ANALISIS IMUNOKIMIA UNTUK DETEKSI MIKROBA PATOGEN DAN SENYAWA RACUN

ANALISIS IMUNOKIMIA UNTUK DETEKSI MIKROBA PATOGEN DAN SENYAWA RACUNMarlia Singgih WibowoMarlia Singgih WibowoSekolah FarmasiSekolah Farmasi--ITBITB

Uji kehamilan menggunakan kit

Test Mikrobapatogen

Analisis Imunokimia

ImunoImuno (basis : (basis : sistemsistemimunimun mamaliamamalia))KimiaKimia ((reaksireaksi kimiakimia))

Analisis Imunokimia

AnalisisAnalisis berdasarkanberdasarkan reaksireaksi spesifikspesifikantaraantara Antigen (Ag) Antigen (Ag) dandan AntibodiAntibodi ((AbAb))

AnalisisAnalisis kualitatifkualitatif maupunmaupun kuantitatifkuantitatif

PenggunaanPenggunaan senyawasenyawa “label” “label” untukuntukvisualisasivisualisasi reaksireaksi

Apakah Antibodi&Antigen itu?

Reaksi spesifik antara Antigen (Ag) danAntibodi (Ab)

Ab dibentuk berdasarkan Ag yang menginduksinya

Antigen Antigen (antibody generator)(antibody generator)

ImunogenikImunogenik : : SenyawaSenyawa yang yang dapatdapatmemicumemicu sistemsistem imunimun mamaliamamaliaAntigenikAntigenik : : senyawasenyawa yangdapatyangdapatbereaksibereaksi spesifikspesifik dengandengan antibodiantibodiSyaratSyarat : BM : BM tinggitinggi (>5000), (>5000), strukturstrukturkimiakimia komplekskompleks. (. (bilabila BM BM rendahrendah dapatdapatdikonjugasidikonjugasi dengandengan protein carrier protein carrier agar agar bersifatbersifat imunogenikimunogenik))

Bahan yang dapat dianalisis(sebagai Antigen) dengan metodeimunokimia

MikrobaMikroba patogenpatogen dandanatauatau toksintoksin mikrobamikrobaToksinToksin tanamantanaman, , hewanhewanProtein Protein spesifikspesifik atauatausenyawasenyawa lain yang lain yang berstrukturberstruktur spesifikspesifikSenyawaSenyawa obatobat((narkotiknarkotik, , psikotropikpsikotropik))SenyawaSenyawa pestisidapestisida

Contoh obat XTC

AntibodiAntibodi

HasilHasil reaksireaksi humoralhumoral selsel B B dalamdalam limpalimpamamaliamamaliaSpesifikSpesifik terhadapterhadap antigen yang antigen yang memicunyamemicunyaImunoglobulinImunoglobulin : : IgAIgA, , IgDIgD, , IgMIgM, , IgEIgE, , IgGIgG

Struktur IgG dan IgM

IgG IgM

PrinsipPrinsip ReaksiReaksiReaksiReaksi imunologiimunologi didi dalamdalam mamaliamamalia ::

AgAb Reaksi primer

Reaksisekunder

Reaksi tersier(degranulasi,opsonisasi)

(Fiksasi komplemen, aglutinasi, presipitasi)

Label

VisualisasiVisualisasi ReaksiReaksi AgAg--AbAb

SUBSRAT

PRODUK (dapatdivisualisasi)

Kompleks

Ag-Ab-Label

SenyawaSenyawa ““LABELLABEL” ”

SenyawaSenyawa yang yang dikonjugasidikonjugasi padapadaantigen antigen atauatau antibodiantibodi untukuntuk dapatdapatmemmem--visualisasivisualisasi reaksireaksi AgAg--AbAbDapatDapat berupaberupa enzimenzim, , senyawasenyawaberfluoresensiberfluoresensi, , radioaktifradioaktif, , dlldll..ReaksiReaksi amplifikasiamplifikasi dapatdapat dilakukandilakukansehinggasehingga dapatdapat diukurdiukur secarasecarafisikokimiafisikokimia

BeberapaBeberapa contohcontoh “label”“label”

Enzim Enzim : Horse radish peroxidase (HRP), : Horse radish peroxidase (HRP), Alkaline PhosphataseAlkaline PhosphataseSenyawa berfluoresensiSenyawa berfluoresensi : Fluorescein, : Fluorescein, Umbelliferon, Tetrametil rodhaminUmbelliferon, Tetrametil rodhaminSenyawa LuminescenceSenyawa Luminescence : Luciferin: LuciferinPartikel Partikel : Tanned erythrocyte, Colloidal, : Tanned erythrocyte, Colloidal, microsphere , gold, silvermicrosphere , gold, silverVesikel Vesikel : liposom: liposom

MetodeMetode analisisanalisis imunokimiaimunokimiaberdasarkanberdasarkan labelnyalabelnya

EIAEIA (Enzyme (Enzyme ImmunoAssayImmunoAssay))ELISAELISA (Enzyme Linked(Enzyme Linked--ImmunosorbentImmunosorbent Assay)Assay)RIARIA (Radio (Radio ImmunoAssayImmunoAssay))IFA IFA ((ImmunoFluorescenceImmunoFluorescence Assay)Assay)LIALIA (Luminescence (Luminescence ImmunoAssayImmunoAssay))

Bahan yang diperlukan dalam reaksi Ag-Ab dalam analisis imunokimia

AntigenAntigenAntibodiAntibodiMedia Media penyanggapenyangga reaksireaksiLarutanLarutan DaparDapar pelarutpelarutLarutanLarutan DaparDapar pencucipencuciSenyawaSenyawa “Label”“Label”SubstratSubstratSenyawaSenyawa penghentipenghenti reaksireaksiInstrumenInstrumen pendeteksipendeteksi hasilhasil reaksireaksi

Suatu larutan atau suspensi antigen (dapat pula dilakukan sebaliknya yaitu dengan memasukkan antibodi terlebih dahulu) dimasukkan kedalam sumur pelat solid, lalu diinkubasi pada suhu tertentu selama waktu tertentu pula (sesuai dengan jenis antigen dan antibodi yang digunakan), lalu ditambahkan larutan pem”blok” untukmenghindari ikatan non-spesifik

Larutan antibodi B (anti-antigen A) dimasukkan kedalam sumur pelat tersebut setelah proses pencucian. Kompleks A-B akan terbentuk dengan kuat. Suatu konjugat antibodi C (anti-antibodi B) dengan suatu Label (misalnya suatu Enzim) ditambahkan sehinggaakan membentuk kompleks A-B-C-Enz.

Penambahan substrat tertentu akan menyebabkan terbentuknya warna dan reaksi warna dihentikan dengan penambahan senyawa lain agar warna yang terbentuk stabil pada saat pengukuran.

Warna yang terbentuk diukur intensitasnya dengan menggunakan alat spektrofotometer. Konsentrasi yang terukur akan sebanding dengan antigen yang terikat pada reaksi yang terjadi

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalammenggunakan kit pereaksi imunokimia:

ApakahApakah kit kit tersebuttersebut dilengkapidilengkapi dengandenganbrosurbrosur /booklet yang /booklet yang lengkaplengkap tentangtentangmetodemetode analisisanalisis yang yang digunakandigunakan??ApakahApakah sudahsudah adaada parameter parameter evaluasievaluasidandan validasivalidasi yang yang dilakukandilakukan ??MengevaluasiMengevaluasi sumbersumber--sumbersumberkesalahankesalahan yang yang mungkinmungkin terjaditerjadiSeleksiSeleksi awalawal kit kit pereaksipereaksi : : padapada tahaptahapiniini perluperlu dilakukandilakukan

SeleksiSeleksi awalawal kit kit pereaksipereaksi : : padapada tahaptahap iniini perluperludilakukandilakukan evaluasievaluasi terhadapterhadap kurvakurva standard standard dandanapakahapakah adaada reduksireduksi data yang data yang dilakukandilakukan, , Parameter evaluasi : accuracy, precision, sensitivity, selectivity, specificityMemahamiMemahami prosedurprosedur percobaanpercobaan : : EfekEfek matriksmatriks, , perolehanperolehan kembalikembali, , reaksireaksi silangsilang, , pengaruhpengaruh dandanpenangananpenanganan sample, sample, modifikasimodifikasi prosedurprosedur, , modifikasimodifikasi teknisteknis assay.assay.Pengembangan data validasi : rentang normal, ujiterhadap kondisi abnormal, stimulasi, supresi, rentang QC

SumberSumber kesalahankesalahan dalamdalamanalisisanalisis imunokimiaimunokimia

KesalahanKesalahanRandom/Random/AcakAcak(imprecision)(imprecision)KesalahanKesalahansistemiksistemik(inaccuracy)(inaccuracy)

KesalahanKesalahan acakacakPipetingPipeting : : masalahmasalah desaindesain pipetpipet ituitu sendirisendiri, , caracaramenggunakanmenggunakan dandan halhal teknisteknis dalamdalam penggunaanpenggunaanpipetpipet (volume yang (volume yang dikeluarkandikeluarkan, , dlldll))PemisahanPemisahan padatanpadatan daridari cairancairan : : prosesproses pembtknpembtknendapanendapan yang yang tergantungtergantung padapada waktuwaktu, , kecepatankecepatan, , suhusuhu, , dlldll, , pencucianpencucian yang yang tidaktidaksempurnasempurna, , dlldll..KondisiKondisi ReaksiReaksi BiokimiaBiokimia : : konstantakonstantakesetimbangankesetimbangan antibodiantibodi, , waktuwaktu, , suhusuhuJumlahJumlah radioaktifradioaktif : : untukuntuk prosesproses RIARIAIntensitasIntensitas fluoresensifluoresensi yang yang terjaditerjadi : : untukuntuk prosesprosesIFAIFAKesalahanKesalahan spektrofotometrikspektrofotometrikStabilitasStabilitas pereaksipereaksi

KesalahanKesalahan sistemsistem

KesalahanKesalahan mempipetmempipet : : masalahmasalah kalibrasikalibrasialatalat, , bentukbentuk pipetpipet, , dlldllInterferensiInterferensi dalamdalam reaksireaksi : : terjadinyaterjadinya nonnon--specific bindingspecific binding, , inhibisiinhibisi enzimenzim, , pendaranpendarancahayacahaya, , adanyaadanya pengaruhpengaruh enzimenzim endogen, endogen, pengaruhpengaruh obatobat lain yang lain yang digunakandigunakan , , pengaruhpengaruh senyawasenyawa endogen endogen lainnyalainnya((bilirubinbilirubin, , dlldll))EfekEfek matriksmatriks