi amonia oleh organisme positif urease akan

mengatasi buffer dalam jangka menengah dan mengubahnya dari oranye menjadi

merah muda . hasil pengamatan untuk uji uraease pada E. coli menunjukan hasil

negati, hal ini dikarenakan Organisme negatif urease baik tidak menghasilkan

perubahan warna dalam media atau mengubahnya kuning dari produk asam.

(Leboffe, 2011).

TSIA agar adalah media deferensial yang digunakan dalam menentukan

fermentasi karbohidrat dan produksi H2S. Selain itu, ujia TSIA ini juga dapat

mendeteksi adanya gas hasil dari metabolisme karbohidrat. TSIA membedakan

bakteri berdasarkan fermentasi mereka laktosa, glukosa dan sukrosa dan produksi

hidrogen sulfida. TSIA yang paling sering digunakan dalam identifikasi

Enterobacteriaceae, meskipun berguna untuk bakteri gram negatif lainnya

(Lehman, 2005). Hasil dari pengamatan untuk uji TSIA pada E. coli menunjukan

hasi A/A dengan gas positif dan H2S negatif. Warna kuning pada keseluruhan

media tersebut dikarenakan E. coli pada media TSIA dapat memfermentasikan

glukosa, laktosa dan sukrosa. Gas positif dikarenakan gas yang dihasilkan oleh

fermentasi karbohidrat akan muncul sebagai celah di media atau akan mengangkat

agar-agar dari bagian bawah tabung (Leboffe, 2011). Media uji motilitas

digunakan untuk menentukan motilitas dari suatu mikroorganisme. Uji motilitas

sering kali digunakan dalam diferensiasi dari Enterobacteriaceae (Shields dkk,

2013). Hasil pengamatan uji motilitas pada E. coli adalah positif, hal ini

ditunjukan adanya pertumbuhan bakteri disekitar area penusukan. Pergerakan dari

bakteri tersebut dikarenakan media semisolid (uji motilitas) dirancang dengan

mengurangi konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4% pada media yang

hanya cukup untuk mempertahankan bentuknya sementara memungkinkan

pergerakan bakteri bergerak. (Leboffe, 2011).

Hasil dari pengamatan untuk uji gula-gula adalah positif kecuali manitol.

Fermentasi karbohidrat adalah proses metabolisme oleh molekul organik yang

bertindak memberikan donor elektron serta satu atau lebih produk organik yang

bertindak sebagai penerima elektron. Fermentasi glukosa dimulai dengan

memproduksi piruvat. Produk akhir fermentasi piruvat meliputi berbagai asam,

alkohol, dan H2 atau Gas CO2. Produk akhir yang spesifik tergantung pada

organisme tertentu. Setiap media terdiri dari bahan dasar yang ditambahkan

karbohidrat yang dapat difermentasi. Bahan dasar tersebut termasuk di dalamnya

adalah pepton dan indikator pH. Setiap karbohidrat dapat digunakan, namun

umumnya yang sering digunakan adalah glukosa , laktosa , dan sukrosa. Tabung

Durham diletakkan terbalik dalam masing-masing tabung sebagai indikator

adanya produksi gas. Produksi asam dari fermentasi karbohidrat menurunkan pH

di bawah netral dan ternyata Deaminasi dari asam amino pepton menghasilkan

amonia (NH3), yang meningkatkan pH. Produksi gas ditunjukkan dengan adanya

gelembung pada tabung Durham. Kemampuan media ini untuk mendeteksi

produksi asam tergantung pada waktu inkubasi dan kemampuan fermentor untuk

menghasilkan kelebihan yang relatif asam terhadap amonia yang dihasilkan dari

proses deaminasi. (Leboffe, 2011)

Menurut Ijong dan Dien tahun 2011, hasil uji biokimia untuk E. coli

umumnya isolat uji memfermentasi laktosa dan menghasilkan asam dan gas, indol

dan metil red positif, oksidase negatif, tidak menggunakan sitrat sebagai sumber

energi dan motil, sedangkan uji lainnya memberikan hasil yang bervariasi.

B. Resistensi Antibiotik

E. coli pada media semua isolat bakteri kemudian diuji pola resistensinya

terhadap antibiotik. Antibiotik yang digunakan antara lain siprofloksasin,

gentamisin, tetrasiklin, kloramfenikol dan asam nalidiksat.Hasil dari pengujian

antibiotik ditujukkan pada Tabel 2.

Tabel 2. uji resistensi E. coli isolat feses diare anak terhadap antibiotik

No Sampel Sip Gen Tetra Klo NA

S R S R S R S R S R

1. 1a S - S - - R - R - R 2. 1b S - - R - R - R - R

3. 2a S - S - S - S - S -

4. 2b S - - R S - S - S -

5. 3a - R S - - R - R - R

6. 3b - R S - - R - R - R

7. 3c - R S - - R - R - R

8. 4a - R S - - R - R - R

9. 4b - R S - - R - R - R

10. 5 S - S - S - S - - R

11. 6 - R S - - R S - - R

12. 7 S - S - S - S - - R

13. 8 - R S - - R - R - R 14. 9 S - S - S - - R - R

15. 10 S - S - - R - R - R

Jumlah 8 7 13 2 5 10 5 10 2 13

Persentase 53% 46,7% 86,7% 13,3% 33,3% 67,7% 33,3% 67,7% 13,3% 86,7%

Keterangan :

Cip : siprofloksasin Tet : tetrasiklin

Gen : gentamisin Clo : kloramfenikol

Nal : asam nalidiksat

Gambar 9. Persentase pemeriksaan uji sensitivitas E. coli isolat feses diare anak

terhadap antibiotik

46,7

13,3

66,7 66,7

86,7

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

cip gen tet clo nal

res

sen

Hasil uji pola resistensi E. coli terhadap beberapa jenis antibiotik

menujukan 53,3% sensitif dan 46,7% resisten terhadap siprofloksasin, 86,7%

sensitif dan 13,3% resisten terhadap Gentamisin, 33,3% sensitif dan 67,7%

resisten terhadap Tetrasiklin, 33,3% sensitif dan 67,7% resisten terhadap

kloramfenikol, 13,3% sensitif dan 86,7% resisten terhadap asam nalidiksat.

Pengujian terhadap resistensi E. coli terhadap antibiotik tertinggi adalah asam

nalidiksat diikuti dengan tetrasiklin, kloramfenikol, siprofloksasin dan terendah

adalah gentamisin.

Asam nalidiksat merupakan golongan dari kuinolon, resistensi terhadap

kuinolon dapat terjadi melalui 3 mekanisme, yaitu melalui mutasi Gen gyr A yang

menyebabkan subunit A dari DNA girase bakteri berubah sehingga tidak dapat

diduduki molekul obat lagi, perubahan pada permukaan sel bakteri sehingga

mempersulit penetrasi obat ke dalam sel dan penigkatan mekanisme pemompa

obat keluar sel (efflux) (Anonim, 2007).

Tetrasiklin dan kloramfenikol termasuk antibiotik yang sering digunakan

oleh masyarakat. Terjadinya resistensi pada kloramfenikol dan tetrasiklin ini

karena terjadinya pemindahan plasmid dari bakteri resisten kepada bakteri

sensitif, dan hal ini dapat juga terjadi bila bakteri yang semula sensitif terkena

paparan obat. Tetrasiklin merupakan antibiotika yang paling banyak tersedia pada

unit-unit pelayanan kesehatan terutama Puskesmas untuk pengobatan pasien

sehingga banyak dipakai. Selain itu antibiotika ini digunakan juga untuk makanan

hewan ternak yang hanya dilakukan oleh petani dan kurang diawasi oleh tenaga

ahli. Hal ini merupakan salah satu bentuk penyalah gunaan antibiotika yang dapat

menyebabkan terpaparnya bakteri patogen oleh antibiotika yang kemudian

menjadi resisten (Refdanita dkk, 2004).

Siproflokasin merupakan generasi pertama golongan fluorokuinolon.

Secara umum mekanisme resistensi terhadap fluorokuinolon merupakan

antimikroba yang unik karena secara langsung menghambat sintesis DNA, hal ini

terjadi oleh interaksi antara obat dengan kompleks yang terdiri dari DNA dan

salah satu dari kedua enzim target, yaitu DNA gyrase dan topoisomerase IV.

Mekanisme resistensi fluorokuinolon mencakup satu atau dua dari tiga kategori

utama, yaitu perubahan dalam target obat dan perubahan dalam penetrasi obat

untuk mencapai target (Hooper, 2005).

Gentamisin merupakan golongan dari amino glikosida. Bakteri dapat

resisten terhadap amino glikosida karena kegagalan penetrasi ke dalam bakteri,

rendahnya afinitas obat pada ribosom atau inaktivasi obat oleh enzim bakteri.

Enzim inaktivator aminoglikosida yang dikenal yaitu enzim fosforilase, adenilase,

asetilase, gugus hidroksil spesifik atau gugus amino. Informasi genetik untuk

sintesis enzim terutama didapat melalui konjugasi, transfer DNA sebagai plasmid

dan transfer faktor resisten. Plasmid pembawa faktor resistensi yang tersebar luas

terutama di lingkungan rumah sakit dan membawa lebih dari 20 kode enzim ini

bertanggung jawab terhadap penyempitan spektrum kanamisin, gentamisin dan

tobramisin (Refdanita dkk, 2004). Hasil penelitian menunjukan 86,7% E. coli

sensitif terhadap antibiotik gentamisin, hal ini menunjukan bahwa disc antibiotik

gentamisin mampu menghambat sintesis protein dari E. coli melalui kerja di

ribosom.

Berikut ini adalah gambar hasil uji antibiotik pada media MHA

1

Keterangan :

a. E. coli sensitif terhadap siptofloksasin

b. E. coli resisten terhadap gentamisin

2

Keterangan :

a. E. coli sensitif terhadap tetrasiklin

b. E. coli sensitif terhadap kloramfenikol

c.

Gambar 10. Hasil uji resistensi isolat E. coli terhadap antibiotik yang disesuaikan

dengan Standart CLSi