BAB I PENDAHULUAN1.1 Latar BelakangTumbuh-tumbuhan mempunyai kedudukan dan peranan yang amat penting dalam kehidupan manusia. Hampir lima dekade terakhir ini timbul ketertarikan yang kuat dalam meneliti tumbuhan sebagai sumber obat-obatan. Ini didasarkan pada beberapa alasan. Pertama, adanya gerakan revolusi hijau yang didasari keyakinan bahwa pengobatan dengan tumbuhan lebih aman dan dapat mengurangi efek samping pada tubuh manusia dibandingkan dengan obat-obatan sintetis. Kedua, adanya fakta bahwa banyak obat-obatan penting yang digunakan sekarang berasal dari tumbuhan Diperkirakan sekitar 30.000 spesies tumbuhan ditemukan di dalam hutan hujan tropika, sekitar 1.260 spesies diantaranya berkhasiat sebagai obat.Salah satu tanaman yang diprediksi memiliki khasiat sebagai obat adalah Lippia nodiflora. Tanaman ini sering disebut frogfruit. Tanaman ini merupakan salah satu tanaman yang diprediksi memiliki senyawa bioaktif terpenoid. Tanaman liar yang tumbuh pada t`anah-tanah yang lembab atau di sepanjang sungai ini tumbuh tersebar luas di Pennsylvania, Florida,Arkankas, Texas, dan California. Selain itu tanaman ini juga dapat ditemukan di Hawaii, Meksiko Tengah, Amerika Selatan, Hindia Barat, Jepang dan India.Agar pengobatan secara tradisional dapat dipertanggungjawabkan, maka diperlukan penelitian ilmiah seperti penelitian di bidang farmakologi, toksikologi, identifikasi dan isolasi zat kimia aktif yang terdapat dalam tumbuhan. Tumbuhan dapat digunakan sebagai obat-obatankarena tumbuhan tersebut menghasilkan suatu senyawa yang memperlihatkan aktifitas biologis tertentu.Senyawa aktif biologis itu merupakan senyawa metabolit sekunder yang meliputi alkaloid, flavonoid, terpenoid dan steroid.Tumbuhan secara alamiah menghasilkan beragam jenis senyawa. Secara umum, senyawa-senyawa tersebut dapat dibagi tiga, yaitu metabolit primer, polimer, dan metabolit sekunder. Metabolit primer adalah senyawa-senyawa yang terdapat pada semua sel dan memegang peranan sentral dalam metabolisme dan reproduksi sel-sel tersebut. Contoh metabolit primer antara lain asam nukleat, asam amino, dan gula. Polimer adalah senyawa penyusun sel yang terdiri dari senyawa yang memiliki berat molekul yang tinggi, seperti selulosa, lignin, dan protein. Metabolit sekunder adalah senyawa yang secara khusus terdapat pada jenis atau spesies tertentu saja (Hanson, 2011).Berbeda dengan senyawa metabolit primer yang pada umumnya memberi pengaruh biologi terhadap sel atau organisme tanaman itu sendiri, metabolit sekunder memberikan pengaruh biologi terhadap sel atau organisme lain. Menurut Wink (2010) metabolit sekunder bukanlah produk buangan yang tak berguna, tetapi perangkat yang penting untuk melawan herbivora dan mikroba. Beberapa metabolit sekunder berfungsi sebagai molekul isyarat untuk menarik arthropoda penyerbuk, hewan penyebar benih, dan sebagai senyawa isyarat dalam hubungan tanaman-tanaman, tanaman-binatang, dan tanaman-mikrobia.Sebagai tanaman yang diprediksi mengandung senyawa terpenoid yang menurut studi digunakan dalam bidang kesehatan. Seperti pengobatan anti inflamasi, analgesik, antipiretik, hepatoprotektif dan masih banyak yang lainnya. Oleh karena itu, di dalam jurnal ini, Lippia nodiflora diisolasi senyawa terpenoidnya untuk selanjutnya digunakan sebagai obat.1.2 Rumusan Masalah Tanaman Lippia nodiflora merupakan salah satu tanaman liar yang diprediksi memiliki senyawa bioaktif terpenoid. Tanaman yang tumbuh liar ini tumbuh pada tanah yang lembab, atau dapat di temukan disepanjang tepi sungai. Rumusan masalah dari jurnal ini adalah bagaimana cara mengisolasi senyawa terpenoid dari tanaman Lippia nodiflora?

1.3 Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk menguji adanya senyawa terpenoid yang terkandung pada tanaman Lippia nodiflora dengan cara isolasi terpenoid dengan metode preparatif HPTLC.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Lippia nodifloraFilum nodiflora (buah katak, gigi gergaji frogfruit, kusut Turki), adalah tanaman hias dalam keluarga Verbenaceae, berasal dari Amerika Selatan dan Amerika Serikat. Lippia nodiflora merupakan tanaman hijau yang tumbuh di tepi sungai di bagian benua afrika dan beberapa daerah tropis dan subtropics.

Gambar 1.1. Tanaman Lippia nodiflora

2.2 TerpenoidBerbagai produk tumbuhan yang mempunyai beberapa sifat umum lipid membentuk beraneka golongan senyawa dengan (atau dibentuk dari) satuan rumus bangun lima karbon yang lazim. Golongan ini dinamakan isoprenoid, terpenoid, atau terpen ( Grayson, 1988; Fraga 1988; Croteau 1988). Tata-namanya beragam , bergantung pada penulisnya, seperti dijelaskan oleh Loomis dan Croteau (1980), tapi banyak penulis menggunakan istilah terpen untuk isoprenoid tanpa oksigen dan merupakan hidrokarbon murni (Robinson 1980). Untuk isopren (C5H8), isoprenoid merupakan satuan isopren dimer, trimer, atau polimer, yang biasanya bergabung dalam bentuk kepala sampai ekor:

Gambar 1.2. Unit IsoprenTerpenoid didefinisikan sebagai senyawa metabolit sekunder yang memiliki struktur molekul yang mengandung kerangka karbon yang terbentuk dari unit-unit isoprena. Sedangkan senyawa isoprena itu sendiri secara alamiah bukanlah precursor untuk pembentukan terpenoid. Isoprena memiliki 5 karbon, sehingga jumlah atom karbon dari terpenoid merupakan kelipatan 5. Degradasi senyawa terpenoid karena proses kimia ataupun biokimia, menyebabkan atom karbon hilang sehingga akan memiliki jumlah atom karbon yang berbeda dengan definisi terpenoid, tetapi secara keseluruhan senyawa ini akan tetap menunjukkan bahwa senyawa ini berasal dari unit isoprena maka senyawa golongan ini masih dapat disebut sebagai senyawa golongan terpenoid. Berdasarkan jumlah kerangka isoprena yang dimilikinya, terpenoid dapat dibedakan atas beberapa kelas antara lain:1. Hemiterpenoid : memiliki 1 unit isoprena (5 karbon)2. Monoterpenoid : memiliki 2 unit isoprena (10 atom karbon)3. Sesquiterpenoid : memiliki 3 unit isoprena (15 atom karbon)4. Diterpenoid : memiliki 4 unit isoprena (20 atom karbon)5. Sesterpenoid : memiliki 5 unit isoprena (25 atom karbon)6. Triterpenoid : memiliki 6 unit isoprena (30 atom karbon)7. Tetraterpenoid : memiliki 8 unit isoprene (40 atom karbon)8. Polisioprenoid : memiliki > 8 unit isoprena (atom karbo lebih dari 40)9. Karotenoid

Berikut merupakan Tabel Klasifikasi Rasional Terpen yang Telah Ditetapkan Berdasarkan Jumlah Unit Isoprene yang Tergabung dalam Kerangka Molekul Dasar.

Sifat umum TerpenoidSifat fisika dari terpenoid adalah :1) Dalam keadaan segar merupakan cairan tidak berwarna, tetapi jika teroksidasi warna akan berubah menjadi gelap2) Mempunyai bau yang khas3) Indeks bias tinggi4) Kebanyakan optik aktif5) Kerapatan lebih kecil dari air6) Larut dalam pelarut organik: eter dan alkohol

Sifat Kimia1) Senyawa tidak jenuh (rantai terbuka ataupun siklik)2) Isoprenoid kebanyakan bentuknya khiral dan terjadi dalam dua bentuk enantiomer.

Berikut beberapa contoh terpenoid:Monoterpen:

2.3 Isolasi

Isolasi adalah suatu usaha bagaimana cara memisahkan senyawa yang bercampur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang murni. Tumbuhan mengandung ribuan senyawa sebagai metabolit primer dan metabolit sekunder. Biasanya proses isolasi senyawa dari bahan alami mengisolasi senyawa metabolit sekunder, karena dapat memberikan manfaat bagi kehidupan manusia.Kandungan senyawa dari tumbuhan dapat diarahkan pada suatu senyawa yang lebih dominan dan salah satu usaha isolasi senyawa tertentu makan dapat dimanfaatkan pemilihan pelarut organic yang akan digunakan pada isolasi tersebut, dimana pelarut polar akan lebih mudah melarutkan senyawa polar dan sebaliknya senyawa non polar lebih mudah larut dalam pelarut non polar.Secara kimia, terpenoid umumnya larut dalam lemak dan terdapat di dalam sitoplasma sel tumbuhan. Biasanya terpenoid diekstraksi dari jaringan tumbuhan dengan memakai eter minyak bumi, eter atau kloroform, dan dapat dipisahkan secara kromatografi pada silika gel atau alumina memakai pelarut di atas (Harborne 1987).Isolasi terpenoid dapat dilakukan dengan cara ekstraksi. Ekstraksi adalah penguraian zat-zat berkhasiat atau zat aktif di bagian tanaman. Tujuannya untuk menarik semua komponen kimia yang terdapat dalam simplisia. Sokletasi adalah suatu metode atau proses pemisahan suatu kompoen yang terdapat dalam zat padat dengan cara penyaringan penyaringan berulang-ulang dengan menggunakan pelrut tertentu, sehingga semua komponen yang diinginkan akan terisolasi.

Gambar 2.1. Ekstraksi Sokletasi

2.4 Metode HPTLCHPTLC adalah metode peningkatan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang menggunakan teknik konvensional KLT dengan cara lebih dioptimalkan. Prinsip kerja HPTLC yaitu pemisahan komponen campuran untuk afinitas yang berbeda untuk fase diam seperti kelarutan diferensial dalam bentuk padat atau cair dan fase bergerak seperti cairan atau gas.

Gambar 3.1. HPTLC

2.5 TLC SCANNER 3 CAMAGTLC SCANNER 3 CAMAG digunakan untuk evaluasi densitometri objek dari bidang kromatografi planar dan elektroforesis.

Gambar 3.2. TLC Scanner 3 CAMAG

BAB IIIMETODOLOGIIsolasi terpenoid terpenoid dengan preparatif metode HPTLC yang diutarakan dalam jurnal sebagai berikut:

3.1 Persiapan SampelTanaman Lippia nodiflora sebagai sampel didapatkan dari kebun Shree Bapalal Vaidhya, yang berlokasi di kampus Veer Narmad, Gujarat utara. Tanaman diambil lalu dicuci. Tanaman dicuci menggunakan air mengalir dan dicuci menggunakan air destilasi. Setelah itu tanaman dikeringkan di dalam oven pada suhu 40 0C selama 3 hari. Lalu tanaman dihaluskan hingga menjadi bubuk. Setelah itu bubuk disaring menggunakan saringan 30 mesh dan disimpan dalam botol bubuk.

3.2 Persiapan EkstrakEkstraksi merupakan proses penarikan senyawa yang ada di daalam tumbuhan, pada proses ekstraksi dipilih pelarut yang kepolaranya mirip dengan sel tumbuhan. Dalam ekstraksi, sampel yang berupa bubuk dilarutkan dengan pelarut metanol. Ekstraksi dilakukan menggunakan sokhlet. Sampel daun dibungkus menggunakan kertas saring, agar hasil ekstraksi tidak menyatu dengan ampasnya. Sampel dimasukkan pada radas sokhletnya. Pelarut dimasukkan ke dalam labu, yang banyaknya 2 kali siklus. Kemudian pasang alat ekstraksi, dan mulai mengekstraksi.

3.3 Pengujian Triterpenoid Menggunakan Metode Kromatografi Lapis TipisSebelum pengujian menggunakan metode kromatografi lapis tipis, dilakukan pengujian adanya triterpenoid. Sebanyak 0.5 ml ekstrak dicampur dengan asetat anhidrida ke dalam tabung reaksi, lalu dipanaskan. Setelah mendidih larutan didinginkan. Kemudian, campuran ditambahkan 1 ml H2SO4 pekat. Jika campuran berubah warna menjadi ungu maka mengindikasikan adanya triterpenoid. Pengujian menggunakan metode kromatografi lapis tipis plat silika gel yang berukuran 3 10 cm. Sebanyak 0.5 ml sampel ditambahkan asetat anhidrida dan dihomogenkan. Lalu, pada plat silika dibuat garis horizontal start di bagian bawah dan garis finish pada bagian atas menggunakan pensil. Selain itu harus diperhatikan cara memegang plat silika. Plat silika tidak boleh dipegang bagian yang akan digunakan untuk menghindari spot lain yang akan terbaca saat pengukuran. Seletah itu, campuran sampel diambil menggunakan pipa kapiler kemudian ditotolkan pada garis start pada plat silika. Penotolan dilakukan sesuai dengan ketebalan yang diinginkan lalu dikeringkan. Eluen disiapkan dengan mencampurkan pelarut heksana, toluena, dan etil asetat dengan perbandingan 2:15:0.5. setelah itu, sebanyak 10 ml eluen dimasukkan kedalam chamber. Setelah selesai plat silika dimasukkan kedalam chamber yang telah berisi eluen. Saat memasukan plat silika perlu diperhatikan bahwa eluen tidak boleh melebihi dari garis start pada plat silika. Setelah itu chamber ditutup dan pemisahan dibiarkan berlangsung sampai eluen mencapai garis finish. Kemudian plat silika dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan. Lalu dibaca spot-spot yang terbentuk dibawah chamber UV pada gelombang 366 nm.

3.4 Pengukuran Triterpenoid Menggunakan Metode Preparatif HPTLC dengan alat CAMAG TLC Scanner 3Pengujian menggunakan metode High Performance Thin Layer Chromatoghraphy dilakukan mengguanakan plat HPTLC dengan ukuran 20 x 10 cm yang terlebih dahulu dipanaskan pada suhu 110 0C selama 30 menit. Setelah itu persiapan eluen dilakukan dengan cara yang sama pada pengujian dengan metode KLT. Eluen dibuat dengan mencampurkan heksana, toluena, dan etil asetat dengan perbandingan 2:15:0.5. Kemudian 10 ml dari campuran eluen dimasukkan kedalam chamber. Setelah itu chamber ditutup dan sampel dimasukan sebanyak 2000 L kedalam CAMAG TLC Scanner 3. Lalu plat dimasukan kedalam CAMAG. Penotolan sampel pada plat dilakukan secara otomatis di dalam CAMAG dengan ketebalan 180 mm. Hasil penotolan berupa pita. Setelah itu tunggu hingga eluen mencapai garis pada plat. Kemudian setelah selesai, hasil dibaca dibawah sinar UV pada gelombang 366 nm.

3.5 Isolasi Kandungan TriterpenoidSetelah elusi selesai plat dikeluarkan dari chamber untuk selanjutnya dilakukan isolasi triterpenoid. Spot hasil dari elusi dikeruk dengan menggunakan scapel, lalu dielusi dengan metanol kedalam tabung. Isi dari tabung di masukkan menjadi satu kesatuan sampel yang diberi kode LN-1. Kelebihan konsentrasi dari metanol dievaporasi dengan menempatkan tabung pada suhu ruang hingga suhu akhir dan ditahan sampai 1/3 dari volume awal. Kode LN-1, pita telah dikonfirmasi dengan menghasilkan kromatogram pada Rf yang sama.

3.6 Konfirmasi Kandungan TritepenoidSetelah selesai pita diisolasi mengunakan metode HTPLC yang digunakan CAMAG Scanner 3 dan dikembangkan konfirmasi menggunakan spektrofotometer UV-VIS dan GC-MS. Pembacaan pada kedua instrumen tersebut menghasilkan bahwa terdapat kandungan triterpenoid dengan satu garis.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASANSkrining fitokimia merupakan analisis kualitatif terhadap senyawa-senyawa metabolit sekunder. Suatu ekstrak dari bahan alam terdiri atas berbagai macam metabolit sekunder yang berperan dalam aktivitas biologinya. Senyawa-senyawa tersebut dapat diidentifikasi dengan pereaksi-pereaksi yag mampu memberi ciri khas dari setiap golongan metabolit sekunder. Berbagai metode yang dapat digunakan untuk identifikasi metabolit sekunder yang terdapat pada suatu ekstrak antara lain dengan cara Kromatografi Lapis Tipis.

4.1 Skiring TerpenoidSenyawa yang akan diidentifikasi dalam jurnal adalah senyawa terpenoid. Hal pertama yang dilakukan adalah skrining terpenoid. Skrining dilakukan dengan proses kromatografi lapis tipis (KLT) yang mengkonfirmasi kemungkinan adanya terpenoid yang ditunjukkan dengan adanya pita biru pada panjang gelombang (360 nm) dari pembacaan dibawah sinar UV dan zona warna ungu dalam tabung reaksi ketika dipanaskan pada suhu 100C selama 5 sampai 10 menit (Hostettman 1998). 4.2 Preparatif HPTLC EkstrakKemudian dilakukan preparatif HPTLC ekstrak. Metode ekstraksi fitokimia merupakan prosedur yang paling penting dalam penggunaan farmasi dari setiap tumbuhan yang diketahui memiliki peranan penting pada obat-obatan tradisional. Preparatif metode HPTLC itu sendiri merupakan salah satu prosedur yang murah namun sangat handal dalam mengumpulkan senyawa murni dari ekstrak tumbuhan mentah. Ekstrak kasar mengungkapkan beberapa pita di Rf yang berbeda dibawah pembacaan oleh scanner KLT (gambar 1 dan 4). Bilangan Rf adalah jarak yang ditempuh senyawa pada kromatografi, nisbi terhadap garis depan. Bilangan Rf diperoleh dengan mengukur jarak antara titik awal dan pusat bercak yang dihasilkan senyawa, dan jarak ini kemudian dibagi dengan jarak antara titik awal dan garis depan (yaitu jarak yang ditempuh cairan pengembang) (Harborne 1987).

Gambar 1. Preparatif HPTLC di 366 nm

4.3 Isolasi Konstituen TerpenoidSkrining co-kromatografi LN-1 oleh HPTLC dengan ekstrak kasar metanol mengungkapkan hasil pembacaan bahwa adanya pita tajam, tunggal, dan berwarna biru yang dianggap adanya triterpenoid pada Rf=0,41 pada panjang gelombang 366 nm (Gambar 2 dan 3).

Gambar 2. HPTLC LN-1 pada panjang gelombang 366 nm

Gambar 3. Skrining Co-kromatografi LN1 dengan ekstrak metanol Lippia nodiflora. LN1 = Fraksi yang dikumpulkan oleh HPTLC preparatif. MCE = metanol ekstrak kasar Lippia nodiflora

Setelah didapatkan Rf dan panjang gelombang untuk triterpenoid, kemudian dilakukan konfirmasi isolasi dari terpenoid. Perbandingan spektrum pada ekstrak kasar di TLC scanner mengungkapkan penyerapan maksimum pita di panjang gelombang 365 sampai 370 nm (Gambar 4); analisis spektrum LN-1 dilakukandengan spektrofotometer UV-Vis pada kisaran panjang gelombang 200-800 nm. Fraksi LN-1 menunjukkan adanya puncak tunggal pada spektrum lengkap pada panjang gelombang sekitar 370-380 nm. Hal ini mengkonfirmasi bahwa benar adanya perkiraan senyawa terpenoid yang terkandung dalam tanaman tersebut.

Gambar 4. HPTLC kromatogram dari LN-1