bab iii

5/17/2018 BAB III - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/bab-iii-55b07cfe7bf45 1/9

15

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis Rancangan Penelitian

Adapun jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental. Penelitian ini

dirancang menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan menggunakan 6

kelompok yang terdiri dari 4 kelompok perlakuan dan 2 kelompok kontrol.

Kelompok perlakuan terdiri dari P1, P2, P3 dan P4 masing-masing pemberian

ekstrak etanol kulit buah delima dengan konsentrasi 60%, 45%, 30% dan 15%.

Sedangkan kelompok kontrol terdiri dari P0 dan P5 masing-masing adalah

pemberian akuades sebagai kontrol negatif dan kloramfenikol sebagai kontrol

positif. Jumlah pengulangan dilakukan sebanyak 4 kali sesuai dengan rumus

ulangan Hanafiah (2008), sebagai berikut:

(t-1)(r-1) ≥ 15 Keterangan:

(6-1)(r-1) ≥ 15 t = jumlah perlakuan

5(r-1) ≥ 15 r = jumlah ulangan

(r-1) ≥ 3

r ≥ 4

Jadi, jumlah ulangan yang diperlukan dengan percobaan dengan 6

kelompok perlakuan minimal dilakukan sebanyak 4 kali ulangan.

Pengulangan dilakukan pada waktu yang bersamaan antara perlakuan yang

satu dan yang lainnya dengan menggunakan ekstrak yang sama dan isolat yang

sama.

Rancangan tersebut dapat dilihat pada tabel 3.1.Tabel 3.1 Rancangan Penelitian

UlanganPerlakuan

P0 P1 P2 P3 P4 P5

I

II

III

IV

P0I

P0II

P0III

P0IV

P1I

P1II

P1III

P1IV

P2I

P2II

P2III

P2IV

P3I

P3II

P3III

P3IV

P4I

P4II

P4III

P4IV

P5I

P5II

P5III

P5IV



16

Keterangan :

P0 : Akuades sebagai kontrol negatif

P1 : Ekstrak etanol kulit buah delima dengan konsentrasi 60%




P5 : Kloramfenikol sebagai kontrol positif

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Klinik bagian

Patologi Rumah Sakit Umum Daerah dr. Zainoel Abidin (RSUDZA) sebagai

tempat pengambilan sampel bakteri, di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Kedokteran (FK) Universitas Syiah Kuala sebagai tempat uji aktivitas antibakteri

ekstrak kulit buah delima terhadap E. coli, dan di Laboratorium Kimia Organik

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Syiah

Kuala sebagai tempat pembuatan ekstrak kulit buah delima dan uji fitokimia

ekstrak kulit buah delima. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November

2011-Februari 2012.

3.3 Alat dan Bahan Penelitian

Alat-alat yang digunakan adalah vacum rotary evaporator , oven, labu

erlenmeyer , cawan petri, gelas ukur, tabung reaksi, vortex, tabung eppedorf , rak

tabung, kaca objek, jarum ose, batang pengaduk, pipet tetes, lidi penyebar,

mikroskop, kompor listrik, inkubator, freezer , autoklaf, timbangan digital, lampu

bunsen, sarung tangan, spektrofotometer, test plate, korek api, gunting, penggaris,

aluminium foil, kapas, kertas label, kertas saring, selotip dan kertas tisu.

Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak etanol kulit buah delima,

isolat E. coli, media Nutrient Broth (NB), media MacConkey, media Nutrient

Agar (NA), media Mueller Hinton Agar (MHA), media Sulfide Indol Motility,

media Methyl Red (MR), media Triple Sugar Ion Agar (TSIA), media Simmon’s

Citrate Agar (SCA), media urea, reagen merah metil, reagen kovacs, glyserol,

alkohol 70%, akuades, etanol 96%, NaCl 0,9%, cakram antibiotik kloramfenikol,



17

kertas cakram kosong diameter 5 mm, minyak emersi, larutan kristal violet ,

larutan lugol, larutan safranin, reagen Mayer , reagen Dragendorf , reagen Wagner ,

pereaksi Libermann-Buchard , larutan FeCl3 1%, logam magnesium 0,5 mg dan

larutan H2SO4.

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Ekstrasi kulit buah delima dengan metode maserasi

Buah delima yang masih segar diperoleh dari pohon yang ada di halaman

FMIPA Universitas Syiah Kuala. Dipilih buah yang masih muda dengan ukuran

mencakup sedang dan kecil yang berada di ujung percabangan dengan kulit

berwarna hijau muda. Buah delima kemudian dibersihkan dan dikupas, lalu kulit

dan isinya dipisahkan, yang diambil hanya kulitnya saja, dipotong kecil-kecil lalu

diambil sebanyak 250 gram. Kemudian dikeringanginkan pada suhu kamar selama

5 hari menjadi 40 gram. Kulit tersebut dihaluskan dengan blender sehingga

menjadi serbuk kering. Ekstraksi serbuk kering kulit buah delima dilakukan

dengan metode maserasi menggunakan etanol 96%. Ekstrak direndam dan

disaring menggunakan kertas saring. Ampasnya direndam kembali sampai 3 kali

perendaman hingga diperoleh filtrat yang jernih. Masing-masing perendaman

dilakukan selama 24 jam. Ekstrak dipekatkan dengan vacum rotary evaporator

pada suhu 40oC hingga diperoleh ekstrak yang kental.

Ekstrak padat 100% murni kemudian diencerkan dengan akuades untuk

membuat stok larutan konsentrasi 60%, 45%, 30% dan 15%. Pengenceran

dilakukan dengan menggunakan rumus:

Keterangan :

V1 = Volume awal

V2 = Volume yang diinginkan

M1 = Konsentrasi awal

M2 = Konsentrasi yang diinginkan

V1 . M1 = V2 . M2



18

3.4.2 Uji Fitokimia

Uji fitokimia dilakukan pada sampel ekstrak etanol kulit buah delima.

a. Uji Alkaloid

Sampel ekstrak etanol kulit buah delima digerus terpisah kemudian

ditambahkan 1 ml amonia. Selanjutnya ditambahkan 10 ml kloroform,

digerus kembali dan disaring. Filtrat yang terbentuk ditambahkan dengan

10 ml H2SO4 2 N lalu dikocok kuat-kuat, didiamkan sampai larutan asam

sulfat dan kloroform terpisah. Lapisan asam sulfat diambil dan dipisahkan

menjadi tiga bagian kedalam test plate untuk mengetahui adanya

kandungan alkaloid, dipisahkan menjadi tiga bagian kedalam test plate.

Positif alkaloid bila penambahan dengan reagen Mayer akan menyebabkan

endapan putih, dengan reagen Dragendorf menyebabkan endapan

kemerahan dan dengan reagen Wagner menyebabkan endapan berwarna

coklat.

b. Uji Steroid, Terpenoid , Saponin

Sampel ekstrak etanol kulit buah delima kemudian diekstraksi lagi

dengan dietil eter . Ekstrak dietil eter diuji dengan reagen Liberman

Burchard pada test plate. Warna biru atau hijau menunjukkan adanya

steroid dan warna merah menunjukkan adanya terpenoid . Residu yang

tidak larut dalam dietil eter dituang ketabung reaksi dan ditambahkan

dengan akuades lalu dikocok kuat-kuat. Adanya busa yang stabil selama

30 menit menunjukkan adanya saponin.

c. Uji Flavonoid

Sampel ekstrak etanol kental diekstraksi lagi dengan n-heksana.

Residu yang terbentuk diekstraksi dengan 10 ml etanol 80%, selanjutnyaditambahkan 0,5 mg logam magnesium dan HCl 0,5 M. Warna merah

muda atau ungu menunjukkan adanya flavonoid .

d. Uji Tanin

Sampel ekstrak etanol kulit buah buah delima dicampur dengan 10

ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai

tidak berwarna. Selanjutnya diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1-2



19

tetes pereaksi besi (III) klorida. Bila timbul warna biru atau kehitaman

menunjukkan adanya tanin.

3.4.3 Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat seperti tabung reaksi, cawan petri, kapas lidi dan labu erlenmeyer

disterilisasikan di dalam oven selama 2 jam dengan suhu 150oC, sedangkan bahan

cair seperti media agar, akuades, NaCl 0,9% disterilisasikan di dalam autoklaf

dengan suhu 121oC selama 15 menit. Sterilisasikan jarum ose dengan

menggunakan pijaran api.

3.4.4 Pembuatan Media

a. Media Nutrient Broth (NB)

Nutrient broth sebanyak 3,25 gram dicampurkan dengan 250 ml akuades

steril, kemudian dipanaskan hingga larut. NB disterilkan dalam autoklaf selama

15 menit pada suhu 121oC selanjutnya dituang kedalam tabung reaksi ± 5 ml.

b. MacConkey Agar

Agar serbuk MacConkey sebanyak 2,5 gram dicampurkan dengan 250 ml

akuades steril, panaskan hingga larut. Kemudian disterilkan menggunakan

autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC. MacConkey dituang ke dalam cawan

petri secara steril ± 20 ml dan diinkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 35oC.

c. Media Nutrient Agar (NA)

Agar serbuk Nutrient agar sebanyak 7 gram dicampurkan dengan 250 ml

akuades steril, panaskan hingga larut. Kemudian disterilkan menggunakanautoklaf selama 15 menit pada suhu 121

oC. Nutrient agar dituang ke dalam

tabung reaksi ± 10 ml kemudian dimiringkan atau dituang ke dalam cawan petri ±

20 ml. Lalu diinkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 35oC.

d. Media Mueller Hinton Agar (MHA)

Agar serbuk Mueller hinton agar sebanyak 9,5 gram dicampurkan dengan

250 ml akuades steril, panaskan hingga larut. Kemudian disterilkan menggunakan



20

autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121oC. MHA dituang ke dalam cawan petri

± 25 ml, tunggu hingga mengeras. Lalu inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu

35oC.

3.4.5 Reidentifikasi Bakteri Escherichia coli

a. Isolasi Bakteri

Shigella sp. ATCC berasal dari Fakultas Kedokteran Hewan (FKH)

Unsyiah. Setelah itu, bakteri ditanam ke dalam Salmonella Shigella Agar (SSA)

menggunakan ose bulat dengan teknik goresan kuadran (streak quadrant ) hingga

diperoleh koloni tunggal. Salmonella Shigella Agar yang telah ditanami bakteri

diinkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37oC. Koloni tunggal yang tumbuh lalu

dibiakkan pada media NA miring sebagai stok kultur.

b. Pemeriksaan Makroskopis

Bakteri yang tumbuh dalam media Salmonella Shigella Agar

diidentifikasi secara makroskopis berdasarkan bentuk koloni, permukaan, tepi dan

warna koloni.

c. Pemeriksaan Mikroskopis

Pemeriksaan mikroskopis yang dilakukan adalah pewarnaan gram. Kaca

benda dibersihkan dengan menggunakan alkohol 96%, kemudian membuat

sediaan suspensi kuman dengan NaCl fisiologis steril pada kaca benda dengan

menggunakan ose bulat steril, kemudian fiksasi 3-4 kali diatas Bunsen. Sediaan

ditetesi zat warna kristal violet pada seluruh permukaan sediaan suspensi kuman

dan biarkan selama 1 menit, lalu bilas dengan air yang mengalir. Selanjutnyaditetesi larutan lugol pada seluruh permukaan sediaan suspensi kuman dan biarkan

selama 1 menit, lalu bilas dengan air yang mengalir. Lunturkan zat warna pada

sediaan dengan alkohol 96% selama 10-15 detik, lalu bilas dengan air yang

mengalir. Kemudian ditetesi zat warna safranin pada seluruh permukaan sediaan

suspensi kuman dan biarkan selama 15-30 detik, lalu bilas dengan air yang

mengalir. Lalu keringkan sisa-sisa air pada kaca benda dengan cara diangin-



21

anginkan. Tetesi sediaan dengan minyak emersi, lalu amati dibawah mikroskop

dengan lensa objektif perbesaran 100 kali (Pelczar and Chan, 2005).

d. Uji Biokimia

1. Methyl Red (MR)

Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose steril dan

diinokulasikan pada media MR dengan memasukkan ose sampai ke

dalam permukaan tabung, kemudian dihomogenkan. Inkubasi selama

24 jam pada suhu 37oC, lalu ditambahkan reagen merah metil sebanyak

5 tetes. Bila positif maka adanya asam ditandai dengan perubahan

warna biakan menjadi warna merah yang nyata.

2. Sulfate Indol Motility (SIM)

Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose steril dan

diinokulasikan pada media SIM dengan cara menusuk ose tegak lurus

sampai sepertiga dasar tabung. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.

Lalu tambahkan 1-2 ml reagen kovacs, bila positif akan ditandai dengan

adanya bentuk cincin berwarna merah pada bagian permukaan atasnya.

3. Simmon’ s Citrate Agar (SCA)

Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose steril dan diinokulasi

pada media SCA dengan cara digoreskan secara zig-zag pada

permukaannya. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Bila positif

maka tidak ada perubahan warna.

4. Urease

Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose steril dan suspensikan

inokulum dengan media urea. Kocok tabung biakan dengan hati-hatiagar inokulum dapat tersuspensi dengan baik pada media tersebut.

Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC, bila positif maka ditandai

dengan tidak ada perubahan warna.

5. Triple Sugar Ion Agar (TSIA)

Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose steril dan inokulasikan

pada media TSIA dengan cara ditusuk pada bagian bawah agar miring,

lalu dilanjutkan dengan menggoreskan secara zig-zag pada bagian



22

permukaan. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC, bila positif maka

bakteri akan tumbuh namun tidak berubah warna.

3.4.6 Penyiapan Bakteri Uji

Escherichia coli diinokulasikan ke dalam media NA yang dibuat

membentuk miring dengan cara menggoreskan biakan stok E. Coli menggunakan

jarum ose ke dalam media agar miring NA. Lalu diinkubasi selama 18-24 jam

dengan suhu 37oC. Bakteri yang sudah diregenerasi tersebut diswab dan

dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi NaCl 0,9% untuk diukur

kepadatannya dengan menggunakan spektrofotometer pada derajat absorpsi 0,08-

0,1 dan panjang gelombang 625 nm.

3.4.7 Prosedur Uji Antibakteri

Pelaksanaan uji aktivitas antibakteri ini menggunakan metode difusi

cakram Kirby Bauer dengan cara kerja sebagai berikut :

a. Escherichia coli yang dibiakkan pada NA miring diswab, kemudian

dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi NaCl 0,9% steril.

Biakan E. Coli yang digunakan sudah diukur kepadatannya dengan

menggunakan spektrofotometer pada derajat absorpsi 0,08-0,1 dan

panjang gelombang 625nm.

b. Kertas cakram direndam di dalam ekstrak kulit buah delima pada

konsentrasi 20%, 40%, 60% dan 80%.

c. Perendaman dilakukan selama 30 menit (Adnyana et al., 2004).

d. Suspensi bakteri tadi diswab dengan menggunakan kapas lidi steril secara

merata pada media MHA.

e.

Kertas cakram yang telah direndam kemudian dikeringkan agar tidak merembes pada media dan kemudian diletakkan diatas media dengan

menggunakan pinset steril.

f. Cakram antibiotik yang mengandung kloramfenikol 30 µg (kontrol positif)

dan cakram yang telah direndam akudes (kontrol negatif) diletakkan dalam

media.

g. Media di inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37oC.



23

h. Daerah bening disekitar cakram menunjukkan zona hambat. Diameter

daerah bening yang diperoleh kemudian diukur menggunakan penggaris

dalam satuan (mm).

3.5 Parameter yang diuji

Parameter yang diukur adalah diameter zona hambat ekstrak etanol kulit

buah delima terhadap pertumbuhan E. coli dalam satuan milimeter.

3.6 Analisis Data

Data yang diperoleh dari penelitian ini terlebih dahulu dianalisis

normalitas menurut Liliefors dan homogenitas keragaman. Apabila data tidak

berdistribusi normal dan homogen, maka dilakukan transformasi data. Apabila

normalitas dan homogenitas data juga belum terpenuhi, maka analisis data

dilakukan dengan uji nonparametrik. Namun, bila data berdistribusi normal dan

homogen, maka dapat dilanjutkan dengan uji Analisis Varian (ANOVA). Apabila

terdapat pengaruh antara perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Beda Nyata

Terkecil (BNT) (Hanafiah,2008).

bab iii

Documents