bab iv 17juli2012z

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1. Jenis Penelitian

Jenis penelitian dilaksanakn secara eksperimental laboratorik

dengan desain penelitian control group post test only design secara in

vivo, Penelitian ini terdiri dari dua tahap, dengan optimalisasi dosis tawas

sebagai penelitian pendahuluan untuk penelitian pengaruh jus tomat ranti

(Lycopersicum pimpinellifolium Mill.) dengan atau tanpa cabai rawit

(Capsicum frutescens) pada tikus yang diinduksi tawas dosis optimum.

4.2. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan selama tiga bulan dengan perincian :

1. Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Islam

Malang untuk pembuatan jus tomat ranti (Lycopersicum

pimpinellifolium Mill.) dan jus cabai rawit (Capsicum frutescens)

serta pemeriksaan preparat hepar

2. Laboratorium kimia Universitas Muhmmadiyah Malang untuk

adaptasi, perlakuan hewan coba, pembuatan preparat hepar, dan

pemeriksaan preparat hepar.

41

42

4.3. Alat dan Bahan Penelitian

4.3.1. Hewan Coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah

tikus wistar (Rattus novergicus) berjenis kelamin jantan, berusia

sekitar 2-3 bulan, dan kisaran berat badan 130-180 gram biakan

lokal dengan kondisi sehat yang ditandai dengan gerak aktif tikus

dan dipilih secara acak (random sampling).

Pemilihan tikus wistar dengan pertimbangan bahwa hewan

ini mudah didapatkan, mudah beradaptasi sesuai dengan

lingkungan yang baru serta mudah untuk dimanipulasi sehingga

jumlah sampel dapat dikendalikan dengan baik. Dipilih jenis

kelamin jantan karena tidak mengalami siklus hormonal yang dapat

mempengaruhi hasil penelitian. Pemilihan umur 2-3 bulan

didasarkan pada pertimbangan sudah mencapai umur dewasa,

sedangkan berat badan dapat menggambarkan kesehatan hewan

coba (Hairrudin, 2006). Hewan coba diperoleh dari Laboratorium

kimia Universitas Muhmmadiyah Malang.

Metode pengambilan sampel menggunakan simple non

probability sampling. Federer (1963) dalam Sastrosupadi (1977)

menyatakan bahwa hubungan antara perlakuan dan banyaknya

ulangan adalah sebagai berikut :

(t-1) (n-1) ≥ 15

(Sastrosupadi, 1977)

43

Dimana t merupakan jumlah perlakuan dan n merupakan

jumlah pengulangan/sampel. Penelitian ini menggunakan lima

kelompok perlakuan (t=5), sehingga jumlah pengulangan (jumlah

sampel) yang dibutuhkan adalah:

(t-1) (n-1) ≥ 15

4(n-1) ≥ 15

4n-4 ≥ 15

4n ≥ 19

n ≥ 5

Jumlah tikus yang digunakan pada percobaan ini adalah 5

ekor tikus untuk tiap kelompok perlakuan. Sehingga jumlah hewan

coba minimal yang dibutuhkan dalam penelitian ini sebanyak 55

ekor.

4.3.2. Alat dan Bahan Pemeliharaan Hewan Coba

1. Kandang hewan coba dengan ukuran 40 x 30 cm,

menggunakan wadah plastik yang diatasnya ditutup dengan

anyaman kawat. Dalam satu kandang berisi satu kelompok

tikus.

2. Makanan hewan coba, menggunakan PARS dan tepung dengan

perbandingan 2:1. Berat total pakan yang diberikan per ekor

per hari adalah 36 gram.

3. Botol yang berisi air minum, diletakkan di bagian atas

kandang.

4. Sekam, digunakan sebagai alas untuk tikus.

44

5. Timbangan digital Dhaus Pioneer PA214 400 gram.

4.3.3. Alat dan Bahan Perlakuan Paparan Tawas

1. Sonde oral dan spuit OneMed 5 cc, yang digunakan untuk

perlakuan paparan tawas yang diberikan secara oral personde

lambung.

2. Larutan tawas 2%, 4%, 6%, dan 8% di dapat dari lab kimia

Universitas Muhammadiyah Malang.

4.3.4. Alat dan Bahan pembuatan Jus Buah Tomat ranti

(Lycopersicum pimpinellifolium Mill.) dan cabai rawit

(Capsicum frutescens)

1. Alat

a. Blender MADAT VITAMAX – O2 FIBER

b. Wadah tempat menyimpan buah tomat ranti dan cabai rawit

segar

c. Timbangan digital Dhaus Pioneer PA214 210 gram

d. Kertas saring/kain untuk menyaring

e. Erlenmeyer 100, 250, dan 500 ml

f. Beker glass 50 ml dan corong gelas

g. Pipet volume 10 dan 25 ml

h. Pipet tetes

i. Gelas ukur 25, 50, 100 ml

j. Alumnium foil

k. Batang pengaduk

l. Botol coklat penyimpan jus

45

m. Handscoon

2. Bahan

a. Buah Tomat ranti (Lycopersicum pimpinellifolium Mill.)

dan cabai rawit (Capsicum frutescens)

b. Akuades

4.3.5. Alat dan Bahan Perlakuan Jus Buah Tomat ranti (Lycopersicum

pimpinellifolium Mill.) dan Cabai Rawit (Capsicum frutescens)

a. Sonde oral dan spuit OneMed 5cc, yang digunakan untuk

perlakuan Jus Buah Tomat ranti (Lycopersicum pimpinellifolium

Mill.) dan cabai rawit (Capsicum frutescens) yang diberikan

secara oral personde lambung.

b. Larutan Jus Buah Tomat ranti (Lycopersicum pimpinellifolium

Mill.) 100% serta cabai rawit (Capsicum frutescens) 25%, 50%,

dan 100%.

4.3.6. Alat dan Bahan Pembedahan

a. Spuit OneMed 5cc

b. Gunting

c. Tempat organ

d. Pinset

e. Pengait jaringan

f. Handscoon

g. Parafin

h. Formalin 10%

i. Chloroform

46

j. Kotak kaca

4.3.7. Alat dan Bahan Perhitungan aktifitas antioksidan

4.4. Tahapan Kerja

Alat-alat:

1. Kain tipis,

2. Neraca digital,

3. Blender,

4. Sentryfuge,

5. Plastik PP (0.5 kg),

6. Pipet tetes,

7. Gelas ukur,

8. Labu ukur,

9. Stirrer,

10. Timbangan,

11. Almari es,

12. Termometer.

13. Mortar

14. Kuved

15. Spektrofotometer (Spektrunic 20 Genesys, Jerman)

16. Spektrofotometer VV (USA)

Bahan:

1. Cabai rawit,

47

2. tomat ranti,

3. Yodium,

4. Air,

5. Etanol 95%

6.aquades

7. Amilum.

4.4.1. Pengelompokan Hewan Coba

Pada penelitian optimasi dosis tawas, selanjutnya sampel

akan dibagi menjadi 5 kelompok yang dapat dilihat pada table 4.1 di

bawah ini.

Tabel 4.1. Pengelompokan Hewan Coba Penelitian Tahap

Optimasi Dosis Tawas

Kontrol Kelompok 0 (K0) n=5 Tanpa tawas

Perlakuan

Kelompok 1 (K1) Induksi tawas 2%




Pada penelitian pengaruh jus buah tomat ranti

(Lycopersicum pimpinellifolium Mill.) dengan atau tanpa cabai

rawit (Capsicum frutescens) pada tikus dengan paparan tawas dosis

optimal, selanjutnya sampel akan dibagi menjadi 6 kelompok yang

dapat dilihat pada Tabel 4.2 di bawah ini.

48

Tabel 4.2. Pengelompokan Hewan Coba Penelitian Pengaruh

Jus Buah Tomat Ranti (Lycopersicum pimpinellifolium Mill.)

Dengan Atau Tanpa Cabai rawit (Capsicum frutescens) pada

Tikus dengan Paparan Tawas Dosis Optimal

Kontrol

Kelompok 0 (K0) n=5

Kontrol NegatifTanpa tawas

Kelompok 1 (K1) n=5

Kontrol Positif

Induksi tawas 8% tanpa jus Buah Tomat

ranti (Lycopersicum pimpinellifolium Mill.)

dan cabai rawit (Capsicum frutescens)

Perlakuan

Kelompok 2 (K2) n=5

Indukisi tawas 8% + Buah Tomat ranti

(Lycopersicum pimpinellifolium Mill.)

100%

Kelompok 3 (K3) n=5



100% + cabai rawit (Capsicum frutescens)

25%

Kelompok 4 (K4) n=5




50%

Kelompok 5 (K5) n=5




100%

49

4.4.2. Pemeliharaan Hewan Coba

Proses adaptasi (penyesuaian diri terhadap lingkungan)

dilakukan selama 7 hari dengan diberi makan dan minum sebanyak

standar laboratorium. Pada hari ketujuh masa adaptasi, dilakukan

penimbangan berat badan tikus yang dianggap sebagai berat badan

prakondisi, dan dilanjut sampai masa perlakuan selama 7 hari.

Proses ini dilakukan di animal house Laboratorium kimia

Universitas Muhammadiyah Malang.

4.4.3. Pembuatan Jus Buah Tomat ranti (Lycopersicum

pimpinellifolium Mill.) dan Cabai Rawit (Capsicum frutescens)

Buah tomat ranti (Lycopersicum pimpinellifolium Mill.)

dan cabai rawit (Capsicum frutescens) diambil dari BPTP (Balai

Pengkajian Teknologi Pertanian) Karangploso, dengan perawatan

penyiraman dan pemupukan standar. Selanjutnya, buah dicuci

sampai bersih kemudian diblender tanpa diberi air. Buah tomat

ranti (Lycopersicum pimpinellifolium Mill.) dan cabai rawit

(Capsicum frutescens) yang telah diblender disaring dengan

menggunakan kertas saring/kain penyaring, bagian airnya diambil

dan ampasnya dibuang, ini merupakan konsentrasi jus buah tomat

ranti (Lycopersicum pimpinellifolium Mill.) dan cabai rawit

(Capsicum frutescens) 100%. Kemudian diencerkan dengan

menggunakan aquades hingga didapatkan konsentrasi 25% (75ml

50

aquades + 25ml jus cabai rawit) dan 50% (50ml aquades + 50ml

jus cabai rawit).

Penjelasan prosedur kerja pembuatan jus buah tomat ranti

(Lycopersicum pimpinellifolium Mill.) dan cabai rawit (Capsicum

frutescens) secara skematik dapat dilihat pada Lampiran 1.

4.4.4. Perlakuan

Pada penelitian optimasi dosis tawas, tikus diberi paparan

tawas melalui oral (personde lambung) 30 menit setelah

pemberian pakan tikus. Pada penelitian pengaruh jus buah tomat

ranti (Lycopersicum pimpinellifolium Mill.) dengan atau tanpa

cabai rawit (Capsicum frutescens) pada tikus dengan paparan

tawas, tikus diberi jus 30 menit setelah pemberian pakan, dan 30

menit setelah itu dilakukan pemberian tawas. Pemberian tawas dan

jus diberikan secara oral (personde lambung).

4.4.5. Pembedahan

Cara pembedahan yang dilakukan adalah dengan

pembiusan. Pertama, gunakan handscoon dan siapkan alat-alat

pembedahan. Kemudian lakukan pembiusan dengan chloroform..

Letakkan tikus yang telah pingsan di parafin. Selanjutnya bedah

bagian perut hingga ke dada tikus menggunakan alat bedah minor.

Ambil organ hepar kemudian letakkan di wadah yang terisi larutan

formalin 10%. Penjelasan prosedur pembedahan secara skematik

dapat dilihat pada Lampiran 2.

4.4.6. Teknik Pengambilan Darah

51

1. ambil darah dari aorta tikus

2. masukkan dalam tabung dengan EDTA-antikoagulan

4.4.7. Teknik Perhitungan Jumlah aktifitas antioksidan

a. Menimbang 5 gram sampel kemudian di haluskan dengan

mortar.

b. Menambah sampel dengan etanol 95% sebanyak 250 ml

kemudian

menvortex untuk membantu melarutkan sampel.

c. Mensentrifuge ekstrak dengan kecepatan 4000 rpm selama 10

menit untuk

memisahkan ekstrak dari endapan.

d. Mengambil supernata sebanyak 4 ml dan menambahkan dengan

1 ml

larutan 1,1-diphenyl-2-pieryllhidrozil (DPPh) 0,2 mM.

e. Membiarkan selama 10 menit, kemudian memasukkan kedalam

kuved dan

diukur absorbsinya pada λ = 517 nM.

f. Melakukan kontrol seperti prosedur di atas (e) dengan

menggunakan

bahan larutan 1,1-diphenyl-2-pieryllhidrozil (DPPh) 0,2 mM.

g. Menghitung Aktivitas Sceavenger Radikal Bebas sebagai

persentase

berkurangnya warna DPPH dengan perhitungan :

52

% Aktivitasi Oksidan = 100 – [100x(absorbansisampel /

absorbansikontrol)]

(Blois, 1958 dalam Hanani dkk, 2005)

.

4.5 Teknik Analisa Data

Tahap pertama terlebih dahulu dilakukan entry data, kemudian

dilakukan proses clearing (uji normalitas dan homogenitas). Apabila data

bersifat terdistribusi normal serta varian bersifat homogen maka dilanjutkan

dengan analisa data. Metode analisa data yang digunakan berupa metode

statistik parametrik yaitu ANOVA test yang akan ditampilkan dalam bentuk

tabel dan diagram. Menggunakan ANOVA test dikarenakan lebih dari 2

kelompok uji dengan syarat data terdistribusi normal dan homogen. Hasil

dikatakan bermakna bila p < 0,05. Uji lanjut dengan metode uji Tukey.

Peneliti menambahkan dengan uji korelasi untuk mengetahui hubungan antar

kelompok perlakuan apabila dosis dinaikkan. Semua analisa data dilakukan

dengan memakai perangkat software statistik SPSS versi 17.

Tikus Rattus norvegicus strain Wistar jantan usia 2 bulan sebanyak 25 ekor,

berat rata – rata 150 gram

Adaptasi 7 hari

Kesimpulan

Tanpa diberi paparan

tawas dalam makanan

Kelompok PerlakuanKelompok Kontrol

Diberi paparan

tawas 6% dalam

makanan (0,9 gr)

Diberi paparan

tawas 4% dalam

makanan (0,6 gr)

Diberi paparan tawas 2%

dalam makanan (0,3

gr)

Pengambilan sample d tikus melalui aorta

pembedahan

Pengumpulan Data anti oksidan

Pemeriksaan jumlah anti oksidan

Analisa Data jumlah anti oksidan

Diberi paparan

tawas 8% dalam

makanan (1,2 gr)

53

4.6 Diagram Alur Penelitian

4.6.1 Tahap I: Optimasi Dosis Tawas

Tikus Rattus norvegicus strain Wistar jantan usia 2 bulan sebanyak 30 ekor, berat rata- rata 150 gr

Kelompok 1

(Kontrol Negatif)Tanpa

perlakuan (2 ml

aquadest)

pembedahan

Kelompok 2

(Kontrol Positif)

pemberian tawas 8% +

2 ml aquades

Kelompok 3

Paparan tawas 8%+ jus Tomat ranti 100% 1 ml + 1ml aquadest

Kelompok 4

Paparan tawas 8% + jus Tomat

Ranti 100% 1 ml + jus cabai rawit 25% 1 ml

Kelompok Kontrol Kelompok Perlakuan

Pengambilan darah tikus melalui aorta

Pemeriksaan Jumlah antioksidan

Kesimpulan

Pengumpulan Data antioksidan

Analisa Data jumlah antioksidan

Kelompok 5

Paparan tawas 8% + jus Tomat

Ranti 100% 1 ml + jus cabai rawit 50% 1 ml

Kelompok 6

Paparan tawas 8% + jus tomat

ranti 100% 1ml + jus

cabai rawit 100% 1ml

54

4.6.2 Tahap II: Penelitian Pengaruh Jus Buah Tomat Ranti (Lycopersicum

pimpinellifolium Mill.) Dengan Atau Tanpa Cabai Rawit

(Capsicum frutescens) Pada Tikus Dengan Paparan Tawas

Dosis Optimal

55

4.7. Kegiatan dan Waktu Penelitian

NO Kegiatan Bulan ke-1 Bulan ke-2 Bulan ke-3 Bulan ke-4

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

1 Pembelian alat,

bahan, dan hewan

coba

2 Adaptasi hewan coba

3 Induksi tawas dengan

dosis 2%, 4%, 6%,

dan 8%

4 Pembunuhan hewan

coba, pengambilan

sampel hepar, dan

pembikinan preparat

hepar

5 Pemeriksaan struktur

sel hepar tikus

6 Tabulasi dan analisa

data

7 Adaptasi hewan coba

8 Induksi tawas dosis

optimal dan

pemberian Jus Buah

Tomat ranti

(Lycopersicum

pimpinellifolium

56

Mill.) 100% dan

cabai rawit

(Capsicum

frutescens) 25%,

50%, 100%

9 Pembunuhan hewan

coba, pengambilan

sampel hepar, dan

pembikinan preparat

hepar

10 Pemeriksaan Jumlah

CEC

11 Tabulasi dan analisa

data

12 Penulisan laporan

dan pembahasan serta

peberbitan artikel

bab iv 17juli2012z

Documents