BAB IIIMETODE KERJA

A.   Alat dan Bahan1.      Alat

      Jarum ose      Alkohol 96%      Pipet tetes      Tissue      Gelas objek      Korek api      Bunsen      Mikroskop

2.      Bahan       Air keran atau aquadest      Larutan Gentian Kristal Violet      Larutan Lugol      Kaca preparat      Karbol Fuchsin Z      Media BHIB      Media Mac Conkey      Media SIM      Media TSIAL      Media Mr-Vp      Media Urea      Media Gula-gula      Media SCA      Larutan Covas      Larutan Metyl Red      KOH 40%      Larutan a-naftol

B.     Cara Isolasi dan Identifikasia.      Isolasi

Isolasi atau pembiakan adalah proses menumbuhkan mikroorganisme dari tempat infeksi (lingkungan in vivo) melalui berbagai spesimen dan menumbuhkan dalam lingkungan tiruan di laboratorium (lingkungan invitro). Ketika bakteri tumbuh pada media, pada umumnya populasi bakteri akan mudah diamati tanpa mikroskop karena berada dalam jumlah yang banyak berupa koloni bakteri sehingga memungkinkan untuk identifikasi laboratorik selanjutnya . Keberhasilan pemindahan bakteri dari lingkungan in vivo ke in vitro memerlukan nutrisi dan lingkungan yang dibutuhkan oleh bakteri patogen

tersebut. Karena pada lingkungan in vivo bakteri dapat menggunakan berbagai hasil metabolik dan jalur fisiologik untuk pertumbuhan selama berada di dalam tubuh hospes kemudian secara tiba-tiba harus dapat menyesuaikan diri dengan kondisi tiruan di laboratorium. Dengan demikian sangatlah penting untuk menyediakan nutrisi yang dibutuhkan dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri.

Di dalam tubuh, populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam jenis bakteri untuk memisahkan bakteri patogen perlu dilakukan isolasi di laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.

Untuk memperoleh hasil yang baik dalam pertumbuhan bakteri maka perlu cara kerja yang aseptik, dan sterilisasi ose sebelum digunakan mengambil koloni yang dicurigai sebagai penyebab infeksi.

b.      Inkubasi Metode-metode yang

digunakan untuk mengoptimalkan kondisi inkubasi:

Ø  inkubasi dilakukan pada suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri (35⁰C-37⁰C) dan kelembaban udara yang mengandung CO2 sekitar 3-5%

Ø  untuk pertumbuhan bakteri yang memerlukan CO2 lebih banyak diperlukan inkubasi pada tempat khusus yang mengandung CO2 (tablet natrium bikarbonat dengan kelembaban dan penutupan yang sangat erat akan menghasilkan CO2 yang cukup , sebagai alternatif dapat juga dilakukan inkubasi pada sungkup lilin yang dapat menghasilkan CO2 3%.

c.       Identifikasi

1.      Hari I      Siapkan alat dan bahan yang di

gunakan       Setelah ose di sterilkan ambillah

biakan bakteri       Kemudian masukkan ke dalam

media BHIB Di lakukan pewarnaan gram

      Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan (fiksasi) 3x di atas api Bunsen.

      Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin), biarkan selama 2- 3 menit.

      Cuci dengan air mengalir      Zat warna dibuang dan bubuhi

dengan larutan mordant (lugol), diamkan selama kira-kira 1-2 menit.

      Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol 96%, sampai warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur lagi).tunggu 20 – 40 detik

      Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi dengan cat-penutup (counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2 menit.

      Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar, lihat dengan mikroskop

      Kemudian masukkan ke dalam ingkubator pada media BHIB dan  

      ingkubasi selama 24 Jam dengan suhu 37 °c

2.      Hari II     Biakan yang tumbuh pada media

BHIB di wranai dengan padapengecetan gram.

       Selain itu biakan juga di tanami pada media BAP,Mac concey.EMBA.dan endo agar.

       Media yang telah di tanami kemudian di inkubasi pada suhu 37°C seiama 24 jam didalam incubator.

3.      Hari IIIPEWARNAAN GRAM

      Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan (fiksasi) 3x di atas api Bunsen.

      Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin), biarkan selama 2- 3 menit.

      Cuci dengan air mengalir      Zat warna dibuang dan bubuhi

dengan larutan mordant (lugol), diamkan selama kira-kira 1-2 menit.

      Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol 96%, sampai warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur lagi).tunggu 20 – 40 detik

      Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi dengan cat-penutup (counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2 menit.

      Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar, lihat dengan mikroskop

      Media TSIA Setelah nall di stelirkan ambil

bakteri pada media ( emba ) dan tusukkan nall pada media TSIA setelah di tusuk goreskan pada permukaan media dari babwah ke atas fiksasi pada mulut tabung dan tutup dengan kapas steril dan ingkubasi selama 24 Jam dengan suhu 37 °c

4.      Hari IV     Dilakukan pembacaan pada media

SCA,SIM,MrVP,dan gula-gula.Hasit pembacaan di catat kemudian dicocokkan dengan table \identifikasi bakteri.

C.     Tes Uji biokimia1)        Buatlah suspensi bakteri dari coloni

bakteri yang sebelumnya telah di tanam pada media EMBA yang di ambil adalah coloni yang menunjukkan ciri koloni bakteri proteus

2)        Ambil satu mata nal suspensi bakteri dan tanam pada tiap media dengan cara:

1.        Media SCA        Goreskan perlahan secara zig-zag

mata nal (yang sudah suspensinya)

dari bagian dalam permukaan media miring sampai keluar

        Sterilkan pada mulut tabung dan tutup dengan menggunakan kapas steril

        Pada media SCA, tidak perlu di tusuk dengan nal

        Ingkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°c

2.        Media SIM        Tusukkan nal yang sudah suspensi

bakterinya ke tengah-tengah media agar, jangan sampai menyentuh permukaan tabling/ mendekati.

        Tutup dengan kapas steril yang sebelumnya sudah di fiksasi pada mulut media

        Ingkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°c

3.        Media MR-VP dan gula-gula ( laktosa, maltosa , glukosa , sukrosa , manitol )

        Ambil satu ose suspensi bakteri, masukkan dalam media cair, aduk-aduk agar suspensi bakteri dan agarnya tercampur yang di dalamnya ada tabung durham.

        Tutup kembali dengan kapas steril        Ingkubasi selama 24 jam dengan

suhu 37°c

4.        Media Urea        Goreskan perlahan secara zig-zag

mata nal (yang sudah suspensinya) dari bagian dalam permukaan media miring sampai keluar

        Sterilkan pada mulut tabung dan tutup dengan menggunakan kapas steril

        Pada media Urea, tidak perlu di tusuk dengan nal

        Ingkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°c

D.    Kerangkaka identifikasi bakteri

ENDOPembacaan hasil

Pewarnaan gram

Inkubasi 370C selama 24 jamBHIB

Inkubasi 370C selama 24 jamTSIAPewarnaan gram

      SIM      MR-

VP      SCA      Urea

      Glukosa      Laktosa      Maltose     

Sukrosa      Manitol

Inkubasi 370C selama 24 jamInkubasi 370C selama 24Pemusnahan

EMBAMCSSAsampel