BAB I

PENDAHULUAN1. A.    Latar Belakang

Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-

komponennya, misalnya senyawa Flavonoida dan isoflavonoida yang terdapat pada tahu, tempe,

bubuk kedelai dan tauco serta Scoparia dulcis, Linderniaanagalis, dan Torenia violacea. Yang pada

senyawa isoflavon memiliki banyak manfaat. Beberapa kelebihan senyawa isoflavon yang potensial

bagi kesehatan manusia,di antaranya adalah sebagai antioksidan, antitumor / antikanker,

antikolesterol, antivirus, antialergi, dan dapat mencegah osteoporosis. Dan semua kromatografi

bekerja berdasarkan metode kromatografi.

Kromatografi juga merupakan pemisahan camuran senyawa menjadi senyawa murninya dan

mengetahui kuantitasnya. Untuk itu, kemurnian bahan atau komposisi campuran dengan kandungan

yang berbeda dapat dianalisis dengan benar. Tidak hanyakontrol kualitas, analisis bahan makanan

dan lingkungan, tetapi juga kontrol danoptimasi reaksi kimia dan proses berdasarkan penentuan

analitik dari kuantitasmaterial. Teknologi yang penting untuk analisis dan pemisahan preparatif pada

campuran bahan adalah prinsip dasar kromatografi.

Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik kromatografi. Pemilihan teknik

kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan.

Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan

fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalirmelalui fase diam dan membawa

komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak

pada laju yang berbeda.

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat di laboratorium kimia. Metode

kromatografi, karena pemanfaatannya, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif.

Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan

kromatografi preparatif hanya dilakukan juka diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan

secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari

molekul. Sifat utama yang terlibat ialah :

1)      Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan)

2)      Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan)

3)      Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian).

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan dilakukan dengan menggunakan salah satu dari

empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah :

Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas Cair (GC) dan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung

pada sifat kelarutan dan keatsirian senyawa yang akan dipisah. KKt dapat digunakan terutama bagi

kandungan tumbuhan yang mudah larut dalam air (karbohidrat, asam amino dan senyawa fenolat),

KLT merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang larut lipid (lipid, steroid,

karotenoid, kinon sederhana dan klorofil), GC penggunannya terutama untuk senyawa atsiri (asam

lemak, mono- dan seskuiterpen, hidrokarbon dan senyawa belerang), cara lain yaitu HPLC, dapat

memisahkan kandungan yang keatsiriannya kecil. HPLC adalah suatu metode yang menggabungkan

keefisienan kolom dan kecepatan analisis.

1. B.     Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang diatas dapat dirumuskan masalah sebagai berikut:

1. Pengertian kromatografi2. Kromatografi Kertas3. Kromatografi Lapis Tipis4. Kromatografi Gas (GC)5. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)6. C.    Tujuan Penulisan

Adapun tujuan penulisan makalah ini adalah:

1. Untuk memenuhi tugas kuliah kimia analitik2. Untuk mengetahui jenis-jenis kromatografi3. D.    Manfaat Penulisan

1. Untuk menjelaskan kepada pembaca tentang kromatografi2. Untuk menjelaskan kepada pembaca tentang prinsip kerja setiap jenis kromatografi3. Untuk memperlihatkan kepada pembaca bentuk dari setiap jenis kromatografi

 

BAB II

KAJIAN TEORI1. A.    Pengertian Kromatografi

Kromatografi secara harfiah terdiri dari dua kata yaitu cromos yang berarti warna dan graphos yang

berarti tulis. Jadi, kromatografi merupakan suatu metode pemisahan fisik senyawa organik dan

anorganik, yang didasarkan atas distribusi diferensial komponen sampel di antara dua fase.

Menurut pengertian ini kromatografi selalu melibatkan dua fase, yaitu fase diam (stationary phase)

dan fase gerak (gerak phase atau fase mobil. Fase diam dapat berupa padatan atau cairan yang

terikat pada permukaan padatan (kertas atau suatu adsorben), sedangkan fase gerak dapat berupa

cairan disebut eluen atau pelarut, atau gas pembawa yang inert. Gerakan fase gerak ini

mengakibatkan terjadinya migrasi differensial komponen-komponen dalam sampel.kromatografi

dibagi diklasifikasikan menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa gerak yang terlibat,

pasangan fasa gerak dan fasa diam, mekanisme pemisahan dan teknik kerja yang digunakan.1. B.     Kromatografi Kertas (KKt)

Kromatografi kertas merupakan bentuk kromatografi yang paling sederhana, mudah dan murah.

Banyak digunakan untuk identifikasi kualitatif  penemunya adalah Martri, Consden

dan Gordon.Fasa diam dalam kromatografi ini berupa air yang terikat pada selulosa kertas

sedangkan fasa geraknya berupa pelarut organic nonpolar. Berdasarkan kedua hal itu kromatografi

kertas dapat digolongkan ke dalam kromatografi partisi. Dalam kromatografi kertas fasa gerak

merembes ke dalam kertas karena efek kapiler. Rembesan fasa gerak pada kertas dapat dilakukan

dengan teknik menaik ( ascending ) atau dengan teknik menurun (descending). Pada teknik menaik

rembesan fasa bergerak kea as sedangkan pada pada tekik menurun rembesan fasa gerak bergerak

ke bawah. Pada teknik menurun fasa gerak disamping bergerak karena efek kapiler juga dibantu oleh

efek gravitasi sehingga rembesan berjalan lebih cepat.

Pelaksanaan teknik ini terbagi pada 3 tahap , yaitu :

1. Penotolan cuplikan2. Tahap pengembangan3. Identifikasi atau penampakan noda.

Pada tahap penotolan cuplikan, prertama-tama siapkan kertas kromatografi dengan ukuran tertentu .

buatlah garis awal dengan jarak 2-3 cm dengan salah satu ujung kertas dengan menggunakan pensil

( karena pensil terdiri dari satu komponen yaitu kabon sehingga tidak mengganggu migrasi dan

pemisahan komponen sampel). Selanjutnya totolkan larutan cuplikan dengan menggunakan

mikropipet atau pipa kapiler pada garis awal tadi, kemudian keringkan.

Pada tahap pengembangan, ujung kertas kromatogram dekat garis awal berisi totolan cuplikan

dicelupkan ke dalam pelarut ( eluen ) yang terdapat di dalm bejana kromatografi . pencelupan

diusahakan tidak merendam totolan cuplikan atau garis awal. Biarkan eluen merembes melalui

totolan cuplikan. Komponen-komponen cuplikan akan terbawa oleh rembesan cuplikan. Perbedaan

kelarutan komponen-komponen cuplikan dalam eluen akan mengakibatkan kecepatan bergerak

komponen-komponen dalam kertas juga berbeda. Perbedaan kecepatan bergerak komponen-

komponen ini lebih umum disebut migrasi diferensial. Hasil pemisahan akan Nampak sebagai noda-

noda berwarna pada kertas dengan jarak yang berbeda-beda dari garis awal. Noda-noda ini

selanjutnya disebut sebagai kromatogram. Perembesan eluen dihentikan setelah eluen hamper

mencapai ujung kertas. Pekerjaan selanjutnya adalah member tanda batas gerakan eluen, dan

kemudian kertas diangkat dari cairan pengelusi untuk seterusnya dikeringkan. Pada tahap identifikasi

atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat langsung diperiksa dan ditentukan

harga Rf nya. Besaran ini (kependekan dari rate of flow) menyatakan derajat retensi atau factor

refensi. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang

ditempuh oleh eluen (fasa gerak). Rf = jarak yang ditempuh komponen/jarak yang ditempuh eluen.

Setiap komponen mempunyai harga Rf sendiri-sendiri. Bila noda tidak berwarna dapat dilakukan hal-

hal sebagai berikut:1. Menyemprot kertas dengan pereaksi penimbul warna seperti ditizon, ninhidrin, kalium kromat,

ammonium sulfide dll.2. Menyinari kertas dengan sinar ultraviolet3. Mendedahkan kertas pada uap iodium4. Menentukan harga Rf nya

Kromatografi kertas sangat berguna untuk pemisahan zat anorganik, organik dan biokimia dalam

jumlah yang sedikit. Sebagai fasa diam umumnya air yang terserap oleh pori-pori kertas. Oleh Karena

itu fasa diam bersifat sedikit polar. Bila diinginkan fasa diam yang lain, maka biasanya kertas akan

dikeringkan, kemudian menggunakan fasa diam seperti glikol, alcohol dll. Jika kertas dilapisi dengan

zat-zat hidrofobik maka kromatografi yang dilakukan adalah kromatografi fasa terbalik ( reversed-

phase-chromatography). Sistem ini berguna untuk pemisahan asam-asam lemak, dan senyawa-

senyawa non polar lainnya, yang mungkin akan terelusi terlalu cepat jika digunakan fasa diam polar

kelarutannya yang rendah.1. C.    Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Menurut Rohman, Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada

tahun 1983. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan

elektroforesis. Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform)

pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik.

Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena

pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi

pada pengembangan secara menurun (descending).

Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaanya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan

kromatografi kolom. Demikian juga dengan peralatan yang digunakan, dalam kromatografi ini

peralatan yang digunakan lebih sederhana.

Keuntungan kromatografi planar adalah:

1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau

dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi

2 dimensi4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan

bercak yang tidak bergerak.

Teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan suatu adsorben yang disalutkan pada suatu

lempeng kaca sebagai fase stasionernya dan pengembangan kromatogram terjadi ketika fase mobil

tertapis melewati adsorben itu. Seperti dikenal baik, kromatografi lapis tipis mempunyai kelebihan

yang nyata dibandingkan kromatografi kertas karena nyaman dan cepatnya, ketajaman pemisahan

yang lebih besar dan kepekaannya tinggi.

Prinsip kromatografi Menurut Stahl mengemukakan kaidah dasar kromatografi jerap yaitu

Hidrokarbon jenuh terjerap sedikit atau tidak sama sekali, karena itu ia bergerak paling cepat.

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang

seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina)

merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi

yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau

campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang merupakan

gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan isolasi pigment tanaman yangberwarna

hijau dan kuningan.

Kromatogram

Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna yangmerupakan sebuah

campuran dari beberapa zat pewarna.Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis: Sebuah garis

menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran

pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk

menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan

bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan

ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak.

Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan

untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan

oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan

beberapa kertas saring yang terbasahioleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap

mencegah penguapan pelarut.Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-

komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan

akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.

Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan

maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase

diam.

 

Fase Diam KLT

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang

seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina)

merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi

yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet.Fase gerak merupakanpelarut atau

campuran pelarut yang sesuai. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium

oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang

jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.

Fase Gerak KLT

Dalam kromatografi, eluent adalah fasa gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan

umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi

antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab

itu pemisahan komponen gula dalam tetes secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan

jumlah umpan.

Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut

tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina

atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut

yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut

yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (jel silika).

 

Deteksi Bercak

Bercak pemosahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk

penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan

adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga

bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan

pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar ultraviolet terutama untuk

senyawa yang dapat berfluoresensi, membuat bercak akan terlihat jelas. Jika senyawa tidak dapat

berfluoresensi maka bahan penyerapnya akan diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian

bercak akan kelihatan hitam sedang latar belakangnyaa akan kelihatan berfluoresensi.

Perhitungan nilai Rf

Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari lempengan

untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada

jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing.Ketika

pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut

ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.

1. D.    Kromatografi Gas (GC)

GC (Gas Chromatography)  yang biasa disebut juga Kromatografi gas (KG) merupakan teknik

instrumental yang dikenalkan pertama kali pada tahun 1950-an. GC merupakan metode yang dinamis

untuk pemisahan dan deteksi senyawa-senyawa organik yang mudah menguap dan senyawa-

senyawa gas anorganik dalam suatu campuran Perkembangan teknologi yang signifikan dalam

bidang elektronik, komputer, dan kolom telah menghasilkan batas deteksi yang lebih rendah serta

identifikasi senyawa menjadi lebih akurat melalui teknik analisis dengan resolusi

yang meningkat.GC menggunakan gas sebagai gas pembawa/fase geraknya. Ada 2 jenis

kromatografi gas, yaitu :1. Kromatografi gas–cair (KGC) yang fase diamnya berupa cairan yang diikatkan pada suatu

pendukung sehingga solut akan terlarut dalam fase diam.2. Kromatografi gas-padat (KGP), yang fase diamnya berupa padatan dan kadang-kadang berupa

polimerik.

Kromatografi gas mempunyai prinsip yang sama dengan kromatografi lainnya, tapi memiliki beberapa

perbedaan misalnya proses pemisahan campuran dilakukan antara stasionary fase cair dan gas fase

gerak dan pada oven temperur gas dapat dikontrol sedangkan pada kromatografi kolom hanya pada

tahap fase cair dan temperatur tidak dimiliki.

Secara rinci prinsip kromatografi adalah udara dilewatkan melalui nyala hydrogen (hydrogen flame)

selanjutnya uap organik tersebut akan terionisasi dan  menginduksi terjadinya aliran listrik pada

detektor, kuantitas aliran listrik sebanding dengan ion.

SISTEM PERALATAN KROMATOGRAFI GAS (GC)1. 1.      Fase gerak

Fase gerak pada GC juga disebut dengan gas pembawa karena tujuan awalnya adalah untuk

membawa solut ke kolom, karenanya gas pembawa tidak berpengaruh pada selektifitas. Syarat gas

pembawa adalah: tidak reaktif; murni/kering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada

detektor; dan dapat disimpan dalam tangki tekanan tinggi (biasanya merah untuk hidrogen, dan abu-

abu untuk nitrogen).

1. 2.      Ruang suntik sampel

Lubang injeksi didesain untuk memasukkan sampel ecara cepat dan efisien. Desain yang populer

terdiri atas saluran gelas yang kecil atau tabung logam yang dilengkapi dengan septum karet pada

satu ujung untuk mengakomodasi injeksi dengan semprit (syringe). Karena helium (gas pembawa)

mengalir melalui tabung, sejumlah volume cairan yang diinjeksikan (biasanya antara 0,1-3,0 μL) akan

segera diuapkan untuk selanjutnya di bawa menuju kolom. Berbagai macam ukuran semprit saat ini

tersedia di pasaan sehingga injeksi dapat berlangsung secara mudah dan akurat. Septum karet,

setelah dilakukan pemasukan sampel secara berulang, dapat diganti dengan mudah. Sistem

pemasukan sampel (katup untuk mengambil sampel gas) dan untuk sampel padat juga tersedia di

pasaran.

Pada dasarnya, ada 4 jenis injektor pada kromatografi gas, yaitu:

1. Injeksi langsung (direct injection), yang mana sampel yang diinjeksikan akan diuapkan dalam injector yang panas dan 100 % sampel masuk menuju kolom.

2. Injeksi terpecah (split injection), yang mana sampel yang diinjeksikan diuapkan dalam injector yang panas dan selanjutnya dilakukan pemecahan.

3. Injeksi tanpa pemecahan (splitness injection), yang mana hampir semua sampel diuapkan dalam injector yang panas dan dibawa ke dalam kolom karena katup pemecah ditutup; dan

4. Injeksi langsung ke kolom (on column injection), yang mana ujung semprit dimasukkan langsung ke dalam kolom.

Teknik injeksi langsung ke dalam kolom digunakan untuk senyawa-senyawa yang mudah menguap;

karena kalau penyuntikannya melalui lubang suntik secara langsung dikhawatirkan akan terjadi

peruraian senyawa tersebut karena suhu yang tinggi atau pirolisis.

1. 3.      Kolom

Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di dalamnya terdapat fase diam. Oleh

karena itu, kolom merupakan komponen sentral pada GC.  Ada 3 jenis kolom pada GC yaitu kolom

kemas (packing column) dan kolom kapiler (capillary column); dan kolom preparatif (preparative

column). Perbandingan kolom kemas dan kolom kapiler dtunjukkan oleh gambar berikut :

                   Kolom Kemas                                         Kolom Kapiler

Kolom kemas terbuat dari gelas atau logam yang tahan karat atau dari tembaga dan aluminium.

Panjang kolom jenis ini adalah 1–5 meter dengan diameter dalam 1-4 mm. Kolom kapiler sangat

banyak dipakai karena kolom kapiler memberikanefisiensi yang tinggi (harga jumlah pelat teori yang

sangat besar > 300.000 pelat). Kolom preparatif digunakan untuk menyiapkan sampel yang murni

dari adanya senyawa tertentu dalam matriks yang kompleks.

Fase diam yang dipakai pada kolom kapiler dapat bersifat non polar, polar, atau semi polar. Fase

diam non polar yang paling banyak digunakan adalah metil polisiloksan (HP-1; DB-1; SE-30; CPSIL-

5) dan fenil 5%-metilpolisiloksan 95% (HP-5; DB-5; SE-52; CPSIL-8). Fase diam semi polar adalah

seperti fenil 50%-metilpolisiloksan 50% (HP-17; DB-17; CPSIL-19), sementara itu fase diam yang

polar adalah seperti polietilen glikol (HP-20M; DB-WAX; CP-WAX; Carbowax-20M) (6).

1. 4.      Detektor

Komponen utama selanjutnya dalam kromatografi gas adalah detektor. Detektor merupakan

perangkat yang diletakkan pada ujung kolom tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang

membawa komponen hasil pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik

yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di dalamnya menjadi sinyal

elektronik. Sinyal elektronik detektor akan sangat berguna untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif

terhadap komponen-komponen yang terpisah di antara fase diam dan fase gerak.

Pada garis besarnya detektor pada KG termasuk detektor diferensial, dalam arti respons yang keluar

dari detektor memberikan relasi yang linier dengan kadar atau laju aliran massa komponen yang

teresolusi. Kromatogram yang merupakan hasil pemisahan fisik komponen-komponen oleh GC

disajikan oleh detektor sebagai deretan luas puncak terhadap waktu. Waktu tambat tertentu dalam

kromatogram dapat digunakan sebagai data kualitatif, sedangkan luas puncak dalam kromatogram

dapat dipakai sebagai data kuantitatif yang keduanya telah dikonfirmasikan dengan senyawa baku.

Akan tetapi apabila kromatografi gas digabung dengan instrumen yang multipleks misalnya GC/FT-

IR/MS, kromatogram akan disajikan dalam bentuk lain.

Beberapa sifat detektor yang digunakan dalam kromatografi gas adalah sebagai berikut :

Jenis detektor Jenis Sampel Batas Kecepatan Alir (mL/menit)

DeteksiGas

PembawaH2

Udara

Hantaran Panas

Senyawa umum

5 – 100 mg 15 – 30 - -

Ionisasi Nyawa Hidrokarbon

10 – 100 pg 20- 60

30 – 60

200 – 500

Penangkap electron

Halogen organik, pestisida

0,05 – pg 30 – 60 - -

Nitrogen – Fosfor

Senyawa nitrogen

organik dan fosfat

organic0,1 – 10 g 20 – 40

1 – 5

700 – 100

Fotometri Nyala (393

nm)

Senyawa-senyawa

sulfur10 –

100 pg 20 – 40

50 – 70

60 – 80

Fotometri Nyala (526

nm)

Senyawa-senyawa

fosfor1 – 10

pg 20 – 40

120 –

170100 – 150

Foto Ionisasi

Senyawa yang

terionisasi dengan UV

2 pg C/detik 30 – 40 - -

Konduktivitas Elektrolik

Halogen, N, S

0,5 pg C

12 pg S

4 pg N 20 – 40 80 -

Fourier Transform- Inframerah

(FTIR)

Senyawa-senyawa organic

1000 pg 3 – 10 - -

Selektif Massa

Sesuai untuk senyawa apapun

10 pg – 10 ng 0,5 – 30 - -

Emisi Atom

Sesuai untuk elemen

apapungas Pembasa

0,1 – 20 pg 60 – 70 - -

1. 5.      Komputer

Komponen GC selanjutnya adalah komputer. GC modern menggunakan komputer yang dilengkapi

dengan perangkat lunaknya (software) untuk digitalisasi signal detektor dan mempunyai beberapa

fungsi antara lain: Memfasilitasi setting parameter-parameter instrumen seperti: aliran fase gas; suhu oven dan

pemrograman suhu; serta penyuntikan sampel secara otomatis. Menampilkan kromatogram dan informasi-informasi lain dengan menggunakan grafik berwarna. Merekam data kalibrasi, retensi, serta perhitungan-perhitungan dengan statistik. Menyimpan data parameter analisis untuk analisis senyawa tertentu.

Cara Kerja

Gas pembawa dialirkan dari tangki bertekanan tinggi melalui alat pengatur tekanan yang dapat

menentukan kecepatan aliran gas pembawa yang akan  mengalir ke komponen yang lain. Sampel

dimasukkan dalam injektor yang dipanaskan agar sampel berubah menjadi gas dan mengalir ke

dalam kolom. Pada kolom campuran zat penyusun mengalami pemisahan proses partisi pada fase

cair melalui detekor yang mengirimkan signal ke recorder setelah mengalami amplifikasi. Bila sampel

berupa cairan dapat dimasukkan dengan syringe, bila berupa gas melalui katup. Sampel masuk

kedala injektor mengalir dengan gas pembawa masuk kedalam kolom.

Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Gas Kelebihan

1.     Waktu analisis yang singkat dan ketajaman pemisahan yang tingga

2.     Dapat menggunakan kolom lebih panjang untuk menghasilkan efisiensi pemisahan yang tinggi

3.     Gas mempunyai vikositas yang rendah

4.     Kesetimbangan partisi antara gas dan cairan berlangsung cepat sehingga analisis relatif cepat

dan sensitifitasnya tinggi

5.     Pemakaian fase cair memungkinkan kita memilih dari sejumlah fase diam yang sangat beragam

yang akan memisahkan hampir segala macam campuran.

Kekurangan

1.     Teknik Kromatografi gas terbatas untuk zat yang mudah menguap

2.     Kromatografi gas tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah besar.

Pemisahan pada tingkat mg mudah dilakukan, pemisahan pada tingkat gram mungkin dilakukan,

tetapi pemisahan dalam tingkat pon atau ton sukar dilakukan kecuali jika ada metode lain.

3.     Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak bersifat reaktif terhadap fase diam dan zat

terlarut.

1. E.     Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)2. A.    Prinsip Dasar HPLC

Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui

kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di

dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan

interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.

Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu.

Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan

keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas.

Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.

Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah

data hasil pengukuran HPLC.

B. Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi

Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi, yaitu:1. 1.      Fasa Gerak

Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut. Berbeda

dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan

fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa

solute melewati kolom menuju detektor. Sebaliknya dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi

membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan

solute-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu

keberhasilan proses pemisahan.

Persyaratan fasa gerak HPLC

Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan

berikut:

1)      Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis.

2)      Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu

interpretasi kromatogram.

3)      Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.

4)      Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.

5)      Zat cair tidak kental.

6)      Sesuai dengan detektor.

Jenis fasa gerak

Fasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa

gerak berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat

dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non

interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi

fasa gerak.

1. 2.      Pompa

Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk

mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan

dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :

1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/in2)2. Keluaran bebas pulsa3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit4. Bahan tahan korosi

Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki kenutungan  dan kekurangannya  yaitu

pompareciprocating, displacement dan pneumatic.1. Pompa reciprocating

Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut.

2. Pompa displacementPompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (~250 mL) dan tidak mudah untuk melakukan pergantian pelarut.

3. Pompa pneumaticDalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.

4. 3.      Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel

Kadang kala, faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada keterulangan pemasukan

cuplikan ke dalam peking kolom. Masalahnya, kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom

dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil

mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika

memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke

dalam sistem HPLC :

1. Injeksi SyringeAlat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.

1. Injeksi ‘stop-flow’

Injeksi stop-floe adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara,

sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom.

Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.

1. Kran CuplikanJenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi ‘load’, cuplikan masih berada dalam loop, (b) kran diputar untuk mengubah posisi ‘load’ menjadi posisi ‘injeksi’ dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500μL. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5 hingga 5 μL.

2. KolomKolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fas diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya.

3. Detektor

Berbagai detektor untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikian detektor harus memenuhi

persyaratan berikut: (1) cukup sensitive; (2)stabilitas dan keterulangan tinggi;(3) respon linear

terhadap solute; (4) waktu respon pendek sehinggatidak bergantung kecepatan alir ;(5)realibilitas

tinggi dan mudah digunakan; (6) tidak merusak cuplikan. Detektor HPLC dikelompokan ke dalam tiga

jenis, yaitu: detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanaya

solute. Sebaliknya, detektor sepesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solute yang tidak

dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yang bersifat umum terhadap solute setelah fasa gerak

dihilangkan dengan penguapan. Detektor berdasarkan absorpsi UV merupakan detektor HPLC yang

paling banyak di pake. Detektor elektrokimia paling banyak dipakai terutama

dalam HPLC penukar ion.

1. C.                Cara Kerja HPLC

Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi

berbutar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel dimasukan

ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil

pemisahan dideteksi oleh detektor, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat =

recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solven

pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa

milliliter per menit.

Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel.

Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali

diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini terutama sering dilakukan untuk

analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam

makanan.

Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau C18 yang

terikat pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian langsung

dimasukan kedalam kolom. Suatu solven dengan polaritas rendah, misalnya CH3 berair yang secara

bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH murni, menjamin pemisahan yang baik pada C-18

yang terikat pada silica gel.

D. Kelebihan HPLC

Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High

Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. Beberapa kelebihan KCKT

diantaranya ialah1. Dapat dilaksanakan pada suhu kamar.2. Cepat dan mudah melaksanakannya.3. Peka, detektor HPLC dapat divariasi dan unik.4. Pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya.5. Ideal untuk molekul besar dan ion.6. Mudah memperoleh cuplikan.7. Daya pisahnya baik.8. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis.9. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil.10. E.     Aplikasi HPLC Dalam Kehidupan

HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran

yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi

golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-

komponennya.

HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa

jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di

daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak.

Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100 cm),

dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat

diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan.

Cuplikan dapat dipisahkan secara preparatif.

DAFTAR PUSTAKA

Hendayana, Sumar. 2006,  Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektrolisis Modern,

Bandung: PT.  Remaja Rosdakarya