38

BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Pengaruh Toksisitas Rhodamin B dan Sakarin terhadap Gambaran

Histopatologi Ginjal Tikus Putih (Rattus norvegicus)

Pengamatan terhadap gambaran histopatologi ginjal tikus putih (Rattus

norvegicus) dilakukan pada setiap kelompok perlakuan. Pengamatan dilakuakan

secara langsung terhadap histopatologi ginjal menggunakan mikroskop Olympus

BX51 dan selanjutnya dilakukan pengukuran terhadap lebar space Bowman. Hasil

pengamatan selanjutnya dijelaskan secara deskriptif kualitatif. Adapun yang

diamati pada gambaran histopatologi ginjal tikus putih (Rattus norvegicus)

menggunakan perbesaran 400X yaitu Bowman space, kapsula Bowman dan

tubulus ginjal.

Ginjal pada mamalia berjumlah sepasang, yang terletak dalam rongga

abdomen retroperitoneal primer kiri dan kanan kolumna vertebralis (Setiadi,

2007). Fungsi utama ginjal adalah mengekskresikan zat sisa metabolisme dan zat-

zat yang lain yang berbahaya terhadap tubuh, sambil mempertahankan konstituen

darah yang masih berguna. Selain itu ginjal juga memiliki fungsi endokrin yang

penting (Patrick, 2005). Secara histologis, ginjal tikus dibagi menjadi dua wilayah

yaitu korteks dan medula. Ginjal terdiri dari jutaan unit fungsional ginjal yaitu

nefron. Unit nefron ginjal terdiri dari glomerulus, tubulus proksimal, loop henle

asenden dan desenden, tubulus distal dan duktus kolektivus (Mescher, 2013).

Gambaran histopatologi ginjal tikus putih (Rattus norvegicus) dapat dilihat pada

38

39

kelompok kontrol negatif (K-), kelompok perlakuan 1 (P1), kelompok perlakuan

2 (P2), dan kelompok perlakuan 3 (P3).

Hasil pemeriksaan mikroskopis terhadap gambaran histopatologi ginjal

kelompok kontrol negatif (K-) menunjukkan keadaan normal dan tidak ditemukan

adanya kerusakan. Hal ini ditunjukkan dengan epitel pada kapsula Bowman

berbentuk skuamus simpleks, terdapat ruang antar Bowman atau Bowman space

yang membatasi glomerulus dan kapsula bowman, tubulus ginjal juga terlihat

normal tanpa ada kerusakan ditunjukkan dengan epitel tubulus kontortus yang

berbentuk kuboid simpleks dengan batas antar sel yang terlihat jelas (Gambar

5.1). Menurut O’Callaghan (2006) Glomerulus merupakan suatu bola kapiler yang

dikelilingi oleh kapsula Bowman, kumpulan tubulus berbentuk kapsula cekung

dimana urin difiltrasi. Lapisan parietal kapsula Bowman terdiri atas epitel pipih

selapis. Menurut Peckham (2014) Tubulus proksimal dilapisi oleh epitel kuboid

selapis dengan brush border (mikrovili), sedangkan tubulus distal dilapisi oleh

epitel kuboid dengan sedikit mikrovili sehingga lumennya tampak lebih besar.

Gambar 5.1 Gambaran histopatologi ginjal dengan perbesaran 400Xkelompok kontrol negatif (K-).

Glomerulus

Bowman space

Makula Densa

Tubulus

Proksimal

Tubulus

Distal

Tubulus

Proksimal

40

Gambaran histopatologi dari ginjal tikus putih (Rattus novergicus) pada

kelompok perlakuan 1 (P1) yang merupakan kelompok tikus yang diinduksi

rhodamin B dosis 22,5 mg/kgBB menunjukkan adanya hipertropi pada glomerulus

sehingga Bowman space mengalami penyempitan. Tubulus ginjal pada kelompok

perlakuan 1 (P1) memiliki gambaran yang tidak berbeda dengan histopatologi

tubulus ginjal kelompok kontrol negatif (K-). Hal ini ditandai dengan epitel

tubulusnya yang tersusun rapi dengan batas antar sel yang jelas, intinya terletak

ditengah serta tidak tampak adanya nekrosis (Gambar 5.2).

Gambar 5.2Gambaran histopatologi ginjal dengan perbesaran 400X kelompok

Perlakuan 1 (P1).

Pada kelompok perlakuan 2 (P2) yang merupakan kelompok tikus induksi

sakarin dosis 157,77 mg/kgBB menunjukkan gambaran sel normal yang sama

dengan kelompok kontrol negatif (K-). Glomerulus ginjal tampak normal tanpa

adanya hipertropi sehingga ruang antar Bowman atau Bowman space terlihat jelas.

Tubulus

Distal

Tubulus

Proksimal

Hipertropi

Glomerulus

Space

Bowman

Tubulus

Proksimal

41

Gambaran histopatologi tubulus ginjal kelompok perlakuan 2 (P2) juga

menunjukkan kondisi yang normal. Lumen tubulus dan batas antar sel tubulusnya

tampak jelas (Gambar 5.3).

Gambar 5.3 Gambaran histopatologi ginjal dengan perbesaran 400X kelompok Perlakuan 2 (P2).

Gambaran histopatologi ginjal pada kelompok perlakuan 3 (P3) yang

merupakan kelompok tikus yang diinduksi kombinasi rhodamin B dosis 22,5

mg/kgBB dan sakarin dosis 157,77 mg/kgBB menunjukkan kondisi peningkatan

kerusakan ginjal dibandingkan dengan kelompok perlakuan sebelumya.

Kerusakan terjadi pada semua glomerulus maupun pada sel tubulusnya.

Glomerulus pada kelompok perlakuan 3 (P3) tampak mengalami hipertropi.

Glomerulus yang mengalami hipertropi sehingga tampak membesar. Hal ini

menyebabkan glomerulus dan kapsula Bowman menyatu sehingga ruang antar

Bowman atau Bowman space tampak menghilang.Epitel kuboid pada tubulus

Bowman Space

Glomerulus

Tunbulus

Proksimal

Makula Densa

Tunbulus

Proksimal

Tunbulus

Distal

42

ginjal tikus kelompok perlakuan 3 (P3) tampak saling berhimpit tanpa adanya

batas yang jelas. Tubulusnya secara keseluruhan tampak mengalami hipertropi

sehingga lumen tubulusnya tampak menyatu. Selain itu juga tampak adanya

hemoragi (Gambar 5.4).

Gambar 5.4 Gambaran histopatologi ginjal dengan perbesaran 400X kelompok

Perlakuan 3 (P3).

Selain dilakukan analisa secara deskriptif kualitatif, gambaran

histopatologi ginjal juga dianalisa secara kuantitatif. Analisa kuantitatif

hitopatologi ginjal dilakukan terhadap lebar Bowman space pada setiap kelompok

perlakuan. Lebar Bowman space diukur berdasarkan jarak antara bagian terluar

glomerulus ke kapsula Bowman. Hasil pengukuran selanjutnya dilakukan analisa

data dengan menggunakan uji one way analysis of variant (ANOVA) dan

dilakukan uji lanjutan dengan uji Tukey seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5.1.

Bowman space

Makula Densa

Hemoragi

Tubulus

Proksimal Hipertropi

Tubulus

43

Tabel 5.1 Rata-rata Lebar Space Bowman Ginjal Tikus Putih (Rattus norvegicus)

Perlakuan

Rata-rata Lebar Space

Bowman Ginjal Tikus Putih

(µm)

Kontrol Negatif

11.654 ± 0,770a

Perlakuan 1

(Rhodamin B dosis 22,5 mg/kgBB)

2.474 ± 0.514b

Perlakuan 2

(Sakarin dosis 157,77 mg/kgBB)

11.08 ±0.65a

Perlakuan 3

(Rhodamin B + Sakarin) 1.2 ± 0.059c

Berdasarkan hasil analisa statistika terhadap lebar Bowman space ginjal

tikus putih (Rattus novergicus) pada Tabel 5.1 menunjukkan bahwa terdapat

perbedaan yang signifikan (p<0,05), kecuali pada kelompok perlakuan 2 (P2). Hal

ini menunjukkan bahwa terdapat penyempitan Bowman space pada gambaran

histopatologi ginjal kelompok perlakuan 1 (Gambar 5.2) dan gambaran

histopatologi ginjal kelompok perlakuan 3 (Gambar 5.4) dibandingkan dengan

kelompok kontrol negatif (K-) (Gambar 5.1).

Xenobiotik (Rhodamin dan sakarin) yang masuk melalui saluran

pencernaan akan diabsorbsi oleh duodenum dari usus halus dan selanjutnya

ditranspor melalui pembuluh darah kapiler mesenterika menuju vena porta

hepatica menuju hati sebelum ke sirkulasi sistemik (Staf Pengajar Farmakologi,

2004). Xenobiotik yang masuk dalam tubuh akan dimetabolisme di hati,

kemudian di ekskresikan oleh ginjal (Wirasuta dan Nurini, 2006). Rhodamin B

dan sakarin dimetabolisme di dalam hati melalui dua tahapan. Menurut Sobinoff,

et al. (2012) Tahap I: oksidasi yang dikatalis oleh sekelompok enzim yang

44

dinamakan monooksigenase/Sitokrom P450. Tahap II: senyawa hasil dari

produksi fase I diubah menjadi berbagai metabolit polar yang spesifik.

Rhodamin B (tetraethyl-3’,6’-diaminofluran) masuk ke dalam tubuh

melalui proses ingesti dan selanjutnya akan diserap oleh vena mesenterika dan

melalui vena porta hepatika akan dimetabolisme di hepar. Proses metabolisme

rhodamin B paling utama terjadi melalui tahap satu metabolisme. Rhodamin akan

dimetabolisme melalui fase oksidasi dan hidrolisis dengan bantuan enzim

Cytochrome P450 (CYP). Proses ini disebut dengan de-etilasi, dimana rhodamin

akan dipecah menjadi 3’,6’-diaminofluoran dan N,N’-diethyl-3’,6’

diaminofluoran (Webb, et al., 2014). Senyawa tersebut merupakan senyawa

radikal yang dapat beredar melalui pembuluh darah hingga merusak jaringan

tubuh termasuk ginjal. Metabolisme rhodamin B pada fase ini juga mengaktivasi

senyawa klorin (Cl) dengan bantuan enzim P-450 (CYP-450) (Lu Yongke &

Caderbaum A, 2008). Klorin (Cl) termasuk senyawa halogen dan radikal, senyawa

halogen sangat berbahaya dan memiliki reaktivitas yang tinggi untuk mencapai

kestabilan dalam tubuh dengan menyerang molekul terdekat dan mencari

pasangan elektron sehingga akan merusak bentuk molekul tersebut. Akibat dari

aktivitas radikal senyawa klorin (Cl) maka sel-sel makromolekul seperti protein,

karbohidrat, lemak dan asam nukleat akan hancur yang menimbulkan efek toksik

dan menyebabkan kerusakan sel tubuh (Manurung, 2011).

Sakarin merupakan zat karsinogenik yang dapat menyebabkan kanker

setelah tubuh terpapar 5-10 tahun. Sakarin merupakan xenobiotik yang dapat

menjadi sumber ROS (Reactive Oxygen Species). Dalam proses metabolisme fase

45

satu sakarin membutuhkan lebih banyak molekul O2 untuk proses oksidasi

sehingga terbentuk radikal superoxide (O2-) yang dapat memicu stres oksidatif.

Menurut Sobinoff, et al. (2012) xenobiotik yang dimetabolisme oleh sitokrom

P450 akan menghasilkan superoksida (O2-). Superoksida (O2

-) jika bereaksi

dengan SOD maka akan membentuk H2O2 tetapi jika O2- bereaksi dengan Fe maka

akan terbentuk hidroksi radikal. Hidroksi radikal ini yang akan menyebabkan stres

oksidatif. Amin & Almuzafar (2015) Menambahkan bahwa pembentukan radikal

bebas (O2-) dari metabolisme sakarin dapat menyebabkan perubahan fungsi hati

dan ginjal.

Rhodamin B dan sakarin dapat menyebabkan kerusakan pada sel tubuh.

Kerusakan juga dapat terjadi pada sel ginjal, dimana ginjal merupakan organ yang

berfungsi mengeksresikan zat-zat sisa metabolisme melalui filtrasi glomerulus,

reabsorbsi dan augmentasi tubulus kemudian dikeluarkan dari dalam tubuh

melalui urin. Kerusakan pada sel ginjal menyebabkan adanya respon tubuh untuk

mempertahankan keadaan normal sel salahsatunya yaitu dengan melakukan

hipertropi sel.

Hipertropi adalah kerusakan jaringan yang ditandai dengan pertambahan

ukuran organ akibat bertambahnya ukuran sel. Karakteristik dari hipertropi dapat

dilihat dengan mengecilnya lumen pada tubulus dan membesarnya sel-sel tubulus.

Hipertropi glomerulus terjadi karena adanya akumulasi senyawa yang bersifat

toksik, walaupun konsentrasinya rendah namun dengan paparan yang cukup lama

dalam tubuh dapat menyebabkan kerusakan (Takashima dan Hibiya, 1995).

Paparan zat toksik dalam jangka waktu yang cukup lama dapat menyebabkan

46

hipertropi pada tubulus ginjal. Hipertropi pada tubulus ginjal disebabkan karena

beban kerja yang berat menggantikan fungsi tubulus lain yang telah hancur dan

rusak, sehingga hemostasis tubuh tidak terganggu meskipun sejumlah tubulus

dalam nefron yang lain telah rusak (Arifin, et al., 2004).

Rhodamin B dan sakarin merupakan xenobiotik karena senyawa kimia

yang dimilikinya merupakan senyawa asing bagi tubuh. Rhodamin B dan sakarinn

apabila demetabolisme didalam tubuh akan mengahsilkan senyawa radikal.

Senyawa radikal tersebut dapat menyebabkan kerusakan pada sel tubuh salah

satunya yaitu pada sel pembuluh darah, sehingga menyebabkan hemoragi.

Menurut Sobinoff, et al. (2012), zat xenobiotik yang dimetabolisme dalam tubuh

oleh sitokrom P450 akan menghasilkan radikal bebas, radikal bebas kemudian

akan menginduksi pembentukan ROS dan meyebabkan stres oksidatif. Skholnik,

et al. (2011) stres oksidatif merupakan kondisi dimana terjadi peningkatan ROS

(Reactive Oxygen Species) yang akan menyebabkan kerusakan sel, jaringan atau

organ. Birben, et al. (2012) Menambahkan stres oksidatif yang tinggi akan

menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid membran sel dan merusak organisasi

membran sel sehingga mengakibatkan hilangnya fungsi seluler secara total.

Perubahan yang terjadi pada glomerulus akan mengakibatkan terganggunya fungsi

produk filtrat dan kontrol komposisi filtrat sendiri, sementara perubahan pada

tubula mengakibatkan terganggunya proses reabsorbsi dari filtrat (Bevelander dan

Ramely, 1998).

47

5.2 Pengaruh Toksisitas Rhodamin B dan Sakarin terhadap Aktivitas Superoxide

Dismutase (SOD) dalam Ginjal Tikus Putuh (Rattus norvegicus)

Pengukuran aktivitas Superoxide Dismutase (SOD) ginjal tikus putih

(Rattus norvegicus) pada setiap kelompok perlakuan dilakukan dengan

menggunakan metode spektrofotometri dengan mengukur nilai absorbansi pada

panjang gelombang 580 nm (Lampiran 9). Hasil uji aktivitas SOD selanjutnya

dilakukan analisa secara kuantitatif dengan menggunakan uji one way analysis of

variant (ANOVA) dan dilakukan uji lanjutan dengan uji Tukey seperti yang

ditunjukkan pada Tabel 5.2.

Tabel 5.2 Rata-rata Aktivitas Superoxide Dismutase (SOD) Ginjal Tikus Putih

(Rattus norvegicus)

Perlakuan

Rata-rata Aktivitas

Superoxide

Dismutase

(SOD) (Unit/mL)

Aktivitas Superoxide Dismutase

(SOD)

Peningkatan

Terhadap

Kontrol Negatif

Penurunan

Terhadap

Kontrol Negatif

Kontrol Negatif

5,989 ± 0,370a - -

Perlakuan 1

(Rhodamin B dosis 22,5 mg/kgBB)

4,322 ± 0,366b - 27,83%

Perlakuan 2

(Sakarin dosis 157,77 mg/kgBB)

5,411 ± 0,240a - 9,65%

Perlakuan 3 (Rhodamin B + Sakarin) 3,167 ± 0,494c - 47,11%

Keterangan:Perbedaan notasi a,b,c menunjukkan adanya perbedaan yang

signifikan (p<0,05) antar kelompok perlakuan.

48

Berdasarkan hasil analisa statistika terhadap aktivitas Superoxide

Dismutase (SOD) ginjal tikus putih (Rattus novergicus) di atas (Tabel 5.2)

menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan (p<0,05) antara

kelompok perlakuan terhadap kelompok kontrol negatif (K-), kecuali pada

kelompok perlakuan 2 (P2) dengan induksi sakarin. Kelompok kontrol negatif

(K-) adalah kelompok kontrol tanpa perlakuan (tanpa pemberian rhodamin B dan

sakarin), kelompok kontrol negatif (K-) ini memiliki rata-rata aktivitas SOD

sebesar 5,989 ± 0,370Unit/mL. Aktivitas SOD pada kelompok kontrol negatif

(K-) digunakan sebagai standar penurunan aktivitas SOD pada kelompok

perlakuan.

Superoxide Dismutase (SOD) adalah salah satu antioksidan yang paling

kritis yang mempu memperbaiki efek tekanan (stress) oksidatif. Superoxide

Dismutase (SOD) berfungsi mengkatalisis perubahan superoksida menjadi

hidrogen peroksida dan oksigen (Nurhayati dkk., 2011). Superoxide Dismutase

(SOD) melindungi sel-sel tubuh dan mencegah terjadinya peradangan yang

diakibatkan oleh radikal bebas. Aktivias enzim Superoxide Dismutase (SOD)

memiliki peranan penting dalam sistem pertahanan tubuh, terutama terhadap

aktifitas senyawa oksigen reaktif yang menyebabkan stres oksidatif (Winarsi,

2007).

Kelompok perlakuan 1 (P1) yang diinduksi dengan rhodamin B dosis 22,5

mg/kgBB memiliki rata-rata aktivitas Superoxide Dismutase (SOD) sebesar 4,322

± 0,366Unit/mL. Berdasarkan hasil analisa statistik pada kelompok perlakuan 1

(P1) menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan sebesar 27,83%

49

dibandingkan dengan kontrol negatif (K-) sehingga ditandai dengan notasi yang

berbeda. Menurut Sulistina (2013) Rhodamin B termasuk dalam golongan

xenobiotik organoklorin dimana selama proses metabolisme tidak dapat diekskresi

dengan baik, apabila terakumulasi dapat menyebabkan sitotoksisitas sampai

dengan kematian sel. Menurut BPOM (2005), rhodamin B mengandung senyawa

klorin (Cl) yang sangat reaktif, apabila tertelan senyawa ini akan berusaha

mencapai kestabilan dalam tubuh dengan cara mengikat senyawa lain. Lemaire, et

al. (2010) menambahkan, Organoklorin dalam tubuh dapat menginduksi sistem

sitokrom P450 (CYP450) dan menurunkan aktivitas enzim antioksidan.

Kelompok perlakuan 2 (P2) diinduksi dengan sakarin dosis 157,77

mg/kgBB memiliki rata-rata aktivitas Superoxide Dismutase (SOD) sebesar 5,411

± 0,240 Unit/mL. Berdasarkan hasil analisa statistik pada kelompok perlakuan 2

(P2) menunjukkan adanya penurunan yang tidak signifikan sebesar 9,65% dari

kelompok kontrol negatif (K-), sehingga ditandai dengan notasi yang sama.Hal ini

dapat disebabkan karena hanya sebagian kecil jumlah sakarin yang di

metabolisme dalam tubuh dan lebih banyak yang langsung diekskresikan melalui

urin, sehingga radikal bebas yang dihasilkan menjadi lebih kecil. Menurut Irion

(2002) Sakarin tergolong zat xenobiotik karena termasuk substansi yang tidak

dibutuhkan untuk melaksanakan proses biokimia tertentu oleh sel dalam tubuh.

Amin & Almuzafar (2015) menambahkan bahwa sakarin dapat menyebabkan

perubahan fungsi hati dan ginjal karena pembentukan radikal bebas. Sebagian

besar sakarin yang masuk kedalam tubuh diekskresikan melalui urin dalam bentuh

utuh, dan sebagian kecil dimetabolisme di hati. Sakarin dosis tinggi (500 mg/kg

50

BB) dapat menghasilkan Reactive Oxygen Species (ROS) dan peroksidasi lipid

yang menyebabkan penurunan yang signifikan pada komponen antioksidan seluler

salah satunya yaitu SOD, sedangkan sakarin dalam dosis rendah memberikan efek

penurunan SOD yang lebih kecil dibandingkan dengan pemberian sakarin dosis

tinggi.

Kelompok perlakuan 3 (P3) diinduksi dengan kombinasi rhodamin B dosis

22,5 mg/kg BB dan sakarin dosis 157,77 mg/kgBB memiliki rata-rata aktivitas

Superoxide Dismutase (SOD) sebesar 3,167 ± 0,494 Unit/mL. Berdasarkan hasil

analisa statistika pada kelompok perlakuan 3 (P3) menunjukkan penurunan yang

paling signifikan sebanyak 47,11% dibandingkan dengan kelompok kontrol

negatif (K-) sehingga ditandai dengan notasi yang berbeda.Radikal bebas

rhodamin B dan sakarin yang merupakan kombinasi dari dua zat xenobiotik akan

bergabung dan bersinergi sehingga menghasilkan radikal bebas yang lebih

banyak. Hal ini dapat menyebabkan aktivitas SOD pada kelompok perlakuan 3

(P3) menjadi lebih rendah dibandingkan dengan kelompok perlakuan 1 (P1) dan

kelompok perlakuan 2 (P2). Hal tersebut menunjukkan bahwa pemberian

kombinasi rhodamin B dan sakarin akan menimbulkan efek toksik yang lebih

besar dibandingkan dengan pemberian rhodmin B atau sakarin saja.