analisis cemaran daging babi pada produk sosis sapi yang...

i

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA

PRODUK SOSIS SAPI YANG BEREDAR DI

WILAYAH BUMI SERPONG DAMAI

MENGGUNAKAN METODE REAL TIME

POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR)

SKRIPSI

VESTY ANIS TRIANA

1112102000002

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

Februari 2017

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA

PRODUK SOSIS SAPI YANG BEREDAR DI

WILAYAH BUMI SERPONG DAMAI

MENGGUNAKAN METODE REAL TIME

POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh Sarjana Farmasi

VESTY ANIS TRIANA

1112102000002

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

Februari 2017

vi

ABSTRAK

Nama : Vesty Anis Triana

Program Studi : Farmasi

Judul Penelitian : Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk Sosis

Sapi Yang Beredar Di Wilayah Bumi Serpong

Damai (BSD) Menggunakan Metode Real Time

Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Status kehalalan dalam produk makanan olahan yang berlabel halal masih sangat

diragukan. Banyaknya kasus pencemaran daging babi terhadap produk makanan

olahan berlabel halal menjadikan alasan utama peneliti untuk mengidentifikasi hal

tersebut. Penelitian ini dilakukan untuk menganalisis cemaran daging babi pada

produk sosis sapi yang beredar di wilayah Bumi Serpong Damai (BSD)

menggunakan metode Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Real

Time PCR dengan tekhnik amplifikasi DNA adalah suatu metode dalam

mendeteksi DNA mitokondria (mtDNA) didalam gen target yang spesifik karena

tekhnik ini dapat menghasilkan DNA dalam jumlah jutaan kalinya sehingga

memungkinan DNA mitokondria (mtDNA) dapat terdeteksi dengan mudah di

dalam gen target. Real Time PCR dengan menggunakan primer spesifik DNA sapi

dan primer spesifik DNA babi masing-masing menghasilkan kurva amplifikasi

dengan nilai Cp 11.31 dan 16.31. Hasil kurva amplifikasi Real Time PCR dengan

menggunakan primer spesifik babi terhadap sampel sosis sapi menunjukkan tidak

terjadinya proses amplifikasi sehingga tidak ada nilai Cp yang dihasilkan. Hal ini

menunjukkan bahwa pada sampel sosis sapi yang beredar di wilayah BSD tidak

mengandung DNA daging babi.

Kata kunci : Halal, sosis sapi, daging babi, Real Time PCR.

vii

ABSTRACT

Name : Vesty Anis Triana

Program study : Pharmacy

Title of research : Analysis of Pork Contamination in Beef Sausage

Product Which Are Available in Bumi Serpong

Damai (BSD) Using Real Time Polymerase Chain

Reaction (RT-PCR) Method

Halal status in processed food products which labeled as halal is still doubtful.

Many cases of pork contamination in processed food products labeled as halal are

the main reason for researcher to identify them. This study was conducted to

analyze pork contamination in beef sausage products which distributed in the

Bumi Serpong Damai (BSD) region using Real Time Polymerase Chain Reaction

(RT-PCR) method. Real Time PCR with DNA amplification technique is a

method to examine the mitochondrial DNA (mtDNA) gene in a specific target

because of this technique can produce DNA in large quantities so that

mitochondrial DNA (mtDNA) can be detected easily in the target gene. Real Time

PCR using bovine specific primers and porcine specific primers respectively

produce amplification curve with the Cp value 11:31 and 16:31. The results of

Real Time PCR amplification curves by using porcine specific primers to beef

sausage samples showed that no occurrence of the amplification process so that no

Cp values are generated. This shows that in samples of beef sausage which

distributed in the BSD region does not contain porcine DNA.

Keywords : Halal, beef sausage, pork, Real Time PCR.

viii

KATA PENGANTAR

Puji syukur senantiasa penulis panjatkan atas kehadirat Tuhan Yang Maha

Esa, Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya, sehingga saya

dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam

rangka menyelesaikan tugas akhir sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Farmasi di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Negeri

(UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Saya menyadari sangat banyak bantuan, dukungan, dan bimbingan dari

berbagai pihak yang selalu diberikan kepada penulis sejak masa perkuliahan

hingga masa pengerjaan dan penulisan skripsi ini. Pada kesempatan ini, penulis

ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Ibu Dr. Zilhadia M.Si., Apt, selaku pembimbing pertama serta bapak Chris

Adhiyanto. M.Biomed., Ph.D, selaku pembimbing kedua yang telah

membantu, membimbing dan memberikan ilmu kepada saya, serta

meluangkan waktu, tenaga dan pikiran dari awal penelitian sampai pada

penyusunan skripsi ini selesai.

2. Bapak Dr. H. Arief Sumantri, SKM., M.Kes, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3. Ibu Dr. Nurmeilis M.Si., Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Seluruh dosen yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan sehingga

penulis dapat menyelesaikan studi di Jurusan Farmasi Fakultas Keokteran

dan Ilmu Kesehatan Universitas Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Seluruh laboran Laboratorium Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah

membantu dalam hal penggunaan alat dan bahan selama penelitian.

6. Kedua orang tua saya, Bapak H.Badri dan Ibu Hj.Samiyah yang senantias

memberikan bantuan moril, materil dan spiritual sehingga skripsi ini dapat

ix

diselesaikan, serta kakak-kakak saya, Fanny Riandy dan Meilinda Shintia

Putri yang selalu menghibur saya.

7. Teman seperjuangan “Halalan Toyyiban” Safizah Ummu Harisah yang

selalu setia menjadi partner dalam menyelesaikan penelitian ini.

8. Teman-teman “UKHTI CANTIK” Nanur, Lila, Ayu, Safizah, Dwi, Rani

yang senantiasa menghibur serta memberikan masukan, dan semangat bagi

penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

9. Teman-teman Farmasi angkatan 2012 yang telah berjuang bersama-sama

selama perkuliahan hingga menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih belum sempurna. Oleh karena

itu, kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Penulis berharap

semoga hasil dari penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis

dan dunia ilmu pengetahuan, khususnya bagi mahasiswa farmasi serta bagi

masyarakat pada umumnya

Akhir kata, penulis berharap semoga Allah SWT mencatat dan memberikan

balasan yang berlipat ganda atas segala kebaikan semua pihak yang telah

membantu dalam nmenyelesaikan skripsi ini.

Ciputat,15 Januari 2017

Vesty Anis Triana

x

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS

AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Vesty Anis Triana

NIM : 1112102000002

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya,

dengan judul :

ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA PRODUK SOSIS SAPI

YANG BEREDAR DI WILAYAH BUMI SERPONG DAMAI

MENGGUNAKAN METODE REAL TIME POLYMERASE CHAIN

REACTION (RT-PCR)

untuk dipublikasi atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada Tanggal : 15 Januari 2017

Yang menyatakan,

(Vesty Anis Triana)

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................... v

ABSTRAK ........................................................................................................... vi

ABSTRACT ........................................................................................................ vii

KATA PENGANTAR ....................................................................................... viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ..................... x

DAFTAR ISI ....................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiv

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xv

DAFTAR ISTILAH ......................................................................................... xvi

BAB I PENDAHULUAN ..................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 3

1.3 Tujuan Penelitian ................................................................................. 3

1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 4

2.1 Organel Sel .......................................................................................... 4

2.2 Asam Nukleat dan Nukleotida ............................................................ 5

2.3 DNA .................................................................................................... 6

2.3.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA .................................................. 6

2.3.2 Sifat Fisika DNA ....................................................................... 8

2.3.3 DNA Mitokondria ...................................................................... 8

2.3.4 Isolasi DNA ............................................................................. 10

2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................... 12

2.4.1 Tahapan PCR ........................................................................... 13

2.4.2 Komponen PCR ....................................................................... 14

2.5 Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) ........................... 16

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ........................................................ 19

3.1 Kerangka Konsep Penelitian ............................................................. 19

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................... 20

3.2.1 Tempat Penelitian .................................................................... 20

3.2.2 Waktu Penelitian ...................................................................... 20

3.3 Alat dan Bahan .................................................................................. 20

3.3.1 Alat .......................................................................................... 20

3.3.2 Bahan ....................................................................................... 20

3.4 Prosedur Penelitian ............................................................................ 21

3.4.1 Pengambilan Sampel ................................................................ 21

xii

3.4.2 Isolasi DNA ............................................................................. 21

3.4.3 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV ...... 22

3.4.4 Amplifikasi DNA Menggunakan Real Time PCR ................... 23

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 24

4.1 Isolasi DNA ........................................................................................ 24

4.2 Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan Sampel Sosis

Sapi Menggunakan Primer Sapi dan Babi pada Real Time PCR ....... 27

4.2.1 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan

NTC Menggunakan Primer Sapi ............................................ 29

4.2.2 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Sosis Sapi, dan

NTC Menggunakan Primer Sapi ............................................. 30

4.2.3 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, dan

NTC Menggunakan Primer Babi ............................................. 31

4.2.4 Hasil Amplifikasi DNA Daging Babi, Sosis Sapi, dan

NTC Menggunakan Primer Babi ............................................. 32

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 34

5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 34

5.2 Saran ................................................................................................... 34

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 35

LAMPIRAN ........................................................................................................ 38

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 3.1 Urutan Basa Primer dan Universal Probe Library Babi dan Sapi

(Roche®) dengan Modifikasi ............................................................. 21

Tabel 4.1 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA .......................................... 26

Tabel 4.2 Program Dual Color Hydrolysis Probe-UPL Probe 96-II ................. 28

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Sel Eukariot dan Prokariotik .......................................................... 4

Gambar 2.2 Struktur Basa Nitrogen Purin dan Pirimidin .................................. 6

Gambar 2.3 Skema Double Helix Model ........................................................... 7

Gambar 2.4 Struktur Mitokondria ...................................................................... 9

Gambar 2.5 Tahapan Polymerase Chain Reaction .......................................... 14

Gambar 2.6 Bentuk Kurva Real Time PCR ..................................................... 17

Gambar 4.1 Kurva Amplifikasi Daging Sapi, Daging Babi dan NTC

Menggunakan Primer Sapi ........................................................... 29

Gambar 4.2 Kurva Amplifikasi Daging Sapi, Sosis Sapi dan NTC

Menggunakan Primer Sapi ........................................................... 30

Gambar 4.3 Kurva Amplifikasi Daging Sapi, Daging Babi dan NTC

Menggunakan Primer Babi ........................................................... 31

Gambar 4.4 Kurva Amplifikasi Daging Babi, Sosis Sapi dan NTC

Menggunakan Primer Babi ........................................................... 32

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA ..................................... 38

Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer ..................................... 40

Lampiran 3. Perhitungan TM (Melting Temperature) Primer .......................... 41

Lampiran 4. Campuran Reaksi Mastermix Untuk Amplifikasi DNA .............. 42

Lampiran 5. Kurva Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, Sosis Sapi

dan NTC Menggunakan Primer Sapi ........................................... 43

Lampiran 6. Kurva Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, Sosis Sapi

dan NTC Menggunakan Primer Babi ........................................... 45

xvi

DAFTAR SINGKATAN

AFL : Arbitrary Fluorescence Level

ATP : Adenosine Triphosphate

CP : Crossing Point

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP : Deoxycytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic Acid

dNTP : Deoxyribonuleaside Triphosphate

dTTP : Deoxythmidine Triphosphate

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic Acid

kDa : kilo Dalton

mtDNA : mitochondrial Deoxyribonucleic Acid

NLS : Nuclei Lysis Soluition

PCR : Polymerase Chain Reaction

PPS : Protein Precipitation Solution

RNA : Ribonucleic Acid

rRNA : ribosomal Ribonucleic Acid

RT-PCR : Real Time Polymerase Chain Reaction

Tm : Melting Temperature

tRNA : transfer Ribonucleic Acid

SDS : Sodium Dedocyl Sulfate

UPL : Universal Probe Library

1

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Islam telah menetapkan dasar tentang halal dan haram. Sesuatu dikatakan

halal jika tidak ada satu pun yang mengharamkannya. Dalam Islam, halal adalah

segala sesuatu yang diperbolehkan Allah sedangkan haram adalah segala sesuatu

yang dilarang Allah. Islam juga memberikan penjelasan tentang makanan yang

halal dan haram (Qardhawi, 1993) yang tercantum pada beberapa surat dalam Al-

Qur’an (Al-Baqarah : 173, Al-An’am : 145, Al Maidah : 3, dan An Nahl : 115).

Sesungguhnya Allah hanya mengharamkan bagimu bangkai, darah, daging

babi, dan binatang yang (ketika disembelih) disebut (nama) selain Allah. Tetapi

barang siapa dalam keadaan terpaksa (memakannya) sedang ia tidak

menginginkannya dan tidak (pula) melampaui batas, maka tidak ada dosa

baginya. Sesungguhnya Allah Maha Pengampun lagi Maha Penyayang. (Al

Baqarah (2) : 173)

Pada dalil tersebut dijelaskan bahwa salah satu makanan yang diharamkan

adalah babi. Ditinjau dari aspek kesehatan, konsumsi makanan halal terutama

daging harus lebih dipertimbangkan. Hal ini didasarkan pada penelitian yang

menemukan bahwa daging babi yang diharamkan oleh ajaran Islam memiliki

beberapa resiko terhadap kesehatan seperti adanya cemaran mikroba dan parasit

Salmonella sp, Yersinia enterocolitica, Toxoplasma gondii dan Trichinella sp dan

resiko kesehatan lainnya (Anugrah et al., 2014). Daging babi merupakan salah

satu daging yang sering digunakan pada produk olahan makanan seperti sosis.

Sosis adalah produk olahan daging yang pada akhir-akhir ini semakin banyak

digemari dan dikonsumsi oleh seluruh masyarakat khususnya anak-anak. Daging

yang umum digunakan pada produk sosis adalah daging sapi dan daging ayam.

Harga daging babi yang relatif lebih murah sering digunakan sebagai bahan

campuran dalam pembuatan sosis yang dijual dengan label halal. Hal ini semata-

1

2


mata dilakukan demi alasan keuntungan tanpa memperhatikan hak konsumen

khususnya orang muslim akan syarat kehalalan suatu makanan (Susanto et al.,

2014).

Adanya kasus pencampuran atau pemalsuan daging babi terhadap produk

olahan sosis sapi sering terjadi di tengah masyarakat. Produk olahan lain seperti

bakso bercampur daging babi juga banyak ditemukan di tengah masyarakat.

Sebagai contoh, di Yogyakarta ditemukan bakso bercampur daging babi

(Yuningsih, 2010). Hal yang sama juga terjadi di kota Salatiga yang mana

diantara 10 sampel bakso sapi yang dianalisis terdapat 1 sampel yang positif

mengandung daging babi (Suparman et al., 2014).

Karena adanya kasus pemalsuan daging babi terhadap daging sapi maka

perlu dilakukan analisis cemaran daging babi pada produk olahan makanan lebih

lanjut. Produk olahan makan yang akan dianalisis pada penelitian ini adalah sosis

sapi yang beredar di wilayah Bumi Serpong Damai (BSD). BSD merupakan salah

satu kota satelit dan mandiri, dimana semua fasilitas tersedia dikota tersebut salah

satunya fasilitas perdagangan. Hal ini yang menjadikan dasar utama untuk

melakukan analisis terhadap sosis sapi yang beredar di wilayah BSD.

Salah satu metode analisis handal yang digunakan adalah Real Time

Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Dalam aplikasinya, RT-PCR telah

berkembang dalam menganalisis suatu bahan yang ada di dalam produk makanan

olahan dengan mengidentifikasi DNA genom dan mitokondria DNA dari bahan

tersebut (Mane et al., 2013). PCR dengan tekhnik amplifikasi DNA adalah suatu

metode pilihan dalam mendeteksi DNA mitokondria (mtDNA) didalam gen target

yang spesifik karena tekhnik ini dapat menghasilkan DNA dalam jumlah jutaan

kalinya sehingga memungkinan DNA mitokondria (mtDNA) dapat terdeteksi

dengan mudah di dalam gen target (Norrakiah et al., 2015). DNA mitokondria

(mtDNA) menjadi target amplifikasi dalam PCR karena mtDNA dapat bermutasi

dengan kecepatan tinggi dan mempunyai jumlah molekul mencapai ribuan dalam

satu sel sehingga dapat memungkinkan dilakukan analisis dari sampel (Suparman

et al., 2014). Dengan demikian, identifikasi DNA sangat baik digunakan untuk

melacak sejumlah kecil kandungan babi yang ada di dalam produk makanan

olahan.

3


Oleh karena itu, penelitian ini difokuskan kepada identifikasi DNA babi

dalam produk sosis sapi yang beredar di wilayah BSD, Tangerang Selatan dengan

menggunakan metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction).

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah sosis sapi yang beredar di

wilayah Bumi Serpong Damai (BSD) tercemar oleh daging babi.

1.3 Tujuan Penelitian

Menganalisis cemaran daging babi pada produk sosis sapi yang beredar di

wiliyah Bumi Serpong Damai (BSD) menggunakan metode Real-Time PCR.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah dapat mengetahui serta memberikan

informasi kepada masyarakat tentang keamanan dan kehalalan makanan dari

produk olahan daging terutama sosis sapi yang beredar di wilayah Bumi Serpong

Damai (BSD), Tangerang Selatan agar masyarakat lebih barhati-hati dalam

mengonsumsi produk olahan daging.

4


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Organel Sel

Sel adalah unit dasar bagi struktur dan fungsi organisme. Dalam suatu

struktural kehidupan, sel termasuk kedalam tingkat organisasi terendah yang dapat

melakukan semua aktivitas yang dibutuhkan untuk proses kehidupan. Semua sel

memiliki ciri-ciri tertentu. Misalnya, sel diselubungi oleh membran yang

meregulasi lalu-lintas materi antara sel dan lingkungannya. Setiap sel juga

menggunakan DNA sebagai informasi genetik (Campbell et al., 2008). Berbagai

jenis sel dapat dimanfaatkan dalam rekayasa genetika dan bioteknologi, tidak saja

sel prokariot yang merupakan sel tunggal sederhana seperti bakteri, akan tetapi

juga sel eukariot antara lain jamur, tanaman, dan hewan (Radji, 2011).

Sel Eukariotik dan Prokariotik

Gambar 2.1 Sel eukariotik dan prokariotik (Campbell et al., 2008)

4

5


Sel prokatiot, terutama bakteri dan virus merupakan sel yang sering kali

dimanipulasi dan dijadikan model dalam rekayasa genetika untuk mempelajari

struktur dan fungsi sel organisme yang lebih tinggi yaitu tumbuhan, hewan, dan

manusia. Genom bakteri terdiri dari molekul DNA berbentuk sirkular yang tidak

dikelilingi oleh membran inti, dan lebih sederhana dibandingkan dengan struktur

kromosom eukariot (Radji, 2011).

Sel eukariot memiliki struktur yang lebih kompleks dibandingkan dengan

sel prokariot. Sel eukariot selain memiliki organel nukleus, mitokondria, dan

kloroplas, juga memiliki membran internal yang melapisi nukleus dan vakuola.

Struktur sel eukariot yang sangat kompleks tersebut menunjukkan bahwa sifat dan

fungsi sel eukariot lebih kompleks dari pada sel prokariot. Struktur dan sifat sel

eukariot yang sangat rumit ini merupakan alasan kuat bahwa pada tahap-tahap

awal pengembangan rekayasa genetika lebih banyak menggunakan sel prokariot

sebagai model, karena lebih sederhana dan lebih mudah untuk direkayasa. Dewasa

ini para ahli biologi molekular telah banyak menggunakna sel eukariot untuk

mempelajari lebih dalam struktur dan fungsinya (Radji, 2011).

2.2 Asam Nukleat dan Nukleotida

Asam nukleat adalah suatu polinukleotida yang tersusun dari monomer-

monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan fosfodiester. Nukleotida

merupakan molekul yang tersusun dari gugus basa, gula, dan fosfat. Asam nukleat

merupakan biomolekul yang penting karna dapat mengatur proses kehidupan

setiap organisme makhluk hidup. Asam nukleat berfungsi sebagai penyimpan dan

pembawa informasi genetik ke dalam sel. Sel mempunyai dua jenis asam nukleat

yaitu DNA (asam deoksiribonukleat) yang berfungsi sebagai penyimpan informasi

dan RNA (asam ribonukleat) berperan sebagai ekspresi gen dan biosintesis protein

(Murray et al., 2006). Dalam ilmu biologi, asam nukleat digunakan sebagai

substrat karena berperan penting dalam proses replikasi, transkripsi, dan

rekombinasi pada DNA dengan reaksi enzimatis (Xiong et al., 2001).

6


2.3 DNA

2.3.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA

1. DNA termasuk dalam suatu kelas molekul organik yang disebut asam

nukleat. Subunit asam nukleat disebut nukleotida. Setiap nukleotida terdiri

dari:

a. Deoksiribosa , suatu gula berkarbon-5

b. Gugus fosfat, yang terikat pada karbon 5’ deoksiribosa

c. Basa nitrogen, yang terdiri dari empat jenis berbeda-dua purin dan dua

pirimidin

Gambar 2.2 Struktur basa nitrogen purin dan pirimidin (Watson, 1953)

2. Nukleotida saling dihubungkan oleh ikatan fosfodiester antara fosfat pada

satu nukleotida dan gula pada nukleotida berikutnya. Gula dan fosfat

berselang-seling membentuk “tulang punggung” yang panjang bagi rantai

nukleotida atau polinukleotida. Basa-basa memanjang dari karbon 1’ setiap

gula pada rantai.

3. Kedua ujung polinukleotida berbeda satu sama lain, membuatnya menjadi

suatu molekul polar. Ujung-ujung tersebut dirancang menurut nomor karbon

pada gula. Gugus fosfat pada ujung 5’ dan gugus hidroksil pada ujung 3’.

7


Gambar 2.3 Skema double helix model (Watson, 1983)

4. DNA heliks ganda.

a. Struktur DNA disimpulkan pada awal tahun 1950-an oleh James Watson

dan Francis Crick. Mereka membangun sebuah model DNA dengan

menggunakan informasi dari percobaan yang dilakukan oleh Rosalind

Franklin dan ilmuan lain.

b. DNA adalah suatu molekul untai ganda atau rangkap dua, terdiri atas dua

pasang polinukleotida. Pasangan tersebut merupakan hasil interaksi

spesifik antara basa-basa di setiap unit DNA. Strukturnya menyerupai

tangga tali dengan gula-fosfat sebagai tulang punggungnya membentuk

“sisi tangga” dan pasangan basa membentuk “anak tangga” yang kaku.

c. Molekul DNA memuntir untuk membentuk suatu heliks dengan 10 basa

per tikungan heliksnya.

d. Kedua untai DNA berpasangan dengan polaritas 5’ ke 3’ yang

berlawanan. Dengan kata lain kedua untai adalah antiparalel. Ujung 5’ di

satu untai berpasangan dengan ujung 3’ di untai yang lain, dan kedua

untai tersebut berjalan dalam arah yang berlawanan.

5. Kedua untai molekul DNA dipasangkan oleh pasangan basa komplementer.

Setiap nukleotida di satu untai berpasangan dengan satu nukleotida spesifik

(komplementer) pada untai yang lain.

a. Purin dan pirimidin. Basa purin (yaitu adenin, guanin) lebih besar dan

selalu berpasangan dengan basa pirimidin (yaitu timin, sitosin) yang

8


lebih kecil. Sementara khusus adenin (A) selalu berpasangan dengan

timin (T) dan guanin (G) selalu berpasangan dengan sitosin (S).

b. Pasangan basa komplementer dihasilkan dari pembentukan ikatan

hidrogen (ikatan nonkovalen yang lemah) antara pasangan yang spesifik.

Setiap pasangan A-T membentuk dua ikatan hidrogen, sementara

pasangan G-C membentuk tiga ikatan hidrogen. Suatu molekul DNA

distabilisasi oleh sejumlah besar ikatan hidrogen disepanjang untainya.

6. Variasi DNA ditemukan pada rangkaian linear pasangan basa disepanjang

molekulnya. Keanekaragaman rangkaian yang menakjubkan dibentuk dalam

molekul DNA yang panjangnya dapat mencapai ribuan hingga jutaan

pasangan basa (base pairs = bp) (Bresnick, 2003).

2.3.2 Sifat Fisika DNA

Untai ganda DNA akan terpisah menjadi untai tunggal dengan adanya

pemanasan pada suhu tinggi ( >900C ) yang biasa dikenal dengan istilah

denaturasi. Denaturasi dapat dipengaruhi oleh pH ekstrim (pH < 3 atau pH > 10).

Proses denaturasi DNA bersifat reversibel sehingga untai yang terpisah bisa

bergabung kembali (renaturasi) pada suhu ±600C. DNA menyerap sinar UV pada

panjang gelombang 260 nm (Yuwono, 2009).

2.3.3 DNA Mitokondria

DNA mitokondria (mtDNA) merupakan molekul polimer rantai ganda, satu

rantai kaya akan molekul guanin atau heavy (H) strand, rantai lainnya kaya akan

sitosin atau light (L) strand. mtDNA mengkode 13 protein, 22 RNA transfer

(tRNA), dan 2 RNA ribosom (rRNA), yaitu 12S rRNA dan 16S rRNA (Syukriani,

2012).

DNA mitokondria (mtDNA) terletak didalam sitoplasma sel eukariota.

Struktur organel ini berupa kantung yang diselaputi oleh dua membran yaitu

membran luar dan membran dalam, selain itu memiliki dua kompartemen yaitu

matriks mitokondria (yang diselimuti langsung oleh membran dalam) dan ruang

antar membran (Gambar 2.4). Membran luar mengandung sejumlah protein

transpor (yang disebut porin) dan enzim-enzim yang terlibat dalam biosintesis

9


lipid dan metabolisme mitokondria. Porin ini membentuk saluran berukuran relatif

besar pada lapian bilayer membran luar yang memungkinkan lolosnya ion atau

molekul berukuran 5 kDa atau kurang. Ion atau molekul tersebut bebas memasuki

ruang antar membran namun sebagian besar tidak dapat melewati membran dalam

yang bersifat impermeabel (Susmiarsih, 2010).

Gambar 2.4 Struktur Mitokondria

Membran dalam memiliki struktur melekuk, melipat ke bagian matriks

mitokondria, yang dikenal sebagai krista. Struktur melekuk ini sangat membantu

dalam meningkatkan luas permukaan membran dalam sehingga meningkatkan

kemampuannya menghasilkan ATP. Struktur yang melekuk ini juga membantu

mempercepat komponen matriks mencapai membran dalam. Membran dalam dan

matriks mitokondria terkait erat dengan aktivitas utama mitokondria yaitu terlibat

dalam pembentukan energi, oksidasi asam lemak dan siklus Krebs. Matriks

mitokondria mengandung protein (sekitar 67% dari seluruh protein mitokondria),

enzim, DNA mitokondria dan ribosom (Susmiarsih, 2010).

Fungsi mitokondria dalam sel adalah menghasilkan energi dalam bentuk

ATP (adenosin trifosfat). Sebagian besar ATP dihasilkan melalui proses

fosforilasi oksidatif. Energi yang dihasilkan ini digunakan sel untuk homeostatis,

regulasi, pembelahan, motilitas dan kematian (Susmiarsih, 2010).

10


2.3.4 Isolasi DNA

Analisis DNA menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction)

dikenal spesifik, reproduktif, dan sensitif. Namun tingkat keberhasilan tersebut

ditentukan oleh ada atau tidaknya DNA yang dihasilkan pada saat proses isolasi.

Kualitas DNA yang dihasilkan pada saat proses isolasi sangat penting untuk

menentukan keberhasilan analisis dengan menggunakan PCR (Polymerase Chain

Reaction). Molekul DNA yang sering digunakan dalam teknologi DNA

rekombinan adalah DNA plasmid dan DNA genom total dari sel bakteri. Isolasi

DNA adalah proses pemisahan DNA dari komponen-komponen penyusun sel

lainnya. (Nooratiny et al., 2013). Proses ini melibatkan penghancuran atau

pelisisan membran sel (lisis), pemisahan DNA dari protein sel, dan pemurnian

DNA (Kheyrodin et al., 2012). Berikut adalah uraian tahapan isolasi DNA:

1. Penghancuran Membran Sel (lisis)

Penghancuran membran sel bisa dilakukan secara fisik misalnya dengan

cara sonikasi, maupun dengan cara kimia yaitu dengan menggunakan enzim

lisozim, etilendiamin tetra asetat (EDTA), atau kombinasi dari keduanya

(Radji, 2011). Penggunaan lisozim biasanya untuk ekstraksi dan isolasi

DNA dari sel tumbuhan. EDTA merupakan zat yang dapat merusak

membran sel dengan cara mengikat ion Mg2+ yang berfungsi untuk

mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim

nuklease yang merusak asam nukleat (Izzah, 2014). Pada kondisi tertentu

pemecahan dinding sel cukup dilakukan dengan lisozim dan EDTA, akan

tetapi juga sering ditambahkan bahan lain yang dapat melisiskan dinding sel

antara lain detergent triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (SDS) (Radji,

2011). Sodium dodesil sulfat (SDS) merupakan detergent yang dapat

merusak integritas membran sel dengan cara mengikat lipid yang terdapat

pada membran sel (Izzah, 2014). Setelah sel lisis, tahapan selanjutnya

adalah memisahkan sel dibris dengan cara sentrifugasi sehingga

meninggalkan ekstrak sel dalam supernatan yang jernih (Radji, 2011).

11


2. Pemisahan DNA dari Protein Sel

Disamping DNA, ekstrak sel juga mengandung protein dan RNA dalam

jumlah yang cukup besar. Umumnya cara pemisahan DNA dilakukan

dengan penambahan larutan fenol atau campuran fenol dan kloroform

dengan perbandingan 1:1. Sedangkan untuk pengendapan protein dengan

cara sentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA

yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan RNA sehingga

perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA (Radji,

2011).

3. Pemurnian DNA

Tahap akhir dari isolasi DNA adalah proses pemurnian DNA. Molekul

DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara

presipitasi etanol. Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti

Na+), pada suhu -20oC etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan

baik sehingga mudah dipisahkan dengan cara sentrifugasi (Radji, 2011).

Pada umumnya, isolasi DNA dengan metode konvensional yang dijelaskan

sebelumnya cukup melelahkan karena membutuhkan waktu hingga beberapa jam

bahkan sampai beberapa hari (Izzah, 2014). Seiring berkembangnya ilmu

pengetahuan dan teknologi, metode isolasi DNA telah banyak dikembangkan dan

digunakan dalam sebuah penelitian. Salah satu metode yang mudah

pengerjaannya serta dapat menghasilkan DNA dengan kemurnian tinggi yaitu

dengan menggunakan metode kit komersial (Nishiguchi et al., 2002).

Metode kit komersial tidak hanya digunakan untuk mengisolasi DNA dari

produk makanan olahan tetapi juga dirancang untuk mengisolasi DNA yang

berasal dari sel darah putih, sel kultur jaringan hewan, jaringan tanaman, dan juga

dari bakteri gram negatif serta gram positif (Promega, 2014). Keuntungan yang

dihasilkan dari metode isolasi DNA dengan menggunakan kit diantaranya

menghemat waktu selama proses isolasi karena dapat menghasilkan jumlah DNA

hanya beberapa menit saja, meningkatkan sensitifitas dan keunggulan PCR dalam

menganalisis karena pada proses isolasi menghasilkan DNA dengan kemurnian

yang tinggi, mengurangi seminimal mungkin jumlah kontaminan pada DNA yang

12


dihasilkan, dan dapat digunakan untuk penelitian karena metode kit komersial

dapat memurnikan DNA yang berasal dari berbagai sumber (Roche, 2007).

Pengukuran kemurnian dan jumlah DNA hasil isolasi dapat dilakukan

melalui spektrofotometer yang didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultraviolet

yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan iradiasi sinar

UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm,

sedangkan penyerapan oleh protein pada panjang gelombang 280 nm.

Perbandingan absorbansi pada 260 nm dan 280 nm (A260/A280) dapat memberikan

validasi kemurnian DNA (Muladno, 2010). Hasil isolasi DNA dikatakan murni

jika nilai rasio A260/280 antara 1,8-2,0. Nilai rasio yang lebih rendah dari 1,8

menunjukkan adanya kontaminasi protein sedangkan nilai rasio melebihi 2,0

menunjukkan adanya kontaminasi RNA (Teare et al, 1997).

2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Pada tahun 1985, Kary Mullis mempublikasikan suatu teknik berbasis

biologi molekular yaitu PCR (Polymerase Chain Reaction) yang digunakan untuk

mengamplifikasi untai DNA spesifik menjadi ribuan sampai jutaan kopi untai

DNA (Viljoen et al., 2005). Untai DNA yang akan diamplifikasi terdiri dari empat

basa yaitu Adenin (A), Thymine (T), Cytosine (C), dan Guanin (G). Teknik

amplifikasi ini menggunakan metode enzimatis yang diperantai oleh sepasang

primer oligonukleotida (Hewajuli et al., 2014). Teknik PCR dapat meningkatkan

jumlah fragmen DNA hingga mencapai 106-107 kali dalam waktu singkat. Pada

setiap n siklus PCR, akan diperoleh sebanyak 2n kali DNA target (Radji, 2011).

Pelipat gandaan pada untai DNA spesifik ini membutuhkan suatu enzim yang

dikenal dengan polimerase. Polimerase adalah enzim yang mampu

menggabungkan DNA untai tunggal membentuk untaian molekul DNA yang

panjang pada reaksi polimerisasi (Hewajuli, et al., 2014). Keberhasilan PCR

sangat bergantung pada kemampuannya untuk hanya mengamplifikasi DNA

target dan tidak mengamplifikasi DNA non-target (Radji, 2011).

13


Reaksi amplifikasi DNA dimulai dengan melakukan tiga tahapan berurutan

yaitu denaturasi (pemisahan untai ganda menjadi untai tunggal), annealing

(penempelan primer pada DNA tamplate untai tunggal), dan extension

(pemanjangan untaian DNA oleh enzim polimerase). Panjang basa DNA primer

umumnya 15-20 basa nukleotida. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua

yaitu primer yang berada sebelum daerah target yang identik dengan sekuen DNA

pada ujung 5’-fosfat (forward) dan primer yang berada setelah daerah target yang

identik dengan sekuen DNA pada ujung 3’-OH (reverse) (Viljoen et al., 2005).

2.4.1 Tahapan PCR

Proses PCR untuk memperbanyak DNA terdiri dari serangkaian siklus suhu

yang berulang, dimana masing-masing siklus terdiri dari 3 tahap diantaranya:

1. Denaturasi DNA template

Tahap denaturasi DNA cetakan dilakukan pada suhu 94oC-96oC, dimana

pada tahap ini terjadi pemisahan DNA heliks ganda menjadi 2 untai tunggal

(Radji, 2011). Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sekuen DNA target. Jika

DNA target kaya akan basa G-C maka diperlukan suhu yang lebih tinggi,

hal ini dikarenakan ikatan hidrogen pada G-C lebih banyak dan kuat

dibandingkan dengan A-T. Selain itu suhu denaturasi juga tidak boleh

terlalu tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama karena dapat

mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim Taq

polymerase (Izzah, 2014).

2. Penempelan Primer (Annealing)

Tahap annealing oligonukleotida primer dengan untai tunggal DNA cetakan

pada ujung 3’ pada suhu 45oC-60oC. Primer adalah oligonukleotida untai

tunggal yang urutan nukleotidanya dirancang komplemeter dengan urutan

DNA cetakan pada daerah ujung 3’. Primer menentukan bagian fragmen

DNA yang akan diamplifikasi (Radji, 2011).

14


3. Reaksi Polimerasi (elongasi)

Tahap elongasi, yaitu pemanjangan primer menjadi suatu untai DNA baru

yang komplementer terhadap masing-masing DNA cetakan untai tunggal

oleh enzim DNA polimerase pada suhu 72oC (Radji, 2011).

Gambar 2.5 Tahapan Polymerase Chain Reaction

2.4.2 Komponen PCR

Beberapa komponen yang dibutuhkan dalam PCR (Polymerase Chain

Reaction) diantaranya DNA template, primer, enzim Taq DNA polymerase,

deoxyribonuleaside triphosphate (dNTP’s), buffer PCR, MgCl2 (Viljoen et al.,

2005).

1. DNA Template

Fungsi DNA template di dalam proses PCR sebagai cetakan untuk

pembentukan molekul DNA baru yang sama. DNA template ini dapat

berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal

di dalam DNA template tersebut mengandung fragmen DNA target yang

dituju (Handoyo et al., 2001).

2. Primer

Primer merupakan sebuah untai tunggal DNA spesifik yang biasa dikenal

dengan istilah oligodeoksiribonukleotida atau oligomer (Viljoen et al.,

2005). Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen

DNA target yang akan di amplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus

hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA

15


(Handoyo et al., 2001). Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan

urutan DNA yang telah diketahui (Viljoen et al., 2005). Melting temperatur

(Tm) primer yaitu temperatur dimana 50% untai ganda DNA terpisah yang

berkisar antara 50-65oC, panjang primer pada umumnya 18-30 basa

(Handoyo et al., 2001). Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan

menjadikan spesifisitas primer rendah dan ukuran primer yang pendek

kemungkinan terjadinya mispriming (penempelan primer di tempat lain

yang tidak diinginkan) tinggi. Hal ini akan menyebabkan berkurangnya

spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan berpengaruh pada

efektifitas dan efisiensi proses PCR (Handoyo et al., 2001).

3. Enzim Taq DNA Polymerase

Polimerase adalah suatu molekul komplek yang memiliki tiga aktivitas

diantaranya sebagai aktivitas polimerase dari ujung 5’-3’, aktivitas

exonuclease (aktivitas pengoreksian) dari ujung 3’-5’dan bisa juga dari 5’-

3’(Viljoen et al., 2005). Enzim DNA Polimerase berfungsi sebagai katalisis

untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR, enzim ini diperlukan

untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk

proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena

itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95oC. Aktivitas

polimerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut

diisolasi. Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri

Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat

dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polimerase (diisolasi dari bakteri

Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polimerase DNA berkaitan erat

dengan buffer PCR yang dipakai (Handoyo et al., 2001).

4. dNTP’s (Deoxyribonuleaside Triphosphate)

dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri dari dATP (deoksiadenosin

trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifisfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan

dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak

sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA.

dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer

16


membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template

(Handoyo et al., 2001).

5. Buffer PCR dan MgCl2

Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena

itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer pada

PCR adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR diperlukan

juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari MgCl2. MgCl2 bertindak

sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase.

Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan

template yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara).

Dalam proses PCR, konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas dan

perolehan proses. Pada umumnya, buffer PCR sudah mengandung senyawa

MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah dilakukan

variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang diperlukan (Handoyo et al., 2001).

2.5 Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) merupakan suatu teknik

modifikasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR) dalam ilmu biologi molekular

modern yang digunakan untuk mengidentifikasi DNA atau RNA dalam sampel.

Secara prinsip, Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) maupun

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu proses amplifikasi DNA

template yang dilakukan secara berulang sehingga menghasilkan jumlah copy

DNA sampai jutaan kalinya (Ma et al., 2006). Perbedaannya yaitu dalam

Polymerase Chain Reaction (PCR) pengamatan dilakukan pada akhir reaksi

amplifikasi dengan visualisasi di agar elektroforesis (Hewajuli et al., 2014).

Sedangkan dalam Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) terdapat

pelacak yang berfluoresensi (fluoresence dye) yang bisa menghasilkan data

flouresensi secara real time (Ma et al., 2006) sehingga pengamatan bisa dilakukan

secara langsung saat proses amplifikasi masih berjalan tanpa harus menunggu

semua siklus amplifikasi selesai. Disamping memiliki sensitivitas yang lebih

tinggi, kelebihan pengujian Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

dibanding dengan PCR konvensional adalah lebih dinamis, risiko kontaminasi

17


silang lebih sedikit, kemampuan aplikasi penggunaan untuk pengujian lebih

banyak (Hewajuli et al., 2014).

Instrumen Real Time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur

peningkatan pewarna (dye) flourescent yang berpendar ketika terikat dengan untai

ganda DNA. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragmen DNA hasil

amplifikasi dapat diamati secara seketika. Semakin banyak DNA yang terbentuk

semakin tinggi pula intensitas flourescent yang dihasilkan. Hasil peningkatan

flourescent digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa

yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil (Izzah,

2014).

Gambar 2.6 Bentuk Kurva Real-time PCR (Sumber. Bio-rad.com)

Dalam Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) umumnya terdapat

tiga jenis pelacak berflouresensi yang digunakan diantaranya flourescent DNA-

binding dyes, fluorescent probes, dan fluorescent primers. Flourescent DNA-

binding dyes merupakan jenis pelacak yang menghasilkan warna ketika terikat

dengan untai ganda pada DNA (sdDNA) contohnya seperti SYBR green (Ma et

al., 2006). Sedangkan flourescent probe merupakan suatu pelacak berbasis probe

yang umumnya adalah potongan DNA atau RNA yang diberi label nukleotida

18


yang mengandung 32P atau nukleotida yang berlabel fluoresen (Murray et al.,

2006), contohnya seperti Taqman probe, scorpions, dan molecular beacons. Probe

dirancang untuk mengikat urutan DNA yang diapit oleh sepasang primer. Probe

terdiri dari reporter yang terletak pada ujung 5’ yang merupakan pewarna

flouresensi dan quencher yang terletak pada ujung 3’ yang merupakan molekul

penerima sinyal flouresensi. Prinsip kerja dari probe yaitu sinyal yang

berfluoresensi dari reporter akan dilepaskan dan diidentifikasi ketika dua pewarna

terpisah melalui hibridisasi atau aktivitas nuklease (Ma et al., 2006).

19


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Kerangka Konsep Penelitian

19

Pengumpulan sampel sosis sapi, daging sapi

segar dan daging babi segar

Isolasi DNA sampel dan DNA

kontrol

Pengukuran kemurnian dan kuantitas DNA hasil

isolasi dengan Spektrofotometri UV

Amplifikasi DNA dengan Real Time PCR

Hasil

20


3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

3.2.1 Tempat penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Pangan dan Obat

Halal, Laboratorium Penelitian 2, dan Laboratorium Kimia Analisis Obat Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta.

3.2.2 Waktu Penelitian

Waktu pelaksanaan penelitian dilaksanakan dari bulan Oktober 2016 hingga

November 2016.

3.3 Alat dan Bahan

3.3.1 Alat

Real-Time PCR (LightCycler® 480 – Roche), Multiwell Plate 96 (Roche®),

Collection Tube 1,5 ml, Mikropipet 0,5-10 μl (1660550-Biorad), Mikropipet 20-

200 μl (Biorad), Mikropipet 100-1000 μl (1660553-Biorad), Mikrotip volume 10

μl, 200 μl, dan 1000 μl (Genfollower), Sentrifugator (5417R-Eppendrof),

Spektrofotometer UV DNA (DeNovix®), Digital Waterbath (SB-100 Eyela),

vortex, autoklaf, oven, air-dry, timbangan analitik, spatula, gelas beaker, kertas

perkamen, sterofoam, alumunium foil, lumpang alu.

3.3.2 Bahan

Daging sapi segar, daging babi segar, produk sosis sapi yang beredar di

wilayah BSD, satu set Wizard® Genomic DNA Purification Kit (017958-

Promega) (meliputi: Nuclei Lysis Solution, RNase, Protein Precipitation Solution,

DNA Rehydration Solution), LC 480 Probe Master (terdiri dari: Fast Start Taq

DNA Polymerase, dNTP mix, MgCl2 6,4 mM), Primer, Universal Probe Library

(tabel 3.1), Aquabidest, Isoparopanolol, Etanol Absolut.

21


Tabel 3.1

Urutan Basa Primer dan Universal Probe Library Babi dan Sapi (Roche®) dengan

Modifikasi

Nama Primer Runutan Basa

Babi Forward 5'- TGGGGTGTTTAGTGGGTTTG-3'

Reverse 5'- TCCTTGTACTATTCTCACCAGACCT -3'

UPL 5'- (FAM)-GACCCAGA-3'

Sapi Forward 5'- TGAGGGGGTGTGTTGAGTG -3'

Reverse 5'- TACTATTCGCACCCGACCTC -3'

UPL 5'- (FAM)-GACCCGA -3'

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel sosis sapi dilakukan secara acak dengan produsen

berbeda yang beredar di wilayah Bumi Serpong Damai (BSD).

3.4.2 Isolasi DNA

Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard® Genomic DNA

Purification Kit (Promega).

1. Preparasi Jaringan Hewan dan Pelisisan Sel

Sebanyak 20 mg daging sapi segar, daging babi segar, dan sampel sosis sapi

dihancurkan sampai halus menggunakan pisau steril, lumpang alu dan

blender. Masing-masing daging dan sampel dimasukkan ke dalam

mikrosentrifuge tube 1,5 ml lalu ditambahkan 600 μl Nuclei Lysis Solution.

Masing-masing campuran tersebut dihomogenkan selama 10 detik

kemudian diinkubasi pada suhu 650C selama 30 menit.

22


2. Degradasi RNA dan Presipitasi Protein

Masing-masing campuran yang sudah diinkubasi ditambahkan 3 μl larutan

RNAse lalu diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 30 menit.

Selanjutnya ditambahkan 200 μl Protein Precipitation Solution dan

divortex, kemudian didiamkan dalam ice selama 5 menit lalu disentrifugasi

dengan kecepatan 16.000 rpm selama 4 menit.

3. Presipitasi dan Pelarutan DNA

Supernatan yang terbentuk ditambahkan 600 μl isopropanol kemudian

dihomogenkan lalu disentrifugasi dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1

menit. Endapan yang terbentuk ditambahkan 600 μl etanol 70% kemudian

dihomogenkan lalu disentrifugasi kembali dengan kecepatan 16.000 rpm

selama 1 menit. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan etanol 70% lalu

endapan di keringkan selama 15 menit kemudian ditambahkan 100 μl DNA

Rehydration Solution, selanjutnya didiamkan selama 1 jam pada suhu 650C

dan disimpan pada suhu 40C.

3.4.3 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV

DNA yang sudah diisolasi dianalisis menggunakan Spektrofotometri UV

DNA (DeNovix). Proses analisis dilakukan dengan cara pada layar

Spektrofotometri UV DNA dipilih Nucleic Acid. Kemudian Sample port pada

Spektrofotometri UV DNA dibersikan menggunkan tisu dan sebanyak 1 μl DNA

Rehidration Solution yang digunakan sebagai blanko diteteskan di atas Sample

port, selanjutnya ditekan tombol “Blank” pada layar Spektrofotometri UV DNA.

Sample port dibersihkan kembali menggunakan tisu dan sebanyak 1 μl DNA

sampel diteteskan di atas Sample port, selanjutnya ditekan tombol “Measure”

pada layar Spektrofotometri UV DNA untuk mengukur kemurnian dan

konsentrasi DNA sampel. DNA dianalisis pada panjang gelombang 260 nm dan

280 nm. Tunggu beberapa detik kemudian akan muncul data kemurnian dan

konsentrasi DNA.

23


3.4.4 Amplifikasi DNA Menggunakan Real Time PCR

1. Pembuatan Primer 50 μM Dari Larutan Induk 100 μM

Sebanyak 50 μl larutan induk primer 100 μM dimasukkan kedalam

Microsentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 50 μl aquadest

kedalam masing-masing tube tersebut. Larutan tersebut dihomogenkan

dengan menaik turunkan pegas pada mikropipet.

2. Pembuatan Primer 5 μM Dari Seri Larutan Induk 50 μM

Sebanyak 3 μl larutan induk primer 50 μM dimasukkan kedalam

Microsentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 27 μl aquadest

kedalam masing-masing tube tersebut. Larutan tersebut dihomogenkan

dengan menaik turunkan pegas pada mikropipet.

3. Pembuatan Mastermix Real Time PCR

Master mix dibuat dengan volume total 20 μl yang terdiri dari 5 μl DNA

template; 3,8 μl Aquabidest; 0,4 μl primer forward 5 μM; 0,4 μl primer

reverse 5 μM; 0,4 μl UPL 10 μM; dan 10 μl LightCycler® 480 probe master

(enzim Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6,4 mM MgCl2).

4. Loading Sampel dan Taqman Probe Mastermix kedalam Multiwell Plate

(Roched, 2008)

Campuran reaksi dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang

diinginkan. Kemudian dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas secara

perlahan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan pemilihan program

pada LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan digunakan untuk proses

ampilifikasi. Setelah campuran reaksi total Real-Time PCR dan program

amplifikasi telah siap, campuran reaksi total Real-Time PCR yang

diletakkan pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing foil

kemudian diletakkan pada mesin Real-Time PCR. Instrumen Real-Time

PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung memberikan

hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva.

24


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini dilakukan analisis cemaran daging babi pada produk

sosis sapi yang beredar di wilayah Bumi Serpong Damai (BSD) menggunakan

metode Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Hasil analisis didapat

melalui beberapa tahap diantaranya isolasi DNA, pengukuran kemurnian dan

kuantifikasi DNA hasil isolasi, amplifikasi DNA dan analisis DNA hasil

amplifikasi.

4.1 Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan terhadap daging sapi, daging babi, dan 6 sampel

sosis sapi yang beredar di wilayah Bumi Serpong Damai (BSD) menggunakan

Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega. Metode isolasi DNA dalam

jaringan hewan dilakukan melalui beberapa tahap yaitu preparasi jaringan hewan,

pelisisan sel, degradasi RNA, presipitasi protein, presipitasi dan purifikasi DNA,

dan rehidrasi DNA. Tahap pertama adalah preparasi jaringan hewan yang

dilakukan dengan cara menghancurkan daging dan sosis sapi terlebih dahulu

menggunakan pisau steril, lumpang alu, dan blender. Tahap kedua adalah

pelisisan membran sel dan nukleus yang dilakukan dengan cara menambahkan

Nuclei Lysis Solution (NLS) pada daging dan sosis sapi yang telah dihancurkan.

NLS menghancurkan membran sel dan nukleus dengan cara mengganggu ikatan

kimia pada membran tersebut (Nurfadila, 2015). Kandungan yang terdapat

didalam NLS biasanya terdiri dari etilendiamin tetra asetat (EDTA) atau detergen

seperti sodium dodesil sulfat (SDS). EDTA berperan dalam mempertahankan

integritas DNA hasil isolasi dengan cara mengikat ion Mg2+ yang berfungsi untuk

mempertahankan integritas sel maupun aktivitas enzim nuklease yang dapat

merusak DNA sedangkan SDS merupakan detergen yang dapat merusak integritas

membran sel dengan cara mengikat lipid yang terdapat pada membran sel (Izzah,

2014). Daging dan sosis sapi yang sudah ditambah dengan NLS, kemudian

dihomogenkan selama 10 detik lalu diinkubasi pada suhu 650C selama 30 menit.

24

25


Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan proses pelisisan membran sel dan

nukleus. Tahap ketiga adalah degradasi RNA yang dilakukan dengan cara

menambahkan RNAse. RNAse berfungsi untuk membersihkan DNA dari RNA.

RNAse merupakan enzim yang dapat mendegradasi RNA. Hal tersebut dapat

memudahkan proses isolasi karena RNAse akan merusak RNA sedangkan DNA

tidak (Radji, 2011). Setelah ditambah RNAse kemudian dilakukan inkubasi pada

suhu 370C yang bertujuan untuk mengoptimalkan proses pendegradasian RNA

oleh RNAse (Nurfadila, 2015). Tahap keempat adalah presipitasi protein yang

dilakukan dengan cara menambahkan Protein Precipitation Solution (PPS) dan

kemudian dilakukan sentrifugasi yang berfungsi untuk memisahkan supernatan

dengan endapan. Endapan yang dihasilkan adalah protein sedangkan supernatan

yang dihasilkan adalah DNA. Hal tersebut terjadi karena sebelum proses

sentrifugasi sampel ditambah PPS yang berfungsi untuk mengendapkan protein

(Nurfadila, 2015). PPS dapat mengendapkan protein dengan cara menurunkan

kelarutan protein. Kandungan yang terdapat didalam PPS biasanya terdiri dari

garam netral seperti amonuim sulfat, pelarut organik seperti etanol atau aseton,

dan zat pengendap lainnya seperti asam trikloroasetat (Ngili, 2013). Tahap kelima

adalah presipitasi dan purifikasi DNA yang dilakukan dengan cara menambahkan

isopropanol dan etanol 70% yang berfungsi untuk memurnikan molekul DNA.

Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+ pada suhu -200C

etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah

dipisahkan dengan cara sentrifugasi (Radji, 2011). Tahap terakhir adalah rehidrasi

DNA yang dilakukan dengan menambahkan DNA Rehidration Solution yang

berfungsi untuk melarutkan molekul DNA. DNA yang telah ditambah dengan

DNA Rehidration Solution selanjutnya didiamkan pada suhu 650C selama 1 jam

yang berfungsi untuk mempercepat proses pelarutan DNA kemudian DNA

disimpan pada suhu 40C.

Isolat DNA yang dihasilkan dari tahapan kerja diatas, didapatkan

konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometri DNA

(DeNovix). Pengukuran isolat DNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm

dan 280 nm, sedangkan tingkat kemurnian DNA dapat ditentukan dengan cara

26


menghitung rasio antara nilai A260 dan A280 (Muladno, 2010). Hasil pengukuran

terlihat pada tabel 4.1 dibawah ini:

Tabel 4.1 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA

Berdasarkan hasil pengukuran konsentrasi isolat DNA yang terlihat pada

table 4.1, konsentrasi DNA tertinggi terdapat pada sampel 1 yaitu sebesar 234.110

ng/µl sedangkan konsentrasi DNA terendah terdapat pada sampel 4 yaitu sebesar

1.624 ng/µl, meskipun sampel 4 memiliki konsentrasi yang paling rendah, namun

masih dapat dilajutkan ke tahap amplifikasi DNA menggunakan real time PCR

karena batas konsentrasi minimal isolat DNA untuk real time PCR adalah 0.1 ng

(Roche). Selain itu, pengukuran kemurnian isolat DNA menunjukkan bahwa

daging babi, daging sapi, sampel 1, sampel 3, dan sampel 4 memiliki nilai

kermunian berkisar antara 1.8 – 2.0, sedangkan sampel 2, sampel 5, dan sampel 6

memiliki nilai kemurnian dibawah 1.8. Molekul DNA dikatakan murni apabila

nilai rasio A260/A280 berkisar antara 1.8 – 2.0. Nilai rasio yang lebih rendah dari

1.8 menunjukkan adanya kontaminasi protein sedangkan nilai rasio melebihi 2.0

menunjukkan adanya kontaminasi RNA (Teare et al., 1997).

No. Sampel Konsentrasi Kemurian (A280/260)

1. Daging sapi 95.587 ng/µl 1.86

2. Daging babi 27.154 ng/µl 1.99

3. Sampel 1 234.110 ng/µl 1.82

4. Sampel 2 43.749 ng/µl 1.77

5. Sampel 3 22.700 ng/µl 1.87

6. Sampel 4 1.624 ng/µl 1.86

7. Sampel 5 29.223 ng/µl 1.76

8. Sampel 6 33.796 ng/µl 1.75

27


4.2 Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan Sampel Sosis Sapi

Menggunakan Primer Sapi dan Babi Pada Real Time PCR

Amplifikasi DNA daging sapi, daging babi dan 6 sampel sosis sapi yang

beredar di wilayah Bumi Serpong Damai (BSD) dilakukan dengan menggunakan

dua primer yaitu primer sapi dan primer babi. Penggunaan primer sapi bertujuan

untuk mamastikan bahwa sampel sosis yang berlogo sapi mengandung daging

sapi. Sedangkan primer babi digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya

kandungan babi didalam sampel sosis yang berlogo sapi tersebut.

Konsentrasi primer pada PCR yang dianjurkan berkisar antara 0,1 – 0,5 µM.

Konsentrasi primer yang tinggi ( ≥ 0,5 µM ) dapat meningkatkan kesalahan

penempelan primer pada DNA cetakan, sehingga menyebabkan penumpukan

primer yang tidak spesifik. Namun, penggunaan konsentrasi primer yang terlalu

rendah akan memberikan hasil amplifikasi yang tidak jelas (Bintang, 2010).

Proses amplifikasi pada PCR biasanya berlangsung 35 – 40 siklus

(Muladno, 2010), namun penelitian ini hanya menggunakan 30 siklus. Hal ini

dikarenakan sebelum mencapai siklus ke 30 sudah terjadi amplifikasi pada sekuen

DNA. Program amplifikasi yang digunakan pada Real Time PCR (RT-PCR)

dipilih berdasarkan penanda yang digunakan. Penelitian ini menggunakan

Universal Probe Library (UPL) sebagai penanda pada reaksi RT-PCR sehingga

program yang digunakan dapat dilihat pada tabel 4.2 dibawah ini:

28


Tabel 4.2 Program Dual Color Hydrolysis Probe – UPL Probe 96-II

Analisis kurva amplifikasi dilihat dari kenaikan kurva dan nilai CP

(Crossing Point) pada kurva amplifikasi. Spesifisitas hasil amplifikasi dapat

dilihat melalui nilai TM (Melting Temperature) pada melt curve. CP adalah

jumlah siklus dimana sampel mulai terbaca diatas Arbitrary Fluorescence Level

(AFL) yang menunjukkan awal mulainya fase pertumbuhan eksponensial. Oleh

karena itu, semakin rendah nilai CP maka semakin tinggi konsentrasi DNA target.

Tm adalah suhu dimana 50% bagian dari DNA telah terbuka menjadi untai

tunggal. Nilai Tm tergantung dari jumlah basa A, G, T dan C. Primer yang

spesifik akan menghasilkan satu puncak Tm pada DNA target (Izzah, 2014).

29


4.2.1 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan NTC

Menggunakan Primer Sapi

Amplifikasi yang pertama dilakukan menggunakan primer sapi adalah

dengan menguji daging sapi sebagai kontrol positif, daging babi sebagai kontrol

negatif dan NTC sebagai blanko. Amplifikasi terhadap kontrol dilakukan untuk

mengetahui primer sapi yang digunakan spesifik atau tidak terhadap daging sapi.

Kurva amplifikasi terhadap kontrol menggunakan primer sapi dapat dilihat pada

gambar 4.3 dibawah ini:

Gambar 4.1. Kurva Amplifikasi Daging Sapi, Daging Babi, dan NTC


Keterangan: DS (Daging Sapi), NTC (No Template Control), DB (Daging Babi).

Pada gambar 4.3, nilai CP hasil amplifikasi DNA daging sapi adalah 11.31

sedangkan pada DNA daging babi dan NTC tidak menghasilkan nilai CP. Nilai

CP yang dihasilkan oleh daging sapi menunjukkan telah terjadinya proses

amplifikasi sedangkan pada daging babi dan NTC tidak terjadi proses amplifikasi.

Hal ini menunjukan bahwa primer sapi dapat mengamplifikasi DNA daging sapi

secara spesifik. Hasil amplifikasi yang spesifik dikarenakan tidak terjadi mis-

priming ataupun primer dimer. Primer-dimer adalah terbentuknya struktur

sekunder karena menempelnya sesama primer sejenis ataupun primer yang tidak

sejenis yaitu antara primer forward dengan komplemen primer reverse (Widowati,

2013). Sedangkan mis-priming adalah penempelan primer diluar sekuen DNA

DS

NTC

DB

30


target (Izzah, 2014). Berdasarkan hasil amplifikasi diatas, maka primer sapi dapat

digunakan untuk tahap selanjutnya yaitu untuk memastikan bahwa sampel sosis

yang berlogo sapi tersebut mengandung daging sapi.

4.2.2 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Sosis Sapi, dan NTC


Amplifikasi kedua yang dilakukan menggunakan primer sapi adalah dengan

menguji daging sapi sebagai kontrol positif, sosis sapi sebagai sampel, dan NTC

sebagai blanko. Amplifikasi terhadap sampel menggunakan primer sapi dilakukan

untuk memastikan bahwa sosis sapi yang digunakan sebagai sampel mengandung

daging sapi. Kurva amplifikasi terhadap kontrol positif, sampel dan NTC

menggunakan primer sapi dapat dilihat pada gambar 4.4 dibawah ini:

Gambar 4.2. Kurva Amplifikasi Daging Sapi, Sosis Sapi, dan NTC


Keterangan: DS (Daging Sapi), S1 (Sampel 1), S2 (Sampel 2), S3 (Sampel 3), S4 (Sampel

4), S5 (Sampel 5), S6 (Sampel 6), NTC (No Template Control).

Pada gambar 4.4, nilai CP hasil amplifikasi DNA daging sapi, sampel 1,

sampel 2, sampel 3, sampel 4, sampel 5, dan sampel 6 secara berturut-turut adalah

11.85, 16.70, 19.60, 21.91, 23.28, 22.35, 22.73. Nilai CP yang berbeda-beda

dikarenakan konsentrasi isolat DNA yang dihasilkan juga berbeda-beda

DS S 1

S 2 S 3

S 4

S 5

S 6

NTC

31


sedangkan pada NTC tidak menghasilkan nilai CP karena tidak ada sekuen DNA

yang teramplifikasi. Namun diakhir siklus amplifikasi, terjadi kenaikan kurva

pada NTC walaupun kecil. Hal tersebut dikarenakan telah terjadinya primer-dimer

pada NTC. Primer-dimer adalah terbentuknya struktur sekunder karena

menempelnya sesama primer sejenis ataupun yang tidak sejenis yaitu antara

primer forward dengan primer reverse (Widowati, 2013). Nilai CP yang

dihasilkan oleh daging sapi dan sampel sosis sapi menunjukkan telah terjadinya

proses amplifikasi sehingga dapat disimpulkan bahwa sosis sapi yang beredar di

wilayah Bumi Serpong Damai (BSD) terbukti mengandung daging sapi.

4.2.3 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, dan NTC

Menggunakan Primer Babi

Amplifikasi pertama yang dilakukan menggunakan primer babi adalah

dengan menguji daging babi sebagai kontrol positif, daging sapi sebagai kontrol

negatif, dan NTC sebagai blanko. Amplifikasi terhadap kontrol dilakukan untuk

mengetahui primer babi yang digunakan spesifik atau tidak terhadap daging babi.

Kurva amplifikasi menggunakan primer babi terhadap kontrol dapat dilihat pada

gambar 4.5 dibawah ini:

Gambar 4.3. Kurva Amplifikasi Daging Sapi, Daging Babi, dan NTC


Keterangan : DB (Daging Babi), DS ( Daging Sapi), NTC (No Template Control)

Pada gambar 4.5, nilai CP hasil amplifikasi DNA daging babi yaitu 16.31

sedangkan pada daging sapi dan NTC tidak menghasilkan nilai CP. Nilai CP yang

dihasilkan oleh daging babi menunjukkan telah terjadinya proses amplifikasi

DS NTC DB

32


sedangkan pada daging sapi dan NTC tidak terjadi proses amplifikasi. Hal ini

menunjukkan bahwa sekuen pada primer babi dapat mengamplifikasi DNA

daging babi secara spesifik. Jika dilihat nilai CP yang dihasilkan oleh daging sapi

pada kurva sebelumnya, daging sapi memiliki nilai CP yang lebih rendah

dibandingkan dengan daging babi. Hal ini dikarenakan konsentrasi pada daging

sapi lebih besar dibandingkan dengan daging babi. Berdasarkan hasil amplifikasi

diatas, maka primer babi dapat digunakan pada tahap selanjutnya yaitu untuk

mengidentifikasi cemaran daging babi terhadap sampel sosis sapi yang beredar di

wilayah Bumi Serpong Damai (BSD) dengan melihat terjadinya kenaikan kurva

amplifikasi pada sampel sosis sapi tersebut.

4.2.4 Hasil Amplifikasi DNA Daging Babi, Sosis Sapi, dan NTC


Amplifikasi kedua yang dilakukan menggunakan primer babi adalah dengan

menguji daging babi sebagai kontrol positif, sosis sapi sebagai sampel dan NTC

sebagai blanko. Amplifikasi terhadap sampel menggunakan primer babi dilakukan

untuk mengetahui ada atau tidaknya kandungan daging babi didalam sampel sosis

yang berlogo sapi tersebut. Kurva amplifikasi terhadap kontrol, sampel dan

blanko dapat dilihat pada gambar 4.6 dibawah ini:

Gambar 4.4. Kurva Amplifikasi Daging Babi, Sosis Sapi, dan NTC

Menggunakan Primer Babi Keterangan : DB (Daging Babi), NTC (No Template Control)

DB

33


Pada gambar 4.6, nilai CP hasil amplifikasi DNA daging babi yaitu 16.53

sedangkan pada sampel sosis sapi dan NTC tidak menghasilkan nilai CP. Nilai CP

yang dihasilkan oleh daging babi menunjukkan telah terjadinya proses amplifikasi

sedangkan pada sampel sosis sapi dan NTC tidak terjadi proses amplifikasi Hasil

amplifikasi dan nilai CP yang ditunjukkan pada kurva ini menunjukkan bahwa

didalam sampel sosis sapi yang berada di wilayah Bumi Serpong Damai (BSD)

tidak mengandung daging babi.

34


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Kurva amplifikasi pada Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

menunjukkan bahwa sosis sapi yang beredar di wilayah Bumi Serpong Damai

(BSD) tidak tercemar oleh daging babi.

5.2 Saran

Penelitian terhadap status kehalalan dalam produk makanan olahan perlu

ditingkatkan dikarenakan daya konsumsi makanan olahan siap saji dikalangan

masyarakat Indonesia semakin meningkat.

34

35


DAFTAR PUSTAKA

Ali, M. E., et al. 2012. Analysis of pork adulteration in commercial meatballs

targeting porcine-specific mitochondrial cytochrome b gene by TaqMan

probe real-time polymerase chain reaction. Malaysia: Meat Science 91

(2012) 454–459.

Anugrah, R., P. Adirestuti., R. Puspadewi. 2014. Pengawasan Kehalalan Daging

Sapi dan Produk Olahannya di Sektor Usaha Kecil dan Mikro. Jawa Barat.

Fakultas Farmasi Universitas Jendral Achmad Yani: ISBN: 978-602-18580-

2-8.

Artika, I. M. 2003. Struktur, Fungsi dan Biogenesis Mitokondria. Eijkman

Lecture Series I: Mitochondrial medicine. Lembaga Biologi Molekul Eijkman

Jakarta:17-42

Handoyo, Darmo dan Ari Rudiretna. 2001. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan

Polymerase Chain Reaction (Pcr). Surabaya: Universitas Surabaya.

Hewajuli, D. A., Dhamayanti, NLPI. 2014. Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease. Bogor : Balai Besar Penelitian

Veteriner.

Hidayat, Rian. 2015. Perbandingan Metode Kit Komersial Dan Sds Untuk Isolasi

Dna Babi Dan Dna Sapi Pada Simulasi Cangkang Kapsul Keras Untuk

Deteksi Kehalalan Menggunakan Real Time Pcr (Polymerase Chain

Reaction). Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Izzah, A. N. 2014. Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode

Hydrolisis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapid an DNA Babi dengan

menggunakan Real-Time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Kheyrodin, Hamid dan Khosro Ghazvinian. 2012. DNA Purification and Isolation

of Genomic DNA from bacterial species by plasmid purification system.

African Journal of Agricultural Research: ISSN

Ma, Hongbao., Kuan-Jiunn, S., Geroge, C., X. Tracy Qiao., Mei-Ying, C. 2006.

Application of Real Time Polumerase Chain Reaction (RT-PCR). The journal

of American science: 2 (3): 1-15

Mane, B. G., S. K. Mendiratta., A. K. Tiwari. 2013. Pork Specific Polymerase

Chain Reaction Assay for Authentication of Meat and Meat Products. India:

JOURNAL OF MEAT SCIENCE AND TECHNOLOGY.

36


May, Panloup P., Chretien, M. F., Savagner, F., Vasseur, C., Jean, M., Malthiery,

Y., Reynier, P. 2003. Increased Sperm Mitochondrial DNA Content In Male

Infertility. Hum Reprod 18(3):550- 556.

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi Kedua. Bogor: IPB Press.

Murray, R. K., Granner, D. K., Rodwell, V. W. 2012. Biokimia Harper. Jakarta :

EGC

Mutalib, Sahilah. ABD., et al. 2012. Comparison Between Pork adn Wild Boar

Meat (Sus scrofa) by Polymerase Chain Reacyion-Restriction Fragment

Lenght Polymorphism (PCR-RFLP). Malaysia: Universiti Kebangsaan

Malaysia.

Ngili, Yohanis. 2013. Biokimia Dasar. Bandung: Rekayasa Sains

Nishiguchi, M. K., et al. 2002. DNA Isolation Prosedure. Birkhäuser Verlag

Basel:Switzerland

Nooratiny, I., Sahilah, A. M., Alif Alfie, A. R., and Mohd. Farouk, M. Y.

2013. DNA Extraction From Ghee dan Beef Species Identification Using

Polymerase Chain Reaction (PCR) Assay. Malaysia: IFRJ 20(5): 2959-

2961.

Norrakiah, A. S., Shahrul Azim, M. G., Sahilah, A. M. and Abdul Salam, B. 2015.

Halal analysis of raw materials, ingredients and finished bakery product

using PCR and gene chip southern-hybridization for detection of porcine

DNA. Malaysia: International Food Research Journal 22(5): 1883-1887

(2015). Bintang, Maria. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga

Nurfadila, Mifa. 2015. Isolasi DNA Stomatopoda Sp dan Drosophila

Melanogaster. Blokspot.co.id

Pratami, Dienar Fitri. 2011. Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk Burger

Sapi Yang Beredar di Wilayah Ciputat Melalui Amplifikasi DNA

Menggunakan Real Time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Qhardawi. 1993. Halal Dan Haram Dalam Islam. Bangil: PT. Bina Ilmu.

Radji, Maksum. 2011. Rekayasa Genetika. Jakarta: ISBN : 978-602-8674-40-9

Suparman., W. S. Rahayu., H. T. Atmojo., A. S. 2014. Identifikasi Daging Babi

Dalam Sosis dan Burger Sapi Yang Beredar di Pasar Wage Purwokerto dan

Pasar Wanakriya Kebumen Menggunakan Metode Polymerase Chain

Reaction (PCR) dan Analisis Restriksi Menggunakan Enzim BamH1 dan

BseD1. Purwokerto. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah

Purwokerto: ISBN: 978-602-18580-2-8.

37


Susanto, Edi dan Wardoyo. 2014. Pengaruh Substitusi Daging Babi Terhadap

Karakteristik Asam Lemak Sosis. Lamongan. Program Studi Peternakan.

Fakultas Peternakan Universitas Islam Lamongan.

Susmiarsih, T. (2010). Peran Genetika DNA Mitokondroa (mtDNA) Pada

Motilitas Spermatozoa. Universitas Yarsi, Fakultas Kedokteran :Majalah

Kesehatan Pharma Medika.

St. John, J. C., Jokhi, R. P., Barratt, CLR. 2005. The Impact Of Mitochondrial

Genetics On Male Infertility. Int. J. Androl 28:65-73.

Syukriani, Yoni Fuadah. 2012. DNA Forensik. Bandung: Departemen Ilmu

Kedokteran Forensik dan Medikolegal Fakultas Kedokteran Universitas

Padjadjaran Rumah Sakit Dr. Hasan Sadikin.

Teare, J.M., R. Islam., R. Flanagan., S. Gallagher., M.G Davies., C. Grabau.

(1997). Measurement of Nucleic Acid Concentrations Using the DyNA

QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques 22 : 1170 – 1174.

Viljoen, G. J., Louis, H. N., John, R. C. 2005. Molecular Diagnostic PCR

Handbook. Netherlands: Springer.

Widowati, E. W. 2013. Desai Primer Sitokrom B (cytb b) Sebagai Salah Satu

Komponen PCR (Polymerase Chain Reaction) Untuk Deteksi DNA Babi.

Yogyakarta: Lembaga Penelitian Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga.

Yuningsih, Rahmi. 2010. Perlindungan Konsumen Dari Dampak Buruk Makanan

Tidak Halal Bagi Kesehatan. Jakarta: Pusat Pengkajian Pengolahan Data dan

Informasi Sekretariat Jendral DPR RI.

Yuwono, Triwibowo. 2009. Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga

Xiong, Y., M. Sundaralingam. 2001. Protein-Nucleic Acid Interaction. Ohio State

University, Columbus, Ohio, USA: Encyclopedia Of Life Sciences

38


Lampiran 1. Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA

Sampel

Gambar

Konsentrasi dan

Kemurian

(A280/260)

Daging Sapi

Konsentrasi 95.587 ng/µl

Kemurnian 1.86

Daging Babi


Kemurnian 1.99

Sampel 1


Kemurnian 1.82

Sampel 2


Kemurnian 1.77

39


Sampel 3


Kemurnian 1.87

Sampel 4


Kemurnian 1.86

Sampel 5


Kemurnian 1.76

Sampel 6


Kemurnian 1.75

40


Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer

a. Membuat larutan primer 50 µM dari larutan induk 100 µM

V1 x N1 = V2 x N2

V1 x 100 = 100 x 50

V1 = 50 µL

Maka, 50 µl diambil dari larutan induk primer konsentrasi 100 µM, kemudian

ditambahkan aquabidest sampai volume 100 µl.

b. Membuat larutan primer 5 µM dari seri konsentrasi primer 50 µM.

V1 x N1 = V2 x N2

V1 x 50 = 30 x 5

V1 = 3 µL

Maka, diambil 3 µl dari larutan primer konsentrasi 50 µM, kemudian

ditambahkan aquabidest sampai volume 30 µl.

c. Membuat larutan primer 0,1 µM dari konsentrasi 5 µM.

V1 x N1 = V2 x N2

V1 x 5 = 20 x 0,1

V1 = 0,4 µL

Maka, diambil 0,4 µL dari larutan primer konsentrasi 50 µM.

41


Lampiran 3. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer

PRIMER SAPI PRIMER BABI

Primer Sapi Forward Primer Babi Forward

Tm = 2oC (2 + 6) + 4oC (11 + 0) Tm = 2oC (1 + 9) + 4oC (10 + 0)

= 60oC = 60 oC

Primer Sapi Reverse Primer Babi Reverse

Tm = 2oC (4 + 5) + 4oC (2 + 9) Tm = 2oC (5 + 9) + 4oC (2 + 9)

= 62oC = 72oC

Tm rata-rata primer sapi: Tm rata-rata primer babi:

Tm = (60 + 62) / 2 Tm = (60 + 72) / 2

= 6oC = 66oC

Rumus Tm = 2oC (A + T) + 4oC (G + C)

42


Lampiran 4. Campuran Reaksi Mastermix Untuk Amplifikasi DNA

Konsentrasi

Akhir

Konsentrasi

Awal

Jumlah Yang

Digunakan

Primer Forward 0,1 µM 5 µM 0,4 µl

Primer Reverse 0,1 µM 5 µM 0,4 µl

UPL 0,2 µM 10 µM 0,4 µl

LightCycler®480

Hydrolysis Probe

1x 2x 10 µl

ddH2O - - 3,8 µl

DNA Template - - 5 µl

Total Volume Reaksi 20 µl

43


Lampiran 5. Kurva Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, Sosis Sapi dan

NTC Menggunakan Primer Sapi

a. Kurva Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, dan NTC

b. Kurva Amplifikasi DNA Daging Sapi, Sosis sapi, dan NTC (1)

44


c. Kurva Amplifikasi DNA Daging Sapi, Sosis sapi, dan NTC (2)

d.

45


Lampiran 6. Kurva Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, Sosis Sapi dan

NTC Menggunakan Primer Babi

a. Kurva Amplifikasi DNA Daging Babi, Daging Sapi, dan NTC

b. Kurva Amplifikasi DNA Daging Babi, Sosis Sapi, dan NTC (1)

46


c. Kurva Amplifikasi DNA Daging Babi, Sosis Sapi, dan NTC (2)

analisis cemaran daging babi pada produk sosis sapi yang...

Documents