bab iii

BAB IIIMETODOLOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan November 2013 sampai dengan

januari 2014 yang bertempat di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran dan

Laboratorium Farmasi FMIPA Universitas Halu Oleo Kendari, Sulawesi

Tenggara.

B. Variabel, Definisi Operasional dan Indikator Penelitian

1. Variabel Penelitian

Variabel dalam penelitian ini terbagi menjadi dua : Variabel bebas atau

independen yaitu ekstrak methanol rumput laut(Eucheuma sp) dan variabel

terikat atau dependen yaitu daya hambat bakteri Escherichia coli dan daya

hambat bakteri bakteri Staphylococcus aureus yang diukur melalui zona

bening.

2. Definisi Operasional

Definisi operasional dalam penelitian ini adalah :

a. Ekstrak metanol rumput laut (Eucheuma sp) yang dimaksud dalam

penelitian adalah maserat metanol rumput laut (Eucheuma sp) yang di

uapkan dengan metode Rotary vacum evaporator

Definisi operasional hanya menjelaskan variable.!!!!! Bias pakai

bahasa sendiri….

29

30

- Ekstrak methanol rumput laut ?

- Daya hambat bakteri Escherichia coli ?

konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat

pertumbuhan bakteri E. coli setelah diinkubasi 24 jam dan tidak di

tumbuh koloni bakteri yang diketahui dengan cara mengamati daerah

pada media perbenihan dengan menggunakan metode difuse.

- daya hambat bakteri Staphylococcus aureus ?

konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat

pertumbuhan bakteri S.aureus setelah diinkubasi 24 jam dan tidak

ditumbuh koloni bakteri yang diketahui dengan cara mengamati

daerah pada media perbenihan dengan menggunakan metode difuse.

b. Indikator Penelitian

Indikator dalam penelitian ini adalah diameter zona hambat yang

terbentuk di sekitar kertas cakram dengan klasifikasi respon hambatan

pertumbuhan bakteri seperti pada tabel di bawah ini:

Tabel 3.1.Klasifikasi respon hambatan pertumbuhan bakteri

Sumber : Greenwood, 1995

No Diameter Zona HambatRespon Hambatan

Pertumbuhan1. > 20 mm Kuat2. 16 – 20 mm Sedang3. 10 – 15 mm Lemah4. < 10 mm Tidak ada

31

C. Metode dan Desain Penelitian

1. Metode Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yakni pengujian

ekstrak metanol Eucheumasp terhadap daya hambat pertumbuhan

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.

2. Desain Penelitian

Penelitian ini menggunakan desain post test control only dengan

variabel bebas berupa perlakuan ekstrak metanol Eucheumaspterhadap

bakteriE. coli dan bakteri S.aureus. Desain penelitian dikemukakan seperti

pada Tabel 3.

Tabel 3.2.Desain Penelitian Uji Daya Hambat ekstrakmetanolEucheumasp dan dan eritromisinterhadap pertumbuhan E. coli.

Perlakuan ekstrak

methanol (X)

Diameter zona bening (Y)

Y₁ Y₂ Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10

X₁

Keterangan :

X = perlakuan ekstrak etanol

Y = diameter zona bening

X1 = ekstrak metanol Eucheumasp

Y₁ = diameter zona bening pada koloni E.coli Konsentarsi 5%

32

Y₂ = diameter zona bening pada koloni E. colikonsentrasi 10%

Y3 = diameter zona bening pada koloni E. colikonsentrasi 15%



Y6 = diameter zona bening pada koloni S. aureusKonsentarsi 5%

Y7 = diameter zona bening pada koloni S. aureuskonsentrasi 10%




33

Gambar 3.1. Kerangka Penelitian Uji Daya Hambat ekstrak metanol Eucheumasp terhadap pertumbuhan E. colidan S.aureus.

Serbuk keringEucheuma sp

Ekstraks cair

Ekstrak kental

ekstrakEucheuma sp

Non ekstrak Eucheuma sp

Kertas cakram

Nutrient agar + e.coli

KHM

5% 10% 15% 20% 25%

ekstraksi

evaporasi

34

D. Instrumen Penelitian

1. Alat yang Digunakan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 3.3.

dan 3.4 di bawah ini.

Tabel 3.3 Alat yang digunakan dalam proses skriningNo. Nama FungsiAlat yang digunakan dalam proses skrining1.2.

34.

5.6.

7.

Pisau (2012)Blender (philips 2012)

Erlenmeyer (pyrex 2012)Kertas saring (Watmann 2012)Corong (pyrex 2012)Rotary vacuum evaporator(Buchi Rotavapor R-210 2011)Gelas ukur (pyrex 2012)

Untuk mengambil sampelUntuk memotong kecil-kecil sampel sampai menjadi serbukSebagai penampung hasil maserasiUntuk menyaring hasil maserasi

Untuk melewatkan hasil maserasi dengan baikUntuk menguapkan hasil ekstraksi

Untuk mengambil pelarut/ larutan secara kasar

Tabel 3.4. Alat yang digunakan dalam proses uji daya hambatekstrak metanol Eucheuma spNo. Nama Fungsi

Alat yang digunakan dalam proses uji daya hambatekstrak etanol Caulerpa sp dan ekstrak etanol Gracilaria sp

8.

9.10.12.13.

14.

15.

16.

Neraca analitik (Stuart 2012)Cawan petri (2012)Jarum ose (2012)Lampu spiritus (2012)Hot plate (IKA C-Mag 2011)Autoklaf (WiseClave 2011)Tabung reaksi (pyrex 2012)Mistar penggaris

Untuk menimbang bahan dalam jumlah yang sedikitWadah isolat bakteriUntuk mengambil dan menginokulasi bakteri ujiSterilisasi jarum oseMemanaskan sekaligus menghomogenkan larutan

Sterilisasi alat dan bahan

Menyimpan sekaligus tempat penginokulasian bakteri.

35

Untuk mengukur diameter zona hambat

2. Bahan yang Digunakan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel

3.5. dan tabel 3.6. berikut:

Tabel 3.5. Bahan yang digunakan dalam proses ekstraksiNo. Nama Bahan Fungsi

Bahan yang digunakan dalam proses ekstraksi

1.2.3.

Rumput laut (Eucheuma sp)metanolAquadest

Sampel pengamatanPelarutPelarut

Tabel 3.6. Bahan yang digunakan dalam proses uji daya hambatekstrak metanol Eucheuma sp

No. Nama Bahan Fungsi

Bahan yang digunakan dalam proses uji daya hambat ekstrak ekstrak etanol Caulerpa sp dan ekstrak etanol Gracilaria sp

6.

7.

8.9.10.

Medium Nutrient Agar (beef ekstrak 10 g/l, pepton 10 g/l, agar-agar 15 g/l)Medium Nutrient broth (beef ekstrak 10 g/l, pepton 10 g/l, NaCl 5 g/l)Alkohol 70% (OneMed 2012)Escherichia coli (2012)Staphylococcus aureus (2012)

Media tumbuh bakteri

Media tumbuh bakteri

AntiseptikBakteri ujiBakteri uji

E. Prosedur Pengumpulan Data

1. Lokasi Pengambilan Sampel

Lokasi pengambilan sampel rumput laut Eucheumasp yaitu di perairan

laut pantai nambo, Kecamatan abeli,Kota Kendari, Sulawesi Tenggara

2. Pengambilan dan Persiapan Sampel

36

Eucheumaspdibersihkan, diangin-anginkan selama 2 hari, dipotong –

potong kecil, dan dihaluskan dengan cara diblender.

3. Tahap Ekstraksi

Ekstraksi Eucheumasp menggunakan metode maserasi. Maserasi

dilakukan dengan mencampurkan serbuk Eucheumaspmasing–masing

dengan metanol selama 1 × 24 jam sebanyak 3 kali. Maserat dipisahkan

dari ampas dengan penyaringan menggunakan corong lalu diuapkan

dengan Rotary Vacuum Evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental

(Haryati, 2011).

4. Uji Daya Hambat Antibakteri

a. Sterilisasi Alat

Cawan petri, erlenmeyer, gelas kimia, gelas ukur, tabung reaksi,

penjepit, spatula, Nutrient Agar (NA), dan kertas cakram berdiameter 6

mm yang telah dimasukkan dalam cawan petri disterilisasidi dalam

autoklaf dan disterilkan selama 15 menit pada suhu 121oC dan tekanan 1

atm (Rahma, 2010).

b. Pembuatan Media

Pembuatan Nutrient Agar (NA)

Komponen medium ditimbang dengan menggunakan timbangan

analitis untuk volume yang digunakan sesuai dengan komposisi NA (beef

ekstrak 10g/l, pepton 10 g/l, NaCl 5 g/l, dan agar-agar 15g/l). Semua

37

komponen bahan tersebut, dilarutkan kedalam autoklaf selama 15 menit

pada suhu 121oC dan tekanan 1atm (rahma, 2010)

Pembutan Nurient broth (NB)

Komposisi untuk media NB sama dengan NA, tetapi tidak memakai

agar sebagai pemadat proses pembuatannya lebih sederhana; melarutkan

pepton 10 g/l, NaCl 5 g/l, dan beef ekstrak 10 g/l, kemudian ditampung

dalam tabung reaksi dan siap disterilisasi. Proses pembuatan ini tidak

memerlukan panas (Rahma, 2010)

c. Pengenceran ekstrak dalam berbagai konsentrasi

Pengenceran ekstrak Eucheuma sp dilakukan dengan

mengencerkan ekstrak dari 100% menjadi 25%, 20%, 15%, 10%, dan

5% (v/v) dalam 10 ml aquadest steril (Capuccino and Sherman, 2003)

d. Pembuatan suspensiBakteri

Bakteri uji disuspensikan dalam media NB, diinkubasi selama 24

jam pada suhu 30oC. Pertumbuhan bakteri ditandai dengan adanya

kekeruhan pada media yang telah disuspensikan (Mukhtar 2013)

e. Pengujian Kadar Hambat Minimum (KHM) antibakteri

Pengujian kadar hambat minimum antibakteri dilakukan pada

media Nutrient Agar (NA). Biakan bakteri uji E.colidan S.aureus

dimasukkan dalam cawan petri sebanyak 100µL, tambahkan media

NA sebanyak ± 15 ml dan dihomogenkan dalam media yang telah

memadat dimasukkan kertas cakram yang telah disuspensikan masing-

38

masing ekstrak Eucheuma sp (konsentrasi 25%, 20%, 15%, 10%, dan

5%) selanjutnya diinkubasi selama 24 pada suhu 30oC. Pengamatan

dilakukan dengan mengukur daerah hambat dari masing-masing zat

yang diujikan pengukuran diameter zona hambat dilakukan dengan

mengurangi diameter daerah hambatan dengan diameter kertas cakram

(6mm) (Mukhtar 2013).

F. Teknik Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis dengan komputer SPSS 16.00 for

Windows. Data tersebut dianalisis dengan uji statistik sebagai berikut :

1. Data ditampilkan dalam bentuk tabel dan grafik boxplot.

2. Uji normalitas data dengan uji shapiro wilk (kriteria normal p>0,05)

dan dilanjutkan dengan uji ANOVA (Analisis of variance) untuk

mengetahui adanya perbedaan masing-masing kelompok, jika

didapatkan perbedaan yang bermakna, maka dilanjutkan dengan uji

statistik Post Hock.

3. Sedangkan jika didapatkan distribusi yang tidak normal, maka

dilakukan uji statistik non parametrik Kruskal wallis, dan jika dari hasil

uji statistik tersebut ada perbedaan yang bermakna, maka dilanjutkan

dengan uji statistik mann-whitney

bab iii

Documents