BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangSterilisasi merupakan proses penting yang harus dilalui sebelum bekerja dengan mikroorganisma. Sterilisasi dilakukan pada semua alat dan bahan yang akan digunakan dalam percobaan, baik peralatn laboratorium maupun medium pertumbuhan mikroba. Melalui sterilisasi, seluruh mikroba pathogen dapat mati, sehingga tidak sempat berkembang biak.Sterilisasi didefinisikan sebagai suatu usaha mengeliminasi semua kehidupan mikroba yang ada pada bahan/ produk yang dikehendaki. Proses sterilisasi yang kurang tepat hanya akan menghasilkan steril sebagian (partial sterility) yang berarti masih terdapat mikroba yang dapat tumbuh dan berkembang setelah proses sterilisasi dilakukan.Proses sterilisasi dapat dilakukan dengan menggunakan proses fisik atau dengan menggunakan bahan kimia, seperti NaCl 9%, KNO3 10%, HgCl2 0,1%, HCl 1,1%.Proses fisik sterilisasi dilakukan dengan metode pemanasan dan tanpa pemanasan. Metode dengan pemanasan meliputi pemanasan kering dan pemanasan basah dengan menggunakan uap air.

1.2 Tujuan PercobaanSetelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan mampu :1. Menguasai teknik sterilisasi media dengan menggunakan panas pada proses batch dan kontinyu2. Memahami pengaruh variasi laju alir pada proses sterilisasi kontinyu3. Memahami pengaruh temperatur terhadap kematian mikroba pada proses sterilisasi batch4. Menentukan nilai konstanta laju kematian mikroba (Kd), desimal reduction time atau destruction value (D), dan konstanta Arhenius (Ed) pada proses sterilisasi batch dan kontinyu. BAB IILANDASAN TEORI

2.1 SterilisasiSterilisasi merupakan upaya untuk meminimalisasi gangguan mikroorganisme dengan cara menghilangkan seluruhnya (bakteri, jamur, parasit, virus, termasuk bakteri endospora). Sterilisasi menjadi hal yang sangat penting dalam berbagai proses bioteknologi, salah stunya dalam proses fermentasi. Meskipun proses fermentasi melibatkan mikroorganisme, namun seringkali kehadiran mikroorganisme lain (kontaminan) tetap mengganggu. Hal ini karena:1. Medium akan menumbuhkan semua mikroba yang ada (mikroba target dan kontaminan) sehingga produk yang dihasilkan menjadi sangat beragam. Tentu saja hal ini sangat merugikan karena selain mengurangi produktivitas juga menyulitkan dalam proses isolasi.2. Jika proses fermentasi dilanjutkan dalam keadaan banyak kontaminan, maka kemungkinan produk yang dihasilkan oleh kontaminan menjadi lebih dominan dan mendesak produk mikroba target hingga dapat menghilangkannya.3. Kontaminasi pada produk akhir dapat menurunkan kualitas produk, bahkan mungkin dapat membahayakan manusia4. Kontaminan dapat merusak produk yang diinginkan5. Kontaminasi dari suatu fermentasi bakteri dengan phage dapat me-lisis kultur.Untuk menghindari halhal tersebut di atas, langkah antisipasi yang dapat dilakukan antara lain dengan:a. Penggunaan inokulum murni dalam fermentasib. Sterilisasi medium: merupakan proses yang bertujuan untuk menghilangkan semua jenis makhluk hidup yang ada dalam media, dilakukan sebelum inokulasi kultur.c. Sterilisasi ruang fermenter: Penghilangan semua bentuk makhluq hidup dari ruang fermentor, termasuk udara secara kontinyud. Sterilisasi semua bahan yang digunakan dalam keseluruhan proses fermentasie. Penjagaan kondisi aseptis selama fermentasi

Fermentasi dapat dilakukan baik secara fisika, kimia, maupun radiasi. Sterilisasi secara fisika dapat dilakukan dengan membunuh mikroba atau sekadar mencegah mikroba masuk kesistem kita. Sterilisasi fisik dengan membunuh mikroba dapat dilakukan dengan penggunaan panas, freezing (pembekuan), penggunaan garam berkonsentrasi tinggi, dll. Sementara sterilisasi fisik tanpa membunuh mikroba dapat dilakukan dengan filtrasi. Filtrasi merupakan upaya untuk meminimalisasi kontaminasi mikroorganisme dengan cara menyaring sesuatu dengan filter berukuran tertentu sehingga sebagian mikroba tidak dapat melewatinya. Cara ini tidak membunuh mikroba yang ada, hanya meminimalisasi agar mikroba tidak terbawa.Namun, dalam proses fermentasi, cara sterilisasi fisik yang paling mungkin dilakukan adalah dengan filtrasi dan penggunaan panas, baik panas basah maupun panas kering. Sterilisasi panas basah seringkali digunakan untuk sterilisasi media dan bahanbahan lainnya sementara panas kering untuk sterilisasi alatalat. Faktorfaktor yang mempengaruhi sterilisasi panas antara lain: 11

Jenis dan jumlah kontaminan yang hendak dihilangkan Morfologi mikroorganisme Komposisi media fermentasi pH Ukuran partikel tersuspensi Temperatur yang digunakan Durasi proses sterilisasi Keberadaan air

2.2 Jenis-jenis SterilisasiSterilisasi panas dapat dilakukan secara batch maupun kontinyu.a. Sterilisasi BatchSterilisasi sistem batch dapat dilakukan dengan cara menginjeksikan uap panas ke dalam mantel fermentor ayau coil yang terdapat pada bagian dalam fermentor. Cara ini disebut metode tidak langsung. Atau dengan cara menghilangkan uap panas langsung ke dalam larutan medium (metode langsung). Metode langsung membutuhkan uap panas murni, yaitu bebas dari bahan kimia tambahan seperti senyawa antikarat yang panyak digunakan dalam proses produksi uap. Di samping itu, metode langsung akan mengakibatkan bertambahnya volume cairan media dalam fermentor karena adanya kondensasi uap yang digunakan.

b. Sterilisasi KontinyuSite mini memberikan keuntungan berupa minimalnya kemungkinan kerusakan medium tetapi mengkinsumsi banyak energi. Temperature yang dibutuhkan untuk sterilisasi sistem ini adalah 140oC dengan waktu hanya 30 hingga 120 detik. Alat yang digunakan dapat berupa continues plate heat exchange dan continues injection flash cooler. Kelebihan continues injection flash cooler antara lain: Dapat digunakan untuk media yang mengandung bahan padat tersuspensi Biaya lebih murah Mudah dibersihkan Pemanasan dan pendinginan lebih cepat Penggunaan uap lebih efisienAdapun Kekurangannya antara lain: Dapat terbentuk buih saat pemanasan dan pendinginan Adanya kontak langsung antara media dan uap panas yang murni, yaitu bebas dari bahan anti karat.

2.3 Kinetika Kematian MikrobaProses panas secara komersial umumnya didesain untuk menginaktifkan mikroorganisme yang ada pada makanan yang dapat mengancam kesehatan manusia dan mengurangi jumlah mikroorganisme pembusuk ke tingkat yang rendah, sehingga peluang terjadinya kebusukan sangat rendah. Dalam desain proses termal, ada dua hal yang harus diketahui, yaitu karakteristirk ketahanan panas mikroba dan profil pindah panas dari medium pemanas ke dalam bahan pada titik terdinginnya. Karakteristik ketahanan panas dinyatakan dengan nilai D dan nilai Z. Untuk mencapai level pengurangan jumlah mikroba yang diinginkan, amaka ditentukan siklus logaritma pengurangan mikroba. Kemudian dihitung nilai sterilitasnya pada suhu tertentu (Fo). Nilai Fo ini ditentukan sebelum proses termal berlangsung. Nilai Fo dapat dihitung pada suhu standar atau pada suhu tertentu, dimana untuk menghitungnya perlu diketahui nilai D dan nilai Z (Kusnandar, 2008).

Nilai D menyatakan ketahahanan panas mikroba atau sensitifitas mikroba oleh suhu pemanasan. Nilai D didefinisikan sebagai waktu dalam menit pada suhu tertentu yang diperlukan untuk menurunkan jumlah spora atau sel vegetatif tertentu sebesar 90% atau satu logaritmik. Setiap mikroba memiliki nilai D pada suhu tertentu. Semakin besar nilai D suatu mikroba pada suatu suhu tertentu, maka semakin tinggi ketahahan panas mikroba tersebut pada suhu yang tertentu. Nilai D umumnya dinyatakan pada suhu standar. Untuk bakteri mesofilik atau termofilik umumnya menggunakan suhu standar 121oC, sedangkan untuk sel vegetatif, khamir, atau kapang umumnya menggunakan suhu yang lebih rendah (80-100C). Nilai D pada suhu standar ini sering dituliskan dengan nilai Do (Anonim, 2009).

Faktor-faktor yang mempengaruhi efektifitas proses thermal pencapaian kecukupan proses panas sangat dipengaruhi oleh banyak faktor. Oleh karena itu, faktor-faktor yang mempengaruhi proses termal harus dikontrol dengan baik dan dikendalikan. Berdasarkan persyaratan pendaftaran ke FDA, terdapat faktor-faktor kritis yang dapat mempengaruhi proses pemanasan dan sterilisasi, yang dapat berbeda antara satu produk dengan produk lainnya. Di antara faktor-faktor kritis yang perlu diidentifikasi pengaruhnya adalah: (a) karakteristik bahan yang dikalengkan (pH keseimbangan, metode pengasaman, konsistensi/viskositas dari bahan, bentu/ukuran bahan, aktivitas air, persen padatan, rasio padatan/ cairan, perubahan formula, ukuran partikel, jenis pengental, jenis pengawet yang ditambahkan, dan sebagainya), kemasan (jenis dan dimensi, metode pengisian bahan ke dalam kemasan), (b) proses dalam retort (jenis retort, jenis media pemanas, posisi wadah dalam retort, tumpukan wadah, pengaturan kaleng, kemungkinan terjadinya nesting (Anonim c, 2008).

Jenis dan spesies mikroba berpengaruh terhadap perlakuan panas pada proses sterilisasi. Tabel 2.1 menunjukan ketahanan relative beberapa jenis mikroba terhadap panas yang tinggi. Mikroba yang membentuk spora lebih tahan terhadap pemanasan basah yang paling tinggi jika dibandingkan dengan beberapa jenis mikroba yang lain. Siklus sterilisasi dapat dirancang berdasarkan pemusnahan spora bakteri, sehingga mikroba jenis lain aka mati secar bersamaan. Suhu yang semakin tinggi pada proses sterilisasi maka waktu yang dibutuhkan untuk mematikan spora akan semakin berkurang.

Tabel 2.1 Ketahanan Relatif Berbagai Mikroba Terhadap Panas BatchJenis MikrobaKetahanan Relatif Terhadap Panas

Bakteri vegetative dan khamir1

Virus dan bakteriofage1-5

Spora kapang2-10

Spora bakteri3 x 106

Sumber : J.H (ed), 1988, Chemical Engineers Hand Book

Tabel 2.2. Pengaruh Suhu Dan Waktu Sterilisasi Terhadap Kematian SporaSuhu Sterilisasi (oC)Waktu yang Diperlukan untuk Mematikan Spora (menit)

11630

11818

12112

1258

1322

1380,8

Sumber : J.H (ed), 1988, Chemical Engineers Hand Book

Pengaruh waktu sterilisasi terhadap jumlah spora yang bertahan menunjukan karakteristik yang berbeda-beda. Karakteristik mikroba atau termofilik pada awal proses sterilisasi mengalami peningkatan populasi spora kemudian dengan bertambahnya waktu sterilisasi spora yang hidup semakin berkurang. Panas yang diberikan pada awal proses justru akan meningkatkan populasi mikroba termofil dan setelah temperature pemanasan mencapai temperature yang mengakibbatkan kematian mikroba (lethal temperature), maka secara perlahan jumlah mikroba yang hidup berkurang.

Bailey & Ollis, (1986) menyatakan bahwa kematian jumlah mikroba oleh pemanasan dapat mengikuti persamaan linear orde -1.Persamaannya :.(2.1)N= jumlah mikrobaT= waktu pemanasanKd= konstanta laju kematian mikrobaIntegrasi persamaan 2.1 menjadi :.(2.2)N0= jumlah mikroba sebelum pemanasan pada t = 0Nt = jumlah mikroba setelah pemanasan periode tLogaritma normal persamaan 2.2 memberikan korelasi linear terhadap waktu,.(2.3)N0 sering disebut level kontaminasi (jumlah mikroba sebelum pemanasan kontaminasi mikroba sebelum disterilisasi ) dan Nt adalah level sterilisasi.Dalam proses sterilisasi dikenal istilah decimal reduction time atau destruction value (D) yang didefinisikan sebagai waktu yang dibutuhkan dalam meit pada suhu tertentu untuk mengurangi jumlah sel vegetative atau spora sehingga mikroba yang bertahan berkurang menjadi 1/10, sehingga persamaan 2.2 dapat dituliskan :.(2.4).(2.5)Nilai konstanta laju kematian mikroba (kd) bergantung pada temperatur, mengikuti persamaan Arhenius: .(2.6).(2.7)Apabila nilai ln kd dialurkan terhadap 1/T maka akan diperoleh sebuah garis lurus gradient Ed/R.

BAB IIIMETODOLOGI PERCOBAAN1. 1. 1. 3.1 Alat dan Bahan yang Digunakan3.1.1 Teknik Sterilisasi Media Secara BatchTabel 3.1 Alat dan Bahan Teknik Sterilisasi Media Secara BatchNo.AlatBahan

1.Beker glassSukrosa 12 gram

2.Water bathYeast extract 3 gram

3.Hot platePepton 6 gram

4.Tabung reaksi steril 13 buahFermipan

5.MikroskopMethylen blue

6.Kaca preparat + cover glassAlkohol

7.Pembakar spiritusEs

8.Pipet tetesAquadest

9.Pipet ukur 10 ml steril 3 buah

10.Spatula

3.1.2 Teknik Sterilisasi Media Secara KontinyuTabel 3.2 Alat dan Bahan Teknik Sterilisasi Media Secara KontinyuNo.AlatBahan

1.Beker glassSukrosa 12 gram

2.Water bathYeast extract 3 gram

3.Hot platePepton 6 gram

4.Tabung reaksi steril 13 buahFermipan

5.MikroskopMethylen blue

6.Kaca preparat + cover glassAlkohol

7.Pembakar spiritusEs

8.Pipet tetesAquadest

9.Spatula

10.Coil tembaga

11.Pompa peristaltik

12.Selang

13.Gelas ukur 100 ml

3.2 Diagram Alir Percobaan3.2.1 Pembuatan Media Pertumbuhan Teknik Sterilisasi Media Batch dan Kontinyu

Pencampuran(dalam erlenmeyer 2 Liter)24 gr Sukrosa6 gr Yeast extract12 gr PeptonPembagian larutan(dalam erlenmeyer 1000 ml 2 buah@600 ml)1200 ml AquadestPenyimpanan(dalam lemari pendingin)Pencampuran(H-1 praktikum)Fermipan seujung spatulaInokulasi(dalam inkubator shaker)Media Pertumbuhan

3.2.2 Teknik Sterilisasi Media Secara BatchPemanasan(dalam water bath)Aquades(dalam beker gelas 250 ml)Pemindahan biakan(ke tabung reaksi 13 buah@10 ml)Pemanasan tabung biakan(pada T1, T2, T3 @t1, t2, t3, t4)1 tetes Methylen blue

Pendinginan(dalam beker gelas berisi es)Pengamatan dan penghitunganjumlah sel hidup dan sel mati(dibawah mikroskop secara duplo)

Persiapan untuk pengamatan(pada kaca preparat)1 tetes Sampel

3.2.3 Teknik Sterilisasi Media Secara Kontinyu3.2.3.1 Kalibrasi Laju AlirPerangkaian alatPengaturan skala pompa(pada 60%, 65%, 70%, 75%@2 kali)Penyalaan pompa peristaltikPenampungan cairan dan pengamatan waktu

3.2.3.2 Penentuan Volume CoilPengisian coil dengan airPenampungan dan Pengukuran volume air(dalam coil dengan gelas ukur)Perendaman coil dan Pengukuran panjang coil yang tidak terendam dan diameter coilPerhitungan voulme coil(Volume air yang tertampung - Volume coil yang tidak terendam)

3.2.3.3 Proses Sterilisasi Media Secara KontinyuPemanasan water bath(pada T1, T2, T3 @1, 2, 3, 4)

Penampungan media pada aliran keluaran(dalam tabung reaksi steril)

Pendinginan(dalam beker gelas berisi es)Pengamatan dan penghitunganjumlah sel hidup dan sel mati(dibawah mikroskop secara duplo)

Persiapan untuk pengamatan(pada kaca preparat)1 tetes Sampel

1 tetes Methylen blue

BAB IVHASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN4.1 Data Pengamatan4.1.1. Sterilisasi BatchTabel 4.1 Data Pengamatan Sampel Sebelum Pemanasan Metoda BatchSel Hidup (Nt)Sel MatiJumlah Sel Total (N0)

JumlahFraksiJumlahFraksi

1140.96640.034118

136100136

Tabel 4.2 Data Pengamatan Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati pada Sterilisasi Batch T1 : 40 CNot-MenitSel Hidup (Nt)Sel MatiJumlah Sel Total (N0)

JumlahFraksiJumlahFraksi

17

1060,86980,066122

1130,9560,050119

214

1230,97630,024126

1200,94570,055127

321

1220,924100,076132

1140,891140,109128

428

1020,895120,105114

1310,834260,166157

Tabel 4.3 Data Pengamatan Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati pada Sterilisasi Batch T1 : 50 CNot-MenitSel Hidup (Nt)Sel MatiJumlah Sel Total (N0)

JumlahFraksiJumlahFraksi

17

1130,904120,096125

1200,876170,124137

214

1050,84200,16125

1180,808280,192146

321

1000,8250,2125

1000,813230,187123

428870,837170,163104

570,648310,35288

Tabel 4.2 Data Pengamatan Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati pada Sterilisasi Batch T1 : 60 CNot-MenitSel Hidup (Nt)Sel MatiJumlah Sel Total (N0)

JumlahFraksiJumlahFraksi

17

570,671280,32985

1080,788290,212137

214

660,667330,33399

490,590340,4183

321

280,359500,64178

560,589390,41195

428

40,074500,92654

10,017580,98359

4.1.2. Sterilisasi KontinyuTabel 4.5 Data Pengamatan Sampel Sebelum Pemanasan Metoda Kontinyu T0 = 25oCNoJumlah Sel Hidup (Nt)Jumlah Sel MatiJumlah Sel Total (N0)

11324136

Tabel 4.6 Data Pengamatan Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati pada Sterilisasi Kontinyu T1 : 45 CNoSkala Pompa (%)Jumlah Sel Hidup (Nt)Jumlah Sel MatiJumlah Sel Total (N0)Fraksi Sel Hidup (Xh)Fraksi Sel Mati (Xm)Fraksi Sel Total

160111 -0,05361170,9480,0531

265246 -0,03692550,9650,0361

37042 -0,1125470,8940,0111

47566 -0,0735710,9290,0741

Tabel 4.7 Data Pengamatan Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati pada Sterilisasi Kontinyu T1 : 50 CNo% Skala Pompa (%)Jumlah Sel Hidup (Nt)Jumlah Sel MatiJumlah Sel Total (N0)Fraksi Sel Hidup (Xh)Fraksi Sel Mati (Xm)Fraksi Sel Total

160199 -0,183402390,8330,1671

26556 -0,23715710,7880,2111

370217 -0,121282450,8860,1141

47565 -0,15611760,8550,1451

Tabel 4.8 Data Pengamatan Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati pada Sterilisasi Kontinyu T1 : 55 CNo% Skala Pompa (%)Jumlah Sel Hidup (Nt)Jumlah Sel MatiJumlah Sel Total (N0)Fraksi Sel Hidup (Xh)Fraksi Sel Mati (Xm)Fraksi Sel Total

16048 -0,70449970,4950,5051

26598 -0,227251230,7970,2031

370155 -0,127211760,8810,1191

47576 -0,1129850,8940,1061

4.2 Pengolahan Data4.2.1. Sterilisasi Batch(simpen dilampiran) Tabel 4.9 Hasil perhitungan Ln T (oC)t (menit)Ln Rata-rata (Ln )

407-0,141-0,096

-0,052

14-0,024-0,04

-0,057

21-0,079-0,097

-0,116

28-0,111-0,146

-0,181

507-0,101-0,117

-0,132

14-0,174-0,194

-0,213

21-0,223-0,215

-0,207

28-0,178-0,306

-0,434

607-0,4-0,319

-0,238

14-0,405-0,466

-0,527

21-1,025-0,777

-0,529

28-2,603-3,34

-4,078

Gambar 4.1 Kurva Ln terhadap t (waktu) untuk variasi suhu berbeda

Tabel 4.10 Kd, ln Kd, dan 1/T untuk Sterilisasi BatchT (oC) (oC)KdLn KdD

400,0250,005-5,298460,517

500,0200,0113-4,483203,768

600,0160,0807-2,51728,533

Gambar 4.2 Grafik Hubungan ln Kd terhadap 1/T untuk Sterilisasi BatchPerhitungan Ed :Y = -303,02x + 2,062Berdasarkan persamaan :

Maka, = 303,02Ed = -303,02x 0,082Ed= -24,847

4.2.2. Sterilisai KontinyuTabel 4.11 Hasil perhitungan Q dan No% Skala Pompa (%)Volume (ml)Waktu (detik)Q (ml/detik)Q = (detik) =

1607,14600,119213,622

26510,3600,172147,796

37012600,200127,105

47512,5600,208122,216

Volume Pipa Spiral

Spesifikasi coil:Banyak lilitan: 26 lilitanDiameter: 0.3 cmh coil tidak tercelup 1: 4,8 cmh coil tidak tercelup 2: 3,4 cmVolume spiral: 26 mLVterendam: 25,421 mL

Perhitungan ln untuk variasi suhu berbeda:Tabel 4.12 Hasil perhitungan Ln T (oC)% Skala pompa (%)Ln

4560 -0,053

65 -0,036

70 -0,112

75 -0,073

5060 -0,183

65 -0,237

70 -0,121

75 -0,156

5560 -0,704

65 -0,227

70 -0,127

75 -0,112

Tabel 4.13 % Skala Pompa, Ln dan (waktu) untuk T = 45oCNo% Skala Pompa (%)Ln Nt/No (detik)

160-0,053213,622

265-0,036147,796

370-0,112127,105

475-0,073122,216

Tabel 4.14 % Skala Pompa, Ln dan (waktu) untuk T = 50oCNo% Skala PompaLn Nt/No (Waktu Tinggal) detik

160 -0,183213,622

265 -0,237147,796

370 -0,121127,105

475 -0,156122,216

Tabel 4.15 % Skala Pompa, Ln dan (waktu) untuk T = 55oCNo% Skala PompaLn Nt/No (Waktu Tinggal) detik

160 -0,704213,622

265 -0,227147,796

370 -0,127127,105

475 -0,112122,216

Gambar 4.3 Kurva Ln terhadap (waktu tinggal) Tabel 4.16 Kd, Ln Kd, dan 1/T untuk Sterilisasi KontinyuT (oC)Kd Ln Kd1/TD

450,0004-7,8240,0225756,463

500,0011-6,8120,0202093,259

550,0022-6,1190,0181046,629

Gambar 4.4 Kurva ln Kd terhadap 1/T untuk Sterilisasi KontinyuPerhitungan Ed:y = 430,75x - 1,6907Berdasarkan persamaan :

Maka, = 430,75Ed = -430,75x 0,082Ed= -35,3215

4.3 Pembahasan4.3.1 Aas Nurhasanah (NIM. 131411001)Sterilisasi merupakan proses penting yang harus dilalui sebelum bekerja dengan mikroorganisme. Sterilisasi didefinisikan sebagai suatu usaha mengeliminasi semua kehidupan mikroba yang ada pada bahan/produk yang dikehendaki. Praktikum kali ini praktikan melakukan teknik sterilisasi media secara batch dan kontinyu dan akan didapatkan juga kinetika kematian dari masing-masing teknik sterilisasi media secara batch dan kontinyu. Tujuan dari percobaan ini adalah menguasai teknik sterilisasi media dengan menggunakan panas pada proses batch dan kontinyu, memahami pengaruh variasi laju alir (pada sterilisasi kontinyu) dan temperature pada proses sterilisasi batch dan kontinu, dan menentukan nilai konstanta laju kematian mikroba (Kd), decimal reduction time atau destruction value (D), dan energi aktivasi (Ed) pada proses sterilisasi batch dan kontinyu.1. Teknik Sterilisasi Media Secara BatchSterilisasi secara batch dilakukan dengan mensterilisasi media pada suhu dan waktu tertentu. Pada teknik sterilisasi batch, prosesnya relatif sederhana, dan proses pemanasan serta pendinginan dapat dilakukan dalam satu waktu perioda. Namun, proses pemanasan serta pendinginan pada sterilisasi batch, berlangsung lambat, hingga mengakibatkan kematian mikroba (lethal temperature). Pada proses sterilisasi batch, dihitung jumlah sel yang mati dan jumlah sel yang hidup setelah melalui proses pemanasan dan pendinginan. Bakteri yang digunakan adalah Saccharomyces cerevisiae. Sebelum memulai sterilisasi media, alat-alat telah terlebih dahulu di sterilisasi. Sterilisasi dilakukan sekali run pada suatu water bath dengan suhu 40oC, 50oC, dan 60oC. Variasi waktu yang digunakan pada setiap suhu adalah 7 menit, 14 menit, 21 menit dan 28 menit. Media dimasukan ke dalam tabung reaksi secara aseptis agar sampel tidak terkontaminasi. Setelah dilakukan pemanasan kemudian dilakukan pedinginan dengan memasukan media ke dalam beaker glass yang berisi es yang berfungsi agar mikroba tidak aktif/tidak bergerak sehingga mempermudah penghitungan jumlah mikroba yang hidup dan yang mati saat dilihat dengan menggunakan mikroskop. Pada saat akan memulai penghitungan mikroba, sampel dihomogenisasi terlebih dahulu menggunakan suatu alat agar sampel yang mengendap menjadi homogen sehingga mikroba merata di seluruh tempat dalam tabung reaksi. Kemudian sampel diteteskan ke dalam kaca preparat secara aseptis lalu ditambahkan pula satu tetes methylen blue ke dalamnya yang berfungsi untuk membedakan mikroba yang mati dan mikroba yang hidup. Pada mikroba yang sudah mati akan berwarna biru, hal ini dikarenakan sistem kekebalan mikroba itu sudah mati sehingga metylen blue dengan mudahnya akan masuk ke dalam sel mikroba tersebut sedangkan mikroba yang masih hidup akan tetap bening karena dinding sel mikroba masih aktif sehingga tidak ada methylen blue yang mengkontaminasi juga dapat mempermudah penghitungan jumlah mikroba yang sudah mati dan yang masih hidup.Jumlah kematian mikroba pada teknik sterilisasi media secara batch dapat dihitung dengan membuat grafik ln Nt/No terhadap waktu pemanasan (t) sehingga akan diperoleh nilai k sebagai slope nya. Berdasarkan grafik, diperoleh nilai kd (konstanta laju kematian mikroba) dan dari nilai kd dapat dihitung pula nilai D (decimal reduction time). Nilai D adalah waktu yang dibutuhkan dalam menit pada suhu tertentu untuk mengurangi jumlah sel vegetatif atau spora sehingga mikroba yang bertahan berkurang menjadi 1/10, yakni:Tabel 4.17 Perolehan Nilai kd dan D Pada Berbagai SuhuSuhu (oC)Konstanta Laju Kematian Mikroba(kd)Decimal Reduction Time(D)

400,005460,517

500,0113203,768

600,080728,533

Setelah diperoleh nilai kd, dapat dihitung nilai energi aktivasinya (Ed) dengan membuat grafik ln Kd terhadap 1/T sehingga dapat diperoleh nilai energi aktivasinya (Ed) yakni -24,847 Joule berdasarkan hasil perhitungan dari grafik.Dari nilai kd yang diperoleh menunjukkan sesuai dengan literatur yaitu bahwa semakin tinggi suhu maka konstanta laju kematian mikroba (kd) juga semakin besar. Hal ini disebabkan oleh semakin tinggi suhu maka semakin banyak jumlah mikroba yang mati. Berbanding terbalik dari nilai D (decimal reduction time) bahwa semakin tinggi suhu maka semakin kecil nilai D (decimal reduction time). Hal ini disebabkan oleh semakin tinggi suhu mengakibatkan waktu yang dibutuhkan untuk mengurangi jumlah sel vegetative atau spora sehingga mikroba yang bertahan berkurang menjadi 1/10 semakin kecil. Hal ini menandakan semakin tinggi suhu maka akan semakin cepat membunuh mikroba sehingga menunjukkan bahwa nilai D juga sesuai dengan literatur.1. Teknik Sterilisasi Media Secara KontinyuPada dasarnya proses ini sama dengan proses sterilisasi batch yaitu melalui dua proses, proses pemanasan dan proses pendinginan. Sterilisasi secara kontinyu dilakukan dengan mensterilisasi media pada suhu dan pada laju alir tertentu. Sterilisasi dilakukan dengan melewatkan media pada suatu water bath dengan menggunakan coil tembaga dengan suhu 45oC, 50oC, dan 55oC. Persen skala pompa yang digunakan pada setiap suhu adalah 60%, 65%, 70%, dan 75% pada pompa peristaltik. Pompa peristaltik tersebut dikalibrasi agar mendapat laju alir dengan satuan mL/detik.Tabel 4.18 Perolehan Laju Alir Setelah Dikalibrasi%Skala PompaLaju Alir (mL/detik)

600,119

650,172

700,200

750,208

Dari data pengamatan diketahui bahwa semakin besar laju alir semakin sedikit waktu tinggal sampel biakan dalam pipa. Waktu tinggal dalam coil tembaga dihitung dengan menggunakan persamaan . Vcoil = 25,421 mL = 25,421 x 10-3 dm3. Berdasarkan perhitungan, diperoleh waktu tinggal sebagai berikut :Tabel 4.19 Perolehan Waktu TinggalWaktu tinggal Waktu (detik)

1213,622

2147,796

3127,105

4122,216

Setelah proses sterilisasi (proses pemanasan dan pendinginan), dilakukan penghitungan jumlah mikroba yang masih hidup dan mati yang prinsipnya sama dengan teknik sterilisasi media secara batch yang telah dijelaskan diatas.Jumlah kematian mikroba pada teknik sterilisasi media secara batch dapat dihitung dengan membuat grafik ln Nt/No terhadap waktu pemanasan (t) sehingga akan diperoleh nilai k sebagai slope nya. Berdasarkan grafik, diperoleh nilai kd (konstanta laju kematian mikroba) dan dari nilai kd dapat dihitung pula nilai D (decimal reduction time). Nilai D adalah waktu yang dibutuhkan dalam menit pada suhu tertentu untuk mengurangi jumlah sel vegetatif atau spora sehingga mikroba yang bertahan berkurang menjadi 1/10, yakni:Tabel 4.20 Perolehan Nilai kd dan D Pada Berbagai SuhuSuhu (oC)Konstanta Laju Kematian Mikroba(kd)Decimal Reduction Time(D)

400,00045756,463

450,00112093,259

500,00221046,629

Setelah diperoleh nilai kd, dapat dihitung nilai energi aktivasinya (Ed) dengan membuat grafik ln Kd terhadap 1/T sehingga dapat diperoleh nilai energi aktivasinya (Ed) yakni -35,3215 Joule berdasarkan hasil perhitungan dari grafik.Dari nilai kd yang diperoleh menunjukkan sesuai dengan literatur yaitu bahwa semakin tinggi suhu maka konstanta laju kematian mikroba (kd) juga semakin besar. Hal ini disebabkan oleh semakin tinggi suhu maka semakin banyak jumlah mikroba yang mati. Berbanding terbalik dari nilai D (decimal reduction time) bahwa semakin tinggi suhu maka semakin kecil nilai D (decimal reduction time). Hal ini disebabkan oleh semakin tinggi suhu mengakibatkan waktu yang dibutuhkan untuk mengurangi jumlah sel vegetative atau spora sehingga mikroba yang bertahan berkurang menjadi 1/10 semakin kecil. Hal ini menandakan semakin tinggi suhu maka akan semakin cepat membunuh mikroba sehingga menunjukkan bahwa nilai D juga sesuai dengan literatur. Selain itu, semakin besar laju alir pada saat sterilisasi, maka semakin sedikit mikroba yang mati.Dari kedua percobaan yaitu pada sterilisasi secara batch dan kontinyu juga diperoleh bahwa semakin lama waktu sterilisasi maka semakin banyak mikroba yang mati dan semakin tinggi suhu sterilisasi maka akan semakin banyak pula mikroba yang mati sesuai dengan literatur. Namun data percobaan yang diperoleh kurang akurat. Hal ini disebabkan karena beberapa faktor diantaranya adanya pengotor yang ditemui pada mikroskop, penanganan yang kurang aseptis, serta ketelitian dalam menghitung jumlah sel. Selain itu, faktor lainnya yaitu mikroba yang matinya banyak hanya sel vegetatifnya sedangkan sporanya sedikit yang mati. Hal tersebut sesuai dengan grafik ln(Nt/No) terhadap waktu pada berbagai temperatur sterilisasi untuk spora dari Bacillus stearothermophilus dan sel vegetatif Eschericia.coli, disajikan pada gambar berikut.

Gambar 4.5 Profil Kinetika Kematian Spora dan Sel VegetatifDari gambar diatas menunjukkan bahwa untuk mematikan spora lebih sulit dibandingkan dengan mematikan sel vegetatif baik dari segi temperatur maupun waktunya.

4.3.2 Fajar Muhammad Ramadhan (NIM. 131411006)

Pada praktikum ini dilakukan proses pengeliminasian kehidupan mikroba pada sampel media pertumbuhan mikroba dengan menggunakan teknik sterilisasi. Teknik Sterilisasi yang digunakan adalah secara batch dan kontinyu. Tujuan dari praktikum kali ini adalah :1. Menguasai teknik sterilisasi media dengan menggunakan panas pada proses batch dan kontinyu.1. Memahami pengaruh temperatur terhadap kematian mikroba.1. Menentukan nilai konstanta laju kematian mikroba (Kd), Decimal reduction time atau destruction value (D), dan konstanta Aarhenius (Ed) pada proses sterilisasi.Hal yang pertama dilakukan pada hari pertama praktikum adalah sterilisasi alat dan pembuatan media pertumbuhan mikroorganisme untuk praktikum sterilisasi secara batch dan kontinyu. Alat yang perlu disterilisasi terlebih dahulu berupa tabung reaksi dan pipet volum. Mikroorganisme yang digunakan dalam praktikum sterilisasi ini adalah Saccaromyces cerevisiae sehingga komposisi media pertumbuhannya adalah Yeast Ekstrak. Penanaman Saccaromyces cerevisiae dilakukan satu hari sebelum dilakukannya praktikum sterilisasi ini.Metode praktikum sterilisasi yang digunakan pada praktikum kali ini adalah melakukan pemanasan pada media pertumbuhan mikroorganisme untuk selanjutnya dilakukan uji pengamatan jumlah mikroba dengan menggunakan mikroskop berdasarkan variabel suhu dan waktu tinggal sehingga dapat diamati pengaruh dari suhu dan waktu tinggal proses sterilisasi terhadap kematian mikroba.1. Sterilisasi BatchSterilisasi secara batch dilakukan dengan cara merendam media pertumbuhan didalam penangas air pada waktu dan suhu yang ditentukan. Berikut adalah beberapa variabel suhu dan waktu yang dilakukan pada praktikum1. Variabel suhu yang digunakan secara berurutan adalah 40 0C , 50 0C , 60 0C1. Variabel waktu yang digunakan secara berurutan pada setiap variabel suhu adalah 7 , 14 , 21 , dan 28 menit.Langkah pertama pada praktikum sterilisasi secara batch adalah memasukan media pertumbuhan yang telah ditumbuhi Saccaromyces cerevisiae kedalam beberapa tabung reaksi dan diberi label sesuai dengan variabel suhu dan waktu yang ditentukan diatas. Proses memindahkan media kedalam tabung reaksi harus dilakukan secara aseptis agar media pertumbuhan yang akan dilakukan sterilisasi tidak terkontaminasi. Karena kontaminasi pada media akan menyebabkan kesulitan pada saat pengolahan data. Karena variabel suhu yang dilakukan ada 3 macam dan variabel waktu yang dilakukan ada 4 pada setiap waktunya, ditambah dengan blangko maka media pertumbuhan dipindahkan ke dalam 13 tabung reaksi dengan volume yang sama. Setelah itu dilakukan proses sterilisasi secara batch dengan cara memasukan tabung reaksi kedalam penangas air yang telah diatur suhunya. Setelah melewati variabel suhu tabung reaksi yang berisi sampel diangkat dan dimasukan kedalam es. Sampel yang dimasukan kedalam es akan menyebabkan mikroorganisme yang telah di sterilisasi mengalami hibernasi sehingga tidak tumbuh. Perlakuan ini biasa diberi nama shock thermal. Setelah dilakukan perlakuan shock thermal sampel diamati dengan menggunakan mikroskop. Langkahnya adalah satu tetes sampel ditambahkan dengan satu tetes mehylen blue untuk membedakan sel mati dan sel hidup saat pengamatan. Sel yang hidup memiliki dinding sel utuh yang besifat permeable sehingga methylene blue tidak akan terdifusi masuk kedalam sel hidup, sedangkan sel yang mati telah mengalami kerusakan dinding sel sehingga methylene blue dapat masuk kedalam sel dan membuat mikroorganisme berwarna biru saat pengamatan. Setelah dilakukan pengamatan jumlah sel hidup dan sel mati sesuai dengan prosedur tersebut dan melakukan pengolahan data, data hasil percobaan sterilisasi secara batch adalah sebagai berikutTabel 4.21 Data Hasil Percobaan Sterilisasi Secara BatchTemperature Sterilisasi (oC)

405060

KonstantaKematianMikroba (kd)0,0050,01130,0807

Desimal Reduction Time (D)460,517203,76828,533

Konstanta Arhenius (Ed)-24,847 Joule

Dari data hasil praktikum yang diperoleh terlihat bahwa tidak terjadi penyimpangan data yang terjadi pada saat praktikum. Hasil yang ditunjukan oleh data relevan dengan teori yang disampaikan oleh dosen. Bahwa nilai Kd berbanding terbalik dengan suhu. Semakin tinggi suhu penangas maka nilai Kd yang berarti konstanta kematian mikroba akan semakin besar. Kd sendiri adalah konstanta ukuran banyaknya mikroba yang mati pada suhu dan waktu tertentu. Begitupun dengan nilai D. Pada data hasil praktikum sterilisasi secara batch diatas tidak terjadi penyimpangan. Nilai D atau destruction value secara teoritis adalah waktu yang dibutuhkan dalam menit pada suhu tertentu untuk mengurangi jumlah sel vegetative atau spora. Maka semakin tinggi suhu penangas nilai D akan semakin kecil yang mengindikasikan waktu yang dibutuhkan untuk mengurangi jumlah sel vegetative atau spora menjadi lebih singkat. Sementara untuk nilai Ed pada sterilisasi batch menunjukan seberapa besar kerentanan mikroba untuk hidup saat dilakukan pemanasan. Nilai Ed yang kecil menunjukan bahwa mikroba rentan hidup dalam kondisi pemanasan. Dari data diatas Ed yang didapatkan adalah negative maka itu berarti tidak menyimpang dengan teori.1. Sterilisasi KontinyuSterilisasi secara kontinyu dilakukan dengan cara mengalirkan sampel pada penangas air melalui pipa spiral yang terbuat dari tembaga pada variabel suhu dan waktu tinggal yang beragam. Variabel waktu tinggal divariasikan dengan cara memvariasikan % skala pada pompa. Sedangkan variabel suhu divariasikan dengan cara menaikan temperature penangas air. Berikut adalah beberapa variabel suhu dan % pompa yang dilakukan pada saat praktikum.1. Variabel suhu yang digunakan secara berurutan adalah 45 0C, 50 0C, dan 55 0C1. Variabel skala pompa yang digunakan secara berurutan adalah 60 %, 65 %, 70 %, 75 %. Langkah pertama yang dilakukan pada sterilisasi secara kontinyu adalah melakukan kalibrasi pompa peristaltik. Syarat dari kalibrasi adalah salah satu variabel yang diamati adalah tetap. Itu berarti variabel waktu atau volume harus bernilai tetap. Kalibrasi ini bertujuan untuk mendapatkan laju alir dari setiap skala bukaan pompa. Pada langkah ini juga dilakukan penentuan volume coil yang terendam tempat terjadinya sterilisasi. Setelah mendapatkan variabel hasil kalibrasi maka langkah selanjutnya dapat dilakukan. Langkah selanjutnya adalah proses sterilisasi. Didalam Erlenmeyer berukuran 2 L media pertumbuhan Saccaromyces cerevisiae disimpan, kemudian dimasukan selang yang terhubung dengan pompa peristaltic. Setelah itu dilakukan pengaturan skala pompa dengan variabel yang ditentukan. Setelah itu tampung aliran sampel keluaran dan masukan kedalam es agar sehingga perlakuan shock thermal dapat dilakukan. Setelah itu teteskan satu sampel pada kaca preparat dan campurkan dengan satu tetes methylene blue setelah itu sampel dapat diamati jumlah sel hidup dan sel matinya dengan menggunakan mikroskop. Setelah melakukan pengamatan terhadap jumlah sel hidup dan sel mati juga melakukan pengolahan data sesuai dengan prosedur yang ditentukan. Hasil praktikum sterilisasi secara kontinyu adalah sebagai berikutTabel 4.22 Data Hasil Praktikum Sterilisasi Secara KontinyuTemperature Sterilisasi (oC)

455055

KonstantaKematianMikroba (kd)0,00040,00110,0022

Desimal Reduction Time (D)5756,4632093,2591046,629

Konstanta Arhenius (Ed)-35,3215 Joule

berdasarkan data praktikum yang diperoleh nilai kd berbanding terbalik dengan suhu. Itu berarti data hasil praktikum secara kontinyu kali ini relevan dengan teori yang disampaikan oleh dosen. Begitupun juga dengan nilai D dan konstanta archenius, semuanya relevan dengan teori yang telah disampaikan.

4.3.3 Rd. Ajeng Feby Lailani Belladina (NIM. 131411023)Kali ini praktikan melakukan praktikum bioproses dengan judul Kinetika Kematian Mikroba dan Sterilisasi Media Metoda Batch dan Kontinyu yang dilakukan selama 3 minggu yaitu pembuatan media, percobaan kinetika kematian mikroba dengan sterilisasi metoda kontinyu dan batch. Tujuan dari percobaan ini adalah menguasai teknik sterilisasi media dengan menggunakan panas pada proses batch dan kontinyu, memahami pengaruh variasi laju alir (pada sterilisasi kontinyu) dan temperature pada proses sterilisasi batch dan kontinu, dan menentukan nilai konstanta laju kematian mikroba (Kd), decimal reduction time atau destruction value (D), dan energi aktivasi (Ed) pada proses sterilisasi batch dan kontinyu.1. Pembuatan MediaUntuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba, diperlukan suatu substrat yang disebut media. Setiap media mengandung susunan bahan berbentuk alami seperti tauge, kentang, daging dan wortel ataupun susunan bahan berbentuk buatan seperti senyawa kimia organik maupun anorganik.Pada minggu pertama praktikan membuat media inokulum sebagai media pertubuhan untuk mikroorganisme fermipan (ragi). Supaya mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik dalam media, media harus mengandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakkan mikroba. Komposisi media yang digunakan adalah Media GYEA dibuat sebanyak 700 mL dengan komposisi sebagai berikut.a. yeast ekstrak 10,5 gram, berfungsi sebagai vitamin dan faktor tumbuh juga memiliki hormon yang menghasilkan perolehan sel lebih tinggi, selain itu, yeast ekstrak merupakan nitrogen organik berupa senyawa nitrogen kompleks yang menghasilkan pertumbuhan biomassa lebih cepat dibandingkan nitrogen anorganik.b. pepton 1 gram, berfungsi sebagai vitamin dan faktor tumbuh juga memiliki hormon yang menghasilkan perolehan sel lebih tinggi.c. sukrosa 14 gram, berfungsi sebagai sumber karbon untuk membangun massa sel dan membentuk produk. Konsentrasi glukosa yang lebih tinggi (diatas 200 g/l) dapat ditoleransi oleh ragi dan jamur. Namun pada konsentrasi tertentu, sumber karbon dan katabolit karbon dapat menghambat satu atau beberapa enzim yang berperan dalam proses pembentukan produk. Salah satu pendekatan untuk mencegah penghambatan tersebut adalah dengan memberikan sumber karbon secara terus-menerus pada konsentrasi di bawah konsentrasi penghambatan.d. 700 mL aquadest, berfungsi sebagai pelarut dan alat pengangkut dalam metabolisme.Supaya media yang dibuat tersebut terhindar dari kontaminasi, media dibuat dalam kondisi aseptis yang kemudian disterilisasi ke dalam autoclave selama 1 jam, hal tersebut bertujuan agar media berada dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami mikroba yang dimaksud tidak ditumbuhi mikroba lain yang tidak diharapkan. Selanjutnya media disimpan dalam showcase.

2. Penanaman MikrobaSehari sebelum melakukan percobaan, praktikan menanam fermipan seujung spatula kedalam media dalam suhu ruangan. Setelah itu, inokulum diinkubasi dalam incubator shaker selama 24 jam. Tujuan dari penanaman fermipan sehari sebelumnya adalah agar fermipan dapat tumbuh dan berkembang biak hingga fase eksponensial, penanaman fermipan dilakukan dengan kondisi aseptis hal tersebut bertujuan agar media yang telah ditanam fermipan atau inokulum tidak terkontaminasi oleh lingkungan luar atau tidak ditumbuhi mikroba lain yang tidak diharapkan.

3. Percobaan Kinetika Kematian dengan SterilisasiSterilisasi adalah proses panas untuk mematikan semua mikroba dan merusak spora, sehingga produk bebas dari mikroba patogen dan memiliki daya awet yang lama. 3.1 Percobaan Kinetika Kematian dengan Sterilisasi Media Metoda KontinyuPercobaan kinetika kematian sterilisasi media metoda kontinyu ini terdiri dari beberapa tahap diantaranya kalibrasi laju alir, penentuan volume pipa coil dan proses sterilisasi kontinyu.a. Kalibrasi Laju AlirSebelum melakukan percobaan, praktikan melakukan kalibrasi laju alir yang berfungsi untuk mengetahui laju alir dalam %skala pompa tertentu. Pertama praktikan menyusun alat, setelah alat tersusun, praktikan mengkalibrasi skala pompa peristaltik dengan skala pompa sebesar 60%, 65%, 70% dan 75%. Setelah itu praktikan menampung cairan dalam gelas ukur juga mengamati waktu penampungan cairan menggunakan stopwatch. Semakin besar %skala pompa, semakin cepat pula laju alir media dalam coil, hal ini mempengaruhi waktu tinggal media dalam suhu sterilisasinya yaitu 45oC, 50oC dan 55oC. Selanjutnya air aquadest dikeluarkan beberapa mL untuk pembilasan selang dan pipa coil, kemudian air ditampung untuk setiap 60 detik secara bertahap diulang untuk semua variasi laju alir.

b. Penentuan Volume Pipa CoilDalam menentukan volume pipa coil, praktikan memasukkan air kedalam pipa coil hingga penuh, setelah itu air tersebut dibuang kedalam gelas ukur, volume pipa coil secara keseluruhan tersebut merupakan volume air yang terukur. Untuk mengetahui volume coil yang terendam saja dapat dihitung dengan cara mengurangi volume pipa coil keseluruhan dengan volume pipa coil yang tak terendam pada kedua sisi, untuk mengetahui volume pipa coil tak terendam pada kedua sisi adalah dengan mengukur tinggi pipa coil pada kedua sisi dan diamater pipa coil tersebut sehingga didapatlah volume pipa coil tak terendam.

c. Proses Sterilisasi KontinyuPada proses sterilisasi kontinyu ini, pertama-pertama praktikan memanaskan water bath hingga suhu pertama yaitu 45oC, ketika pemanasan berlangsung praktikan mengeluarkan inokulum dari incubator shaker dan mengambil sampel sebanyak 10 mL untuk pembanding sebelum dilakukan pemanasan. Mikroba dalam sampel sebelum pemanasan tersebut diamati menggunakan mikroskop dengan pewarnaan mikroba. Pewarnaan mikroba bertujuan untuk mengamati dan membedakan struktur yang terdapat dalam sel mikroba dan juga untuk membedakan kelompok mikroba berdasarkan reaksinya terhadap warna yang sekaligus menunjukkan sifat mikroba tersebut. Berdasarkan muatannya, pewarna dibedakan menjadi dua yaitu pewarna asam dan basa. Pada praktikum kali ini praktikan menggunakan pewarna basa yaitu methylen blue dimana sel hidup akan tampak berwarna bening karena sel yang hidup masih memiliki dinding sel utuh yang bersifat selektif permeable sedangkan sel mati akan tampak berwarna gelap atau biru diakibatkan oleh dinding sel mikroba yang mati telah rusak sehingga warna dari methylen blue akan terserap dan masuk melewati dinding sel rusak. Penghitungan jumlah sel hidup dan sel mati dilakukan secara manual, pengamatan dilakukan duplo agar diperoleh data yang akurat. Kemudian setelah alat sterilisasi kontinyu terangkai, wadah media diberi magnet stirrer dan selang yang menuju ke pompa peristaltik, masuk ke coil dan keluaran. Selama proses sterilisasi berlangsung, media yang akan disterilisasi masuk dan keluar coil secara kontinyu, sehingga diperlukan kalibrasi pompa untuk mengetahui laju alir media dalam pompa. Setelah kalibrasi, aquades diganti dengan media dimana media dialirkan secara bertahap pada coil untuk 3 variasi suhu sterilisasi, yaitu 45oC, 50oC dan 55oC. Setelah kondisi suhu pertama tercapai yaitu 450C, skala pompa diset pada 60%,65%,70% dan 75%. Media dibiarkan mengalir dari keluaran hingga tertampung 50 mL dan didapat laju alir dengan satuan mL/detik agar media yang selanjutnya tertampung merupakan keluaran pada skala pompa 60%,65%,70% dan 75%, tabung reaksi disiapkan untuk menampung media sebanyak 5 mL, kemudian tabung dimasukkan ke dalam baskom berisi air es yang bertujuan untuk shock thermal sehingga mikroba tidak mengalami proses kematian lagi. Secara bertahap langkah diulangi untuk variasi skala pompa masing-masing dimana pada setiap pergantian skala pompa media dibiarkan tertampung sebanyak 50 mL sebelum di tampung dalam tabung reaksi sebagai sampel. Kemudian keempat tabung diamati jumlah sel hidup dan mati melalui mikroskop dengan cara yang sama seperti pengamatan untuk sampel sebelum pemanasan. Tahapan diulangi untuk 2 variasi suhu selanjutnya. Dari hasil percobaan diperoleh jumlah sel mati dan sel hidup yaitu Nt dan No sehingga dapat dihitung nilai ln Nt/No yang dialurkan pada waktu sterilisasinya dan dihasilkan garis lurus dengan slope yang merupakan nilai Kd atau konstanta kematian mikroba sehingga dapat dihitung pula nilai D atau Decimal reduction time. Nilai D adalah waktu yang dibutuhkan dalam menit pada suhu tertentu untuk mengurangi jumlah sel vegetatif atau spora sehingga mikroba yang bertahan berkurang menjadi 10%-nya atau 1/10, artinya memusnahkan 90% populasi atau menurnkan jumlah bakteri sebanyak 1 siklus logaritma. Setelah diperoleh nilai Kd, maka dapat dicari pula nilai Ea atau energi aktivasi. Energi aktivasi merupakan energi minimum yang harus dicapai oleh suatu senyawa kimia untuk melakukan atau bereaksi secara kimia. Menurut literatur semakin tinggi suhu pemanasan maka semakin besar pula nilai konstanta laju kematian mikroba (kd) yang diperoleh, hal tersebut disebabkan oleh peningkatan jumlah mikroba yang mati pada temperatur yang semakin tinggi, kematian setiap mikroba bergantung pada ketahanan panas masing-masing mikroba. Sebaliknya, semakin besar nilai konstanta laju kematian mikroba (kd) atau semakin tinggi suhu sterilisasi maka semakin kecil nilai D (decimal reduction time) yang diperoleh, hal tersebut disebabkan oleh peningkatan temperatur yang mengakibatkan semakin kecilnya waktu yang dibutuhkan untuk mengurangi jumlah sel vegetatif atau spora mikroba yang bertahan berkurang menjadi 1/10. Selain itu, semakin besar laju alir saat sterilisasi maka semakin sedikit jumlah mikroba yang mati, hal tersebut disebabkan karena semakin kecilnya waktu tinggal pada proses pemanasan.Berikut kurva Ln terhadap (waktu tinggal)

Gambar 4.6 Kurva Ln terhadap (Waktu Tinggal)Dapat dilihat dari kurva diatas, semakin lama waktu tinggal, maka semakin sedikit jumlah mikroba yang mati sehingga nilai ln Nt/No semakin kecil, sesuai literatur. Tabel 4.23 Nilai Kd, Ln Kd, 1/T dan D Hasil Sterilisasi KontinyuT (oC)Kd Ln Kd1/TD

450,0004-7,8240,0225756,463

500,0011-6,8120,0202093,259

550,0022-6,1190,0181046,629

Dari tabel diatas, dapat disimpulkan bahwa semakin besar suhu sterilisasi maka semakin tinggi pula nilai Kd yang diperoleh dan semakin kecil nilai D yang diperoleh, sesuai dengan literatur. Berdasarkan perhitungan dari grafik, setelah diperoleh nilai kd, dapat dihitung nilai energi aktivasi (Ed) dengan membuat grafik ln Kd terhadap 1/T sehingga dapat diperoleh nilai energi aktivasinya (Ed) yakni -35,3215 Joule3.2 Percobaan Kinetika Kematian dengan Sterilisasi Media Metoda BatchPada teknik sterilisasi batch, proses relatif sederhana dan proses pemanasan serta pendinginan dapat dilakukan dalam satu waktu perioda. Namun, proses pemanasan serta pendinginan pada sterilisasi batch, berlangsung lambat. Sebelum memulai percobaan, sama seperti metode kontinyu dilakukan sterilisasi alat maupun bahan. Percobaan sterilisasi dilakukan sekali run pada suatu water bath dengan suhu 40oC, 50oC dan 60oC dengan variasi waktu yang digunakan pada setiap suhu adalah 7, 14, 21 dan 28 menit. Sama seperti metode kontinyu, sebelum media disterilisasi metode batch, diambil sampel sebelum pemanasan secara aseptis kedalam tabung reaksi yang telah disterilisasi dengan cara pengamatan sama seperti metoda kontinyu. Berikut merupakan data hasil percobaan pada sampel sebelum pemanasan, dimana sangat sedikit atau tidak ada mikroba mati yang terlihat pada mikroskop.Tabel 4.24 Data Pengamatan Sampel Sebelum Pemanasan Secara BatchSel Hidup (Nt)Sel MatiJumlah Sel Total (N0)

JumlahFraksiJumlahFraksi

1140.96640.034118

136100136

Jumlah kematian mikroba pada teknik sterilisasi media secara batch dapat dihitung dengan membuat grafik ln Nt/No terhadap waktu pemanasan (t) sehingga akan diperoleh nilai k sebagai slope.

Gambar 4.7 Kurva Ln terhadap waktu

Dapat dilihat dari kurva diatas, semakin lama waktu tinggal, maka semakin sedikit jumlah mikroba yang mati sehingga nilai ln Nt/No semakin kecil, sesuai literatur. Tabel 4.25 Nilai Kd, Ln Kd, 1/T dan D Hasil Sterilisasi BatchT (oC) (oC)KdLn KdD

400,0250,005-5,298460,517

500,0200,0113-4,483203,768

600,0160,0807-2,51728,533

Dari tabel diatas, dapat disimpulkan bahwa semakin besar suhu sterilisasi maka semakin tinggi pula nilai Kd yang diperoleh dan semakin kecil nilai D yang diperoleh, sesuai dengan literatur. Berdasarkan perhitungan dari grafik, setelah diperoleh nilai kd, dapat dihitung nilai energi aktivasi (Ed) dengan membuat grafik ln Kd terhadap 1/T sehingga dapat diperoleh nilai energi aktivasinya (Ed) yakni - 24,847 Joule.

4.3.4 Ulfa Nurul Azizah (NIM. 131410063)Sterilisasi merupakan suatu cara untuk mengeliminasi semua kehidupan mikroba yang ada pada suatu bahan atau produk yang dikehendaki. Pada percobaan kali ini kami melakukan proses sterilisasi untuk mengetahui kinetika kematian mikroba. Teknik sterilisasi media yang digunakan yaitu secara batch dan continue dengan proses pemanasan. Tujuannya dari percobaan ini adalah untuk mengetahui pengaruh suhu dan waktu sterilisasi pada sterilisasi batch, serta pengaruh suhu dan waktu tinggal pada sterilisasi continue. Media yang digunakan adalah media pertumbuhan untuk bakteri Saccharomyces cereviciae, yaitu glukosa sebagai sumber C, pepton sebagai sumber nutrisi dan yeast ekstrak sebagai sumber N. Untuk melarutkan media pertumbuhan yang digunakan dibantu dengan pemanasan serta pengadukan agar semua bahan larut. Kemudian inokulasi mikroba dilakuakan dengan memasukkan permifan satu spatula kecil, penambahan permifan ini tidak terlalu banyak karena permifan yang banyak mengakibatkan sel yang tumbuh banyak sehingga sulit diamati dibawah mikroskop.. Pada percobaan yang dilakukan, ragi yang dimasukkan kedalam media fermentasi di inkubasi selama 24 jam di incubator shaker.Pada percobaan yang kami lakukan, sterilisasi batch dan kontinyu. Perbedaan percobaan secara batch dan kontinyu adalah pada proses secara kontinyu , media dialirkan dalam suatu koil dengan variasi suhu dan pompa untuk mengetahui pengaruh waktu tinggal terhadap kinetika kematian mikroba. Sedangkan pada proses batch tidak dialirkan koil melainkan hanya dimasukan kedalam beker glass yang berisi air panas dalam water bath dengan variasi suhu dan waktu. Sterilisasi KontinyuPada praktikum kali ini pertama praktikan melakukan proses sterilisasi kontinyu. Hal yang pertama praktikan lakukan yaitu mengeluarkan media inokulum dari incubator shaker , menyediakan es untuk media yang telah disterilisasi dan mengoprasikan alat hingga suhu operasi yang diinginkan tercapai.Disamping itu kami juga melakukan kalibrasi volume koil yang tercelup dengan aquades, dengan cara menghitung total volume satu siklus dari koil tersebut dan mengukur koil yang tercelup. Kalibrasi ini digunakan untuk mengetahui volume media yang tercelup dan setiap pergantian pompa menunggu hingga waktu satu siklius tersebut. Setelah itu melakukan kalibrasi % skala pompa 60%, 65%, 70% dan 75% dengan menghitung waktu laju alir media setiap 1 menit . Didapat hasil larutan setiap 1 menitnya yaitu (secara berurutan) 7,14 mL, 10,3 mL, 12 mL dan 12,5 mL semakin % skala pompa besar, semakin besar pula laju alir yang dihasilkan. Pada proses sterilisai kontinyu berlangsung media diletakan diatas hot plate dan di lakukan pengadukan secara mekanik menggunakan magnetic strirer hal ini bertujuan agar tidak terjadi endapan. Sebelum dilakukan pemanasan, dilakukan analisa kandungan mikroba yang hidup dan mati didalam media dengan metode pewarnaan menggunakan bantuan mikroskop. Sampel diletakan diatas kaca preparat dan ditambahkan tetes methylene blue. Methylene blue ini akan mewarnai sel yang mati dan sel yang hidup akan terlihat bening.Proses selanjutnya yaitu, dilakukannya sterilisasi media dengan cara mengatur skala pompa dan suhu serta mengalirkan media kedalam selang dan masuk kedalam koil yang tercelup didalam . % pompa peristaltik yang pertama yaitu memulai dengan skala yang rendah yaitu 60%. Sampel mengalir kedalam waterbath lalu ditampung di tabung reaksi. Diambil secukupnya dan dimasukan kedalam gelas yang berisikan es. Proses ini bertujuan agar sel tidak berkembang atau non-aktifkan. Setelah itu, sampel dishaker terlebih dahulu agar tidak ada sample yang mengendap dan mikroba dapat menyebar merata pada proses sampling. Lalu, yang didapat di teteskan diatas kaca preparat dan ditambahkan tetes methylene bluedan diamati jumlah sel hidup dan sel mati di mikroskop. Kaca preparat yang digunakan harus steril, dalam proses mensterilkan kaca preparat praktikan menggunakan etanol 70 %. Kita tidak boleh digunakan jika kaca preparat masih basah oleh etanol karena dapat menyebabkan bakteri yang hidup menjadi mati oleh sterilisasi etanol dikaca preparat. Setelah itu ,dilakukan pembuangan sampel 1 siklus. Ini bertujuan agar sampel yang dialiri benar-benar laju alir oleh % skala pompa selanjutnya. Langkah sampling dilakukan untuk variasi % Pompa selanjutnya dan variasi suhu selanjutnya .Berdasarkan data pengamatan menggunakan mikroskop, semakin besar laju alir pada alat yang diberikan semakin sedikit waktu tinggal sampel biakan dalam pipa semkin sedikit waktu tinggal maka mikroba yang mati sedikit, namun jika waktu tinggal semakin lama maka mikroba yang mati akan semakin banyak. Seharusnya berdasarkan teori jumlah sel yang mati semakin bertambah seiring dengan bertambahnya suhu pemanasan. Namun data percobaan terlihat fluktuatif. Hal ini disebabkan adanya pengotor dan mikroba lain yang ditemui pada mikroskop, penanganan yang kurang aseptis, serta faktor ketelitian saat menghitung jumlah sel. Waktu tinggal sampel didalam pipa dapat dihitung dengan persamaan waktu tinggal. Setelah mendapatkan nilai waktu tinggal, nilai Kd diperoleh dengan cara memplotkan nilai Ln Nt/N0 terhadap waktu tinggal. Sehingga didapat nilai slope dari persamaan garis linear dalam grafik sebagai nilai Kd. Pada suhu 450C,500C dan 550C didapat nilai kd nya yaitu 0.0004 ,0.0011 dan 0,0022 . Dilakukan perhitungan untuk mencari nilai D dan nilai Ed. Nilai D menyatakan ketahahanan panas mikroba atau sensitifitas mikroba oleh suhu pemanasan Semakin besar nilai D suatu mikroba pada suatu suhu tertentu, maka semakin tinggi ketahahan panas mikroba tersebut pada suhu yang tertentu. Nilai D umumnya dinyatakan pada suhu standar. Untuk bakteri mesofilik atau termofilik umumnya menggunakan suhu standar 121oC, sedangkan untuk sel vegetatif, khamir, atau kapang umumnya menggunakan suhu yang lebih rendah (80-100C). Setelah menghitung nilai dextrusion value dapat dihitung nilai konstanta Arhenius (Ed), dengan cara membuat grafik antara 1/T dengan ln Kd. Didapat nilai slope dari grafik yaitu 430,75. Nilai slope dimasukan kedalam persamaan 3, didapat nilai konstanta Arhenius-nya yaitu 35,3215 Joule.

Sterilisasi BatchPada praktikum sterlisasi batch hampir sama dengan proses sterilisasi kontinyu pada proses analisanya namun yang jadi berbedaan adalah saat proses sterilisasinya pada batch langkah yang pertama dilakukan adalah mengambil sample yang di masukan pada tabung reaksi terlebih dahulu lalu dilakukan pemanasan dengan cara memasukan sample kedalam air dengan suhu operasi yang diinginkan setelah itu dimasukan kedalam.Pada proses sterilisasi batch, menghitung jumlah sel yang mati dan jumlah sel yang hidup setelah melalui proses pemanasan dan pendinginan. Sampel berisi biakan dipanaskan pada temperature berbeda-beda yakni 50 oC, 55 oC, dan 60 oC dan pada rentang waktu berbeda pula, yaitu pada 7, 14, 21, dan 28. Setelah proses pemanasan dan pendinginan, jumlah sel dihitung dengan menggunakan mikroskop. Pada saat meneteskan sampel ke dalam kaca preparat, semua hal yang dilakukan harus dilakukan secara aseptis agar sampel tidak terkontaminasi, kaca preparat yang digunakan harus kering dari alcohol karena alcohol akan mematikan sel bakteri sehingga pada saat penagamatan analisis dibawah mikroskop banyak S.Cerevisiae yang mati. Berdasarkan tabel data pengamatan, jumlah sel yang mati semakin bertambah seiring dengan bertambahnya suhu pemanasan. Namun, berdasarkan data percobaan, data yang diperoleh kurang akurat. Hal ini disebabkan karena beberapa faktor, diantaranya adanya pengotor yang ditemui pada mikroskop, penanganan yang kurang aseptis, serta faktor ketelitian saat menghitung jumlah sel. Kematian jumlah mikroba oleh pemanasan dapat dihitung dengan membuat grafik ln terhadap waktu pemanasan (t) sehingga akan diperoleh nilai k sebagai slope-nya. Adapun nilai Desimal reduction time atau destruction value (D) pada suhu 50 oC adalah 7,601 dan pada suhu 55 oC 6,786 dan 60oC 4,82. Semakin besar nilai D suatu mikroba pada suatu suhu tertentu, maka semakin tinggi ketahahan panas mikroba tersebut pada suhu yang tertentuk.Setelah diperoleh nilai Kd, KJ Nilai konstanta laju kematian mikroba (kd) bergantung pada temperatur,. dapat dihitung nilai Ed dengan membuat grafik ln Kd terhadap 1/T sehingga berdasarkan hasil perhitungan dari grafik dapat diperoleh nilai Ed, yakni - 24,847 Joule.

BAB VKESIMPULAN DAN SARAN5.1 Kesimpulan0. Teknik sterilisasi media dapat dilakukan dengan dua cara yaitu secara batch dan secara kontinyu.0. Berdasarkan jumlah mikroba yang mati pada teknik sterilisasi media secara batch maka diperoleh nilai nilai konstanta laju kematian mikroba (kd) dengan nilai 0,005; 0,0113; 0,0807 dan nilai decimal reduction time atau destruction value (D) sebesar 460,517; 203,768 dan 28,533 untuk suhu 40oC, 50oC dan 60oC. Diperoleh juga nilai energi aktivasi (Ed) dari grafik ln Kd terhadap 1/T dan didapatkan nilai sebesar Ed nya sebesar -24,847 Joule.0. Suhu dan waktu sangat berpengaruh terhadap kematian mikroba. Karena semakin lama waktu pemanasan maka semakin banyak mikroba yang mati. Semakin tinggi suhu mikroba yang mati pun akan semakin banyak.0. Berdasarkan jumlah mikroba yang mati pada teknik sterilisasi media secara kontinyu maka diperoleh nilai nilai konstanta laju kematian mikroba (kd) pada berbagai suhu sebesar 0,0004; 0,0011 dan 0,0022 dan nilai decimal reduction time atau destruction value (D) sebesar 5756,463; 2093,259 dan 1046,629 untuk suhu 45oC, 50oC dan 55oC. Diperoleh juga nilai energi aktivasi (Ed) dari grafik ln Kd terhadap 1/T sehingga didapatkan nilai Ed nya sebesar -35,3215 Joule.0. Suhu dan laju alir sangat berpengaruh terhadap kematian mikroba. Semakin tinggi suhu kematian mikroba semakin banyak. Selain itu, semakin besar laju alir pada saat sterilisasi, maka semakin sedikit mikroba yang mati.5.2 Saran0. Pada proses penanaman mikroorganisme yaitu fermipan (ragi) sebaiknya tidak terlalu banyak agar pada pembiakkan tidak terjadi perebutan nutrien sehingga memudahkan proses pengamatan.0. Seperti yang telah kita ketahui, pada praktikum kinetika kematian mikroba dan teknik sterilisasi media secara kontinyu, terdapat 2 media yang dibuat oleh masing-masing kelompok, saat pencampuran kedua media tersebut harus diaduk agar media homogen.Proses pengamatan harus dilakukan seteliti mungkin dan dilakukan secara duplo agar mendapatkan hasil yang akurat