0

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

2.1 Flavivirus

Flavivirus adalah genus virus yang termasuk ke dalam Arbovirus (ar-

thropod-borne viruses) yaitu virus yang alami menginfeksi dan bereplikasi di

dalam tubuh serangga (arthropod) yang kemudian dapat ditularkan ke vertebrata

yang lain.

Gambar 2.1

Klasifikasi Arbovirus (Go et.al., 2014)

Virus yang masuk ke dalam kelompok Arbovirus terdiri dari berbagai

famili dengan taksonomi yang berbeda yaitu: Flaviviridae (genusflavivirus),

Bunyaviridae (genus Nairovirus, Orthobunyavirus, Phlebovirus, dan Tospovirus),

Togaviridae (genus Alphavirus), Rhabdoviridae (genus Vesiculovirus), Ortho-

myxoviridae (genus Thogotovirus), dan Reoviridae (genus Orbivirus

8

1

danColtivirus) (Gambar 2.1). Penyakit akibat flavivirus dapat ditularkan dari

hewan vertebrata ke manusia secara tidak langsung dengan perantara

serangga/nyamuk sehingga sering juga disebut dengan istilah zoonosis tidak

langsung (indirect zoonosis). Pada umumnya famili virus yang termasuk zoonotik

arbovirus adalah famili Togaviridae dan Flaviviridae (Go et.al., 2014).

Genus flavivirus termasuk ke dalam famili Flaviviridae yang terdiri dari

kurang lebih 70 spesies virus, tersebar sangat luas di seluruh benua kecuali di

Antartika. Flavivirus sendiri berasal dari bahasa latinflavus yang berarti kuning

(jaundice) yang merupakan ciri khas penyakit Yellow Fever(Huang et al., 2014).

Penyakit karena flavivirus sebagian besar ditularkan dengan bantuan nyamuk

sehingga disebut juga mosquito-borne flavivirus, seperti virus Dengue, virus JE,

virus West Nile, dan virus Zika di Indonesia (Myint et al., 2014; Perkasa et al.,

2016).

2.1.1 Struktur Flavivirus

Flavivirus merupakan virus RNA untai tunggal, positif sense, dengan

panjang genom ±11 kilo base (kb). Flavivirus berukuran kecil sekitar 50 nm,

berupa partikel sferis yang memiliki electron-dense sekitar 30 nm, dan dikelilingi

oleh amplop lipid serta memiliki open reading frame (ORF) tunggal yang

mengkode 3 protein struktural dan 7 protein non struktural. Protein struktural

berupa capsid (C), membran (M), dan envelope (E). Protein non struktural (NS)

berupa protein NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, dan NS5(Murphy, 1980;

Lindenbach and Rice, 2003).

2

Capsid adalah protein yang berukuran 11 kDa yang memiliki peranan

dalam berbagai interaksi RNA yang berhubungan dengan membran. Bagian C

yang diberi nama Nascent C (anchC) mengandung C-terminal hydrophobic

anchor yang berperan sebagai sinyal peptide untuk translokasi protein pr ke

endoplasmic reticulum (ER) dan berperan pada perakitan virion (Lindenbachet al.,

2007).

Gambar 2.2

Struktur dan organisasi flavivirus, CAP: Capsid; prM: Premembrane; E:

Envelope; nonstructural: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5 (Zhang et

al., 2003; Coffey et al., 2013).

Protein prM adalah glikoprotein yang berperan sebagai prekursor dari

protein membrane (M) yang berukuran 26 kDa. Fragmen pr dari protein M

berperan untuk menstabilkan E dan melindungi protein E agar tidak mengalami

perubahan pada lingkungan yang asam yang memicu terjadinya fusi virus dengan

3

membran sel. Setelah prM melalui pemecahan yaitu oleh enzim furin di trans-

Golgi terbentuklah protein M yang berukuran sekitar 8kDa dan fragmen N-

terminal protein pr yangdisekresikan ke media ekstrasel. Protein M ditemukan

pada virion matur, yaitu pada C-terminal dari prM yang berperan membuat virus

menjadi bentuk yang infektif (Murray et al., 1993; Lindenbach and Rice, 2003).

Envelope (E) adalah protein berukuran 53kDa yang merupakan protein

utama pada permukaan virus. Protein ini berinteraksidengan reseptor virus, dan

berperan dalam fusi membran. Antibodi umumnya mengenali protein ini dan jika

terjadi mutasi pada protein E ini akandapat mempengaruhi virulensi. Protein ini

juga berperan dalam memberi sinyal untuk translokasi NS1 ke lumen

ER(Lindenbach and Rice, 2003).

Protein NS1, beratnya sekitar 46 kDa, dapat berada di dalam sel maupun

pada pemukaan virus, dan disekresi secara perlahan dari sel mamalia. Peranan

NS1 belum diketahui dengan pasti, hanya saja dalam suatu penelitian ditemukan

jika mutasi terjadi pada protein NS1 maka akan terjadi gangguan replikasi RNA.

Disamping itu pada saat infeksi akan muncul respon humoral yang kuat terhadap

NS1. Adanya antibodi terhadap sel permukaan dapat mencegah lisisnya sel yang

terinfeksi virus oleh komplemen(Lindenbach et al., 2007).

Protein NS2A berukuran relatif kecil sekitar 22 kDa. Pemecahan protein

NS1-2A terjadi di ER. Protein NS2A diperkirakan berperan sebagai interferon

(IFN) antagonis dengan menghambat signalingIFN. Protein NS2B juga berukuran

kecil yaitu sekitar 14 kDa. Protein ini merupakan protein membran yang jika

4

bergabung dengan NS3 akan berperan sebagai kofaktor dari NS2B-NS3 serine

protease(Lindenbach et al., 2007).

Protein NS3 berukuran sekitar 70 kDa, yang berperan dalam memproses

poliprotein dan replikasi RNA. Protein ini berperan dalam melakukan

defosforilasi dari 5’ end dari RNA sebelum penambahan cap, dan juga

merangsang terjadinya apoptosis melalui capcase 8(Lindenbach et al., 2007).

Protein NS4A dan NS4B berukuran 16 kDa dan 27 kDa, berperan dalam

replikasi, perakitan, dan penyusunan membran virus. Protein ini ditemukan berada

pada komplek replikasi. Protein ini sama halnya dengan NS2A dapat

menghambatsignaling dari IFN (Lindenbach et al., 2007).

Protein NS5 merupakan protein flavivirus yang stabil(conserved)

danberukuran besar sekitar 103 kDa. Bagian N-terminal RNA-nya berperan dalam

memproses 5’ cap dan RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) yang terlibat

dalam melakukan perpanjangantemplate endogen(Lindenbach et al., 2007).

2.1.2 Siklus hidup flavivirus

Masuknya flavivirus dimulai dari tahap awal berikatan dengan reseptor

terlebih dahulu. Pada awalnya amplop virus kontak dengan reseptor pada sel

hospes dan terjadilah endositosis yaitu saat virus masuk ke dalam endosome.

Kondisi yang asam di dalam endosome memicu terjadinya perubahan bentuk dari

protein E yang merangsang terjadinya fusi antara membran virus dan membran

endosomedan melepaskan kapsid ke dalam sitoplasma. Kapsid kemudian hancur

dan melepaskan RNA virus. RNA yang dilepaskan ini mengkode prekursor

5

poliprotein sekitar 3.400 asam amino. RNA flavivirus ini adalah positif sense

RNA sehingga secara langsung dapat mengalami proses translasi. Pada ujung

akhir RNA (end) membentuk struktur yang berikatan dengantranslation initiation

protein. Komplek protein ini yang akan memulai translasi RNA. Proses translasi

polipeptida ini diproses oleh sinyal hospes dan protease NS2B/NS3 virus

membentuk tiga protein struktural yaituprotein core (C), premembrane (prM), dan

E serta tujuh protein non structural(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, dan

NS5). Protein tersebut berperan dalam replikasi dan perakitan RNA virus serta

memodulasi respon sel hospes(Lindenbach and Rice, 2003; Mazzon et al., 2009).

Positif sense RNA virus digunakan sebagai templatestrand RNA virus

yang baru. Proses replikasi virus ini terjadi berulang pada membran sel hospes

menghasilkan banyak salinan positif sensestrand RNA. Beberapa dari strand ini

ditranslasi untuk membentuk lebih banyak protein virus sampai jumlahnya cukup

untuk merakit virus baru di dalam ER. Proses perakitan virus meliputi

pernagkaian RNA virus bergabung dengan protein struktural C, prM, E dan

protein nonstruktural yang lain. Virus yang terbentuk masih merupakan virus

imatur. Protein prM berfungsi melindungi virus agar tidak terjadi fusi prematur

selama perjalanan menuju ke luar sel. Virus lalu keluar menuju apparatus golgi

dan mengalami maturasi di sana. Proses maturasi ditandai dengan terjadinya

pemecahan protein prM menjadi protein M. Virus matur lalu dilepaskan ke luar

sel melalui proses eksositosis(Mazzon et al., 2009). Gambar mengenai siklus

hidup flavivirus dapat dilihat pada Gambar 2.3.

6

Gambar 2.3

Siklus hidup flavivirus. 1) virus kontak dengan reseptor sel hospes yang memicu

terjadinya endositosis; 2) masuk ke dalam endosomedan penurunan pH

lingkungan menjadi asam sehingga terjadi perubahan bentuk amplop virus; 3)

terjadinya fusi membran virus dengan membran sel hospes serta melepaskan RNA

virus; 4) translasi virus RNA menghasilkan poliprotein; 5) Lokasi pemecahan,

topologi dari protein struktural (hijau) dan nonstruktural (merah) di membran ER,

dilanjutkan dengan terjadinya replikasi; 6) Sintesis RNA, disusun menjadi virion

imatur; 7) ditranspor ke apparatus golgitempat terjadi pemecahan prM menjadi M

menghasilkan virus matur; 8) dilepaskan dengan eksositosis(Mazzon et al., 2009).

2.1.3 Klasifikasiflavivirus

Flavivirus berdasarkan filogenetiknya dibagi menjadi 4 kelompok yaitu 1)

mosquito-borne flavivirus(MBFV); 2) tick-borne favivirus (TBFV); 3) no known

vektor virus (NKV); dan 4) insect specificflavivirus(ISF) (Gaunt et al., 2001;

7

Huang et al., 2014; Huhtamo et al., 2014). Berikut flavivirus berdasarkan

filogenetiknya:

1. Mosquito-borne flavivirus (MBFV)

MBFV merupakan kelompok flavivirus terbesar yaitu flavivirus yang

dapat ditularkan pada vertebrata (mamalia, dan burung) melalui gigitan nyamuk.

Kelompok MBFV dibagi menjadi dua kelompok besar. Kelompok pertama yaitu

flavivirus yang ditularkan oleh nyamuk genus Culexdankelompok kedua yaitu

flavivirus yang ditularkan oleh genus Aedes (Gaunt et al., 2001).

Terdapat ±26 spesies virus yang termasuk ke dalam kelompok MBFV

yang ditularkan melalui nyamuk Culexspp. seperti yang ditunjukkan pada Gambar

2.3. Flavivirus yang ditularkan oleh nyamuk genus Culexdisebut virus neurotrofik

karena bersifat neuroinvasif sehingga sering mengakibatkan terjadinya infeksi

pada otak (ensefalitis). Beberapa anggota MBFV yang telah berhasil terdata

seperti virus JE, West Nile, Saint Louis Encephalitis, Aroa virus, Naranjal virus,

Cacipacore virus,Koutango virus, Yaounde virus, Stratford virus, Israel Turkey

meningo-encephalomyelitis virus,Ntaya virus, Tembusu virus,dan Sitiawan

virus(Bolling et al., 2015).

Flavivirus yang ditularkan nyamuk genus Aedes disebut juga non

neurotrofik karena gejala utamanya berupa gejala perdarahan (haemorrhagic).

Terdapat 17 spesies virus yang termasuk ke dalam kelompok ini termasuk virus

Dengue (DEN), Yellow Fever, dan Zika. Siklus flavivirus ini pada umumnya

melibatkan nyamuk, primata, dan manusia. Manusia dalam siklus ini tidak

8

berperan sebagai dead end host. Viremia pada manusia tinggi sehingga dapat

menginfeksi nyamuk yang kemudian selanjutnya ditularkan ke manusia yang lain.

Mekanisme penularan ini sering dikenal dengan mekanisme penularan secara

horizontal (Gaunt et al., 2001; Huhtamo et al., 2014).

Gambar. 2.4

Pohon filogenetik flavivirus yang masuk ke dalam MBFV(Moureau et al., 2015)

2. Tick-borneflavivirus (TBFV)

Virus TBFV terbagi menjadi dua kelompok sesuai dengan hospesnya.

Pertama, hospes kutu (tick) seperti caplak (genus Ixodes), dan hewan pengerat

(rodent). Flavivirusyang termasuk ke dalam kelompok ini adalah pertama,

9

kelompok virus Tick Borne Encephalitis (TBE) yaituFar Eastern TBE, West

European TBE, Gadgets Gulley,Royal Farm, Powassan, Karshi, Kyasanur Forest

disease, Langat,Omsk Hemorrhagic fever, danKadam. Kedua, TBFV yang

hospesnya adalah burung laut (tick-borne seabird-associated viruses). Virus yang

termasuk ke dalam kelompok ini adalah virus Meaban, Tyuleniy, dan Saumarez

Reef(Gaunt et al., 2001).

3. Virus No Known Vektor (NKV)

Virus NKV adalah flavivirus yang tidak melibatkan nyamuk sebagai

vektornya namun bersifat vertebrate-specific yaitu flavivirus ini hanya dapat

bereplikasi pada hewan vertebrata kecil. Secara filogenetik berdasarkan gen NS5

terbagi menjadi 2 kelompok yaitu NKV yang berhubungan dengan kelelawar dan

yang berhubungan dengan binatang pengerat (rodent) (Huhtamo et al., 2014).

NKV yang berhubungan dengan kelelawar contohnya virus Bukalasa,

Carey Island, Dakar Bat, Phnom Penh, Rio Bravo, dan Montana myotis

leukoencephalitis. NKV yang berhubungan dengan binatang pengerat contohnya

virus Cowbone Ridge, Jutiapa,Modoc, Sal Vieja,dan San Perlita(Kuno et al.,

1998; Gaunt et al., 2001).

4.Insect SpecificFlavivirus (ISF)

ISF adalah flavivirus yang hanya bisa bereplikasi pada sel nyamuk saja

dan tidak dapat hidup pada sel vertebrata. Dahulu tidak banyak diteliti karena

tidak menyebabkan penyakit pada manusia (Kuno, 2007). Namun seiring dengan

10

majunya teknik deteksi virus dan meningkatnya ketertarikan dalam penelitian di

bidang entomologi terutama mengenai virus pada nyamuk maka terjadi

peningkatan penelitian tentang ISF. Sampai saat ini ditemukan 21 ISF yang baru,

seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.5. Selain menemukan banyak spesies ISF

baru, juga ditemukan fakta bahwa ISF yang berada bersama dengan MBFV pada

seekor nyamuk (superinfection/co-infection) akan menyebabkan terjadinya

penurunan replikasi salah satu virus (Bolling et al, 2015).

Banyaknya penelitian tentang ISF yang dilakukan oleh kelompok riset

mandiri di berbagai negara menyebabkan adanya kekacauan dalam nomenklatur

penamaan virus. Suatu virus yang sama bisa memiliki beberapa nama yang

berbeda sesuai dengan peneliti dan tempat ditemukannya. Seperti pada tiga

spesies virus yang baru ditemukan yaitu Hanko virus yang diisolasi dari nyamuk

Ae. caspius di Finlandia pada tahun 2005; Ochlerotatus flavivirus dari

AedesdanCulexspp. di Spanyol, Italia, dan Portugal dari tahun 2007-2010; dan

Spanish Ochlerotatusflavivirus dari Ae. caspius di Spanyol 2006. Ketiga virus

tersebut ternyata virus yang sama karena memiliki persentase identity sekuen

asam nukleotida sebesar 91% - 96%(Blitvich and Firth, 2015). Suatu konsensus

telah ditentukan oleh Kuno (1998) bahwa flavivirus yang memiliki kesamaan

sekuen nukleotida (% identity)lebih dari 84% dikatakan masuk dalam satu spesies.

Ketiga spesies tersebut sepakat dinamakan Hanko virus karena virus ini memiliki

sekuen nukleotida yang paling komprehensif dibandingkan dua virus yang lain.

Begitu pula pada virus CTFV, Spanish Culexflavivirus, dan virus Wang Thong

11

juga merupakan virus yang sama yang dinamakan Culextheileriflavivirus(Blitvich

and Firth, 2015).

Distribusi geografis ISF sangat luas dan spesies nyamuk yang berperan

sebagai vektor ISF bervariasi di setiap negara. Virus ISF terbagi menjadi dua

kelompok, Pertama, classical ISF (cISF) yaitu kelompok ISF yang pertama

ditemukan. Virus ini memiliki karakteristik filogenetik yang sangat berbeda

dengan kelompok flavivirus lain, dan bersifat monofiletik.

Gambar. 2.5

Peningkatan jumlah penemuan ISF pada rentang tahun 1975-2015 (Bolling et al,

2015).

Kedua, dual-hospes affiliated ISF (dISF) adalah ISF yang secara filogenetik

masih berhubungan dengan kelompok flavivirus pada nyamuk atau vertebrata

(MBFV) dan tidak bersifat monofiletik (Blitvich and Firth, 2015; Moureau et al.,

2015). Selengkapnya berikut pembagian ISF:

a. Classical ISF (cISF)

12

Kelompok cISFterbagi menjadi dua klade yaitu pertama, cISF pada nyamuk Aedes

spp. seperti Aedes flavivirus, Aedes galloisi flavivirus,Cell Fusing Agent Virus,

dan Kamiti River Virus. Kedua, cISF pada nyamuk Culexspp. yaitu Calbertado

virus, CTFV, Nienokoue virus, dan Quang Binh virus. Khusus untuk virus

Nakiwogo dan Palm Creek diisolasi dari nyamuk Mansonia dan Coquillettidia

spp. Terdapat juga Hanko Virus dipertimbangkan sebagai strain yang baru. Virus

ini diisolasi pada Culexspp. dan Aedes spp.(Calzolari et al., 2012; Vázquez et al.,

2012; Blitvich and Firth, 2015).

b. dual ISF (dISF)

Kelompok dISF dilihat dari filogenetiknya berada dalam satu kluster dengan klade

MBFV namun termasuk ISF karena sifatnya yang hanya dapat bereplikasi pada

sel serangga. Hal ini mengindikasikan bahwa dISF merupakan virus yang

memiliki dua hospes (dual hospes virus) dan merupakan ISF yang kehilangan

kemampuan untuk menginfeksi vertebrata (Blitvich and Firth, 2015; Bolling et al,

2015). Nounané virus adalah dISF pertama yang dilaporkan diisolasi dari nyamuk

Uranotaenia mashonaensis di Côte d’Ivoire, Uganda pada tahun 2004. Terdapat

sekurangnya 8 dISF lain yang telah ditemukan seperti Barkedji virus di Senegal

dan Israel; Chaoyang virus di Korea Selatan dan Cina; Donggang virus di Cina;

Ilomantsi virus di Finlandia; Lammi virus di Finlandia; Marisma Mosquito Virus

di Spanyol dan Italia; Nanay virus di Peru; dan Nhumirim virus di Brazil (Blitvich

and Firth, 2015). Pohon filogenetik flavivirusdapat dilihat selengkapnya pada

Gambar 2.6.

13

Gambar 2.6

Pohon filogenetik flavivirus: cISF-biru; dISF-hijau; NKV flavivirus-merah;

mosquito/vertebrataflavivirus-ungu; tick/vertebrataflavivirus-hitam (Blitvich and

Firth, 2015)

14

2.1.4 Penularan ISF

Keberlangsungan siklus hidup flavivirus yang termasuk ke dalam

kelompok MBFV di alam terjadi karena adanya replikasi virus baik pada tubuh

nyamuk dan berbagai jenis vertebrata termasuk manusia. Berbeda halnya

dengan ISF yang replikasinya hanya terjadi pada tubuh nyamuk saja.

Keberlangsungan generasi virus ISF terjadi melalui mekanisme penularan

transovarial. Virus dapat ditularkan secara vertikal (transovarial) dari induk ke

anaknya, terbukti dengan ditemukannya virus pada larva nyamuk, nyamuk

jantan, dan ditemukannya antigen virus pada jaringan ovarium nyamuk yang

terinfeksi. Penularan secara transovarial telah ditemukan pada virus Dengue,

Yellow Fever, JE, danWest Nile. Pada penelitian eksperimen terhadap virus

Yellow Fever dari kelompok MBFV ditemukan rerata penularan transovarial

sangat rendah yaitu 0,2% namun penularan transovarial pada Culex flavivirus

yang merupakan kelompok ISF mencapai 100%. Penularan melalui mekanisme

ini memungkinkan kelangsungan hidup virus pada telur dalam kurun waktu

yang cukup lama melewati berbagai musim (Rosen et al., 1980; Saiyasombatet

al., 2011; Huang et al., 2014).

Virus dapat ditularkan secara vertikal menunjukkan bahwa virus dapat

berada dalam tubuh nyamuk untuk periode waktu yang sangat lama selama

beberapa generasi. Beberapa di antaranya menjadi terintegrasi dengan genom

nyamuk dan ada yang berevolusi dari virus yangkhusus hanya menginfeksi

serangga (ISF) menjadi virus yang dapat menginfeksi vertebrata. Dengan

melihat sejarah evolusi dan plastisitasnya tersebut maka banyak virus yang

15

menginfeksi vertebrata kemungkinan berasal dari virus yang hidup pada

nyamuk atau serangga, lalu kemudian beradaptasi dengan hospes vertebratanya

dan kehilangan kemampuannya dalam menginfeksi serangga(Li et al., 2015).

Mekanisme penularan lain yaitu mekanisme transmisi venereal.

Penularan flavivirusterjadi antar nyamuk, yaitu dari nyamuk jantan yang

terinfeksi ke nyamuk betina sehat, seperti yang ditemukan pada Cx. pipiens.

Penelitian ini pernah dilakukan hanya pada ISF dan mungkin tidak berlaku pada

virus di famili lain (Kuno et. al., 2005).

2.1.5 Superinfeksi virus pada nyamuk

Pada tubuh nyamuk sering ditemukan adanya lebih dari satu jenis virus.

Pada suatu penelitian diperoleh fakta bahwa infeksi beberapa jenis virus pada

seekor nyamuk akan menyebabkan terjadinya penurunan replikasi salah satu virus

sehingga dapat mengurangi potensi penularan. Kejadian ini dikenal dengan istilah

superinfeksi eksklusi. Apabila replikasi virus yang dihambat adalah virus

homolog yang menginfeksi berikutnya disebut dengan mekanisme homologous

interference(Pepin et al., 2008; Bolling et.al., 2015).

Terdapat beberapa studi yang telah meneliti kemampuan ISF dalam

menyebabkan superinfeksi eksklusi pada nyamuk. Seperti pada penelitian

terhadap virus ISF yaitu virus Palm Creek yang diinfeksi bersama dengan virus

West Nile dan Murray Valley encephalitissecara in-vitro pada sel C6/36. Hasilnya

menunjukkan bahwa terjadi pengurangan replikasi virus West Nile dan Murray

Valleysecara signifikan(Hobson et al., 2013). Hal yang sama juga terjadi pada

16

virus ISF yaitu virus Nhumirim yang terbukti mengurangi replikasi virus West

Nile, Japanese Encephalitis, dan Saint Louis Encephalitispada sel C6/36 (Kenney

et al., 2014). Namun demikian perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk

membuktikan konsistensi dari hasil penelitian tersebut.

Penelitian secara in vivo juga pernah dilakukan untuk menilai kompetensi

vektor pada koloni Cx. pipiens yang diinfeksi dengan virus ISF yaitu

Culexflavivirus terhadap penularan virus West Nile. Hasil yang diperoleh

adalah terjadi penekanan replikasi virus West Nile pada nyamuk yang telah

terinfeksi Culexflavivirussebelumnya secara in vivo (Bolling et al., 2015).

Penelitian serupa juga dilakukan di Florida, namun menunjukkan hasil yang

berbeda, seperti pada koloni nyamuk Cx. quinquefasciatus strain Honduran

yang diinfeksi dengan Culexflavivirus dan virus West Nile menunjukkan terjadi

peningkatan penularan virus West Nile pada hari ke-14 setelah terinfeksi (Kent

et al., 2010). Terdapat perbedaan hasil penelitian menunjukkan bahwa

interaksi antara ISF dan MBFV adalah bervariasi dalam berbagai kondisi

tertentu tergantung dari spesies nyamuk, teknik, dan strain virus yang

digunakan.

2.1.6 Analisis filogenetik

Flavivirus baru banyak ditemukan dalam dua dasa warsa terakhir

sehinggadiperlukan kajian untuk menjelaskan hubungan filogenetik antar virus

dalam usaha membuat suatu klasifikasi flavivirus yang jelas. Distribusi geografis

penyebaran virus yang sangat luas disertai diversitas virus, nyamuk, dan hospes

17

vertebrata yang terlibat dalam siklus penularan virus yang sangat beragam

merupakan tantangan tersendiri yang harus dihadapi.Dengan melakukananalisis

filogenetik flavivirusmaka dapat diketahui hubungan kekerabatan virus, ada

tidaknya variasi genetik, dan proses evolusinya (Kuno et al., 1998).

Istilah filogeni (phylogeny) pertama kali ditemukan oleh Haeckel pada

tahun 1866 yang menggambarkan hubungan sekelompok spesies, gen, genom,

atau operational taxonomic unit (OTU), yang berasal dari leluhur yang sama

(common ancestry). Ilustrasi hubungan kekerabatan evolusi ini dipresentasikan

berupa diagram bercabang (branching diagram) atau pohon filogenetik. Setiap

percabangan dihubungkan dengan simpul (node) yang mengarah ke terminal di

ujung pohon Beberapa set karakter yang homolog dari satu atau beberapa

organisme dibandingkan. di dalam pohon filogenetik. Karakter dapat berupa gen

(urutan gen, urutan protein), struktural (morfologi), atau ciri perilaku organisme

(Bruyn et al., 2014). Untuk selengkapnya mengenai komponen pohon filogenetik

dapat dilihat pada Gambar 2.7.

Pada prinsipnya terdapat empat langkah utama untuk melakukan analisis

filogenetik. Empat langkah tersebut adalah 1) Memilih sekuen yang sesuai, bisa

berupa gen parsial atau genom lengkap; 2) Melakukan identifikasi homolog,

sekuen data pembanding harus homolog; 3) Sekuen disejajarkan; dan 4) Memilih

metode yang sesuai untuk analisis filogenetik (Bruyn et al., 2014). Saat ini

tersedia banyak software yang digunakan untuk melakukan analisis filogenetik,

salah satunya adalah program Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)

7 yang digunakan dalam studi ini (Kumar, 2016).

18

.

Gambar 2.7

Komponen pohon filogenetik terdiri dari Node = 1,2,3 melambangkan

hubungan antar taksa (sequence/seq), Cabang=* (menghubungkan 2 node)

(Kidd and Sgaramella-Zonta, 1971)

a. Langkah analisis filogenetik

1. Pemilihan sekuen

Langkah pertama yaitu memilih sekuen yang akan dianalisis. Pada

prinsipnya semua bisa dibandingkan bisa berupa gen keseluruhan atau hanya

coding regions atau bahkan single introns dapat dibandingkan(Bruyn et al.,

2014). Data yang digunakan dalam membuat filogeni dapat berupa sekuen

asam amino maupun nukleotida. Pemilihan sekuen juga disesuaikan dengan

tujuan rekonstruksi filogenetik tersebut. Jika tujuannya hanya untuk

mengetahui duplikasi yang terjadi di dalam suatu gen dalam satu famili, maka

dipilihlah sampel gen yang berasal dari satu spesies secara komprehensif.

Namun, jika tujuannya untuk memahami bagaimana suatu gen dalam satu

19

famili tersebut berevolusi, maka dipilihlah sampel seluas mungkin, tidak

hanya satu spesies tetapi berbagai spesies. Penelusuran literatur yang cermat

sebelumnya sangat membantu dalam pemilihan sekuen tersebut. Terdapat

empat sumber data yang dapat digunakan untuk membuat suatu filogeni yaitu:

1) Sekuen yang telah dipublikasi pada suatu literatur; 2) Basis data gen di

National Center for Biotechnology Information (NCBI); 3) Basis data

expressed sequence tag (EST); maupun 4) Data yang belum terpublikasi dari

peneliti. Setelah mendapatkan sekuen data yang diinginkan, dilakukan Basic

Local Alignment Search Tool (BLAST) untuk mendapatkan sekuen yang

mirip dengan sekuen yang kita ingin bandingkan(Harrison and Langdale,

2006).

2. Identifikasi homolog

Semua sekuen yang dianalisis haruslah sekuen yang homolog. Homolog

berarti berasal dari leluhur yang sama (common ancestry)(Pearson, 2013).

Sekuen yang homolog dapat diperoleh dengan menelusuri basis data sekuen

seperti GenBank, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), dan

DNA Data Bank of Japan (DDBJ) dengan menggunakan fasilitas BLAST

(Basic Local Alignment Search Tool) atau FASTA. Dengan melakukan

BLAST kita dapat mencari persentase identity sekuen nukleotida maupun

kemiripan (similarity) sekuenasam amino yang yang berasal dari leluhur yang

sama(Schreiber, 2007). MEGA menyarankan untuk memilih sekuen yang

memiliki identity lebih besar dari 50% (Kumar et al., 2016).

3. Melakukanpenjajaran sekuen (sequence alignment)

20

Proses alignment secara manual maupun automatis dilakukan pada

sekuen yang homolog agar bisa dibandingkan. Jika menggunakan software

MEGA7 maka alignment dapat dilakukan dengan program ClustalW.

Penjajaran sekuen (alignment)adalah cara untuk mengatur sekuen primer,

dalam hal ini DNA, untuk mengidentifikasi region yang memiliki kesamaan

(identity) hasil dari hubungan fungsional, struktural, atau evolusioner antara

sekuen. Saat proses alignment berlangsung, gap disisipkan di antara residu

sehingga residu yang memiliki kesamaan atau identik diselaraskan dalam

kolom berurutan. Sekuen yang telah mengalami proses penjajaran sebaiknya

dimulai dengan ATG pada 5’ end dan berakhir dengan terminator codon UAA

(Ochre), UAG (Amber), atau UGA (Opal) pada 3’end. Proses penyesuaian

(adjustment)penjajaran ini dapat dilakukan secara manual pada program

MEGA7 (Kumar and Tamura, 2016).

4. Pemilihan metode analisis

Terdapat dua metode umum yang dapat digunakan dalam membuat pohon

filogenetik pada sekuen yang telah mengalami proses penjajaran yaitu

distance-based dan character-based. Metode distance-based adalah metode

yang menggunakan prinsip ketidaksamaan (distance) antara sekuen. Metode

ini berdasarkan kalkulasi jarak genetik dari setiap pasang sekuen pada suatu

dataset(Harrison and Langdale, 2006).

Metode distance-based dimulai dengan mengelompokkan dua sekuen

yang paling dekat, melakukan rekalkulasi jarak, dan pengelompokan kembali.

Demikian terus proses tersebut berulang sampai semua sekuen terkelompokan.

21

Urutan dari sekuen yang dikelompokkan mencerminkan topologi, pola, serta

panjang cabang pada pohon filogenetik yang mencerminkan matrik jarak.

Jarak (distance) tersebut mewakili ketidaksamaan (dissimilarity) antar sekuen.

Keunggulan metode ini mudah dan cepat dalam melakukan analisis sehingga

ideal untuk melakukan eksplorasi awal untuk mengetahui hubungan antar

sekuen pada suatu dataset. Namun kelemahannya adalah metode ini cenderung

mengabaikan analisis distribusi maupun hubungan antar karakter dalam

sekuen sehingga informasi mengenai evolusi sangat terbatas. Contoh metode

distance-based adalah unweighted pair group method with arithmetic

mean(UPGMA) dan neighbour-joining(Harrison and Langdale, 2006; Bruyn

et al., 2014).

Metode character based adalah metode yang menganalisis semua karakter

di setiap posisi pada sekuen yang terdapat pada dataset sehingga semua

informasi tidak ada yang hilang.Contoh dari metode ini maximum parsimony,

maximum likelihood, dan Bayesian inference.Metode ini dapat secara akurat

menggambarkan hubungan antar sekuen yang telah terpisah dalam waktu yang

lama ataupun sekuen yang mengalami evolusi yang cepat. Namun

demikianmetode ini memiliki kelemahan yaitu memakan waktu yang lama

dalam proses analisis (Harrison and Langdale, 2006; Schreiber, 2007; Bruyn

et al., 2014).

b. Jarak Genetik (genetic distance)

22

Jarak genetik adalah ukuran kuantitatif dari suatu perbedaan genetik antar

populasi, sekuen DNA, individu, spesies, atau unit taksonomi yang lain. Jumlah

rata-rata perbedaan kodon atau nukleotida per-gen diukur sebagai jarak genetik.

Ada berbagai data molekuler yang bisa digunakan untuk mengukur jarak genetik

seperti misalnya urutan asam amino atau nukleotida(Nei, 1987). Persentase jarak

genetik dapat diestimasi dengan menggunakan MEGA7. Dari persentase jarak

genetik kita dapat mengetahui persentase identity yaitu persentase kesamaan

susunan nukleotida. Misalnya jika jarak genetiknya sebesar 10% maka persentase

kesamaanya (% identity) adalah 90%. Semakin kecil jarak genetik atau semakin

besar persentase identity berarti hubungan antar sekuen adalah semakin dekat

(Harrison and Langdale, 2006).

2.1.7 Mutasi

Saat dilakukan penjajaran (alignment) pada sekuen nukleotida sering

ditemukan variasi atau perubahan dalam susunan nukleotida yang sering dikenal

dengan istilah mutasi. Mutasi merupakan perubahan materi genetik (gen atau

kromosom) yang dapat diwariskan ke keturunan berikutnya. Mutasi pada virus

RNA lebih sering terjadi dibandingkan virus DNA. Begitu pula virus yang untai

tunggal juga lebih mudah mutasi dibandingkan yang untai ganda. Mutasi dapat

terjadi karena a) terjadi kesalahan replikasi materi genetik;b) kesalahan editing

(proofreading) dari material genetik; ataupun c) kerusakan asam nukleat yang

spontan (Sanjuan and Domingo-Calap, 2016).

23

Jenis mutasi secara garis besar ada dua jenis. Pertama, mutasi titik (point

mutation) yang berupa perubahan pada satu atau beberapa basa karena adanya

penggantian, penyisipan, ataupun penambahan basa yang berefek pada fungsi dari

suatu gen tunggal (single gen). Mutasi tipe ini ada empat jenis yaitu 1) silent

mutation yaitu tidak menyebabkan terjadinya perubahan pada asam amino karena

satu asam amino bisa saja dikode adalah beberapa kodon; 2) missense mutation

yang menyebabkan satu buah asam amino berubah; 3)nonsense mutation adalah

jika suatu asam amino diganti oleh stop codon yang mengakibatkan terjadinya

terminasi translasi dini; dan 4)frameshift mutation yaitu mutasi yang

menyebabkan terjadinya perubahan reading frame sehingga menghasilkan asam

amino yang salah dan biasanya diikuti dengan stop codon. Kedua, mutasi

kromosom yaitu mutasi yang melibatkan perubahan struktur atau jumlah

kromosom yang berefek pada fungsi beberapa gen sehingga terjadi perubahan

fenotipik. Mutasi kromosom ini dapat berupa deletion, insertion, ataupun terjadi

pertukaran segmen DNA antar kromosom yang nonhomolog (Lodishet al, 2000).

2.2 Nyamuk Culexspp.

Nyamuk genus Culex termasuk ke dalam Kingdom Animalia, Phylum

Arthropoda, Kelas Insecta, Order Diptera, dan Famili Culicidae.

2.2.1 Morfologi dan bionomik

Morfologi umum nyamuk genus Culexdewasa memiliki ciri khas sebagai

berikut: nyamuk berukuran kecil sampai sedang, dengan panjang sayap kurang

24

dari 4 mm (Gambar 2.8). Perbandingan panjang antara proboscis dengan palpi 1:4

atau 1:5, abdomen tumpul, cerci tidak menonjol, memiliki pulvili, dan skutelum

dengan tiga lobus. Tidak memiliki bulu kasar (setae) pada mesepimeron bawah

(jika ada hanya berupa 1 atau 2 bulu), tidak ada bulu kasar pada area prespirakular

dan postspirakular, sisik putih pada sternopleuron dan mesepimeron, dan sisik

pada sayap simetris dan sempit (Depkes RI, 2008).

Gambar 2.8

Morfologi khas nyamuk Genus Culex dewasa, 4)Cakar (claws) pada kaki depan

(fore-leg) simpel (jantan bergigi); 5)Terdapat pulvilli besar dekat cakar (betina);

6)Sisik pada sayap tidak lebar; tanpa ada warna keperakkan, dan memiliki skuama

kecil; 7) Tidak ada setae (bulu kasar) pada area prespiracular dan postspiracular;

8) Skutelum berlobus tiga dengan setae; 9) Nyamuk betina memiliki palpi

pendek; 10)Nyamuk jantan memiliki palpi panjang dan antenna dengan rambut

lebat; 11) Larva pada posisi bernafas, (Smart, 1948).

25

Terdapat 42 spesies nyamuk Culexspp. di Asia Tenggara, 16 spesies di

antaranya penting dalam penularan penyakit, dapat dilihat pada Tabel 2.1.

Nyamuk Culex yang ditemukan di Indonesia sesuai dengan kunci identifikasi

nyamuk Culex Depkes RI Dit.Jen. PPdan PL 2008, yang dibagi menjadi dua

kelompok. Kelompok pertama, pipiens group yang ditandai dengan proboscis

tanpa gelang putih, pada mesepimeron bawah terdapat 1-2 bulu kasar (setae).

Contoh pipiens group adalah Cx. fuscocephala, Cx. hutchinsoni, danCx.

quinquefasciatus. Kedua, sitiens group,ditandai dengan proboscis dengan gelang

putih, mesepimeron tanpa bulu kasar. Contoh: Cx. bitaeniorhynchus, Cx

pseudosinensis, Cx. gelidus, Cx. whitmorei, Cx. diengensis, Cx. solitaries, Cx.

mimulus, Cx. tritaeniorhynchus, Cx. pseudovishnui, Cx. vishnui, dan Cx. sitiens

(Depkes, 2008).

Tabel 2.1

Distribusi Culexspp. yang sering ditemui di Asia Tenggara (Reuben et al., 1994)

26

Berikut ciri khas beberapa nyamuk Culex spp.yang sering ditemukan di

Asia Tenggara termasuk di Indonesia:

1. Cx. fuscocephala Theobald.

a. Morfologi

Proboscis tanpa gelang putih dan tergit abdomen semuanya berwarna gelap

tanpa gelang putih. Spesies ini mirip dengan Cx. quinquefasciatus karena

sama-sama tidak memiliki gelang putih pada proboscis. Pada pleuron ada

warna pucat dan gelap. Sayap homogen tidak bernoda dan tidak ada sisik

putih, sisik sayap sempit, dan simetris (Depkes, 2008). Morfologi Cx.

fuscocephala dapat dilihat pada Gambar 2.9.

b. Bionomik

Nyamuk ini suka menghisap darah manusia dan hewan mamalia lain seperti

babi, kuda, dan sapi. Berkembang biak di sawah dan genangan air yang

dasarnya tanah.

c. Vektor

Merupakan vektor virus JE, di samping juga merupakan vektor limfatik

filariasis.

A B

C

D

E

27

Gambar 2.9

Morfologi nyamuk dewasa Cx. fuscocephala Theobald, A. Proboscis tidak

memiliki gelang putih, B. Skutum coklat muda, C. Sayap homogen tidak ada

sisik putih, D. warna pucat dan gelap pada pleuron, E. tergit hitam tanpa

gelang basal dan apikal, (Gaffigan et al., 1999; Depkes, 2008)

2. Cx. quinquefasciatus

a. Morfologi

Dikenal juga dengan namaCx pipiens fatigans. Morfologi berupa proboscis

tanpa gelang putih dan tergit abdomen dengan gelang basal sempit yang

berwarna pucat. Integumen dari pleuron berwarna pucat merata. Sayap

homogen tidak bernoda tanpa adanya sisik putih, sisik sempit, dan simetris

(Depkes, 2008). Morfologi nyamuk Cx qunquefasciatus dapat dilihat pada

Gambar 2.10.

b. Bionomik

Nyamuk banyak ditemukan di daerah tropis di Asia dan Afrika. Merupakan

nyamuk domestik yaitu nyamuk yang berada di sekitar perumahan. Nyamuk

ini tidak mengalami reproduktif diapauses dan telurnya tidak tahan terhadap

kekeringan. Habitat larva terutama pada kontainer artifisial, selokan, sumur

yang dangkal, buangan air limbah organik, dan kolam. Beberapa juga terdapat

28

di alam bebas seperti di lubang pohon, lubang batu karang, dan tepi sungai.

Nyamuk ini dapat ditemukan di daerah subtropik sepanjang musim bahkan

pada musim dingin, namun kepadatan nyamuk paling tinggi terjadi pada

musim panas. Larva ditemukanterutama pada tempat yang terdapat genangan

air yang polutan seperti di perkotaan yang saluran air limbahnya sering tidak

lancar. Pada daerah tropis kepadatan nyamuk tertinggi terjadi pada akhir

musim kemarau yaitu pada bulan Agustus dan pada awal musim hujan di

bulan Oktober dan November, serta terendah pada bulan Desember. Sepanjang

masih ada genangan air maka akan menjadi habitat yang cocok untuk Cx.

quinquefasciatus. Penurunan yang cukup tajam terjadi pada bulan Desember

saat puncak musim hujan (Ramadhani et al., 2010; Grechet al., 2013).

Cx. quinquefasciatus melakukan mating dan meletakkan telur pada senja

hari dan menghisap darah pada malam hari dengan puncaknya pada pukul

20.00-02.00 (Savage et al., 2008). Bersifat antrofofilik (suka menghisap darah

manusia), namun tidak menutup kemungkinan juga dapat menggigit ternak

yang ada seperti sapi dan babi (Reuben et.al., 1994).

A

B

C

29

Gambar. 2.10

Morfologi nyamuk dewasa Cx. quinquefasciatus, A. Proboscis tanpa

gelang putih, B. Gelang basal tergit sempit, C. Sayap tanpa sisik putih

(Gaffigan et al., 1999;Depkes, 2008)

c. Vektor

Isolasi virus JE pada nyamuk Cx. quinquefasciatus pertama kali dilaporkan di

Vietnam, dan juga dilaporkan pernah ditemukan di Thailand, dan Indonesia.

Walaupun demikian nyamuk ini dikatakan merupakan vektor yang lemah dan

tidak berperan penting dalam penularan penyakit (Nitatpattana et al., 2005).

Cx. quinquefasciatus merupakan vektor berbagai virus seperti Avipoxvirus,

bluetongue virus, JE,Venezuelan equine encephalitis virus, West Nile, dan

Western equine encephalitis virus(Bhattacharyaet al.,2016).

3. Cx. gelidus Theobald

a. Morfologi

Tergit abdomen selalu dengan gelang basal putih, jarang tanpa gelang

namun tidak memiliki gelang apikal, dan tanpa bercak. Skutum tertutup sisik

keperakkan yang lebat setidaknya di bagian anterior sampai preskutelar. Sisik

putih pada skutum berakhir di pangkal sayap, gelang basal abdomen mencapai

30

tepi tergit sering dengan bentuk V ke arah posterior. Sisik sayap sempit,

simetris, dan tidak bernoda (Depkes, 2008). Tidak terdapat sisik putih pada

foreleg dan midleg yang membedakannya dengan Cx. whitmori. Morfologi

dapat dilihat pada Gambar 2.11.

b. Bionomik

Larva ditemukan pada genangan air di tanah yang sementara atau tetap

seperti kolam, sungai kecil, dan sawah. Sawah yang luas seperti yang lazim

dijumpai di daerah Asia Tenggara, berhubungan erat dengan peningkatan

populasi nyamuk. Larva juga dapat ditemukan pada penampung air buatan

seperti tangki air dan gentong maupun pada air yang kotor dengan kandungan

bahan organik yang tinggi, seperti rawa-rawa dan selokan (Sudeep, 2014).

A B

C D

E F

G

31

Gambar 2.11

Morfologi nyamuk dewasa Cx. gelidus, A. Proboscis dengan gelang putih, B.

Skutum perak, C. Pleuron pucat, tidak memiliki setae, D. Warna perak pada

skutum sampai pangkal sayap, E. Sayap tidak bernoda, F. Gelang basal

sampai ke tepi tergit (bentuk ―V‖), G. Tidak terdapat sisik putih pada foreleg

dan midleg(Gaffigan et al., 1999; Depkes, 2008)

Nyamuk betina lebih memilih menghisap darah hewan mamalia yang

besar seperti sapi dan babi dibandingkan manusia. Nyamuk ini juga menggigit

ternak seperti kambing, biri-biri, ayam, dan burung liar. Namun demikian

dengan ketiadaan hewan, nyamuk juga bisa menggigit manusia. Nyamuk akan

keluar mencari mangsa dalam kelompok yang besar saat hari mulai gelap.

Menggigit sepanjang malam dengan puncaknya pada pukul 03.00-06.00 pagi.

Kemampuan larva hidup di air jernih maupun kotor dan dengan rentang

mangsa yang luas menyebabkan nyamuk ini sangat berpotensi sebagai vektor

penyakit yang baik (Sudeep, 2014).

C. Vektor

Cx. gelidus adalah vektor utama JE di Malaysia dan Australia. Virus lain

yang dapat ditularkan adalah dari family Togaviridae, Flaviviridae,

Rhabdiviridae, dan Bunyaviridae. Beberapa virus yang berhasil diisolasi dari

lapangan seperti Virus Getah, Ross River, Sindbis, dan Tembusu. Dari

penelitian eksperimental diperoleh bahwa nyamuk Cx. gelidus kompeten

menularkan virus West Nile, Kunjin, dan Murray Valey Encephalitis dengan

rerata infeksi dan penularan mencapai 50%-80% (Sudeep, 2014).

4. Cx. sitiens Wiedemann

32

a. Morfologi

Nyamuk berukuran agak besar danproboscis dengan gelang putih. Tergit

abdomen memiliki gelang basal putih, jarang tanpa gelang namun tidak

memiliki gelang apikal, dan tanpa bercak. Skutum tertutup sisik coklat merata

atau dengan beberapa sisik kuning atau keemasan. Sayap tanpa noda berupa

sisik putih yang jelas. Vertek dengan sisik berwarna coklat tua merata, occiput

dengan sisik coklat tua, dan beberapa sisik yang berwarna hampir hitam pada

posterolateral. Permukaan anterior femur (paha) kaki tengah memiliki bercak

berupa sisik coklat dan putih, tibia kaki tengah, dan kaki belakang dengan

sisik pucat mirip pita (Depkes, 2008). Morfologi Cx. sitiens dapat dilihat pada

Gambar 2.12.

B

A B

C D

E

33

Gambar 2.12.

Morfologi nyamuk dewasa Cx. sitiens, A. Proboscis gelang putih, B. Sisik pada

sternopleuron dan mesipemeron, C. Skutum dengan sisik kuning/ emas, D. Tergit

dengan gelang apikal dan basal, E. Bercak putih pada femur anterior

midleg(Gaffigan et al., 1999; Depkes, 2008)

b. Bionomik

Cx. sitiens adalah nyamuk yang hidup di pesisir/pantai dan larva menyukai

genangan air yang mengandung sampah, genangan air payau yang terkena

sinar matahari langsung, sumur, selokan, tanaman bakau, dan pada kontainer

artifisial manusia. Menggigit pada malam hari baik di dalam rumah maupun di

luar rumah dengan puncak menggigit pada pukul 19.00-20.00. Nyamuk betina

terutama menggigit burung, babi, sapi, domba, kuda, unggas, serta manusia.

Nyamuk ini beristirahat di luar rumah pada siang hari dan dapat terbang

sampai mencapai 35 km (Prummongkol et al., 2012).

c. Vektor

Cx. sitiens adalah vektor dari virus JE, Ross River Virus, dan Kunjin

(Sucharit et.al, 1989).

5. Cx. tritaeniorhynchus

a. Morfologi

Nyamuk berukuran kecil, proboscis dengan gelang putih. Tergit abdomen

selalu dengan gelang basal putih, tidak ada gelang apikal, dan tanpa bercak.

Skutum tertutup sisik tegak coklat merata atau dengan beberapa sisik kuning

34

keemasan. Sayap tanpa noda berupa sisik putih yang jelas berwarna hitam,

kecoklatan, seperti yang terlihat pada Gambar 2.13 (Depkes, 2008).

b. Bionomik

Larva ditemukan pada genangan air permanen dan sementara yang banyak

mengandung tumbuhan dan terkena sinar matahari seperti sawah, kolam,

rawa-rawa, dan tepi sungai yang alirannya tidak deras. Nyamuk ini beristirahat

di luar rumah (outdoor) dan menggigit pada malam hari yaitu pada puncaknya

pukul 21.00-02.30. Nyamuk betina suka menghisap darah ternak seperti sapi,

babi, unggas, dan juga manusia (Lee et al., 1989; Das et al., 2004).

A

C

D

E

B

D

35

Gambar 2.13.

Morfologi nyamuk dewasa Cx. tritaeniorhynchus, A. Proboscis gelang putih,

terdapat bercak putih ventral proboscis, B. Sisik vertek (erect scale) berwarna

coklat tua, C. Skutum berwarna coklat/kuning, D. Tergit memiliki gelang

basal yang sempit, E. Sayap tanpa noda (Gaffigan et al., 1999; Depkes, 2008).

6. Cx. bitaeniorhynchus subgroup

a. Morfologi

Nyamuk ini merupakan kelompok sitiens yang ditandai dengan proboscis

gelap dengan gelang putih. Nyamuk ini berukuran besar dengan ukuran sayap

3,8-5,2 mm, pada2/3 anterior skutum tertutup sisik berwarna krem pucat,

kuning, emas, atau coklat tua yang kontras dengan1/3 posterior skutum, pada

abdominal tergit terdapat apikal berwarna kuning atau pucat. Sayap dengan

sisik pucat tersebar di antara sisik gelap, terutama pada costa dan subcosta,

skutum tidak memiliki sisik keperakkan. Tergit abdomen dengan gelang pucat

apikal yang bagian atasnya mirip segitiga dan gelang basal atau bagian ujung

abdomen tertutup oleh sisik pucat (Depkes, 2008).Morfologi nyamuk ini dapat

dilihat pada Gambar 2.14.

b. Vektor

Nyamuk Cx. bitaeniorhynchus merupakan vektor virus Murray Valley

Encephalitis di Australia serta virus Batai dan JE di India. Nyamuk ini

menghisap darah burung, babi, dan juga manusia (Reuben et al., 1994)

A B

36

Gambar 2.14

Morfologi nyamuk dewasa Cx.bitaeniorhynchus, A. Proboscis gelang putih,

B. Tidak ada setae pada mesipemeron bawah, C. Skutum coklat, D. Sayap

memiliki sisik pucat yang jelas (Gaffigan et al., 1999; Depkes, 2008).

.

7. Cx. vishnui

a. Morfologi

Proboscis gelang putih, skutelum gelap, sayap tidak bernoda dan vertek

coklat tua, Femur kaki tengah anterior gelap sedangkan ventralnya pucat

(Depkes, 2008).Morfologi nyamuk ini dapat dilihat pada Gambar 2.15.

C D

E

A

C

C

D

C

A B

37

Gambar 2.15

Morfologi nyamuk dewasa Cx. vishnui, A. Proboscis gelang putih, sisik pada

vertex coklat tua dengan sisik hitam pada occiput posterolateral, B. Skutum

coklat/kuning, C. Femur tanpa bercak putih, D. Sayap memiliki sisik putih

(Gaffigan et al., 1999; Depkes, 2008).

b. Bionomik

Larva biasanya ditemukan pada genangan air di tanah seperti kolam,

selokan, jejak hewan yang tergenang air, sawah, dan genangan air lain yang

banyak mengandung tumbuhan. Nyamuk betina menggigit ternak terutama

babi, burung, dan manusia (Murty et al., 2002).

c. Vektor

Nyamuk Cx. vishnui memegang peranan penting dalan penularan virus JE

di India. Terdapat korelasi yang signifikan antara kepadatan nyamuk ini

dengan kejadian JE di India (Murty et al., 2002).

2.2.2 Siklus penularan antara nyamuk, flavivirus, danvertebrata

Siklus penularan flavivirus antara nyamuk dan vertebrata ada 3 jenis yaitu

1) siklus enzootik; 2) siklus epizootik; dan 3) siklus urban. Siklus enzootik disebut

juga siklus silvatik atau siklus hutan (jungle cycle). Penularan virus secara alami

antara hewan liar (vertebrata) dengan vektor primer yaitu nyamuk sebagai tempat

replikasi flavivirus. Vertebrata dalam hal ini berperan sebagai reservoir yaitu

D

D

38

hospes yang mengandung virus namun tidak menyebabkan penyakit pada hospes.

Oleh karena itu hospes reservoir adalah hospes primer dari virus yang bisa

terinfeksi berulang kali selama hidupnya (Go et al., 2014).

Siklus epizootik (rural cycle) adalah virus yang ditularkan di antara hewan

domestik atau ternak oleh nyamuk sebagai vektor. Hal ini akan menyebabkan

terjadinya wabah epidemik karena hewan tersebut berperan sebagai hospes

amplifying yaitu hospes tempat virus diamplifikasi/diperbanyak sehingga titernya

menjadi tinggi dan mudah ditularkan ke manusia seperti virus JE dengan hospes

amplifying adalah babi. Manusia dalam hal ini berperan sebagai dead-end host

yaitu hospes yang viremianya sangat rendah akibat tidak terjadinya amplifikasi

virus pada manusia sehingga tidak dapat menularkan ke nyamuk sebagai vector

penular ke manusia yang lain (Go et al., 2014).

Gambar 2.16

Siklus penularan antara vertebrata dan vektor arthropod (Go et al., 2014).

2.2.3 Patogenesis virus di dalam tubuh nyamuk

39

Masuknya patogen ke dalam tubuh nyamuk terjadi saat nyamuk

menghisap darah. Nyamuk memiliki mekanisme antihemostatikyang terdapat

pada salivanya untuk memastikan aliran darah tanpa hambatanuntuk mencegah

kehilangan darah (blood loss). Setelah darah dihisap patogen melewati faring.

Patogen yang berukuran besar dapat rusak ketika melewati faring, namun tidak

mempengaruhi patogen kecil seperti plasmodium ataupun arbovirus (Beerntsen et

al., 2000).

Kelenjar ludah memiliki mekanisme antihemostatik yaitu ketika nyamuk

menusukkan proboscis ke dalam kulit maka akan terjadi reaksi vasokonstriksi,

agregasi platelet, dan proses koagulasi. Namun proses ini dapat dihambat oleh

komponen antihemostatik yang mengandung apirase, sialokinin, dan

antikoagulan. Apirase berperan mencegah agregasi platelet, sialokinin berperan

dalam vasodilatasi, dan thrombin inhibitor berperan dalam mencegah koagulasi.

Semua hal tersebut membuat darah yang dihisap tidak membeku dan mulut

terbebas dari bekuan darah (Beerntsen et al., 2000).

Patogen termasuk virus, harus melewati 3 kompartemen di dalam tubuh

nyamuk yaitu midgut, hemosel, dan kelenjar saliva. Setiap kompartemen dibatasi

oleh penghalang (barrier) fisikal dan fisiologikal. Midgut infection barrier (MIB)

harus dilalui agar dapat masuk ke midgut dan melewati midgut escape barrier

(MEB) agar dapat keluar dari midgut(Lambrechts et al, 2010).Perjalanan patogen

selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 2.17.

Midgut merupakan lingkungan yang membahayakan untuk patogen

termasuk virus.Darah yang termakan berbeda dari darah yang beredar dalam

40

tubuh nyamuk yang merupakan organism homoiterm. Saat suhu dan pH berubah

tiba-tiba di dalam midgut, maka enzim proteolitik memulai proses pencernaan

darahdi dalam lumen.Setelah terlepas dari midgut, virus akan menyebar ke seluruh

bagian tubuh nyamuk melalui hemosel. Untuk dapat menuju kelenjar saliva maka

virus harus dapat melewati saliva infection barrier (SIB) dan terakhir virus harus

dapat melewati saliva escape barrier (SEB) untuk dapat ditransmisikan keluar

saat nyamuk menusukkan proboscis ke hospes vertebrata yang lain saat

menghisap darah. Waktu yang diperlukan dari virus termakan bersama darah

sampai mencapai saliva yang sering disebut dengan istilah extrinsic incubation

period (EIP) memerlukan waktu kurang lebih 2 minggu (Leake and Johnson,

1987; Walker et al., 2014).

Kompetensi vektor dapat diteliti dengan caranyamuk diberikan darah yang

telah mengandung patogen (virus) lalu dinilai perkembangan virus di dalam tubuh

manusia. Keberadaan virus di dalam tubuh nyamuk yang persisten tanpa

menimbulkan efek patologi dalam jangka waktu yang lama menyebabkan nyamuk

dapat menularkan virus sepanjang hidupnya. Terjadi mekanisme keseimbangan

antara replikasi virus dan respon antivirus dari nyamuk sehingga infeksi menjadi

terkontrol. Virus tidak tereliminasi dan tidak bersifat letal bagi nyamuk (Salas-

Benito and De Nova-Ocampo, 2015).

41

Gambar 2.17

Perjalanan patogen di dalam tubuh nyamuk. Situs perkembangan dalam nyamuk

didefinisikan oleh huruf A sampai H, dan migrasi rute diwakili oleh garis. Setelah

menelan darah (A), semua patogen memasuki midgut (B). Virus kemudian masuk

ke sel epitel usus tengah (D keluar dari sel, dan perjalanan melalui hemolymph

penuh hemocoel (E) ke kelenjar liur (H), tempat terjadinya replikasi dan siap

ditularkan (Beerntsen et al., 2000).

2.2.4 Nyamuk Culex sebagai vektor flavivirus

Nyamuk Culexspp. adalah vektor dari berbagai spesies flavivirus baik

yang dapat menimbulkan penyakit pada manusia yang disebut MBFV ataupun

yang hanya spesifik berada dalam tubuh serangga yang disebut ISF. Baik MBFV

maupun ISF sama-sama membutuhkan nyamuk untuk melakukan replikasi

sehingga siap ditularkan.

Terdapat banyak flavivirusMBFV yang berhasil diisolasi dari nyamuk

Culex seperti virus JE, West Nile, Saint Louis Encephalitis, dan Murray Valey

Encephalitis, namun dua diantaranya yaitu virus JE dan West Nile ditemukan di

Indonesia. Penyakit JE dilaporkan bersifat endemis di Bali dan Sumatera Utara

(Kari et al., 2006) serta virus West Nile pernah dilaporkan ditemukan pada sampel

42

darah pasien demam pada suatu penelitian mengenai penyebab demam akut pada

pasien yang dirawat di rumah sakit di daerah Bandung, Jawa Barat (Myint et al.,

2014).

Spesies nyamuk Culex yang berperan sebagai vektor virus JE adalah Cx.

vishnui, Cx. fuscocephala (India); Cx. annullirostris, Cx. gelidus (Australia); Cx.

pipiens, Cx gelidus, Cx. vishnui, Cx. bitaeniorchynchus (Vietnam); Cx.

fuscocephala, Cx. annulus, dan Cx. quinquefasciatus (di Indonesia dan Thailand);

Cx. gelidus, Cx. quinquefasciatus (Myanmar); dan Cx. pipiens complex (Tunisia)

(Rosen et al., 1989; Tan et al., 1993;Reuben et al., 1994; Hurk et al.,

2003;Lindahl et al., 2012).

Berdasarkan hasil survei WHO bekerja sama dengan UNICEF pada tahun

2011-2012 terdapat 24 negara yang endemis JE termasuk di antaranya Indonesia,

Malaysia, Thailand, Vietnam, Jepang, Korea, dan Cina. Kasus JE di negara

tersebut kemudian menurun tajam karena adanya program vaksinasi masal yang

rutin. Indonesia tidak melaksanakan program vaksinasi dan tidak memiliki

dokumentasi insiden JE yang adekuat. Adanya keterbatasan teknologi survei serta

tidak adanya prioritas kebijakan pemerintah setempat dalam penanggulangan

penyakit JE menyebabkan angka kejadian JE yang sebenarnya di Indonesia

diperkirakan lebih tinggi daripada jumlah yang dilaporkan (Campbell et al.,

2011).

Kasus JE yang pernah dilaporkan di Bali pernah tercatat pada tahun 2006

yaitu kasus JE pada anak yang dilaporkan di RSUP Sanglah. Kasus JE pada anak

yang dilaporkan sebesar 36%, meninggal 10%, dan mengalami gejala sisa

43

sebanyak 37% dengan insiden 8,2 per 100.000 anak usia di bawah 10 tahun.

Jumlah tersebut tertinggi dibandingkan dengan beberapa daerah lain di Indonesia

yaitu sebesar 22% di Manado dan 25% di Pontianak. Dinas Kesehatan Bali tahun

2015 menemukan kasus 17 anak yang positif JE melalui pemeriksaan IgM

ELISA. Penemuan kasus positif JE berapapun jumlahnya seharusnya ditanggapi

dengan serius karena berpotensi menimbulkan wabah yang luas karena penularan

virus JE melibatkan nyamuk dan beberapa hewan domestik yang banyak

dipelihara di Bali seperti babi dan burung sebagai hospes amplifier(Kari et al.,

2006).

2.2.5 Propagasi dan identifikasi flavivirus dari nyamuk

Virus adalah parasit obligat intrasel sehingga bergantung pada hospes

untuk kelangsungan hidupnya. Virus tidak ditumbuhkan pada media kultur mati

atau pada lempeng agar namun virus harus memerlukan sel hidup untuk

menyokong replikasinya. Untuk itulah propagasi dilakukan pada cell line dengan

media pertumbuhan yang sesuai. Virus diisolasi setelah dipropagasi dan

diidentifikasi untuk dapat dianalisis struktur, replikasi, filogenetik, dan efeknya

pada sel hospes.

2.2.5.1 Propagasi Virus

a. Teknik Propagasi Virus

Propagasi virus dapat dilakukan dengan tiga teknik seperti inokulasi pada

binatang, telur yang berembrio, dan kultur sel. Sel ditumbuhkan pada kondisi

44

yang telah terkontrol serta ditumbuhkan secara in vitro pada media pertumbuhan

yang sesuai. Pada awal pertumbuhan dipersiapkan media yang mengandung

larutan garam yang seimbang (balanced salt solution), asam amino, gula, protein,

fetal bovine serum (FBS), buffer, dan antibiotika sebelum dilakukan inokulasi sel.

Pada saat inkubasi, sel dibagi dan ditumbuhkan pada permukaan plate atau gelas

flask untuk membentuk lapisan monolayer yang konfluen(Hematian et al., 2016).

b. Cell line

Ada beberapa tipe cell line untuk kultur, yaitu pertama, sel kultur primer

yaitu berupa sel normal yang diperoleh dari sel hewan maupun manusia. Sel ini

hanya mampu tumbuh dalam waktu yang terbatas dan tidak dapat dipertahankan

pada beberapa serial kultur. Sel kultur ini biasanya digunakan untuk isolasi primer

virus dan untuk produksi vaksin. Contoh sel kultur primer adalah sel monkey

kidney dan human amnion. Kedua, sel kultur diploid (semi continous cell line)

yaitu sel ini diploid dan mengandung kromosom dalam jumlah yang sama dengan

sel induknya dan bisa dikultur kembali sampai 50 kali dalam serial transfer.

Contoh Human embryonic lung strain dan Rhesus embryo cell strain. Ketiga,

kulturheteroploid (Continuous cell lines) yaitu berasal dari sel kanker, dapat

dikultur secara serial, dapat disimpan dalam suhu-70°C, namun tidak sesuai untuk

produksi vaksin. Contoh: HeLa (berasal dari epitel sel kanker servik), HEP-2

(berasal dari sel epitel laring), Vero (berasal dari sel ginjal monyet hijau Afrika),

BHK (Baby Hamster Kidney), dan sel C6/36(Albrecht et.al, 1996).

45

Isolasi virus dari nyamuk telah banyak dilakukan karena nyamuk vektor

berbagai virus penyebab penyakit. Ada beberapa cell line yang bisa digunakan

dalam mengisolasi virus dari nyamuk seperti sel C6/36yang berasal dari larva sel

larva nyamuk Aedes albopictus, BHK, dan vero (G. Kuno, Gubler, Velez, and

Oliver, 1985). Dalam mengisolasi flavivirus pada nyamuk sebaiknya

menggunakan sel C6/36 terlebih dahulu sebelum menggunakan sel mamalia lain

seperti sel BHK dan vero. Hal ini disebabkan karenahanya virus yang tumbuh di

nyamuk saja yang bisa tumbuh pada sel C6/36 sehingga aman bagi peneliti.

Berbeda halnya dengan menggunakan sel mamalia seperti sel BHK dan vero,

maka berbagai virus yang sangat berbahaya akan juga ikut terpropagasi mengingat

darah yang dihisap nyamuk dapat mengandung berbagai jenis patogen berbahaya

yang saat itu belum sempat dimetabolisme oleh nyamuk.

Terdapat lebih dari 500 jenis cell line yang berasal dari serangga seperti

dari kelas Diptera, Lepidoptera, dan Hemiptera. Cell line yang berasal dari

nyamuk yang sering digunakan untuk mengisolasi virus padanyamuk adalah sel

C6/36 yang berasal dari Ae. albopictus, AP-61 dari Ae. Pseudoscutellaris, dan

TRA-284 dari genus Toxorhynchites (Walker et al., 2014).

46

Gambar 2.18

Sel C6/36 (ATCC, 2005)

Nyamuk Ae. albopictus adalah vektor kompeten dari berbagai Arbovirus

termasuk Dengue, Chikungunya, dan Eastern Equine Encephalitis Virus. Cell line

pertama pada tahun 1960 yang berasal dari larva Ae. albopictus adalah C6/36

ATC- 15 cell line (Gambar 2.18). Sampai saat inisel C6/36 telah banyak

digunakan untuk meneliti arbovirus pada nyamuk (Walker et al., 2014).

Sel C6/36 terbukti sesuai untuk pertumbuhan arbovirus karena respon

fungsional RNAi (Ribonucleic acid Interferance) yang kurang sehingga

dipergunakan luas untuk mengisolasi arbovirus (Brackney et al., 2010). Serangga

memiliki mekanisme alternatif imunitas alami (innate) yang sering dikenal dengan

RNAi yang mengatur mekanisme kontrol virus. RNAi adalah RNA untai ganda

yang berperan sebagai perantara replikasi virus dan pengenalan sekuen khusus

pada RNA untai tunggal yang didegradasi oleh protein sitoplasma komplek (Blair,

2011).

47

Tingginya sensitivitas dari klon C6/36 dari sel Ae. albopictus telah banyak

dilaporkan dari berbagai penelitian survei virus Dengue. Penggunaan sel ini

sederhana dan metodenya cepat dalam mengisolasi dan identifikasi virus yang

digunakan bersama dengan monoclonal antibodies sehingga pemeriksaan menjadi

lebih efektif dan ekonomis (Gubler, 1984).

Media pertumbuhan yang digunakan untuk kultur sel C6/36 adalah

Eagle’s minimum essential medium (MEM), M199, Roswell Park Memorial

Institute (RPMI 1640), atau Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) yang

disuplementasi dengan 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS), 1% asam

amino esensial, 1% penicillin dan streptomycin 100 U/ml, dan 1% Glutamin. Sel

dipropagasi dan dipelihara pada inkubator dengan suhu 28oC dengan 5% CO2.

Untuk pemeliharaan sel, media yang diperlukan sama seperti dengan media

pertumbuhan hanya saja memerlukan FBS 2%. Penggantian media dapat

dilakukan dua kali seminggu. Apabila sel akan disimpan maka dilakukan

penyimpanan beku (cryopreservation) dengan media freezing berupa media kulur

95% dan Dimethyl sulfoxide (DMSO) 5% lalu disimpan dalam nitrogen

likuid(Nitatpattana et al., 2005; Teng et al., 2013).

Penggunaan cell line mamalia seperti BHK dan vero digunakan setelah

virus dipropagasi pada sel C6/36. Apabila terbentuk CPE pada sel C6/36, barulah

dikultur pada sel mamalia untuk membuktikan lebih lanjut apakah virus tersebut

dapat bereplikasi pada sel mamalia. Jika CPE terbentuk pada sel mamalia maka

virus tersebut termasuk ke dalam MBFVyang berpotensi menimbulkan masalah

48

kesehatan bagi manusia. Namun jika CPE tidak terbentuk pada sel mamalia maka

flavivirus kemungkinan besar masuk kedalam kelompok ISF.

2.2.5.2 Cytophatic effects (CPE)

Cytopathic effect (CPE) adalah perubahan morfologi sel hospes akibat

adanya infeksi virus (Albrecht et al., 1996; Suchman and Blair, 2007). Virus yang

menyebabkan CPE dikatakan bersifat cytopathogenic. Beberapa virus dapat

mengakibatkan CPE yang berat dan beberapa virus lainnya tidak menimbulkan

CPE sama sekali. Sebagian besar CPE dapat dilihat langsung dibawah mikroskop

tanpa perlu dilakukan pengecatan dengan menggunakan lensa 10X obyektif, 10X

okular (magnifikasi 100X) dengan menurunkan kondensor dan diafragma

setengah tertutup untuk memperoleh kontras yang bagus untuk melihat sel yang

translucent. Beberapa tipe CPE dapat diamati pada sel kultur, namun untuk

melihat manifestasi infeksi virus seperti inclusion bodies terkadang diperlukan

pengecatan sel pada kultur (Suchman and Blair, 2007).

Karakteristik CPE sebaiknya diobservasi setiap hari pada kultur dengan tetap

menyertakan sel kontrol yang tidak terinfeksi untuk dapat membedakan perubahan

sel yang normal dengan sel yang mengalami CPE. Waktu munculnya CPE juga

dapat digunakan dalam membantu identifikasi virus. Umumnya CPE dikatakan

lambat jika muncul setelah hari ke-4 atau 5 dan dikatakan cepat jika muncul pada

hari ke-1 atau 2 pada kultur yang diinokulasi dengan titer virus yang rendah. Jika

titer virus yang diinokulasi tinggi maka semua CPE akan muncul dalam waktu

49

yang singkat. Flavivirus termasuk ke dalam virus dengan onset CPE lambat,

karena sering muncul setelah hari ke-enam inokulasi (Suchman and Blair, 2007).

Secara umum terdapat tujuh tipe CPE yaitu:

1. Destruksi total

Destruksi total dari sel monolayer adalah merupakan bentuk CPE yang

paling berat. Semua sel tampak opaque (piknosis), tenggelam, dan terlepas dari

plate atau flaskkultur dalam waktu 24-72 jam. Contohnya adalah virus entero

(Suchman and Blair, 2007).

2. Destruksi subtotal

Terjadi perlepasan atau matinya sebagian sel. Contoh beberapa virus toga

(alphavirus), virus picorna, dan virus paramyxo (Suchman and Blair, 2007).

3. Degenerasi fokal

Terbentuk fokal infeksi yang terlokalisasi akibat adanya transfer virus

antar satu sel ke sel yang lain. Tidak terjadi difusi media ekstraseluler. Sel yang

terinfeksi pada awalnya membesar, bentuknya menjadi bulat, refraktil sehingga

mudah terlihat, lalu terlepas dan meninggalkan area jernih yang dikelilingi oleh

sel yang membulat di sekitarnya sesuai dengan penyebaran infeksi yang

terkonsentrikal. Pada akhirnya seluruh monolayer mungkin terkena. Sitoplasma

yang memanjang dan tipis mungkin tampak, begitu pula fusi sel. Pengamatan

CPE fokal atau total dapat dilihat menggunakan pembesaran 4x obyektif

(magnifikasi 400x) (Suchman and Blair, 2007).