45

BAB IVMETODE PENELITIAN4.1 Jenis PenelitianPenelitian dilaksanakan secara eksperimental laboratorium menggunakan desain penelitian control group post test only. 4.2 Tempat dan Waktu PenelitianPenelitian ini dilakukan dengan rincian tempat dan waktu penelitian sebagai berikut : Tabel 4.1: Tempat, tahapan dan waktu penelitian

WaktuTahapanTempat

15-21Mei 2013 Aklimatisasi tikus Lab. Malang Murin Farm Singosari

20-24 Mei 2013- Pengenceran metanil yellow- Pengenceran minyak atsiriLab. Biokimia FK UNISMA

22-26 Mei 2013 Induksi metanil yellow dan pemberian minyak atsiri daun nilamLab. Malang Murin Farm Singosari

6-7 juni 2013

Pembedahan hewan coba Pengambilan hepar tikusLab. Malang Murin Farm Sigosari

13-14 juni 2013 Pemeriksaan kadar IL-1 betaLab faal FK Univ.Brawijaya

4.3 Sampel Penelitian

(n-1) (p-1) 15Untuk sampel penelitian digunakan rumus Faderer yaitu non probability sampling sebagai berikut (Federe,1963 sastrosupadi, 1997)

n = jumlah kelompokp = jumlah populasi tikus dalam satu kelompok

Tabel 4.2: Sampel Penelitian

Penelitian kelompok

populasi tiap kelompok

populasi tiap kelompok yang digunakanTotal populasi

Tahap eksplorasi dosis

5

5(n 1) 155n 19n 4,75 (4,75 dibulatkan 5), jadi n 5

525

4.4 Bahan dan Alat Penelitian4.4.1 Hewan CobaHewan yang di gunakan pada penelitian ini adalah tikus wistar yang dibeli di laboratorium Murin Farm Malang, yang sudah dipilih sesuai kriteria inklusi dan kriteria ekslusi sebagai berikutTabel 4.3 : Kriteria inklusi dan eksklusi

Kriteria inklusiKriteria eksklusi

a. Jenis kelamin jantanb. Umur tikus antara 2-3 bulanc. Keadaan tikus sehat atau normal, ditandai dengan berbulu halus, mata berwarna merah jernih, gerakan-gerakan tikus seperti makan, minum, tidak terdapat luka atau cacat tubuh.d. Berat badan tikus 150-200 grama. Tikus sakitb. Tikus mati

4.4.2 Alat dan Bahan Untuk Pemeliharaan Hewan CobaTabel 4.4: Alat dan Bahan Pemeliharaan Tikus

Alat dan bahan pemeliharaan tikusKeterangan

Kandang tikusPenelitian ini terdiri dari 5 kelompok perlakuan dengan 5 kali pengulangan sehingga diperlukan 5 kandang tikus.

Makanan tikusMeliputi komposisi BR (makanan standar untuk tikus yang mengandung protein) dan polar (makanan standar untuk tikus yang mengandung karbohidrat) pada perbandingan 1:2. Diberikan dengan cara pakan tersebut dicampur dengan air hangat secukupnya kemudian dibentuk bulat-bulat dan diletakkan di dalam kandang.. Berat pakan yang diberikan per tikus 50 gram/hari, Makanan diberikan pada saat sore dan diganti ketika pagi.

Botol airAir minum yang digunakan adalah air ledeng yang diisi setiap 2 kali sehari

SekamPenggantian Sekam sebagai alas tempat tikus setiap 2 hari sekali

4.4.3 Alat dan Bahan Untuk Pengenceran Metanil YellowTabel 4.5: Alat dan Bahan Pengenceran Metanil Yellow

AlatKeterangan

1. Timbangan Digital Pro OHAUSDigunakan untuk penimbangan metanil yellow

2. Tabung Erlenmeyer 1 buahDigunakan untuk menyimpan larutan Aquades dan Metanil Yellow

3. Tabung Reaksi 1 buahDigunakan untuk mencampur Metanil Yellow dan lauran aquades

4. Kertas Aluminium foilDigunakan sebagai pembungkus tabung erlenmenyer selama penyimpanan

BahanKeterangan

1. Metanil YellowBahan yang diinduksikan kepada tikus kelompok kontrol positif dan semua kelompok perlakuan. Berbentuk bubuk yang berwarna kuning

2. AquadesLarutan yang digunakan untuk mengencerkan bubuk Metanil Yellow

4.4.4 Alat dan Bahan untuk Pengenceran Minyak Atsiri Daun Nilam Tabel 4.6: Alat dan Bahan Pengenceram Minyak Atsiri Daun Nilam

AlatKeterangan

1. Tabung Erlenmeyer 3 buahDigunakan untuk menyimpan larutan Aquades dan Minyak Nilam, masing-masing untuk dosis 3%, 6% dan 12%

2. Tabung Reaksi 3 buahDigunakan untuk mencampur Minyak Nilam dan larutan CMC 5%

3. Pipet tetes 2 buah1 buah untuk mengambil larutan minyak nilam, 1 buah untuk mengambil larutan CMC

4. Aluminium FoilDigunakan sebagai pembungkus tabung erlenmenyer selama penyimpanan

5. HandsconeDigunakan untuk menghindari kontak langsung tangan dengan alat dan bahan yang digunakan

6. Gelas Ukur 2 buah1 buah digunakan untuk mengukur volume minyak nilam yang dibutuhkan, 1 buah untuk mengukur volume larutan CMC yang dibutuhkan

BahanKeterangan

I. Minyak atsiri daun nilam (Pogostemon cablin Benth)Bahan yang disondekan kepada tikus pada semua kelompok perlakuan

II. Larutan CMC 0,5%Larutan standar yang digunakan untuk mengencerkan minyak atsiri daun nilam.

4.4.5Alat dan Bahan Untuk Induksi Metanil YellowTabel 4.7: Alat dan Bahan Pemberian Metanil Yellow

AlatKeterangan

1. Spuit 3cc 25 buahDigunakan untuk injeksi intra peritoneal Metanil Yellow, setiap pengulangan masing-masing 1 buah untuk 25 ekor tikus

2. Kapas AlkoholUntuk desinfeksi pada daerah injeksi

3. Membran filterUntuk menyaring larutan Metanil Yellow sebelum diinjeksikan

BahanKeterangan

I. Larutan Metanil YellowLarutan Metanil Yellow yang dihasilkan dari proses pengenceran dengan aquades

4.4.6 Alat dan Bahan untuk Pemberian Minyak Atsiri Daun Nilam (Pogostemon cablin Benth)Tabel 4.7: Alat dan Bahan Pemberian Minyak Atsiri

Alat dan Bahan Keterangan

Sonde oral dan spuit

Alat ini digunakan untuk memberikan Minyak Atsiri Daun Nilam (Pogostemon cablin Benth) peroral kepada tikus.

Minyak Atsiri Daun Nilam (Pogostemon cablin Benth)Pengenceran Minyak Atsiri dilakukan di Laboratorium Biokimia FK UNISMA dengan konsentrasi 3%, 6%, dan 12%

Handscoon-

4.4.7 Alat dan Bahan Untuk Eliminasi Hewan CobaTabel 4.8: Alat dan Bahan Eliminasi Hewan Coba

AlatKeterangan

1. Spuit 1 ccUntuk menginjeksikan ketamin

2. Heating setUntuk membedah tikus

3. Papan tempat pembedahan tikus

4. Paku payung untuk fiksasi tikus

5. Tabung tempat penyimpanan darah

6. Tempat sampah 2 buahMasing-masing untuk sampah medis dan sampah non medis

7. HandscoonDigunakan untuk menghindari kontak langsung tangan dengan alat dan bahan yang digunakan

BahanKeterangan

I. Ketamin Bahan yang digunakan untuk pembiusan hewan coba dengan dosis 5mg/KgBB intra muskular

4.4.8 Alat dan Bahan Untuk Pemeriksaan IL-1 BetaTabel 4.9: Alat dan Bahan Pemeriksaan IL-1 beta

ALATBAHAN

1. Microtiter Maxi Binding2. Multi channel pipet3. Mikropipet4. Blue tip5. Yellow tip6. Vortek7. Tube8. Sentrifuge9. ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif10. Awareness11. Coating Buffer12. PbS13. PbS Tween14. Antibodi primer (human anti IL- 1)15. Antibodi sekunder (IgG Biotin)16. TMB17. HCL 1N

1. Jaringan Hepar 5 mg

4.5Prosedur Penelitian4.5.1Pengelompokan Hewan CobaSampel dibagi menjadi 5 kelompok, setiap kelompok terdiri dari 5 ekor tikus.Tabel 4.10: Kelompok Kontrol dan PerlakuanKontrol1. Kelompok 1Kontrol negatif K0sampel = 4 ekor Induksi aquades /intra peritoneal @1ml Aquades @2ml personde lambung

2. Kelompok 2Kontrol positif K1sampel = 4 ekor Induksi Metanil yellow 80 mg/KgBB /intra peritoneal @1 ml Aquades @2ml personde

Perlakuan3. Kelompok 3sampel = 4 ekor Induksi Metanil yellow 80 mg/KgBB /intra peritoneal @1ml Minyak Nilam 3% = @2ml personde

4. Kelompok 4 sampel = 4 ekor Induksi Metanil yellow 80 mg/KgBB /intra peritoneal @1ml Minyak Nilam 6% = @2ml personde

5. Kelompok 5sampel = 4 ekor Induksi Metanil yellow80 mg/KgBB /intra peritoneal @1ml Minyak Nilam 12% = @2ml personde

4.5.2Pemeliharaan dan Adaptasi Hewan CobaAdaptasi hewan coba dilakukan selama tujuah hari sebelum perlakuan. Selama tujuh hari ini tikus diberi makan dan minum sesuai standar laboratorium dan dilakukan penimbangan berat badan setiap hari. Selama perlakuan tikus juga dipelihara dan diberi makan dan minum standar laboratorium. Kandang tikus dibersihkan dua kali dalam seminggu. Tikus dipelihara dalam ruangan yang berventilsi cukup, dikandangkan secara individual. Suhu ruangan berkisar 28 32 derajat Celcius, dengan kelembaban 56 5%. Tikus diberi makan dan minum sesuai standar laboratorium, dengan komposisi BR (makanan tikus yang mengandung protein) dan Polar (makanan tikus yang mengandung karbohidrat) dengan perbandingan 1:2.Setiap tiga hari dilakukan pembersihan kandang.. Untuk mengantisipasi bila ada yang mati maka tiap-tiap kelompok perlakuan jumlah sampel ditambah kurang lebih 10%. 4.5.3Pengenceran Metanil YellowDosis Metanil yellow 80mg/KgBB diambil dari penelitian Ramchandani, dkk tahun 1997. Dosis 80mg/KgBB disesuaikan dengan berat badan tikus yaitu 150gram sehingga didapatkan dosis 12mg/150gBB. Cara penghitungan pengenceran berdasarkan pada tabel berikut :Tabel 4.11: Cara Pengenceran Metanil Yellow

Dosis ketentuanDosis per 150 gCara pengenceran

80 mg/1000 g

300 mg Metanil Yellow ditambahkan 25 ml larutan aquades = = 12 mg/ml

4.5.4Pembuatan dan Pemberian Minyak Atsiri Daun Nilam

V1K1=V2K2Proses pembuatan minyak atsiri dilakukan di Pabrik Minyak Nilam, Kesamben Blitar menggunakan proses destilasi menghasilkan minyak atsiri dengan konsentrasi 20% dalam 80 ml. Minyak atsiri kemudian diencerkan dengan menggunakan larutan CMC(Carboxyl Methyl Cellulose) 5% menjadi sediaan dengan konsentrasi 3 %,6%, dan 12%. Cara penghitungan dosis minyak atsiri pada masing konsentrasi sebagai berikut.Keterangan:V1= Volume sebelum pengenceranK1= konsentrasi sebelum pengenceran dalam persenV2= volume setelah pengenceranK2= konsentrasi setelah pengenceran dalam persen

Tabel 4.12: Perhitungan Dosis Pengenceran Minyak Atsiri

DosisCara Pengenceran

Dosis 3%V1.K1=V2.K25 mL x 20% = V2 x 3 V2 = 5 mL x 20% 3% = 100 3 = 33 mLVolume CMC 5% yang ditambahkan = 33 mL - 5 mL = 28 mLMinyak atsiri 5 ml dengan kadar 20% diencerkan dengan CMC 5% sebanyak 28 ml untuk menghasilkan kadar minyak atsiri 3%.

Dosis 6%V1.K1=V2.K210 mL x 20% = V2 x 6 M V2 = 10 mL x 20 %1% = 200 6 = 33 mLVolume CMC 5% yang ditambahkan = 33 mL - 10 mL = 23 mLMinyak atsiri 10 ml dengan kadar 20% diencerkan dengan CMC 5% sebanyak 23 ml untuk menghasilkan kadar minyak atsiri 6%.

Dosis 12%V1.K1=V2.K220 mL x 20 = V2 x 12 M V2 =20 mL x 20%12% = 400 12 = 33 mLVolume CMC 5% yang ditambahkan = 33 mL - 20 mL = 13 mLMinyak atsiri 20 ml dengan kadar 20% diencerkan dengan CMC 5% sebanyak 13 ml untuk menghasilkan kadar minyak atsiri 12%.

4.5.5Perlakuan Hewan CobaPerlakuan dilakukan pada 5 kelompok hewan coba. Proses perlakuan dilakukan pada hari ke 8 sampai hari ke 12 antara jam 18.00-20.00 WIB. Selama perlakuan sediaan Metanil Yellow dan minyak atsiri disimpan ditempat yang gelap dengan suhu ruangan.Kelompok kontrol negatif (K0) diberikan larutan aquades secara intra peritoneal sebanyak 1 ml, 2 jam kemudian diikuti pemberian larutan aquades sebanyak 2 ml personde. Kelompok kontrol positif (K1) diberikan larutan Metanil Yellow secara intra peritoneal sebanyak 1 ml, 2 jam kemudian diikuti pemberian larutan aquades sebanyak 2 ml personde.Kelompok Perlakuan 1 (K2) diberikan larutan Metanil Yellow secara intra peritoneal sebanyak 1 ml, 2 jam kemudian diikuti pemberian larutan minyak nilam 3% sebanyak 2 ml personde.Kelompok Perlakuan 2 (K3) diberikan larutan Metanil Yellow secara intra peritoneal sebanyak 1 ml, 2 jam kemudian diikuti pemberian larutan minyak nilam 6% sebanyak 2 ml personde.Kelompok Perlakuan 3 (K4) diberikan larutan Metanil Yellow secara intra peritoneal sebanyak 1 ml, 2 jam kemudian diikuti pemberian larutan minyak nilam 12% sebanyak 2 ml personde.

4.5.6Eliminasi Hewan Coba dan Pengambilan Hepar Tikus diambil berdasarkan urutan kelompok perlakuan. Tikus dibius intra muskuler pada femur menggunakan ketamine dengan dosis 5 mg/kgBB.Tikus dibedah secara vertikal mengikuti linea mediana dinding abdomen lalu hepar diambil dan diletakkan di tempat organ.Tabel 4.12: Alat Dan Bahan Eliminasi Hewan CobaPembedahan Hewan Coba

Alat:1. Spuit2. Gunting3. Tempat organ4. Pinset5. Pengait jaringan6. HandschoonBahan:1. Hewan coba (Tikus jantan strain Wistar)

4.5.7Pemeriksaan Kadar IL-1 Hepar Tikus Pemeriksaan kadar IL-1 Hepar tikus dilakukan di Laboratorium faal Universitas Brawijaya.Metode yang digunakan dalam pengukuran kadar IL-1 adalah metode ELISA Indirect. Langkah-langkah pengukuran tersebut sebagai berikut1. Isolasi ProteinHepar ditimbang kira-kira 1 gram dicuci dengan Pbs, dihancurkan sampai halus ditambah cairan PMSF 1ml:100 mga) Di Vortex, di inkubasi 30 menit 40Cb) Di sntrifuge 2000Rpm 20 menit2. Coating antigenSupernatan 5 l dilarutkan dalam coating buffer dengan perbandingan 1:20 hingga 200 l/wella) Diinkubasi pada suhu 40C semalam b) Dicuci dalam PBS-Tween 0,2% sebanyak dua kali, @ 5 menit3. Diblok dengan Blocking buffer (BSA 1% dalam PBS) 50 l/wella) Diinkubasi selama 45 menit suhu ruangb) Dicuci dalam PBS-Tween sebanyak dua kali, @ 5 menit4. Coating Ab primer 50l/well IL - 1 1:1500 dalam PBSa) Diinkubasi selama 1 jam suhu ruangb) Dicuci dalam PBS-Tween 0,2% sebanyak dua kali, @ 5 menit5. Coating Ab sekunder 1:1000 dalam PBS dimana Ab sekunder yang digunakan adalah IgG Biotin Anti Mousea) Diinkubasi selama 1 jam suhu ruang b) Dicuci dalam PBS-Tween 0,2% sebanyak dua kali, @ 5 menit6. Ditambahkan substrat SA-HRP 1:1000a) Diinkubasi selama 1 jam suhu ruangb) Dicuci dalam PBS-Tween 0,2% sebanyak dua kali, @ 5 menit7. Ditambahkan substrat Sureblue TMBDiinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang8. Ditambahkan HCl 1N sebagai stop reactionDiinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang9. Dibaca dengan ELISA reader pada = 450 nm4.6Teknik Analisa DataPada akhir minggu perlakuan, dilakukan pengamatan kadar IL-1 hepar tikus meliputi cek kelengkapan data dan entry data ke software SPSS versi 12.00. Kemudian dilakukan cek distribusi, normalitas, dan homogenitas data dengan menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov 1 sample dan uji Saphiro wilk karena data yang didapatkan berupa data numerikal. Setelah itu dilakukan uji statistik one-way ANOVA yang dilanjutkan dengan uji LSD (Least Significant Difference) untuk mengetahui perbandingan antar perlakuan dan siginifikansinya. Hasil dikatakan bermakna bila p0,05.

Tikus, strain Wistar, jantan, usia 2-3 bulan sebanyak 20 ekor, berat 120-150 gram4.7Diagram Alur Penelitian II

Adaptasi 7 hari

Kelompok PerlakuanKelompok Kontrol

Kontrol Negatif (K0)aquades /intra peritoneal @1mlAquades @2ml personde lambung(Selama 5 hari)Kontrol Positif (K1)Induksi Metanil yellow 80 mg/KgBB /intra peritoneal @1 mlAquades @2ml personde(Selama 5 hari)K2Induksi Metanil yellow 80 mg/KgBB /intra peritoneal @1mlMinyak Nilam 3% @2ml personde(Selama 5 hari)K3Induksi Metanil yellow 80 mg/KgBB /intra peritoneal @1mlMinyak Nilam 6% @2ml personde(Selama 5 hari)K4Induksi Metanil yellow80 mg/KgBB /intra peritoneal @1mlMinyak Nilam 12% = @2ml personde(Selama 5 hari)

KesimpulanPemeriksaan kadar IL-1 secara ELISAAnalisis DataPengambilan organ heparEliminasi Hewan Coba