analisis bakteri coliform dalam produk es batu … · melati k, primaboti n, eureka gracia l, wiria...

ANALISIS BAKTERI COLIFORM DALAM PRODUK ES BATU

KEMASAN DARI 5 USAHA MIKRO DENGAN METODE MOST

PROBABLE NUMBER (MPN) DI KECAMATAN DANUREJAN,

YOGYAKARTA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Adityawarman

NIM : 088114041

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i




YOGYAKARTA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Adityawarman

NIM : 088114041

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2012


ii

PERSETUJUAN PEMBIMBING




YOGYAKARTA

Skripsi yang diajukan oleh :

Adityawarman

NIM : 088114041

telah disetujui oleh :

Pembimbing

Yohanes Dwiatmaka, M.Si. tanggal 12 Juni 2012


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Ku yakini dan ku lakukan…….

Semua kehidupan, dinamika kehidupan, dan seluruh isi alam semesta telah

Tuhan karuniakan kepadaku…

Setiap detak jantungku, setiap tarikan nafasku, dan setiap kilatan

pikiranku, semua adalah kehendaknya… Betapa besarnya KaruniaMu..

Maafkanlah hamba yang masih “buta”akan hal itu….

Skripsi ini pun adalah kehendak Nya….

Kesempurnaan hanya milik Dia..

“Janganlah berbuat jahat,

Tambahlah kebajikan,

Dan sucikanlah pikiran,

Ini adalah inti ajaran para Buddha”

sadhu…sadhu…sadhu….

Semoga semua makhluk berbahagia……

Annumodana untuk :

Terimakasih Yang Maha Kuasa atas segalanya….

Terimakasih Bapak, Ibu dan keluargaku…..

Terimakasih dia yang selalu di hatiku…..


v


vi

PRAKATA

Puji dan syukur penulis kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkah dan

karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan sebaik-

baiknya untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) pada Program Studi

Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Dalam proses penyusunan skripsi ini penulis telah banyak memperoleh

berbagai bantuan berupa doa, bimbingan, materi, dorongan semangat, ujian, dan

segala hal yang membawa pada terselesaikannya karya tulis ini.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada :

1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc.,Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma.

2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si selaku Dosen Pembimbing atas

kebijaksanaan, perhatian, dan kesabarannya dalam membimbing

penyusunan skripsi ini.

3. Bapak Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. dan Ibu Agustina Setiawati, M.Sc.,

Apt. selaku Dosen Penguji yang telah meluangkan waktu, kritik, saran dan

pemikiran keilmuannya untuk menguji penulis dalam ujian skripsi.

4. Ibu Maria Dwi Jumpowati S.Si., yang telah memberikan bantuan bimbingan

secara moril, dan kesabaran dalam membantu proses penyelesaian skripsi

ini.


vii

5. Ibu CM. Ratna Rini Nastiti, M.Pharm., Apt selaku Ketua Program Studi

Farmasi sekaligus Ketua Tim Panitia Skripsi Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

6. Ibu Septi Widyastuti, S.Si., M.Kes , Ibu Retno, Ibu Evina, Ibu Darwani, Ibu

Siti, Bapak Jumakir, Bapak Andi, Bapak Sigit dan segenap anggota Balai

Laborarorium Kesehatan Yogyakarta. yang telah membimbing penulis

dalam penelitian laboratorium .

7. Teman-teman Bojoner’s dan FKK A 2008 (Christina Putranti R.W, Perthy

Melati K, Primaboti N, Eureka Gracia L, Wiria Sende P, Kartika Sari S, dan

Ellen Naomi N.S) yang senantiasa setia dalam mendampingi seluruh

kegiatan penulisan skripsi ini.

8. Seluruh Civitas Akademika Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

yang selalu memberikan kondisi yang mendukung untuk pengerjaan skripsi

ini.

9. Seluruh pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah

mendukung penulisan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena

itu, segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan demi

sempurnanya skripsi ini. Semoga skripsi ini bermanfaat dan memberi informasi

bagi pembaca.

Penulis


viii


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL …………………………………………………… i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ……………………….. ii

HALAMAN PENGESAHAN ………………………………………….. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ………………………………………... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ………………………………... v

PRAKATA ……………………………………………………………... vi

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ........................................... viii

DAFTAR ISI …………………………………………………………… ix

DAFTAR TABEL ……………………………………………………… xiii

DAFTAR GAMBAR …………………………………………………… xiv

DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………… xv

INTISARI ………………………………………………………………. xvi

ABSTRACT ……………………………………………………………... xvii

BAB I PENGANTAR ……………………………………………....... 1

A. Latar Belakang …………………..………………………………. 1

1. Permasalahan ………………………………………….…...… 4

2. Keaslian penelitian ………………………………………… 5

3. Manfaat penelitian ………………………………………...…. 5

B. Tujuan Penelitian ……………………..………………………….. 6

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ………………………………….. 7


x

A. Es Batu dan Baku Mutu Air Minum …………………………..… 7

B. Bakteri Coliform ………………………………………………… 10

C. Escherichia coli Sebagai Indikator Pencemaran Air ……………. 11

D. Media Selektif dan Media Diferensial E.coli …………………… 12

E. Uji Identifikasi E.coli ……………………………………………. 14

F. Uji Angka Bakteri Coliform (E.coli) Menggunakan Metode Most

Probable Number (MPN) ………………………………………... 18

G. Landasan Teori ………………………………………………....... 20

H. Hipotesis ……………………………………………………….... 22

BAB III METODE PENELITIAN ....................................................... 23

A. Jenis dan Rancangan Penelitian …………………………………. 23

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional …………………… 23

C. Bahan dan Alat Penelitian ……………………………………….. 26

D. Tata Cara Penelitian ……………………………………………... 27

1. Pengumpulan sampel ………………………………………….. 27

2. Homogenisasi dan pengenceran sampel ………………….…… 27

3. Pembuatan media ……………………………………………... 28

4. Uji Bakteri Coliform (IKM/5.4.2/2009/BLK-Y) ……………... 30

a. Uji pendugaan bakteri Coliform (Presumptive test) ……..….. 30

b. Uji penegasan bakteri Coliform (Confirmative test) …….….. 30

c. Uji konfirmasi Coliform fekal dan Escherichia coli ............... 31

d. Uji identifikasi Eschericia coli ............................................... 31

E. Analisa Hasil ................................................................................... 32


xi

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………. 33

A. Pengumpulan Sampel ……………………….…………………… 34

B. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel ………….…………...… 34

C. Uji Bakteri Coliform (IKM/5.4.2/2009/BLK-Y) ….……………... 36

1. Uji pendugaan bakteri Coliform (Presumptive test) …….…….. 38

2. Uji penegasan bakteri Coliform (Confirmative test) …..………. 44

3. Uji konfirmasi Coliform fekal dan Escherichia coli ................... 48

4. Uji identifikasi Eschericia coli ………………………….…….. 52

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ……………………………….. 72

A. Kesimpulan ……………………………………………......….. 72

B. Saran ………………………………………………………....….. 72

DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………. 73

LAMPIRAN …………………………………………………………… 77

BIOGRAFI PENULIS ………………………………………………… 84


xii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Parameter Mikrobiologi Bahan Baku Air Untuk

Keperluan Minum Berdasarkan PerMenKes RI No.

416/MenKes/Per/IX/1990 …………………….…….…… 8

Tabel II. Sifat-sifat Bakteri Coliform dengan Uji Biokimia

(American Public Health Association, 2005) ………...… 18

Tabel III. Hasil Uji Pendugaan Coliform dengan Media Lactose

Triphtose Broth pada suhu 36o

C±1oC waktu inkubasi 48

jam ….................................................................................. 39

Tabel IV. Hasil Uji Penegasan dan Angka MPN Bakteri Coliform

dengan Media BGLB waktu inkubasi 24 jam pada suhu

36o

C±1oC ………………………………………………... 45

Tabel V. Hasil Uji Konfirmasi dan Angka MPN Bakteri Coliform

Fekal dengan Media ECB waktu inkubasi 48 jam pada

suhu 44-45oC …………………………………………….. 49

Tabel VI. Hasil Uji Biokimia E. coli Sampel Es Batu I dan II …… 68


xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Uji pendugaan pada media LTB sampel I inkubasi

48 jam pada suhu 360

C±10C ……...……………… 41

Gambar 2. Uji pendugaan pada media LTB sampel II inkubasi


C±10C ……………………... 41

Gambar 3. Uji pendugaan pada media LTB sampel III inkubasi


C±10C ………………..…… 42

Gambar 4. Uji pendugaan pada media LTB sampel IV

inkubasi 48 jam pada suhu 360

C±10C …………… 42

Gambar 5. Uji pendugaan pada media LTB sampel V inkubasi


C±10C ……………………...

43

Gambar 6. Hasil uji konfirmasi bakteri Coliform sampel I

konsentrasi 10-1

dengan media BGLB inkubasi 24

jam pada suhu 360

C±10 C …………….................... 46

Gambar 7. Hasil uji konfirmasi Coliform fekal dengan media

ECB inkubasi 48 jam pada suhu 44-450C ………… 51

Gambar 8. Hasil penanaman sampel es batu I dan II pada

media Mac Conkey Agar inkubasi 48 jam pada

suhu 44-450C ……………………………………...

53

Gambar 9. Hasil pengujian H2S sampel es batu I pada uji

identifikasi E.coli ………………………………… 57


xiv

Gambar 10. Hasil pengujian H2S sampel es batu II pada uji


Gambar 11. Reaksi pembentukan Indol oleh bakteri E.coli (Lay,

1994) ……………………………………………… 60

Gambar 12. Hasil pengujian Indol pada uji identifikasi E.coli

pada sampel es batu I …………………………….. 60

Gambar 13. Hasil pengujian Indol pada uji identifikasi E.coli

pada sampel es batu II ……………………………. 61

Gambar 14. Hasil pengujian motilitas sampel I pada uji


Gambar 15. Hasil pengujian motilitas sampel II pada uji


Gambar 16. Hasil uji fermentasi larutan gula-gula pada sampel

I, kontrol positif, dan kontrol negatif …………….. 64

Gambar 17. Hasil uji fermentasi larutan gula-gula pada sampel

II, kontrol positif, dan kontrol negatif ……………. 65

Gambar 18. Reaksi pembentukan sitrat oleh bakteri E.coli

(Cohen, 2011) …………………………………….. 66

Gambar 19. Hasil uji sitrat pada sampel I, kontrol positif, dan

kontrol negatif …………………………………….

66

Gambar 20. Hasil uji sitrat pada sampel II, kontrol positif, dan

kontrol negatif …………………………………….

67


xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Tabel Most Probable Number (MPN) Deret 3 Tabung

(Standar Nasional Indonesia No.01-3839-1995) …………. 77

Lampiran 2. Baku Mutu Es Batu Berdasarkan Standar Nasional

Indonesia 01-3839-1995 ………………………………….. 78

Lampiran 3. Hasil Uji Konfirmasi Coliform dengan media Brilliant

Green Lactose Bile Broth 2% Es Batu Sampel II dan III

Inkubasi 48 Jam Pada Suhu 36o±1

oC …………………… 81

Lampiran 4. Hasil Uji Most Probable Number dan Identifikasi

Eschericia coli pada Sampel Es Batu Kemasan di

Kecamatan Danurejan Yogyakarta ……………………….. 82

Lampiran 5. Surat ijin melakukan penelitian di Balai Laboratorium

Kesehatan Yogyakarta ……………………………………. 83


xvi

INTISARI

Es batu merupakan air yang dibekukan dan sering digunakan dalam

berbagai produk minuman. Banyaknya produsen es batu, contohnya di Kecamatan

Danurejan, Yogyakarta seringkali tidak diiringi dengan kesadaran terhadap

kualitasnya, seperti tingginya kandungan bakteri Coliform dan Eschericia coli

sebagai indikator polusi kotoran dalam produk tersebut. Coliform merupakan

bakteri fakultatif yang memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas

dalam waktu 48 jam pada suhu 37oC yang menyebabkan infeksi saluran kemih,

gastroenteritis, meningitis, dan peritonitis. Infeksi tersebut terjadi karena es batu

berbahan dasar air yang terkontaminasi oleh feses dan pengolahan yang tidak

tepat.

Menurut Standar Nasional Indonesia No.01-3839-1995, es batu harus

memenuhi syarat-syarat air minum sesuai PerMenKes RI No.

416/MenKes/Per/IX/1990 yaitu syarat mutu secara mikrobiologi total Coliform

tidak melebihi 0 bakteri/100ml dan Coliform fekal tidak melebihi 0 bakteri/100ml.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah bakteri Coliform dan

Coliform fekal, temasuk E.coli, pada es batu dari lima usaha mikro es batu di

Kecamatan Danurejan, Yogyakarta sebagai daerah penghasil es batu terbesar di

Yogyakarta. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif komparatif. Sampel uji

berupa es batu yang dicairkan. Data penelitian dibandingkan dengan daftar Most

Probable Number (Standar Nasional Indonesia, 1992) dan dihitung jumlah

bakterinya. Pengujian dilakukan dengan menggunakan media selektif dan

diferensial sebagai uji presumtif dan konfirmatif untuk bakteri Coliform dan

E.coli yang diperkuat dengan uji Sulfur Indol Motility, uji fermentasi gula-gula

dan uji sitrat sebagai tahap penegasan untuk memastikan adanya bakteri E. coli.

Hasil penelitian menunjukkan jumlah bakteri Coliform, Coliform fekal,

dan E.coli pada sampel es batu I, II, dan III dari 5 sampel es batu di Kecamatan

Danurejan Yogyakarta melebihi 0 bakteri/100ml sehingga secara mikrobiologis

tidak memenuhi Standar Nasional Indonesia No.01-3839-1995 yang diacu dari

PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990.

Kata kunci : es batu, Coliform, Coliform fekal, E.coli, lima usaha mikro

Kecamatan Danurejan, Most Probable Number (MPN)


xvii

ABSTRACT

Ice cube is a frozen water that used in many drinking product. Some

producers in Danurejan, Yogyakarta don’t understand about the handling method

to make it, such as contamination of Coliform and Eschericia coli bacteria. This

bacteria used ice cube fecal indicator. Coliform is a facultative bacteria which can

produce some acid and gas of lactose fermentation at 37oC during 48 hours

incubation. It causes infection, gastroenteritis, meningitis, and peritonitis. In

human it is caused by water material contamination of fecal materials and

uncorrect handling methods.

According Standar Nasional Indonesia No.01-3839-1995, ice cube must be

complied with microbiology standard quality of drinking water by PerMenKes RI

No. 416/Men.Kes/Per/IX/1990 that 0 bacteria / 100 ml sampel of Coliform and

fecal Coliform.

This research was purposed to count Coliform and fecal Coliform,

including E.coli bacteria in five ice cube samples of micro producers in

Danurejan, Yogyakarta which be the biggest producer’s region of ice cube in

Yogyakarta. This were a descriptive comparative research. The samples were

melted ice cubes. Research data should be compared to Most Probable Number

table (Badan Standar Nasional, 1992) to count the bacteria. This test used

selective and differential media for presumptive and confirmative test to know

Coliform and fecal Coliform then supported by Sulfur Indol Motility (SIM), sugar

fermentation and citrate test to confirm E.coli contamination.

The result showed that total Coliform, Coliform fecal, and E.coli bacteria

on sampel I, II, III of 5 ice cube samples from Danurejan region Yogyakarta more

than 0 bacteria/ 100ml so this samples didn’t comply with ice cube

microbiological quality of Standar Nasional Indonesia No.01-3839-1995 on the

basic of PerMenKes RI No. 416/Men.Kes/Per/IX/1990.

Key words : ice cube. Coliform, fecal Coliform, E.coli, five micro producers in

Danurejan, Most Probable Number (MPN)


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Es batu adalah massa padat hasil pembekuan air minum yang merupakan

bahan yang biasanya ditambahkan dalam minuman yang sering kita konsumsi

setiap hari. Penggunaan es dalam minuman merupakan hal yang sangat umum

ditemui. Beberapa jenis minuman penggunaan es tidak dapat digantikan dengan

menyimpan minuman tersebut dalam lemari pendingin (Primasentra, 2010).

Proses pembuatan dan pendistribusian es batu yang tidak sehat, seperti

halnya produsen yang menjual es batu berbahan air mentah tanpa dimasak atau

tidak diolah dengan tepat menyebabkan terjadinya pertumbuhan bakteri yang

dapat mengganggu kesehatan konsumen (Primasentra, 2010). Menurut Suriawiria

(1995), air yang digunakan sebagai bahan es batu harus bebas dari mikrobia

penyebab penyakit atau mikrobia patogen. Kehadiran bakteri Coliform sangat

tidak diharapkan, baik dari segi estetika, sanitasi, maupun kesehatan.

Coliform merupakan bakteri heterogen dari famili Enterobacteriaceae

yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran dan kondisi yang

tidak baik terhadap bahan pangan. Coliform merupakan suatu kelompok bakteri

berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk spora, aerobik dan anaerobik

fakultatif yang memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas

dalam waktu 48 jam pada suhu 35 – 37oC. Bakteri Coliform dalam es batu pada

perlakuan tanpa pemanasan dengan suhu penyimpanan 0 oC hari ke 0 dapat terjadi


2

pertumbuhan bakteri Coliform sebesar 8x10 koloni/g dan pertumbuhan terus

meningkat sampai hari ke-10 sebesar 2x108 koloni/g (Arrannilewa, Salawu,

Sorungbe, dan Olasalawu, 2005).

Bakteri Coliform dapat dibedakan menjadi 2 tipe yaitu Coliform fekal,

misalnya Escherichia coli, dan Coliform nonfekal, misalnya Enterobacter

aerogenes. E. coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau

manusia, sedangkan E. aerogenes biasanya ditemukan pada hewan atau tanaman

yang telah mati. Bakteri Coliform tersebut dapat menyebabkan gangguan

kesehatan pada manusia (Fardiaz, 1993). Menurut Brooker (2008), beberapa

kelompok bakteri Coliform bersifat patogen pada manusia, menyebabkan infeksi

saluran kemih, gastroenteritis, meningitis, peritonitis, dan infeksi luka. Infeksi ini

terjadi karena air yang terkontaminasi oleh feses dan produk lain yang berkaitan

dengan produk berbahan air yang menjadi sumber kontaminasi feses.

Menurut Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 (Badan Standarisasi

Nasional Indonesia, 1995), es batu harus memenuhi syarat-syarat air minum

sesuai PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990 yaitu : syarat mutu secara

fisika meliputi bau, jumlah zat padat terlarut, kekeruhan, rasa, suhu dan warna;

secara kimia anorganik meliputi Hg, Al, As, Ba, Fe, F, Cd, kesadahan, Cl, Cr, Mn,

Na, nitrat, nitrit, Ag, pH, Se, Zn, CN, sulfat, sulfida, Cu, Pb; secara kimia organik

meliputi aldrin dan dieldrin, benzen, benzo [a] piren, klordan, CHCl3, 2.4-D,

DDT, deterjen, 1.2-dikloroetana, heptaklor dan heptaklor epoksida,

heksaklorobenzen, gamma-HCH, metoksiklor, pentaklorofenol, pestisida total,

2.4.6-triklorofenol, zat organik KMnO4; secara mikrobiologis meliputi Coliform


3

fekal, total Coliform ; secara radioaktivitas meliputi aktivitas sinar alfa dan beta.

Persyaratan mutu air minum secara mikrobiologis adalah total Coliform tidak

melebihi 0 bakteri/100ml dan Coliform fekal tidak melebihi 0 bakteri/100ml. Jika

jumlah bakteri Coliform dan Coliform fekal lebih dari standar yang ditetapkan,

maka es batu tersebut tidak memiliki jaminan kualitas mikrobiologis dan

keamanan untuk dikonsumsi yang dapat menimbulkan masalah kesehatan.

Berbagai standar, baku mutu dan undang-undang yang mengatur tentang

kualitas air untuk konsumsi masyarakat ditujukan untuk melindungi masyarakat

dari kemungkinan terinfeksi, terkontaminasi bakteri dan bahan-bahan berbahaya

yang terkandung di dalam air. Hal ini disebabkan banyaknya bakteri dan

kontaminasi lain yang dapat mengakibatkan infeksi serius pada manusia dan

hewan, bahkan menyebabkan kematian. Salah satu usaha untuk mencegah kondisi

tersebut adalah dengan melakukan uji mutu es batu secara mikrobiologis (Slamet,

1994).

Metode yang umum digunakan untuk menghitung bakteri total Coliform

dan Coliform fekal dalam sampel air adalah dengan perhitungan Most Probable

Number (MPN). Metode ini bertujuan untuk menghitung jumlah mikroba yang

hidup saja dan dilakukan juga pengenceran berulang. Hasil uji MPN dapat

digunakan untuk menentukan kemungkinan besar jumlah mikroba yang terdapat

dalam suspensi sampel air dengan kepercayaan 95%.

Metode MPN juga mudah dan cepat untuk dilakukan, sehingga dapat

digunakan untuk menghitung jumlah bakteri Coliform pada air kemasan sesuai

SNI (Standar Nasional Indonesia). Hasil penelitian yang diperoleh kemudian


4

dibandingkan dengan daftar Most Probable Number dan dihitung jumlah

bakterinya. Jumlah bakteri yang diperoleh merupakan nilai pendekatan yang tidak

menyatakan jumlah bakteri yang sebenarnya (Nuria, Rosyid, dan Sumantri 2009).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui total Coliform dan Coliform

fekal yang terdapat di dalam es batu kemasan produksi industri mikro yang

diproduksi di Kecamatan Danurejan. Penelitian ini dilakukan di Kecamatan

Danurejan yang merupakan salah satu daerah binaan Dinas Perindustrian

Perdagangan Koperasi dan Pertanian Kota Yogyakarta yang didominasi oleh

usaha kecil dan mikro, termasuk produksi es batu. Produsen es batu skala usaha

mikro perlu memperoleh edukasi tentang kualitas es batu yang sering digunakan

untuk minuman terutama dari segi mikrobiologis untuk melindungi masyarakat

dari resiko terinfeksi dan terkontaminasi oleh bakteri patogen, terutama bakteri

Coliform.

1. Permasalahan

a. Berapa kandungan bakteri total Coliform dan Coliform fekal

berdasarkan metode Most Probable Number (MPN) pada es batu kemasan dari

lima usaha mikro es batu di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta?

b. Apakah kualitas es batu yang diproduksi oleh lima usaha mikro es batu

kemasan di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta dilihat dari segi mikrobiologinya

sesuai dengan persyaratan Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 berdasarkan

PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990 yaitu total Coliform tidak melebihi

0 bakteri/100ml dan Coliform fekal tidak melebihi 0 bakteri/100ml ?


5

2. Keaslian penelitian

Penelitian tentang cemaran bakteri Coliform pada es batu dari lima

usaha mikro es batu kemasan di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta belum

pernah dilakukan sebelumnya.

Beberapa penelitian yang mirip dengan penelitian ini, di antaranya :

Analisa Kualitatif Bakteri Coliform pada Depo Air minum Isi Ulang di Kota

Singaraja Bali (Widiyanti dan Ristiati, 2004), Total Coliform dan Identifikasi

Jenis Bakteri Laktosa Fermenter Cepat pada Es Batu Balok yang dijual di

jalan Wonodri Baru Semarang (Prastiwi, 2006), Analisa Kandungan Bakteri

Coliform pada 5 Sumber Air yang Berada di Desa Jabung, Kecamatan

Gantiwarno, Klaten (Eliandra, 2008). Dari beberapa penelitian tersebut

diperoleh hasil yang menunjukkan adanya kandungan bakteri Coliform dalam

setiap sampelnya. Perbedaan penelitian tersebut dengan penelitian ini terletak

pada lokasi sampling, dan jenis sampel yang digunakan.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bagi ilmu

pengetahuan tentang pengujian kualitas es batu sesuai baku mutu Standar

Nasional Indonesia 01-3839-1995 di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta.

Hasil dan pengujian ini sehingga dapat digunakan sebagai jaminan keamanan

dan kualitas es batu dari aspek mikrobiologis.


6

b. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan pada

masyarakat tentang keamanan dan kualitas es batu yang sehat dan layak

dikonsumsi dari segi mikrobiologis berdasarkan persyaratan Standar

Nasional Indonesia (SNI) 01-3839-1995 dan PerMenKes RI No.

416/MenKes/Per/IX/1990.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Mengetahui kandungan bakteri total Coliform dan Coliform fekal

berdasarkan metode Most Probable Number (MPN) pada es batu kemasan dari

lima usaha mikro es batu di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta, sehingga

diharapkan dapat digunakan konsumen sebagai jaminan kualitas dan keamanan

produk es batu dari segi mikrobiologis.

2. Tujuan khusus

Mengetahui sesuai tidaknya kandungan bakteri total Coliform dan

Coliform fekal pada es batu kemasan yang diproduksi oleh lima usaha mikro es

batu di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta dilihat dari segi mikrobiologisnya

sesuai Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 berdasarkan PerMenKes RI

No. 416/MenKes/Per/IX/1990, yaitu total Coliform tidak melebihi 0

bakteri/100ml dan Coliform fekal tidak melebihi 0 bakteri/100ml sampel.


7

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Es Batu dan Baku Mutu Air Minum

Es adalah air yang membeku atau dibekukan untuk berbagai keperluan.

Pembekuan ini terjadi bila air didinginkan di bawah 0oC (273.15

oK, 32

oF) pada

tekanan atmosfer standar. Es batu dapat terbentuk pada suhu yang lebih tinggi

dengan tekanan yang lebih tinggi juga, dan air akan tetap sebagai cairan atau gas

sampai -30 oC pada tekanan yang lebih rendah (DepKes RI, 1995).

Proses pembuatan es batu memerlukan tindakan higienis sanitasi yang

merupakan bagian dari kesehatan lingkungan. Kualitas tindakan higienis sanitasi

menjadi titik kritis keamanan produk tersebut dalam hal kesehatan, terutama segi

mikrobiologis. Tindakan higienis sanitasi dapat digunakan sebagai jaminan

keamanan dan kualitas produk es batu (DepKes RI, 2004).

Kualitas bahan baku air menjadi kunci utama pembuatan es batu yang

higienis. Bahan baku air yang mentah merupakan media yang dapat menjadi

tempat hidup berbagai jenis bakteri atau fungi. Air sejak ke luar dari mata air, dan

sumur sudah mengandung mikroba, khususnya bakteri atau mikroalgae. Pada air

yang kotor atau sudah tercemar, misal air sungai, air kolam, air danau dan

sumber-sumber lainnya, didapati mikroba seperti pada air jernih, juga kelompok

mikroba lainnya yang tergolong penyebab penyakit, penghasil toksin, penyebab

korosi, penyebab deteriorasi, penyebab pencemaran ini adalah bakteri Escherichia

coli (Widiyanti dan Ristiyanti, 2004).


http://id.wikipedia.org/wiki/Air

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Beku&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Celsius

http://id.wikipedia.org/wiki/Kelvin

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Tekanan_atmosfer_standar&action=edit&redlink=1

8

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam rangka menjaga kualitas es batu

untuk dikonsumsi sebagai bahan tambahan dalam minuman dari pihak produsen

hendaknya memperhatikan mutu air yang digunakan sebagai bahan baku

pembuatan es, serta perlu mengadakan perbaikan terhadap penerapan sanitasi dan

higienitas dalam penanganan es batu dari pihak distributor dan pedagang

minuman. Distributor harus menggunakan kemasan yang sesuai untuk es batu

dalam proses distribusinya, baik dari segi keamanan maupun dari segi ekonomis,

serta mengirimkan es batu sesuai kebutuhan konsumen, misalnya hanya

memberikan es batu balok untuk digunakan sebagai bahan pengawet ikan, buah,

atau untuk mendinginkan produk minuman dalam kemasan sehingga es balok

tidak tercampur dalam produk minuman, dan dari pihak konsumen harus

memastikan asal es yang akan dikonsumsi. Sistem pengolahan, pendistribusian,

dan penyimpanan es batu yang baik dan terjaga dapat menjadikan es tersebut

aman dikonsumsi (DepKes RI, 2004).

Tabel I. Parameter mikrobiologis bahan baku air untuk keperluan minum

(PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990)


9

Proses standar yang digunakan dalam pembuatan es batu untuk tambahan

dalam minuman adalah dengan perebusan bahan baku air pada suhu 100oC

dengan proses pengolahan, penyimpanan, dan distribusi secara higienis (DepKes

RI, 1995). Berdasarkan hasil survey yang dilakukan peneliti kepada 15 produsen

dengan metode wawancara pada bulan Januari tahun 2012, diperoleh informasi

bahwa para produsen mikro es batu kemasan di Kecamatan Danurejan,

Yogyakarta tidak mengetahui proses standar pembuatan es batu sebagai tambahan

dalam minuman. Para produsen tersebut tidak mengetahui faktor-faktor yang

perlu diperhatikan dalam pembuatan es batu kemasan sebagai tambahan dalam

minuman sesuai dengan Standar Nasional Indonesia (SNI) tentang kualitas es batu

untuk tambahan dalam minuman. Para produsen tersebut hanya mengetahui

bahwa pembuatan es batu untuk konsumsi dikategorikan baik jika bahan airnya

sudah direbus hingga mendidih, sedangkan proses lainnya tidak diketahui.

Hasil survey tersebut tidak menunjukkan adanya laporan tentang adanya

kasus penyakit akibat mengkonsumsi es batu di daerah tersebut. Tidak adanya

laporan kasus penyakit akibat mengkonsumsi es batu di daerah tersebut tidak

menjamin bahwa es batu yang diproduksi telah memenuhi kualitas yang baik.

Sebagai langkah preventif perlu dilakukan pembuktian sesuai tidaknya kualitas

dan keamanan es batu di daerah tersebut berdasarkan Standar Nasional Indonesia

(SNI) tentang produk es batu kemasan secara mikrobiologis mengingat kawasan

tersebut merupakan pusat produsen es batu di Yogyakarta.


10

B. Bakteri Coliform

Bakteri Coliform adalah mikroba aerob dan fakultatif anaerob yang

termasuk gram negatif dan berbentuk batang. Bakteri Coliform tidak membentuk

spora dan dapat memfermentasi laktosa. Bakteri Coliform dapat membentuk

asam pada suhu 35-37oC selama 48 jam (Chandra, 2007).

Kelompok bakteri Coliform memiliki beberapa karakter khusus, yaitu

bakteri Coliform mampu menguraikan asam amino menjadi indol tetapi tidak

menghasilkan residu sulfur, yang dideteksi melalui penambahan reagen Kovacs

dan memiliki motilitas pada media atau habitat alaminya karena adanya flagel.

Bakteri Coliform juga mampu menguraikan beberapa jenis gula dalam proses

fermentasinya (glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan sukrosa) menjadi asam

laktat, asam cuka, CO2 dan asam tertentu lainnya tergantung dari spesies

bakterinya. Sumber karbon yang digunakan bakteri Coliform sebagai sumber

energi adalah asetat. Karakteristik bakteri Coliform ini digunakan sebagai dasar

pada tahap identifikasi bakteri Coliform, khususnya bakteri E.coli (Holt, Krieg,

Sneath, Stanley, dan Williams, 2000).

Mikroba aerob yang termasuk gram negatif ini dapat menggunakan

oksigen sebagai penerima elektron terminal. Bakteri ini mampu tumbuh dalam

keadaan rendah oksigen (21% oksigen), kecuali bakteri mikrofilik. Beberapa di

antaranya dapat menyediakan molekul nitrogen. Beberapa genus yang termasuk

dalam kelompok bakteri ini adalah : Acetobacter, Aquaspirillum, Pseudomonas,

Rhizobacter, Rhizobium, dan Rhizomonas, sedangkan pada mikroba fakultatif

anaerob, karakteristiknya sedikit berbeda. Sel-selnya memiliki diameter 0,1-1,5


11

µm. Bakteri Coliform umumnya berbentuk batang lurus, kecuali Vibrio yang

berbentuk berliku-liku atau sel vibrioid, dapat ditemukan di lingkungan sekitar

atau pada hewan atau tanaman sebagai inangnya. Kebanyakan dari spesies ini

bersifat patogen pada manusia dan hewan. Kelompok ini terdiri dari empat famili,

yaitu Enterobacteriaceae (contoh : Citrobacter, Escherichia, Enterobacter,

Klebsiella, Proteus, Salmonella, Shigella, dan Yersinia), Vibrionaceae (contoh :

Earomonas, Photobacterium, Plesiomonas, Vibrio), Pasteurellaceae (contoh:

Actinobacillus, Haemophilus, Pasteurella) dan famili lain (contoh :

Cardiobacterium, Chromobacterium, Einekella, Streptobacillus) (Bonang dan

Koeswardono, 1982).

Coliform fekal adalah anggota dari total Coliform yang mampu

memfermentasikan laktosa pada suhu 44,5oC. Sekitar 97% dari total kandungan

bakteri Coliform fekal terdiri atas Escherichia dan beberapa spesies Klebsiella.

Bakteri Coliform fekal ini juga banyak ditemukan dalam fekal hewan, sehingga

untuk mengetahui adanya pencemaran fekal hewan lebih sesuai digunakan bakteri

Coliform fekal (Chandra, 2007).

C. Escherichia coli Sebagai Indikator Pencemaran Air

Escherichia coli adalah salah satu bakteri Coliform total yang ditemukan

dalam fekal manusia sebagai mikrobiota normal pencernaan. Pada habitat

alamiah, E.coli mampu memfermentasikan laktosa secara optimal pada suhu

44,5oC, sedangkan jika berada dalam saluran pencernaan E.coli mampu


12

memfermentasikan laktosa pada kisaran suhu normal tubuh, yaitu 35-37oC

(Chandra, 2007).

Mikrobia yang paling umum digunakan sebagai petunjuk atau indikator

adanya pencemaran feses dalam air adalah Escherichia coli, serta bakteri dari

kelompok Coliform. Bakteri E.coli merupakan spesies dengan habitat dalam

saluran pencernaan dan non saluran pencernaan, seperti tanah dan air. Bakteri dari

jenis tersebut selalu terdapat di dalam kotoran manusia, sedangkan bakteri

patogen penyebab penyakit tidak selalu ditemukan. Sumber air yang mengalami

kontak dengan kotoran manusia atau hewan dipastikan sumber air tersebut telah

tercemar oleh bakteri E.coli. Mikrobia dari kelompok Coliform secara

keseluruhan tidak umum hidup atau terdapat di dalam air sehingga keberadaanya

dapat dianggap sebagai petunjuk terjadinya cemaran kotoran dalam arti luas, baik

dari kotoran hewan atau manusia (Purnawijayanti, 2001).

D. Media Selektif dan Diferensial E. coli

Media adalah bahan atau substrat yang digunakan untuk menumbuhkan

dan mengembangkan mikroba, yang terdiri dari nutrisi atau zat-zat makanan.

Media yang digunakan untuk pertumbuhan mikroba harus mengandung unsur-

unsur yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu sumber energi, sumber

nitrogen, dan juga ion organik esensial dan kebutuhan yang khusus, seperti

vitamin dan asam amino. Media harus mempunyai tekanan osmosa, tekanan

permukaan, dan mempunyai pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba

(Hadioetomo,1985).


13

Bakteri dapat dibiakkan dalam media bebas sel, yaitu media

pertumbuhan bakteri yang bebas dari segala bentuk kontaminasi sel-sel hidup

yang tidak diharapkan. Media dalam bentuk padat seringkali digunakan

dibandingkan dengan bentuk cair. Pengujian untuk identifikasi bakteri patogen

spesifik, di mana terdapat beberapa bakteri lain, maka substansi media yang

digunakan menghambat pertumbuhan bakteri lain dan tidak mempengaruhi

pertumbuhan bakteri patogen yang diinginkan (media selektif). Media selektif

akan mendukung tumbuhnya jenis spesimen bakteri patogen yang dipilih sesuai

dengan kecocokan, dan ketersediaan substansi-substansi pendukung kelangsungan

hidup bakteri tersebut (Underwood, 1999).

Media selektif adalah media yang berisi bahan tambahan tertentu yang

memperbanyak kehadiran mikroba yang diinginkan dengan menghambat

pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan. Beberapa media pertumbuhan

bakteri Coliform dan E. coli yang tergolong media selektif adalah : media Lactose

Broth (LB) mengandung laktosa dan hanya bakteri yang mampu

memfermentasikan laktosa seperti Coliform yang dapat tumbuh, ditandai dengan

terbentuknya gas pada tabung Durham. Media Brilliant Green Lactose Bile Broth

(BGLB) adalah media yang mengandung laktosa yang hanya mampu

difermentasikan oleh bakteri Coliform fekal dan total Coliform, namun tidak

menimbulkan gas. Media E. coli Broth (ECB) adalah media yang memfasilitasi

bakteri Coliform dan E. coli untuk memfermentasikan laktosa, sedangkan bakteri

lain akan dihambat oleh garam empedu (bile). Hasil positif ditandai dengan

terbentuknya gas (Hadioetomo,1985).


14

Menurut Hadioetomo (1985), media diferensial adalah media yang

membantu dalam perkiraan identifikasi organisme berdasarkan penampakan

pertumbuhannya di media. Beberapa media pertumbuhan diferensial E. coli

adalah sebagai berikut. Media Sulfur Indol Motility (adanya bakteri E.coli ditandai

dengan tidak terbentuknya sulfur, terjadi pembentukan indol dan adanya motilitas

bakteri), media Triphtose Broth (adanya bakteri E.coli ditandai dengan adanya

pembentukan gas), media Mac Conkey Agar (adanya bakteri E.coli ditandai

dengan penampakan morfologi koloni berbentuk kepingan sedikit cembung

dengan ukuran sedang, berwarna merah bata, dan sebaran koloni smooth) dan

media Simmons Citrate Agar (bakteri E.coli tidak menggunakan sitrat sebagai

sumber karbon tetapi asetat) (Holt, Krieg, Sneath, Stanley, dan Williams, 2000).

E. Uji Identifikasi E.coli

Uji ini merupakan serangkaian uji identifikasi bakteri E.coli berdasarkan

karakteristik khusus bakteri E.coli. Uji identifikasi dilakukan dengan

menggunakan beberapa reagen dan media khusus, yaitu uji Sulfur Indol Motility

(SIM), uji fermentasi gula-gula (glukosa, laktosa, manitol, maltosa, sukrosa) dan

uji sitrat 2 %. Hasil uji identifikasi dibandingkan dengan karakteristik E.coli

berdasarkan Holt., dkk (2000).

1. Uji Sulfur Indol Motility (SIM)

Uji ini merupakan paket pengujian identifikasi E.coli yang terdiri dari

tiga parameter pengamatan, yaitu uji pembentukan sulfur (H2S), uji pembentukan


15

Indol dari hasil peruraian asam amino, dan pengamatan pergerakan pertumbuhan

bakteri dalam media tabung. Media yang digunakan untuk tiga pengujian tersebut

adalah satu media yang memiliki komposisi : Pancreatic Digest of Casein, Peptic

Digest of Animal Tissue, Ferrous Ammonium Sulfate, Sodium Thiosulfate, dan

Nutrient Agar. Komposisi media SIM tersebut memungkinkan untuk dilakukan

tiga pengujian sekaligus dalam satu media. Pada uji Indol perlu ditambahkan

reagen Kovacs, sedangkan kandungan Ferrous Ammonium Sulfate dan Sodium

Thiosulfate digunakan untuk uji H2S dan kandungan Nutrient Agar (NA)

digunakan untuk uji motilitas (Finegold dan Baron, 1996).

Menurut Nugraheni (2010), uji sulfur digunakan untuk mengetahui

kemampuan bakteri menguraikan asam amino menjadi unsur sulfur. H2S

diproduksi oleh beberapa jenis mikroba melalui pemecahan asam amino yang

mengandung unsur belerang (S) seperti lisin dan metionin. H2S dapat diproduksi

melalui reduksi senyawa-senyawa belerang anorganik, misalnya : tiosulfat, sulfit

atau sulfat. Hasil peruraian H2S dapat diamati dengan menambahkan garam-

garam logam berat ke dalam medium. Uji ini dikatakan positif apabila H2S

bereaksi dengan senyawa-senyawa ini ditandai dengan terbentuknya logam sulfit

yang berwarna hitam. Hasil negatif dinyatakan jika tidak terbentuk logam sulfit

yang berwarna hitam karena bakteri yang berada dalam medium tersebut tidak

dapat menghidrolisis logam-logam berat yang terkandung dalam medium.

Menurut Holt, dkk. (2000), bakteri E.coli tidak menghasilkan residu sulfur dalam

proses penguraian asam amino.


16

Uji indol digunakan untuk mendeteksi ada tidaknya indol dari peruraian

triptofan oleh bakteri Coliform. Reaksi positif ditandai dengan warna merah muda

di permukaan media setelah penambahan reagen Kovacs. Uji indol dilakukan

setelah pengamatan motilitas agar tidak mengganggu pengamatan motilitas pada

media uji (Universitas Gadjah Mada, 1993).

Uji motilitas merupakan metode yang digunakan untuk mengidentifikasi

E.coli terhadap bakteri lainnya berdasarkan penyebaran koloni karena adanya

kemampuan motilitas bakteri E.coli dalam media Sulfur Indol Motility (SIM).

Adanya kandungan NA semisolid dalam media SIM memungkinkan bakteri yang

memiliki flagel melakukan pergerakan dalam media tersebut. Uji tersebut

berkaitan dengan karakteristik E.coli yang memiliki flagel pada seluruh badan

bakteri (peritrich), sebagai alat untuk bergerak di dalam habitatnya. Jika dalam

media terdapat pertumbuhan bakteri yang menyebar, maka dinyatakan bahwa

bakteri yang diidentifikasi tersebut tergolong sebagai Enterobacteriaceae,

termasuk E.coli (Holt, dkk. 2000).

2. Uji fermentasi larutan gula-gula (glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan

sukrosa)

Kemampuan memfermentasikan berbagai karbohidrat dan produk

fermentasi yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi

mikroba. Glukosa merupakan senyawa yang paling sering digunakan oleh

mikroba dalam proses fermentasi. Fermentasi merupakan proses oksidasi biologi

dalam keadaan anaerob di mana yang bertindak sebagai substrat adalah


17

karbohidrat. Hasil dari fermentasi ini berbeda-beda bergantung pada jenis

bakterinya, misalnya asam laktat, asam cuka, CO2 dan asam tertentu lainnya. Uji

fermentasi karbohidrat, yang akan dilihat adalah pembentukan asam yang akan

terlihat dari perubahan warna medium menjadi kuning dan pembentukan gas yang

terlihat dari adanya gas dalam tabung Durham (Nugraheni, 2010).

Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

menguraikan gula-gula spesifik yang mencerminkan sifat bakteri tersebut

sehingga dapat digunakan sebagai salah satu cara identifikasi bakteri (Nugraheni,

2010). Menurut Holt, dkk. (2000), bakteri E.coli mampu memfermentasikan gula-

gula spesifik yaitu glukosa, laktosa, maltosa, manitol, dan Sukrosa. Karakteristik

kemampuan E.coli memfermentasikan gula-gula spesifik tersebut digunakan

sebagai dasar dalam uji identifikasi E.coli.

3. Uji sitrat 2%

Menurut Lay (1994), uji sitrat bertujuan untuk mengetahui penggunaan

sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi oleh bakteri terutama bakteri

gram negatif golongan Enterobacteriaceae. Uji ini menggunakan media Simmon’s

Citrate Agar yang merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-

satunya sumber karbon, NH4 sebagai sumber N dan Brom Thymol Blue sebagai

indikator pH. Jika bakteri mampu menggunakan sitrat, maka asam akan

dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan

mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. E.coli tidak menggunakan sitrat

sebagai sumber karbon tetapi menggunakan asetat. Menurut Finegold dan Baron


18

(1996), kandungan sitrat dalam media yang digunakan adalah 2% yang

merupakan jumlah optimal dalam satu kali pengujian.

Hasil dari pengujian biokimia untuk identifikasi bakteri E.coli dicocokkan

dengan tabel berdasarkan American Public Health Association (2005), adalah

sebagai berikut.

Tabel II. Sifat-sifat biokimia bakteri Coliform dengan uji biokimia

(American Public Health Association, 2005)

Mikroba Glu Lac Man Mal Suc H2S Ind Mot Cit

E.coli tipe I + gas - + + - - + - -

E.coli tipe II + gas + + + +/- - + +/- -

Keterangan :

F. Uji Angka Bakteri Coliform (E.coli) Menggunakan Metode Most Probable

Number (MPN)

Metode pengujian yang digunakan adalah metode Most Probable Number

(MPN) atau Jumlah Perkiraan Terbatas (JPT). Metode ini merupakan metode

standar World Health Organization (1996) dalam identifikasi Coliform di air,

susu, dan makanan tertentu. Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji

pendugaan (presumptive test), uji konfirmasi (confirmative test) dan uji

kelengkapan (completed test) jika diperlukan. Pada uji tahap pertama, keberadaan

Coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah, atau dugaan. Uji ini

mendeteksi sifat fermentatif Coliform dalam sampel. Beberapa jenis bakteri selain

Glu (glukosa), Lac (Laktosa), Man (Manitol), Mal (Maltosa), Suc (Sucrosa), H2S (sulfur).

+ gas : membentuk gas pada tabung Durham

- gas : tidak membentuk gas pada tabung Durham

+/- : dapat bereaksi positif atau negatif

+ : bereaksi positif

- : bereaksi negative


19

Coliform, juga memiliki sifat fermentatif, maka diperlukan uji konfirmasi untuk

menguji kembali kebenaran adanya Coliform dengan bantuan medium selektif

diferensial. Uji kelengkapan bertujuan meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan

mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri

Coliform yaitu: berbentuk batang, gram negatif, dan tidak berspora (World Health

Organization, 1996).

Hasil dari uji angka bakteri Coliform dengan metode MPN adalah nilai

MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit

pembentuk-koloni (colony-forming unit) dalam sampel. Pada umumnya nilai

MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang

digunakan umumnya per 100 ml atau per g, pada penelitian ini digunakan satuan

per 100 ml karena sampel yang digunakan berupa cairan. Jika terdapat nilai MPN

10 dalam sebuah sampel air, artinya dalam sampel air tersebut diperkirakan

setidaknya mengandung 10 Coliform pada setiap 100 mL atau setiap gramnya.

Makin kecil nilai MPN, maka air tersebut makin tinggi kualitasnya, dan makin

layak untuk dikonsumsi. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95% sehingga

pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN

tertinggi (Institut Teknologi Bandung, 2011).

Uji MPN merupakan perkiraan atau pendekatan konsentrasi bakteri

secara statistik dan bukan menunjukkan konsentrasi yang sebenarnya. Metode ini

mengamati bakteri dengan variabel suhu dan waktu tertentu di mana menunjukkan

hasil positif bila terbentuk gas dalam tabung Durham. Hasil pengujian MPN

dikonversi memberikan data berupa kombinasi tabung positif yang dikonversi


20

menggunakan tabel MPN menjadi data jumlah bakteri uji (Hadyana dan

Qodratilah, 2002).

Uji MPN tersebut dilakukan dalam empat tahap, yaitu uji pendugaan

(presumptive test), uji konfirmatif (confirmative test) pada medium selektif, uji

pelengkap dengan medium Lactose Broth (LB), serta uji identifikasi dengan

melakukan pengujian Sulfur Indol Motility (SIM), uji sitrat 2%, dan uji fermentasi

larutan gula-gula untuk dapat menyimpulkan keberadaan E. coli dalam sampel

air atau makanan (Dwiari, 2008). Perhitungan jumlah bakteri untuk tiap 100 ml

sampel berdasarkan jumlah tabung positif dari 3 seri pengenceran dan faktor

pengencerannya dicocokkan dengan tabel Most Probable Number (MPN) Standar

Nasional Indonesia (Badan Standar Nasional, 1992).

G. Landasan Teori

Es batu merupakan salah satu bahan pangan yang berasal dari pembekuan

air yang ditujukan sebagai bahan tambahan dalam minuman yang semakin lama

tingkat konsumsinya semakin meningkat. Peningkatan kebutuhan es batu tersebut

diiringi dengan banyaknya produsen pembuat es batu namun tidak didukung

dengan pengetahuan mengenai persyaratan baku mutu dan prosedur pembuatan es

batu yang baik, terutama dari segi mikrobiologis.

Secara mikrobiologis es batu dapat terkontaminasi bakteri-bakteri

pathogen, dari bahan dasar pembuatannya saat proses pengolahan dan

penyimpanannya. Bakteri yang umum digunakan sebagai indikator kualitas es

batu adalah Coliform, dan Coliform fekal termasuk E.coli. Menurut World Health

Organization (1996), bakteri tersebut dapat menyebabkan infeksi saluran kemih,


21

gastroenteritis, meningitis, dan peritonitis. Infeksi tersebut terjadi karena es batu

berbahan dasar air yang terkontaminasi oleh feses dan sistem pengolahan yang

tidak tepat.

Salah satu cara untuk mengetahui kandungan bakteri Coliform dan E. coli

pada sampel es batu adalah menggunakan uji pendugaan dan penegasan dengan

media-media selektif di antaranya Lactosa Broth, media Brilliant Green Lactose

Bile Broth, dan E. coli Broth dilanjutkan dengan uji konfirmasi melalui pengujian

Sulfur Indol Motility, uji sitrat 2% dan uji fermentasi larutan gula-gula untuk

identifikasi ada tidaknya bakteri E.coli. Jumlah bakteri Coliform dan E.coli dari

tiap tiga tabung pengenceran dikonversi menggunakan tabel Most Probable

Number (MPN) untuk mendapatkan prediksi jumlah bakteri dalam 100 ml sampel

(BPOM Republik Indonesia, 2008).

Sampel es batu diambil dari lima produsen es batu skala mikro di

Kecamatan Danurejan yang merupakan pusat produsen es batu di Yogyakarta.

Hasil survey peneliti pada bulan Januari 2012, menunjukkan bahwa sebagian

besar produsen tersebut tidak mengetahui persyaratan baku mutu dan prosedur

pembuatan es batu yang baik, terutama dari segi mikrobiologis. Walaupun tidak

diperoleh laporan tentang adanya kasus penyakit akibat mengkonsumsi es batu di

daerah tersebut, namun sebagai langkah preventif perlu dilakukan pembuktian

sesuai tidaknya kualitas es batu di daerah secara mikrobiologi mengingat kawasan

tersebut merupakan pusat produsen yang memproduksi es batu di Yogyakarta.

Oleh karena itu, diperlukan suatu analisa kandungan bakteri tersebut di

dalam es batu untuk diketahui tingkat kesesuaiannya dengan Standar Nasional


22

Indonesia No. 01-3839-1995 bahwa es batu harus memenuhi syarat-syarat air

minum sesuai PerMenKes RI No.416/MenKes/Per/IX/1990, yaitu syarat mutu

secara mikrobiologis : total Coliform tidak melebihi 0 bakteri/100ml dan Coliform

fekal tidak melebihi 0 bakteri/100ml. Analisa ini secara jangka panjang ditujukan

untuk menjamin kualitas es batu kemasan untuk bahan minuman sehingga aman

dikonsumsi oleh masyarakat.

H. Hipotesis

Produk es batu kemasan lima usaha mikro es batu di Kecamatan

Danurejan, Yogyakarta tidak sesuai dengan persyaratan mikrobiologis Standar

Nasional Indonesia 01-3839-1995 berdasarkan PerMenkes RI No.

416/MenKes/Per/IX/1990 yaitu total Coliform melebihi 0 bakteri/100ml sampel

dan Coliform fekal melebihi 0 bakteri/100ml sampel.


23

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental dengan analisis

deskriptif-komparatif, karena tidak memberikan perlakuan terhadap subjek uji.

Data yang diperoleh berupa prediksi jumlah bakteri Coliform ,Coliform fekal dan

Escherichia coli dalam 100 ml sampel yang dibandingkan dengan Standar

Nasional Indonesia 01-3839-1995 yang didasarkan dari PerMenKes RI No.

416/MenKes/Per/IX/1990. Sampel uji berupa sampel es batu yang dicairkan dari

lima usaha mikro di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta. Penelitian laboratorium

dilaksanakan di Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas : produk es batu kemasan dari lima usaha mikro

di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta.

b. Variabel tergantung : jumlah bakteri Coliform, jumlah Coliform

fekal, dan identitas E.coli.

c. Variabel pengacau :

1) Terkendali : jenis es batu (es batu kemasan sebagai bahan

tambahan minuman), media (media selektif dan differensial dari

bakteri Coliform), volume sampel (0,01 ml, 0,1 ml, dan 1 ml),


24

suhu dan waktu inkubasi (media LB, BGLB, dan LTB 35-37oC

selama 48 jam, media ECB 44oC selama 48 jam), asal sampel es

batu (Kecamatan Danurejan).

2) Tak terkendali : kualitas media yang digunakan, akurasi peralatan

dalam pengaturan suhu, akurasi peralatan dalam pengambilan

volume sampel.

2. Definisi Operasional

a. Es batu kemasan adalah air yang dibekukan dalam suatu wadah

berupa plastik dengan ukuran 1 kg. Pembekuan dilakukan pada suhu

0 oC (273,15

oK, 32

oF) sebagai salah satu bahan konsumsi

minuman. Es batu kemasan yang digunakan diperoleh dari lima

usaha mikro di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta.

b. Coliform adalah bakteri aerob dan fakultatif anaerob yang termasuk

gram negatif dan berbentuk batang, dapat memfermentasi laktosa

dan membentuk asam yang dimungkinkan terdapat dalam es batu.

Bakteri Coliform digunakan sebagai indikator pencemaran es batu.

c. Coliform fekal adalah anggota dari bakteri Coliform total yang

memiliki habitat alami di saluran pencernaan dan mampu

memfermentasikan laktosa pada suhu 44,50 oC. Coliform fekal

terdiri dari Escherichia dan beberapa spesies Klebsiella yang

dimungkinkan terdapat dalam es batu. Adanya bakteri Coliform

fekal dalam es batu mengindikasikan bahwa es batu tersebut telah


http://id.wikipedia.org/wiki/Air

http://id.wikipedia.org/wiki/Kelvin

http://id.wikipedia.org/wiki/Fahrenheit

25

mengalami kontak dengan feses baik secara langsung atau tidak

langsung.

d. Escherichia coli adalah salah satu bakteri Coliform fekal dengan

kemampuan memfermentasikan laktosa suhu 44,5oC yang

dimungkinkan terdapat dalam es batu. E.coli merupakan bakteri

gram negatif dengan bentuk seperti kapsul berukuran 1,1 – 1,5 x 2,0

– 6,0 µm. E.coli menunjukkan hasil positif pada uji Indol, hasil

negatif pada uji H2S, hasil negatif pada uji sitrat, hasil positif pada

uji fermentasi gula-gula dan hasil positif atau negatif pada uji

motilitas.

e. MPN (Most Probable Number) adalah metode penentuan jumlah

bakteri Coliform dan Coliform fekal yang mungkin ada di dalam

sampel es batu yang diambil dari lima usaha mikro di Kecamatan

Danurejan, Yogyakarta.

f. Kualitas mikrobiologis es batu adalah kelayakan es batu dari segi

mikrobiologis dengan ketentuan kandungan total Coliform sebesar 0

bakteri/100ml dan Coliform fekal sebesar 0 bakteri/100ml

berdasarkan Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 dan


g. Media selektif adalah media biakan yang mengandung paling sedikit

satu bahan yang menghambat perkembangbiakan mikroba selain

bakteri Coliform total, Coliform fekal, dan E. coli, sehingga media


26

tersebut hanya dapat ditumbuhi bakteri Coliform total, Coliform

fekal, dan E. coli saja.

h. Media diferensial adalah media yang dibuat untuk membedakan

masing-masing bakteri yaitu bakteri Coliform total, Coliform fekal,

dan E. coli terhadap bakteri lain. Pembedaan dilakukan dengan

pengamatan perubahan media biakan atau penampilan koloni pada

media Mac Conkey Agar.

C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan penelitian

Sampel yang diuji adalah produk es batu kemasan dari lima usaha

mikro di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta yang diambil secara acak pada

bulan Januari 2012. Bahan untuk uji MPN adalah Lauryl Triphtose Broth,

Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%, E. coli (EC) Broth, dan NaCl fisiologis

0,85%. Untuk uji identifikasi E.coli adalah media Mac Conkey Agar, media

Sulfur Indol Motility (SIM), larutan gula-gula (glukosa, laktosa, manitol,

maltosa, sukrosa), dan media sitrat 2%. Kontrol positif adalah biakan murni

E.coli ATCC 25922 dan kontrol negatif adalah biakan murni Staphylococcus

aureus ATCC 25923 serta kontrol media pengujian.

2. Alat penelitian

Autoklaf ( KT-40 ALP), inkubator Heraeus, neraca analitik (Mettler AE

200), oven (WTB binder), mikroskop dan alat-alat gelas seperti cawan petri,


27

tabung reaksi dilengkapi tabung Durham, pipet ukur, pengaduk kaca, beker

gelas, objek gelas, gelas arloji, gelas ukur, Erlenmeyer, dan labu ukur.

D. Tata Cara Penelitian

1. Pengumpulan sampel

Penelitian dilakukan dengan mengambil lima sampel es batu dari lima

produsen es batu skala mikro secara acak di Kecamatan Danurejan,

Yogyakarta yang dianggap mewakili seluruh daerah produksi es batu di

Kecamatan Danurejan. Dari setiap produsen tersebut diambil masing-masing

satu kemasan es batu dalam plastik 1 kg sebagai sampel. Sampel diambil

langsung dari produsen sebanyak satu kali tanpa replikasi pengambilan

sampel. Replikasi sampel dilakukan dengan metode pengenceran sebanyak

tiga kali pada saat pengujian di laboratorium.

Pengambilan sampel dilakukan dengan memilih lima objek uji dari lima

produsen es batu secara acak. Sampel disimpan dengan wadah plastik yang

sudah disterilkan dengan alkohol 70% . Sampel yang diperoleh harus segera

diuji agar tidak terkontaminasi pada saat penyimpanan.

2. Homogenisasi dan pengenceran sampel

Perlakuan sampel dilakukan secara aseptis. Bahan pangan termasuk es

batu dalam bentuk beku dipecahkan dengan peralatan tumpul kemudian

ditimbang 25 g atau dicairkan pada suhu kamar sebanyak 25 ml dan

ditambahkan 225 ml larutan pengencer NaCl 0,85%. NaCl 0,85% digunakan

sebagai larutan pengencer karena memiliki karakteristik pH yang sesuai


28

dengan pH fisiologis saluran pencernaan yang merupakan habitat alami E.coli.

Campuran tersebut dihomogenkan dan didiamkan selama 15 menit dalam

wadah yang sudah disterilkan pada suhu kamar dalam kondisi aseptis.

Perlakuan tersebut dilakukan pada seluruh sampel sehingga diperoleh lima

stok sampel. Setiap stok sampel tersebut diencerkan dan direplikasi sebanyak

tiga kali hingga diperoleh konsentrasi sampel sebesar 10-1

, 10-2

, dan 10-3

.

Setiap konsentrasi sampel diambil 1 ml dan diencerkan dengan 9 ml NaCl

0,85% (DepKes RI, 1992).

3. Pembuatan media

a. Lauryl Triphtose Broth (LTB)

Sebanyak 35,6 g serbuk Lauryl Triphtose Broth dilarutkan

dalam 1 liter aquadest ke dalam labu ukur dan dimasukkan ke dalam

tabung reaksi berisi tabung Durham sebanyak masing-masing 10

ml.Kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121o C selama 15

menit. Didinginkan segera sampai suhu 25o C.

b. Brilliant Green Lactose Bile Broth 2% (BGLB 2%)

Sebanyak 40 g BGLB 2% dimasukkan dalam 1 liter aquadest,

dilarutkan tanpa pemanasan, dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi

sebanyak 10 ml yang telah dilengkapi tabung Durham. Setelah itu

disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 100o C selama 30 menit.

Didinginkam segera sampai suhu 250 C.


29

c. Escherichia coli (EC) Broth

Sebanyak 37 g EC Broth dimasukkan dalam 1 liter aquadest,

dilarutkan tanpa pemanasan, dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi

sebanyak 10 ml yang telah dilengkapi tabung Durham. Setelah itu

disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit dengan

didinginkan segera sampai suhu 25 oC.

d. Mac Conkey Agar (MCA)

Sebanyak 3,6 g Mac Conkey Agar dimasukkan dalam 100 ml

aquadest, dan dilarutkan dengan pemanasan. Dimasukkan ke dalam

tabung reaksi sebanyak 10 ml. Disterilisasi dengan autoklaf pada suhu

121o C selama 15 menit. Setelah suhunya mencapai kira-kira 60-70

o C,

dipindahkan bahan dari tabung reaksi ke cawan petri.

e. Nutrient Agar (NA) miring

Sebanyak 1,4 g NA dimasukkan dalam 50 ml aquadest, lalu

dilarutkan dengan pemanasan. Dimasukkan dalam tabung reaksi dan

disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit dan

didinginkan segera dengan posisi tabung reaksi yang dimiringkan.

f. NaCl fisiologis 0,85%

Sebanyak 17 g NaCl dilarutkan dalam aquadest sebanyak 2

liter di dalam labu ukur dan dinetralkan hingga pH = 7 dengan

penambahan NaOH ± 5-10 tetes. Kemudian disterilisasi menggunakan

autoklaf dengan suhu 121o C selama 15 menit.


30

g. Simmons Citrate Agar

Sebanyak 2,3 g Simmons Citrate Agar dalam 100 ml aquadest,

lalu dlarutkan dengan pemanasan. Dimasukkan ke dalam tabung reaksi

dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit dan

kemudian didinginkan.

4. Uji bakteri coliform (IKM/5.4.2/2009/BLK-Y)

a. Uji Pendugaan Bakteri Coliform (Presumptive test)

Dipipet 1 ml pengenceran sampel 10-1

, 10-2

, 10-3

ke dalam

masing-masing 3 tabung sebagai replikasi yang berisi 9 ml Lauryl

Triphtose Broth yang di dalamnya terdapat tabung Durham terbalik.

Semua tabung tersebut disimpan dalam inkubator pada suhu 36oC±1

oC

selama 24 dan 48 jam. Setelah 24 jam dicatat jumlah tabung yang

membentuk gas pada masing-masing pengenceran dan disimpan kembali

tabung yang tidak menghasilkan gas dalam inkubator selama 24 jam pada

suhu 36oC±1

oC, kemudian dicatat kembali tabung yang menghasilkan

gas. Adanya gas pada tabung Durham mengindikasikan adanya bakteri

Coliform.

b. Uji Penegasan Bakteri Coliform (Confirmative test)

Dipindahkan 1 sengkelit dari tiap tabung yang membentuk gas

pada media Lauryl Triphtose Broth ke dalam tabung yang berisi 10 ml

BGLB 2%. Tabung tersebut dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu

36oC ± 1

oC selama 24-48 jam. Adanya gas pada tabung BGLB

memperkuat adanya bakteri Coliform dalam sampel. Tabung yang


31

membentuk gas dicatat dan dibandingkan dengan tabel MPN (Badan

Standarisasi Nasional Indonesia, 1995) (lampiran 1).

c. Uji Konfirmasi Coliform fekal dan Escherichia coli

Biakan dari tabung yang menunjukkan uji penegasan positif

dipindahkan 1 sengkelit ke dalam tabung reaksi berisi 10 ml EC Broth

yang telah dilengkapi dengan tabung Durham terbalik. Seluruh tabung

diinkubasi pada suhu 44-45oC selama 24-48 jam. Dilakukan pengamatan

terhadap pembentukan gas. Dari biakan EC Broth yang positif, masing-

masing diinokulasikan pada petri berisi media Mac Conkey Agar (MCA),

diamati morfologi koloni spesifik yang tumbuh. Menurut Holt et al.

(2000), koloni spesifik E.coli pada media MCA memiliki karakteristik

ukuran koloni sedang, warna merah bata atau merah tua, sebaran koloni

yang tipis seperti awan (smooth), dan berbentuk kepingan sedikit

cembung.

d. Uji Identifikasi Escherichia coli

Dipilih koloni spesifik yang tumbuh pada media Mac Conkey

Agar, diinokulasikan pada media NA miring. Dilanjutkan uji biokimia

melaui pengujian Sulfur Indol Motility (SIM), uji fermentasi gula-gula

(glukosa, laktosa, manitol, maltosa, sukrosa), dan uji sitrat 2%.

Diinkubasikan pada suhu 35-37o C selama 24 jam untuk mengetahui ada

tidaknya bakteri E.coli. Hasil positif uji identifikasi E.coli berdasarkan

APHA (2005) disajikan pada Tabel II.


32

E. Analisis Hasil

Data yang diperoleh berupa hasil reaksi pembentukan gas pada uji

pendugaan dan uji konfirmasi pada tabung Durham terbalik. Timbulnya gas

menunjukkan adanya cemaran Coliform dan Coliform fekal. Kombinasi jumlah

tabung positif gas dicocokkan dengan tabel MPN deret 3 tabung (Badan

Standarisasi Nasional Indonesia, 1995) (lampiran 1). Kombinasi tersebut

menunjukkan indeks MPN yang menyatakan jumlah bakteri Coliform dan

Coliform fekal dalam 100 ml sampel.

Data yang diperoleh dari uji biokimia berupa reaksi-reaksi terhadap reagen

dan media pertumbuhan E.coli. Hasil reaksi biokimia dicocokkan dengan tabel

reaksi uji biokimia E.coli berdasarkan APHA (2005) untuk mengetahui hasil uji

biokimia (Tabel II).

Hasil uji cemaran bakteri Coliform, Coliform fekal dan identifikasi E.coli

yang diperoleh kemudian dianalisis secara deskriptif komparatif berdasarkan

Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 dan PerMenKes RI No.

416/MenKes/Per/IX/1990. Jika kandungan total Coliform dan Coliform fekal

melebihi 0 bakteri/100ml, maka sampel es batu dinyatakan tidak memenuhi

persyaratan es batu berdasarkan Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 dan



33

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Es batu merupakan salah satu komoditas bahan pangan yang sudah sangat

umum digunakan dalam kehidupan sehari-hari terutama sebagai bahan tambahan

dalam berbagai jenis minuman. Tingginya tingkat produksi dan konsumsi es batu

oleh masyarakat harus diikuti dengan terjaminnya kualitas es batu dari segi

kesehatan untuk menjamin keamanan konsumen. Jaminan kualitas es batu yang

paling pokok adalah jaminan secara mikrobiologis.

Berdasarkan hasil survey peneliti pada bulan Januari 2012 pada produsen

es batu skala mikro di Kecamatan Danurejan Yogyakarta, ditemukan fakta bahwa

Kecamatan Danurejan adalah daerah produksi es batu skala mikro terbesar di

Yogyakarta. Jumlah produsen skala mikro di daerah tersebut mencapai 49

produsen yang tersebar secara merata di Kecamatan Danurejan.

Es batu yang dihasilkan oleh produsen di daerah tersebut ditujukan sebagai

bahan tambahan dalam minuman. Menurut kelima produsen es batu di Kecamatan

Danurejan Yogyakarta, bahan baku air yang digunakan dalam pembuatan es batu

tersebut diperoleh dari air sumur yang telah melalui proses perebusan hingga

mendidih. Pemasakan bahan baku air sudah dianggap memenuhi kualitas es batu

yang sehat menurut para produsen es batu di daerah tersebut. Padahal, menurut

Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 kualitas es batu secara mikrobiologis

tidak dapat terpenuhi hanya dengan memasak bahan air sampai mendidih, tetapi


34

juga harus memperhatikan faktor-faktor lain. Faktor-faktor tersebut adalah

higienitas dalam proses pembuatan, penyimpanan, dan pendistribusian es batu.

A. Pengumpulan Sampel

Menurut Gay dan Diehl (1992), analisis pada penelitian deskriptif dapat

menggunakan jumlah sampel sebanyak 10% dari total populasi. Oleh karena itu,

peneliti menggunakan 5 sampel dari 49 total populasi produk es batu di

Kecamatan Danurejan. Sampel tersebut dipilih dengan metode acak tanpa

mempertimbangkan proses pembuatan, distribusi, dan penyimpananya agar

diperoleh sampel yang benar-benar dapat menjadi representatif dari populasi.

B. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel

Homogenisasi sampel dilakukan untuk menjamin bahwa bakteri Coliform

yang terdapat dalam sampel es batu dapat terdistribusi secara merata dalam setiap

pengambilan cuplikan sampel. Hal ini perlu dilakukan karena sampel telah

mengalami proses pembekuan yang dapat melemahkan kehidupan bakteri dan

akibat proses pemadatan saat pembekuan menyebabkan kemampuan hidup bakteri

menjadi berkurang.

Pengenceran sampel dilakukan sebagai tahap pokok dalam pengujian

menggunakan metode Most Probable Number (MPN). Uji MPN deret tiga tabung

membutuhkan tiga konsentrasi berbeda dari setiap sampel yaitu 10-1

, 10-2

, 10-3

untuk dapat dibandingkan dengan tabel MPN berdasarkan Badan Standarisasi

Nasional Indonesia (1995). Pada tahap pengenceran ini setiap konsentrasi


35

direplikasi sebanyak tiga kali sebagai pembanding antar hasil dari setiap

konsentrasi sampel untuk memperoleh hasil yang valid.

Metode pengenceran dilakukan dengan prinsip deret pengenceran tiga

tabung. Metode ini digunakan karena merupakan metode baku dalam pengujian

bakteri Coliform, Coliform fekal, dan Escherichia coli. Metode pengenceran deret

tiga tabung lebih mudah dilakukan dan telah memenuhi standar prosedur

pengujian bakteri Coliform dalam sampel es batu berdasarkan Standar Nasional

Indonesia 01-3839-1995 untuk pengujian mikrobiologis sampel es batu.

Larutan pengencer yang digunakan adalah NaCl 0,85% (NaCl fisiologis)

yang memiliki pH = 7 yang sesuai dengan pH saluran pencernaan manusia,

diharapkan dengan kondisi yang sesuai dengan habitat alami tersebut bakteri

E.coli dapat tumbuh dengan baik. Menurut Macfaddin (1990), larutan NaCl

0,85% merupakan larutan fisiologis yang dapat menggiatkan kembali daya hidup

bakteri E.coli setelah mengalami berbagai proses pengolahan pembuatan bahan

pangan, termasuk akibat proses pembekuan air sebagai bahan baku pada

pembuatan es batu.

Es batu yang digunakan dalam penelitian ini adalah es batu yang dikemas

dalam wadah plastik berkapasitas 1 kg yang telah sepenuhnya membeku. Sampel

es batu dalam kemasan plastik 1 kg dipilih karena merupakan jenis es batu

kemasan yang paling banyak diproduksi oleh produsen es batu skala mikro di

Kecamatan Danurejan Yogyakarta. Lima sampel yang diperoleh tidak

menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan pada warna es batu dan tidak


36

terdapat partikel-partikel pengotor yang dapat diamati secara langsung tanpa

bantuan alat.

C. Uji Bakteri Coliform (IKM/5.4.2/2009/BLK-Y)

Analisa bakteriologi air adalah suatu pengujian untuk mengetahui

kandungan bakteri dan identifikasi jenis bakteri dalam suatu sampel air, baik

berupa air minum, air sumur, dan sampel lain yang mengandung air. Analisa ini

bertujuan untuk menggambarkan kualitas es batu dari segi mikrobiologis. Hasil

analisa ini digunakan sebagai parameter kesesuaian kualitas es batu dengan baku

mutu yang ditetapkan dalam Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 yang

berguna untuk menjamin kelayakan es batu tersebut sebagai bahan pangan untuk

dikonsumsi masyarakat (DepKes RI, 1995).

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah Most Probable

Number (MPN) sesuai dengan standar prosedur IKM/5.4.2/2009/BLK-Y Balai

Laboratorium Kesehatan Yogyakarta. Bakteri yang diteliti pada penelitian ini

adalah golongan bakteri Coliform termasuk Coliform fekal, dan Escherichia coli.

Metode ini digunakan karena merupakan metode baku dalam uji cemaran bakteri

Coliform, Coliform fekal, dan E.coli dalam berbagai macam sampel termasuk es

batu. Selain itu, metode ini dapat menunjukkan perkiraan atau prediksi jumlah

bakteri dalam setiap 100 ml sampel es batu dengan cepat (BPOM RI, 2008).

Metode Most Probable Number didasarkan pada tiga deret tabung dengan

konsentrasi 10-1

, 10-2

, dan 10-3

melalui tahap uji pendugaan, dan uji konfirmasi.

Uji pendugaan merupakan tahap perkiraan awal (screening) kemungkinan adanya


37

bakteri Coliform dengan media LTB (Lauryl Triphtose Broth) dan BGLB

(Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%), untuk uji Coliform fekal digunakan

media ECB (Escherichia coli Broth) dan untuk uji identifikasi E.coli dilakukan

dengan uji Sulfur Indol Motility (SIM), uji fermentasi gula-gula (glukosa, laktosa,

manitol, maltosa, sukrosa), dan uji sitrat 2% (Soemarmo, 2000).

Media yang digunakan tersebut termasuk media differensial yaitu media

yang digunakan untuk membantu dalam perkiraan identifikasi organisme

berdasarkan pertumbuhannya di media. Media differensial mengandung indikator

yang dapat memberikan reaksi positif jika terdapat mikroba yang sesuai dengan

karakteristik indikator. Karakteristik indikator tersebut dapat meliputi hasil

metabolisme atau karakteristik organisme (Hadioetomo, 1985).

Cara menghitung jumlah bakteri dengan metode MPN didasarkan pada

kombinasi tiga konsentrasi sampel deret tiga tabung yang memberikan reaksi

positif. Reaksi positif ditandai dengan adanya pembentukan gas pada tabung

Durham yang diletakkan di dalam tabung reaksi berisi media yang sesuai. Sebagai

contoh, uji Coliform sampel I pada konsentrasi 10-1

diperoleh hasil 2 tabung

positif , 10-1

diperoleh hasil negatif, dan 10-3

diperoleh hasil negatif (2-0-0). Dari

kombinasi tersebut dicatat dan dicocokkan dengan tabel MPN berdasarkan Badan

Standarisasi Nasional Indonesia (1995) dan ditemukan nilai MPN 10 berarti dalam

setiap 100 ml sampel es batu I diperkirakan terdapat 10 bakteri Coliform

(lampiran 1).

Setelah uji MPN selesai dilaksanakan maka dilanjutkan dengan pengujian

biokimia untuk identifikasi bakteri E.coli dalam sampel dengan pengujian Sulfur


38

Indol Motility (SIM), uji fermentasi larutan gula-gula (glukosa, laktosa, manitol,

maltosa, sukrosa) dan uji sitrat 2%.

Uji identifikasi E.coli sebagai bakteri indikator perlu dilakukan untuk

mengetahui ada tidaknya kontaminasi feses pada es batu. Menurut Badan

Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia (2008), tidak semua golongan

bakteri Coliform memiliki hábitat alamiah di dalam saluran pencernaan. Hanya

bakteri E.coli yang memiliki habitat alamiah dalam saluran pencernaan manusia

dan hewan. Metode MPN hanya dapat digunakan untuk pengujian Coliform total

dan Coliform fekal tetapi tidak dapat digunakan untuk identifikasi E.coli.

Es batu yang terbukti mengandung E.coli memberikan makna bahwa es

batu tersebut telah terkontaminasi oleh feses baik secara langsung atau tidak

langsung. Kontaminasi secara langsung dapat terjadi jika proses pembuatan es

batu tidak higienis, baik dari segi sumber daya manusianya atau lingkungannya.

Kontaminasi secara tidak langsung dapat mencemari es batu, misalnya sumber air

yang digunakan berdekatan dengan tempat penampungan feses dan terjadi

rembesan dari penampungan tersebut ke dalam sumber air. Jumlah kontaminasi

yang melebihi batas standar pada bahan pangan (es batu) dapat menimbulkan

berbagai masalah kesehatan. Menurut Brooker (2008), masalah kesehatan

tersebut terkait dengan adanya infeksi bakteri Coliform dan E.coli yang

menimbulkan beberapa penyakit seperti infeksi saluran kemih, gastroenteritis,

meningitis, peritonitis, dan infeksi luka.


39

1. Uji pendugaan bakteri coliform (Presumptive test)

Uji ini merupakan langkah awal penelitian yang bertujuan untuk

mengetahui adanya dugaan keberadaan bakteri Coliform dalam sampel es batu.

Media yang digunakan adalah Lauryl Triphtose Broth (LTB), yaitu media cair

yang mengandung laktosa yang merupakan salah satu bahan yang dapat

diuraikan oleh bakteri Coliform. Laktosa yang telah terurai dapat diamati dengan

terbentuknya gas pada tabung Durham yang diletakkan di dalam tabung reaksi.

Uji pendugaan ini belum dapat digunakan sebagai acuan pasti ada tidaknya

bakteri Coliform karena media LTB yang digunakan bukan merupakan media

selektif untuk pertumbuhan Coliform saja tetapi cenderung sebagai media

pengkayaan bakteri golongan Enterobacteriaceae (Universitas Gadjah Mada,

1993).

Pada penelitian yang dilakukan diperoleh hasil bahwa sampel I, II dan III

pada tiga konsentrasi pengenceran membentuk gas, sedangkan sampel IV dan V

tidak membentuk gas (Tabel III).

Tabel III. Hasil Uji Pendugaan Coliform dengan Media LTB pada suhu

36oC±1

oC waktu inkubasi 48 jam

Keterangan :

+ + + : terbentuk gas pada setiap replikasi

- + - : terbentuk gas pada replikasi kedua

- - - : tidak terbentuk gas

- - + : terbentuk gas pada replikasi ketiga

+ + - : terbentuk gas pada replikasi pertama dan kedua

Sampel es

batu

Konsentrasi sampel es batu deret

3 tabung yang membentuk gas

10-1

10-2

10-3

I + + + - - + - - -

II + + + + + - - - -

III - + - - - - - - -

IV - - - - - - - - -

V - - - - - - - - -


40

Dari tabel III dapat dinyatakan bahwa sampel I, II, dan III mengandung

bakteri Coliform sedangkan sampel IV dan V tidak mengandung bakteri Coliform.

Keberagaman jumlah tabung yang positif dari sampel I, II, dan III menunjukkan

bahwa jumlah bakteri Coliform dalam setiap sampel tidak sama dan semakin

banyak tabung yang positif pada konsentrasi yang lebih kecil menunjukkan

kandungan jumlah bakteri Coliform yang lebih besar. Urutan jumlah tabung

positif paling banyak adalah sampel II yang menghasilkan 3 tabung positif pada

konsentrasi 10-1

dan 2 tabung positif pada konsentrasi 10-2

, diikuti sampel I yang

menghasilkan 3 tabung positif pada konsentrasi 10-1

dan 1 tabung positif pada

konsentrasi 10-2

, dan sampel III hanya menghasilkan 1 tabung positif pada

konsentrasi 10-1

. Jadi dari ke tiga tabung yang menunjukkan hasil positif sampel

II menunjukkan jumlah bakteri Coliform yang paling banyak diikuti oleh sampel I

dan sampel III.

Dari 5 sampel tabung reaksi berisi LTB dengan tabung Durham yang telah

diinkubasi selama 48 jam pada suhu 36o

C±1oC, hanya sampel I , II dan III yang

menunjukkan adanya pembentukan gas, sedangkan tabung sampel IV, dan V tidak

menunjukkan adanya pembentukan gas. Gas yang terbentuk pada sampel I, II dan

III tidak sama pada setiap konsentrasi, tetapi hampir seluruh bagian tabung

Durham terpenuhi oleh gas. Hasil positif adanya bakteri Coliform ditunjukkan

dengan adanya gas dan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas

(Gambar 1,2,3,4 dan 5).


41

Gambar 1. Hasil uji pendugaan pada media LTB sampel I inkubasi 48 jam

pada suhu 36o C±1

oC

Keterangan :

Hasil positif : terbentuk gas pada tabung Durham

Hasil negatif : tidak terbentuk gas pada tabung Durham

A : Sampel I konsentrasi 10-1

(3 tabung membentuk gas)

B : Sampel I konsentrasi 10-2


C : Sampel I konsentrasi 10-3

(tidak membentuk gas)

M: Kontrol media (tidak membentuk gas)

Gambar 2. Hasil uji pendugaan pada media LTB sampel II inkubasi 48 jam

pada suhu 36o C±1

oC

Keterangan :



A : Sampel II konsentrasi 10-1


B : Sampel II konsentrasi 10-2


C : Sampel II konsentrasi 10-3



A B C

A B C

M

M


42

Gambar 3. Hasil uji pendugaan pada media LTB sampel III inkubasi 48 jam

pada suhu 36o C±1

oC

Keterangan :



A : Sampel III konsentrasi 10-1


B : Sampel III konsentrasi 10-2


C : Sampel III konsentrasi 10-3



Gambar 4. Uji pendugaan pada media LTB sampel IV inkubasi 48 jam

pada suhu 36o C±1

oC

Keterangan :


A : Sampel IV konsentrasi 10-1


B : Sampel IV konsentrasi 10-2


C : Sampel IV konsentrasi 10-3



A B C

A B C

M

M


43

Gambar 5. Uji pendugaan pada media LTB sampel V inkubasi 48 jam

pada suhu 36o C±1

oC

Keterangan :


A : Sampel V konsentrasi 10-1


B : Sampel V konsentrasi 10-2


C : Sampel V konsentrasi 10-3


M : Kontrol media (tidak membentuk gas)

Bakteri golongan Coliform terdiri dari bakteri jenis aerob, yaitu bakteri

yang membutuhkan oksigen untuk proses metabolisme dan fakultatif anaerob

yaitu bakteri yang proses metabolismenya dapat berlangsung dengan adanya

oksigen maupun tanpa oksigen. Pembentukan gas pada tabung Durham oleh

bakteri Coliform terjadi karena adanya peruraian dari laktosa yang merupakan

polimer polisakarida rantai panjang yang perlu diuraikan dahulu sebelum masuk

ke dalam sel bakteri. Laktosa dipecah menjadi galaktosa dan glukosa dengan

bantuan enzim β-galaktosidase yang kemudian ditranspor masuk ke dalam sel

melalui proses transpor aktif. Pada mikroba aerob glukosa akan diproses melalui

jalur glikolisis yang menghasilkan asam piruvat. Asam piruvat yang dihasilkan

diproses kembali melalui Siklus Krebs yang menghasilkan asam-asam campuran

A B C M


44

dan residu berupa gas CO2, sedangkan pada bakteri fakultatif anaerob, glukosa

akan dimetabolisme menghasilkan asam-asam campuran dan gas O2. Asam-asam

yang terbentuk dari proses metabolisme bakteri aerob dan fakultatif anaerob

umumnya berupa asam suksinat dan fumarat (Atlas, 1997).

Hasil sampel positif dilanjutkan dengan uji konfirmasi untuk memastikan

keberadaan bakteri Coliform dalam sampel es batu. Media yang digunakan adalah

media BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%). Uji penegasan dilakukan

pada seluruh sampel baik yang memberikan reaksi positif atau negative.

2. Uji penegasan bakteri coliform (Confirmative test)

Uji konfirmasi ini bertujuan untuk menguatkan dugaan adanya bakteri

Coliform dalam sampel es batu. Uji ini merupakan tahap penyeleksian

pertumbuhan bakteri Coliform terhadap bakteri lain dengan menggunakan media

selektif bakteri Coliform yaitu BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%).

Media ini merupakan media cair berwarna hijau yang mengandung laktosa

empedu berwarna hijau dan hanya bakteri yang dapat menfermentasikan laktosa

yang dapat bertahan hidup pada media ini yaitu bakteri Coliform (Universitas

Gadjah Mada, 1993).

Dari hasil uji penegasan, bakteri Coliform, sampel I, II, dan III

membentuk gas pada tabung Durham, sedangkan sampel IV dan V tidak

membentuk gas. Hasil uji konfrimasi dengan media BGLB (Brilliant Green

Lactose Bile Broth 2%) tersaji dalam tabel IV dan gambar 6.


45

Tabel IV. Hasil uji penegasan dan angka MPN bakteri Coliform dengan media

BGLB waktu inkubasi 24 jam pada suhu 36o C±1

oC

Sampel Es

Batu

Konsentrasi sampel deret 3

tabung yang membentuk gas Jumlah

kombinasi

tabung positif

MPN

Coliform

per 100 ml 10-1

10-2

10-3

I + + + - - + - - - 3-1-0 4.300

II + + + + + - - - - 3-2-0 9.300

III - + - - - - - - - 1-0-0 400

IV - - - - - - - - - 0-0-0 0

V - - - - - - - - - 0-0-0 0

Kontrol positif membentuk gas pada tabung Durham

Kontrol negatif tidak membentuk gas pada tabung Durham

Kontrol media tidak membentuk gas pada tabung Durham Keterangan :

Kontrol positif : biakan murni E.coli ATCC 25922

Kontrol negatif : biakan murni Staphyllococcus aureus ATCC 25923


- + - : terbentuk gas pada replikasi kedua

- - - : tidak terbentuk gas pada semua replikasi

- - + : terbentuk gas pada replikasi ketiga


Hasil uji penegasan pada tabel IV menunjukkan bahwa jumlah tabung

positif dari setiap replikasi sampel pada 3 deret pengenceran berbeda-beda. Hal ini

menunjukkan bahwa jumlah bakteri Coliform pada setiap sampel juga berbeda-

beda. Perbedaan jumlah tabung positif antara sampel I, II terhadap sampel III

yang signifikan diduga terjadi karena konsentrasi jumlah bakteri Coliform pada

sampel III sangat kecil. Hal ini dibuktikan dengan terbentuknya tabung positif

sampel III pada konsentrasi paling besar yaitu 10-1

sedangkan pada konsentrasi

10-2

dan 10-3

tidak terbentuk gas. Jumlah bakteri Coliform terbanyak terdapat pada

sampel II, diikuti sampel I dan sampel III. Sampel es batu IV dan V yang tidak

menunjukkan pembentukan gas dimungkinkan karena sumber air, proses

pengolahan, dan pengemasannya sudah memenuhi kualitas kontrol yang sesuai


46

sehingga bakteri Coliform tidak dapat tumbuh. Tabung Durham dalam tabung

reaksi yang terdapat gas mengindikasikan adanya bakteri Coliform, sedangkan

pada tabung yang tidak terdapat gas dinyatakan tidak mengandung bakteri

Coliform (Gambar 6).

Gambar 6. Hasil uji konfirmasi bakteri Coliform sampel I konsentrasi 10-1

dengan

media BGLB inkubasi 24 jam pada suhu 36o C±1

oC

Keterangan gambar :

+ : Kontrol positif membentuk gas (biakan murni bakteri E.coli ATCC 25922)

- : Kontrol negatif tidak membentuk gas (biakan murni bakteri

Staphyllococcus aureus ATCC 25923)

A : Sampel I konsentrasi 10-1

(membentuk gas)

B : Sampel I konsentrasi 10-2

(membentuk gas)

C : Sampel I konsentrasi 10-3

(membentuk gas)

M : Kontrol media (tidak membentuk gas)

Berdasarkan metode dari (IKM/5.4.2/2009/BLK-Y) untuk menjamin

bahwa gas yang terbentuk dihasilkan oleh bakteri Coliform, maka digunakan

kontrol positif berupa biakan murni E. coli dan kontrol negatif dari biakan murni

Staphyllococcus aureus ATCC 25923 serta kontrol media untuk mengetahui ada

tidaknya kontaminasi pada media yang menyebabkan hasil pengujian menjadi

bias. E.coli ATCC 25922 digunakan sebagai kontrol positif karena merupakan

- C B A + M


47

bakteri gram negatif golongan Coliform yang mampu memfermentasikan laktosa

dan menghasilkan asam-asam tertentu dan gas. S.aureus digunakan sebagai

kontrol negatif karena bakteri ini termasuk bakteri gram positif yang dapat

digunakan sebagai pembanding dalam uji identifikasi (Universitas Gadjah Mada,

1993).

Urutan jumlah bakteri Coliform pada media BGLB ini berkorelasi dengan

jumlah tabung positif pada uji pendugaan dengan media LTB. Hasil yang

berkorelasi tersebut dapat digunakan untuk menyatakan bahwa metode yang

dilakukan berhasil sebagai uji penegasan adanya cemaran bakteri Coliform pada

sampel es batu I, II, dan III (lampiran 3).

Berdasarkan hasil perhitungan angka bakteri Coliform dengan metode

MPN (Tabel IV) diperoleh hasil sampel I terdapat 4.300 Coliform /100ml, sampel

II terdapat 9.300 Coliform /100ml, dan sampel III terdapat 400 Coliform /100ml,

sedangkan sampel IV dan V tidak mengandung bakteri Coliform. Jumlah bakteri

Coliform pada sampel es batu I, II, dan III tersebut dinyatakan tidak memenuhi

syarat kualitas mikrobiologi es batu sesuai Standar Nasional Indonesia 01-3839-

1995 dan PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990 yang menyatakan baku

mutu es batu total Coliform tidak melebihi 0 bakteri/100ml, sedangkan sampel IV

dan V secara mikrobiologis memenuhi syarat kualitas es batu berdasarkan baku

mutu tersebut.

Laktosa pada media BGLB hanya dapat difermentasikan oleh bakteri

Coliform menjadi asam suksinat dan dan fumarat diikuti pembentukan O2 oleh

bakteri Coliform fakultatif anaerob dan CO2 oleh bakteri Coliform aerob.


48

Pembentukan gas O2 dan CO2 tersebut dijadikan parameter ada tidaknya bakteri

Coliform dalam sampel es batu (Atlas, 1997).

3. Uji konfirmasi coliform fekal dan Escherichia coli

Uji ini bertujuan untuk membuktikan dan mengkonfirmasi ada tidaknya

bakteri Coliform fekal dan E.coli dalam sampel es batu yang diteliti. Media

Escherichia coli Broth (ECB) merupakan media cair berwarna kuning jernih.

Media ini mengandung laktosa yang hanya dapat diuraikan oleh bakteri yang

mampu memfermentasikan laktosa menjadi asam-asam tertentu dan residu,

berupa gas baik CO2 atau O2. Pembentukan gas inilah yang dijadikan sebagai

parameter untuk mengetahui ada tidaknya bakteri Coliform fekal dan E.coli

(DepKes RI, 2004).

Metode uji konfirmasi Coliform fekal merupakan metode pemeriksaan

yang menunjukkan adanya E.coli atau spesies lain yang sangat dekat dengan

E.coli . Metode ini dapat menunjukkan adanya E.coli secara cepat tanpa harus

mengisolasi biakan dan melakukan tes IMVIC (Indol-Methyl Red-Voges

Proskaeur-Citrate). Sebagian besar bakteri golongan Coliform fekal terdiri dari

E.coli tipe I dan tipe II yang merupakan petunjuk penting adanya kontaminasi

dari material fekal (BPOM RI, 2008).

Pada tahap uji ini sampel dalam media ECB diinkubasi selama 48 jam

pada suhu 44oC. Pada suhu 44

oC bakteri golongan Coliform tidak dapat

tumbuh secara optimal, tetapi sangat baik untuk pertumbuhan bakteri Coliform

fekal dan E. coli. Variabel suhu inkubasi tersebut merupakan penyeleksian


49

Coliform fekal dan E. coli terhadap bakteri-bakteri Coliform yang lain

(Soemarmo, 2000). Berdasarkan hasil pengujian diperoleh hasil yang tersaji

pada Tabel.V berikut.

Tabel V. Hasil uji konfirmasi dan angka MPN bakteri Coliform fekal

dengan media ECB waktu inkubasi 48 jam pada suhu 44-45oC

Sampel Es Batu

Konsentrasi sampel deret 3

tabung yang membentuk gas Jumlah

kombinasi

tabung positif

MPN Coliform

fekal per 100 ml 10

-1 10

-2 10

-3

I + + + - - - - - - 3-0-0 2.300

II + + + + + - - - - 3-2-0 4.300

III - - - - - - - - - 0-0-0 0

IV - - - - - - - - - 0-0-0 0

V - - - - - - - - - 0-0-0 0

Kontrol positif membentuk gas pada tabung Durham

Kontrol negatif tidak membentuk gas pada tabung Durham

Kontrol media tidak membentuk gas pada tabung Durham Keterangan :

Kontrol positif : biakan murni E.coli ATCC 25922

Kontrol negatif : biakan murni Staphyllococcus aureus ATCC 25923


- - - : tidak terbentuk gas pada semua replikasi


Dari Tabel V dapat dilihat bahwa hanya sampel I dan II yang positif

terdapat bakteri Coliform fekal dan E coli, sedangkan sampel III, IV, dan V

negatif. Terdapat perbedaan hasil antara uji konfirmasi Coliform dengan uji

konfirmasi Coliform fekal yang dibuktikan dengan perbedaan jumlah sampel

positif. Pada uji konfirmasi dengan media BGLB (Tabel IV) terdapat 3 sampel

positif yaitu sampel I, II, dan III, sedangkan uji konfirmasi dengan ECB hanya

terdapat 2 sampel positif, yaitu sampel I dan II saja (Gambar 7). Hasil ini

memperkuat bukti bahwa bakteri pada sampel III pada uji konfirmasi BGLB

bukan merupakan Coliform fekal atau E.coli. Hal ini menunjukkan bahwa media


50

ECB pada suhu inkubasi 44oC selama 48 jam terbukti selektif terhadap Coliform

fekal dan E. coli saja.

Hasil MPN jumlah bakteri Coliform fekal dan E.coli (Tabel V)

menunjukkan bahwa sampel I es batu mengandung 2.300 Coliform fekal/100 ml

dan sampel II mengandung 4.300 Coliform fekal/100 ml, sedangkan sampel III,

IV, dan V tidak mengandung Coliform fekal atau E.coli. Maka dapat dinyatakan

bahwa sampel es batu I dan II tidak sesuai dengan baku mutu es batu secara

mikrobiologis berdasarkan Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 dan

PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990 yang menyatakan baku mutu es

batu Coliform fekal dan E. coli tidak melebihi 0 bakteri/100 ml. Secara

mikrobiologis sampel III, IV, dan V memenuhi baku mutu tersebut karena tidak

mengandung bakteri Coliform fekal dan E. coli.

Dalam uji konfirmasi dengan ECB ini digunakan kontrol positif berupa

biakan murni E.coli ATCC 25922 dan kontrol negatif berupa biakan murni

S.aureus ATCC 25923, serta kontrol media untuk meminimalisir terjadinya hasil

pengujian yang bias karena media uji yang terkontaminasi. Kontrol positif akan

membentuk gas, sedangkan kontrol negatif tidak mampu membentuk gas.

Kontrol media yang digunakan merupakan seluruh media yang digunakan dalam

penelitian ini tanpa sampel yang diperlakukan secara sama seperti perlakuan

terhadap media untuk pengujian sampel uji. Kontrol media seharusnya tidak

menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri. Tujuan dari pembuatan kontrol ini

adalah untuk memastikan bahwa gelembung yang terbentuk dari sampel adalah

gelembung dari bakteri Coliform dan E.coli bukan dari bakteri lain (Gambar 7).


51

Gambar 7. Hasil uji konfirmasi Coliform fekal dengan media ECB inkubasi 48 jam

pada suhu 44-45oC

Keterangan gambar :

Hasil positif : terbentuknya gas pada tabung Durham

+ : Kontrol positif dengan biakan murni E.coli ATCC 25922

- : Kontrol negatif dengan biakan murni S. aureus ATCC 25923

A : Sampel es batu I membentuk gas

B : Sampel es batu II membentuk gas

C : Sampel es batu III tidak membentuk gas

M : Kontrol media tidak membentuk gas

Bakteri golongan Coliform termasuk Coliform fekal dan E.coli merupakan

bakteri jenis aerob yaitu bakteri yang membutuhkan oksigen untuk proses

metabolisme dan fakultatif anaerob yaitu bakteri yang menggunakan oksigen

maupun tidak menggunakan oksigen dalam proses metabolismenya. Pembentukan

gas pada tabung Durham oleh bakteri Coliform fekal dan E.coli terjadi karena

adanya peruraian laktosa yang merupakan polimer polisakarida rantai panjang

yang perlu diuraikan dahulu sebelum dapat ditranspor ke dalam sel bakteri.

Laktosa dipecah menjadi galaktosa dan glukosa dengan bantuan enzim β-

galaktosidase yang kemudian dibawa masuk ke dalam sel melalui proses transpor

aktif. Pada mikroba aerob glukosa akan diproses melalui jalur glikolisis yang

menghasilkan asam piruvat. Asam piruvat yang dihasilkan diproses kembali

melalui Siklus Krebs yang menghasilkan asam-asam campuran dan residu berupa

C B A + - M


52

gas CO2, sedangkan pada bakteri fakultatif anaerob, glukosa akan dimetabolisme

dan menghasilkan asam-asam campuran dan gas O2. Asam-asam yang terbentuk

dari proses metabolisme bakteri aerob dan fakultatif anaerob umumnya berupa

asam suksinat dan fumarat (Atlas, 1997).

Hasil uji konfirmasi dilanjutkan dengan uji identifikasi pada media Mac

Conkey Agar dan uji biokimia. Uji identifikasi dan uji biokimia digunakan untuk

memastikan kebenaran adanya bakteri E.coli dari tabung positif dari uji

konfirmasi dengan media ECB.

4. Uji identifikasi Eschericia coli

Pengujian ini hanya dilakukan pada sampel yang menunjukkan reaksi

positif pada uji konfirmasi bakteri Coliform fekal dan E.coli saja, maka hanya

sampel I dan II yang akan digunakan. Hal ini dilakukan karena pada tahap

sebelumnya telah digunakan media ECB yang merupakan media selektif

pertumbuhan bakteri Coliform fekal meliputi E. coli, Klebsiella dan Enterobacter

spp yang mampu memfermentasikan laktosa (Todar, 1998).

Tujuan dari uji identifikasi E.coli adalah untuk mengisolasi dan

mengidentifikasi apakah dalam sampel es batu I dan II terdapat bakteri E.coli.

Media yang digunakan pada uji ini adalah Mac Conkey Agar (MCA). Media Mac

Conkey Agar adalah media agar berwarna merah muda yang dipadatkan pada

cawan petri. Warna merah muda media Mac Conkey Agar disebabkan oleh

komposisi bahan penyusunnya terutama neutral red bile salt yang berwarna

merah. Media ini mempunyai kemampuan untuk memilah bakteri enterik gram


53

negatif yang memfermentasi laktosa, karena media ini mengandung laktosa,

crystal violet dan neutral red bile salt (Fardiaz, 1993).

Crystal violet dan bile salt berfungsi sebagai inhibitor bakteri gram positif

dan beberapa bakteri gram negatif. Bakteri penghasil asam kuat seperti

Escherichia, Klebsiella, dan Enterobacter memperlihatkan koloni berwarna

merah bata, sedangkan bakteri yang tidak memfermentasi laktosa seperti

Salmonella, Proteus, dan Edwardsiella memperlihatkan koloni tidak berwarna

merah bata (Adams dan Moss, 2008).

Gambar 8. Hasil penanaman sampel es batu I dan II pada media Mac Conkey Agar

inkubasi 48 jam pada suhu 35oC

Keterangan :

+ : Kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 (koloni E. coli ditunjukkan

dengan panah hijau)

A : Sampel I menunjukkan pertumbuhan koloni E.coli berwarna merah bata

(ditunjukkan dengan panah hijau)

B : Sampel II menunjukkan pertumbuhan koloni E.coli berwarna merah bata

(ditunjukkan dengan panah hijau) dan koloni Klebsiella (ditunjukkan dengan

panah hitam)

M : Kontrol media tidak menunjukkan adanya pertumbuhan koloni bakteri

B A

+ M


54

Kemampuan E. coli memfermentasi laktosa menyebabkan penurunan pH,

sehingga mempermudah absorpsi neutral red untuk mengubah koloni menjadi

merah bata dan mengendapkan empedu (bile). Koloni lain misalnya (S.aureus;

Pseudomonas.aeruginosa dan Salmonella), bila tumbuh tidak akan menimbulkan

warna merah bata karena tidak mampu memfermentasi laktosa. Mikroba lain

yang dapat tumbuh pada media ini antara lain Enterobacter; Proteus;

Salmonella; Shigella, Aerobacter; Klebsiella, dan Enterococcus (Fardiaz, 1993).

Satu sengkelit sampel positif dari media ECB ditanam pada MCA secara

streak plate dan diinkubasi pada suhu 35oC selama 24 jam. Isolasi E.coli pada

media ini dinyatakan positif jika terbentuk koloni berwarna merah bata (Gambar

8). Berdasarkan Soemarmo (2008), untuk memastikan bahwa koloni yang

tumbuh adalah E. coli maka dilakukan uji yang sama pada kontrol positif dari

biakan murni E. coli.

Pada uji ini diperoleh hasil sampel I dan II memiliki karakteristik yang

mirip dengan kontrol positif, yaitu koloni menyebar berwarna merah bata.

Jumlah sebaran koloni merah bata pada sampel I lebih sedikit daripada sampel

II. Hal ini dikarenakan pada uji konfirmasi E.coli menggunakan media ECB

sampel I memang memiliki jumlah bakteri yang lebih sedikit jika dibandingkan

dengan sampel II.

Sampel I dan II menunjukkan perbedaan keragaman bakteri yang

tumbuh. Sampel I hanya ditumbuhi bakteri E.coli saja, sedangkan sampel II

ditumbuhi E.coli dan bakteri Coliform fekal lainnya yang diduga adalah

Klebsiella (Gambar 8). Pertumbuhan bakteri Coliform fekal tersebut dikarenakan


55

media ECB dan MCA yang digunakan dapat ditumbuhi Coliform fekal lain

termasuk Klebsiella (Effendi, 2007).

Salah satu cara membedakan bakteri E. coli terhadap bakteri Coliform

fekal lainnya didasarkan pada pengamatan ciri-ciri morfologi koloninya. Ciri-ciri

morfologi koloni E.coli pada media MCA adalah ukuran koloni sedang, warna

merah bata atau merah tua, sebaran koloni yang tipis seperti awan (smooth),

dan berbentuk kepingan sedikit cembung. Ciri-ciri morfologi koloni Klebsiella

pada media MCA adalah ukuran koloni yang besar-besar, smooth, mucoid,

cembung, berwarna merah bata sampai merah muda, jika koloni diambil dengan

ose kelihatan elastis seperti tali/ benang (Holt, dkk, 2000). Berdasarkan ciri-ciri

morfologi tersebut dapat dipastikan bahwa pada uji identifikasi E. coli ditemukan

juga adanya bakteri Coliform lain yaitu Klebsiella. Hal ini diperkuat dengan

kesesuaian penampakan morfologi dari koloni Klebsiella tersebut.

Uji identifikasi bakteri E.coli adalah suatu metode untuk mengetahui ada

tidaknya bakteri E.coli dalam sampel yang merupakan lanjutan dari uji

konfirmasi bakteri Coliform fekal dengan media ECB. Bakteri Coliform fekal,

misalnya, Escherichia coli, merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan

atau manusia, sedangkan Enterobacter aerogenes biasanya ditemukan pada

hewan atau tanam-tanaman yang telah mati. Maka uji identifikasi ini hanya dapat

dilakukan jika sampel yang diteliti memiliki hasil positif Coliform fekal dan

sampel I, II telah memenuhi persyaratan untuk dilanjutkan uji identifikasi E.coli

(Fardiaz, 1993).


56

Uji ini dilakukan dengan mengambil satu sengkelit biakan bakteri

sampel I dan II dari media MCA yang sesuai dengan morfologi koloni bakteri

E.coli berdasarkan Holt,dkk (2000). Biakan tersebut kemudian diuji dengan

pengujian Sulfur Indol Motility (SIM), uji fermentasi larutan gula-gula (glukosa,

laktosa, manitol, maltosa, sukrosa), dan uji sitrat 2%. Kontrol positif dengan

biakan murni E.coli ATCC 25922 dan kontrol negatif dengan biakan murni S.

aureus ATCC 25923 digunakan sebagai pembanding sampel.

Uji Sulfur Indol Motility (SIM) merupakan uji identifikasi E.coli

menggunakan tiga indikator, yaitu sulfur, indol, dan pengamatan motilitas bakteri.

Pengujian ini digunakan untuk mengetahui karakteristik bakteri E.coli. Media

SIM mengandung Pancreatic Digest of Casein, Peptic Digest of Animal Tissue,

Ferrous Ammonium Sulfate, Sodium Thiosulfate, dan Nutrient Agar. Komposisi

media SIM tersebut memungkinkan untuk dilakukan tiga pengujian sekaligus

dalam satu media. Untuk uji indol perlu ditambahkan reagen Kovacs, sedangkan

kandungan Ferrous Ammonium Sulfate dan Sodium Thiosulfate digunakan untuk

uji H2S dan kandungan Nutrient Agar (NA) digunakan untuk uji motilitas

(Finegold dan Baron, 1996).

Uji Sulfur Indol Motility dilakukan pada media yang sama dengan

penambahan reagen dan pengamatan yang berbeda. Media yang digunakan adalah

media Sulfur Indol Motility (SIM). Pengamatan uji sulfur dilakukan dengan

adanya asam amino pada media, pengamatan uji indol dilakukan dengan

penambahan reagen Kovacs, dan uji motilitas diamati penyebaran koloni dalam

media pengujian.


57

Uji sulfur atau H2S digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri

menguraikan asam amino menjadi unsur sulfur H2S diproduksi oleh beberapa

jenis mikroba melalui pemecahan asam amino yang mengandung unsur belerang

(S), seperti lisin dan metionin. H2S dapat diproduksi melalui reduksi senyawa-

senyawa belerang anorganik, misalnya : tiosulfat, sulfit atau sulfat. Adanya H2S

dapat diamati dengan menambahkan garam-garam logam berat ke dalam medium.

Hasil uji dinyatakan positif jika H2S bereaksi dengan senyawa-senyawa ini

ditandai dengan terbentuknya logam sulfit yang berwarna hitam. Hasil uji

dinyatakan negatif jika tidak terbentuk logam sulfit yang berwarna hitam karena

bakteri yang berada dalam medium tersebut tidak dapat menghidrolisis logam-

logam berat yang terkandung dalam medium (Wijayanti, 2009).

Gambar 9. Hasil pengujian H2S sampel es batu I pada uji identifikasi E.coli

Keterangan :

+ : kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 (tidak terbentuk warna

hitam logam sulfit)

A : sampel es batu I (tidak terbentuk warna hitam logam sulfit)

- : kontrol negatif biakan murni S. aureus ATCC 25923 (tidak terbentuk warna

hitam logam sulfit)

M : kontrol media tidak menunjukkan pembentukan logam sulfit

+ A - M


58

Gambar 10. Hasil pengujian H2S sampel es batu II pada uji identifikasi E.coli

Keterangan :

+ : kontrol positif biakan murni E.coli ATCC 25922 (tidak terbentuk warna

hitam logam sulfit)

B : sampel es batu II (tidak terbentuk warna hitam logam sulfit)

- : kontrol negatif biakan murni S. aureus ATCC 25923 (tidak terbentuk warna

hitam logam sulfit)

M : kontrol media tidak menunjukkan pembentukan logam sulfit

Hasil penelitian sampel I dan II tidak menunjukkan pembentukan sulfur.

Hasil ini tidak dapat digunakan sebagai acuan untuk menyatakan bahwa bakteri

uji adalah E.coli (Gambar 9 dan 10). Hasil dari uji ini dilanjutkan dengan

pengamatan dengan uji Indol dan pengamatan motilitas bakteri. Uji lanjutan

tersebut dilakukan untuk memperkuat pernyataan bahwa identitas bakteri uji

adalah benar E.coli.

Jika bakteri uji mampu menghasilkan sulfur maka sulfur tersebut akan

berinteraksi dengan Ferrous Ammonium Sulfate yang kemudian akan berinteraksi

dengan Sodium Thiosulfate membentuk kompleks Ferrous Thiosulfate berupa

logam berwarna hitam pada permukaan media SIM. Reaksi pembentukan

kompleks Ferrous Thiosulfate dijadikan sebagai indikator kemampuan bakteri

untuk menghasilkan sulfur dalam proses metabolismenya (Finegold dan Baron,

1996).

+ B - M


59

Bakteri E.coli memiliki karakteristik mampu membentuk sulfur dan ada

yang tidak. Variasi tersebut menyebabkan hasil uji ini tidak menggambarkan

kesimpulan identitas bakteri. Hasil uji ini dilanjutkan dengan uji indol dan

motilitas bakteri dapat untuk memastikan bahwa bakteri uji adalah E.coli

(Wijayanti, 2009).

Uji indol menggunakan media Sulfur Indol Motility (SIM) dan

penambahan reagen Kovacs. Reagen Kovacs mengandung amil alkohol sehingga

dengan adanya indol dapat menyebabkan amil alkohol berubah warna menjadi

merah tua. Hasil uji ini dinyatakan positif apabila membentuk warna merah pada

permukaan medium. Bakteri E. coli dapat memecah asam amino triptofan karena

memiliki enzim triptofanase untuk memecahkan asam amino triptofan dan

amonia sebagai sumber energi (Fardiaz, 1993).

Asam amino merupakan komponen protein yang umum terdapat dalam

bakteri akibat penguraian protein sebagai sumber energi bakteri. E.coli merupakan

bakteri yang mampu menguraikan triptofan sebagai sumber karbon. E.coli

memiliki enzim triptofanase yang mampu mengkatalis peruraian gugus indol

dari triptofan. Pembentukan indol oleh E.coli dapat diketahui dengan

menumbuhkan bakteri pada media yang kaya dengan triptofan. Penumpukan indol

dalam media dapat diketahui dengan penambahan reagen Kovacs yang

mengandung para-dimetil aminobenzaldehide. Reagen pada media Sulfur Indol

Motility (SIM) khususnya kandungan triptofan akan berinteraksi dengan indol

membentuk warna merah pada permukaan medium yang tidak larut pada air

(Gambar 11).


60

Gambar 11. Reaksi pembentukan Indol oleh bakteri E.coli (Lay, 1994)

Hasil uji indol menunjukkan bahwa sampel I dan II memberikan hasil

positif karena terjadi pembentukan warna merah pada permukaan medium setelah

ditetesi larutan Kovacs. Sehingga dapat dinyatakan bahwa sampel I dan II

bereaksi positif terhadap Indol yang berarti bakteri tersebut mampu

menghasilkan indol dari peruraian asam amino triptofan (Gambar 12 dan 13).

Gambar 12. Hasil pengujian Indol pada uji identifikasi E.coli pada sampel es

batu I

Keterangan gambar:

+ : kontrol positif (biakan murni E.coli ATCC 25922) terbentuk warna

merah (ditunjukkan dengan tanda panah)

- : kontrol negatif (biakan murni S. aureus ATCC 25923) tidak terbentuk

warna merah

A : sampel es batu I terbentuk warna merah (ditunjukkan dengan tanda

panah)

M : kontrol media tidak terjadi pembentukan warna merah

+ A - M


61

Gambar 13. Hasil pengujian Indol pada uji identifikasi E.coli pada sampel es

batu II

Keterangan gambar:

+ : kontrol positif (biakan murni E.coli ATCC 25922) terbentuk warna merah

(ditunjukkan dengan tanda panah)


warna merah

B : sampel es batu II terbentuk warna merah (ditunjukkan dengan tanda

panah)

M : kontrol media tidak terjadi pembentukan warna merah

Uji motilitas merupakan metode yang digunakan untuk mengidentifikasi

E.coli terhadap bakteri lainnya berdasarkan penyebaran koloni bakteri dalam

media. Uji motilitas juga dilakukan dengan media Sulfur Indol Motility (SIM).

E.coli merupakan bakteri yang memiliki flagel tipe peritrich (flagel berada di

seluruh bagian badan bakteri) untuk melakukan motilitas dalam medium

hidupnya. Kemampuan E.coli untuk dapat bergerak di dalam medium berfungsi

untuk menjangkau bahan nutirisi dan kondisi ideal yang dibutuhkan untuk

mempertahankan hidupnya, namun tidak semua jenis bakteri E.coli melakukan

pergerakan dalam mediumnya. Jika dalam media terdapat pertumbuhan bakteri

yang menyebar maka dinyatakan bahwa bakteri yang diuji tersebut tergolong

sebagai Enterobacter, termasuk E.coli (Soemarmo, 2000).

+ B - M


62

Gambar 14. Hasil pengujian motilitas sampel I pada uji identifikasi E.coli

Keterangan gambar:

+ : kontrol positif (biakan murni E.coli ATCC 25922) terbentuk pernyebaran

koloni pada daerah inokulasi (ditunjukkan dengan tanda panah)


pernyebaran koloni pada daerah inokulasi (ditunjukkan dengan tanda

panah)

A : sampel es batu I terbentuk penyebaran koloni bakteri pada daerah

inokulasi (ditunjukkan dengan tanda panah)

M : kontrol media tidak menunjukkan penyebaran bakteri

Gambar 15. Hasil pengujian motilitas sampel II pada uji identifikasi E.coli

Keterangan gambar:

+ : kontrol positif (biakan murni E.coli ATCC 25922) terbentuk


panah)

- : kontrol negatif (biakan murni S.aureus ATCC 25923) tidak terbentuk


panah)

B : sampel es batu II terbentuk penyebaran koloni bakteri pada daerah

inokulasi (ditunjukkan dengan tanda panah)

M : kontrol media tidak menunjukkan penyebaran bakteri

+ A -

+ B -

M

M


63

Hasil uji motilitas menunjukkan adanya penyebaran bakteri pada media.

Bakteri ditanam dengan menggunakan ose secara tegak lurus pada media SIM

hingga menyentuh dasar tabung (Gambar 14 dan 15). Media Sulfur Indol Motiity

(SIM) mengandung NA dengan tingkat kepadatan yang rendah (semisolid)

sehingga memudahkan bakteri uji untuk menyebar dalam media tersebut.

Pertumbuhan bakteri uji yang menyebar di sekitar lokasi penanaman menandakan

kemungkinan besar bakteri uji tersebut adalah E.coli.

Kemampuan memfermentasikan berbagai karbohidrat dan produk

fermentasi yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi

mikroba. Glukosa merupakan senyawa yang paling sering digunakan oleh

mikroba dalam proses fermentasi. Fermentasi merupakan proses oksidasi biologi

dalam keadaan anaerob dengan karbohidrat sebagai substratnya. Hasil dari

fermentasi ini spesifik tergantung pada kemampuan bakterinya. Setiap bakteri

memiliki kemampuan memfermentasikan gula-gula tertentu saja. Uji fermentasi

karbohidrat didasarkan pada pembentukan asam yang akan terlihat dari perubahan

warna medium menjadi kuning dan pembentukan gas yang terlihat dari adanya

gas dalam tabung Durham (Wijayanti, 2009).

Berdasarkan Holt, dkk (2000), E.coli adalah bakteri yang mampu

menguraikan gula-gula spesifik seperti glukosa, laktosa, manitol, maltosa,

maltosa dan sukrosa sebelum dapat ditranspor ke dalam sel. Uji larutan gula-

gula ini terdiri dari beberapa jenis gula di antaranya glukosa, laktosa, manitol,

maltosa, dan sukrosa. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui kemampuan

bakteri dalam menguraikan gula-gula spesifik yang mencerminkan sifat bakteri


64

tersebut sehingga dapat digunakan sebagai salah satu cara identifikasi bakteri

(Soemarmo, 2000).

Peruraian gula dideteksi dengan bantuan indikator Phenol red. Indikator

ini berwarna merah dan akan berubah warna menjadi kuning jika terjadi

penurunan pH menjadi lebih asam. Proses peruraian gula oleh bakteri

menghasilkan asam piruvat dan asam laktat yang akan menurunkan pH.

Penurunan pH tersebut menyebabkan suasana medium menjadi lebih asam

sehingga warna indikator akan berubah menjadi kuning. Karakteristik E.coli yang

dapat menghasilkan asam-asam tersebut digunakan sebagai kunci identifikasi

E.coli (Soemarmo, 2000).

Gambar 16. Hasil uji fermentasi larutan gula-gula pada sampel I, kontrol positif, kontrol

media dan kontrol negatif

Keterangan :

Larutan gula-gula : 1 (Glukosa), 2 (Laktosa), 3 (Manitol), 4 ( Maltosa), 5 (Sukrosa)

+ : kontrol positif (biakan murni E.coli ATCC 25922) terjadi perubahan warna dari

merah menjadi kuning

- : kontrol negatif (biakan murni S. aureus ATCC 25923) terjadi perubahan warna dari


A : sampel es batu I terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning

M : kontrol media tidak terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning

A

+ A

- M


65

Gambar 17. Hasil uji fermentasi larutan gula-gula pada sampel II, kontrol positif, kontrol

media dan kontrol negatif

Keterangan :

Larutan gula-gula : 1 (Glukosa), 2 (Laktosa), 3 (Manitol), 4 ( Maltosa), 5 (Sukrosa)

+ : kontrol positif (biakan murni E.coli ATCC 25922) terjadi perubahan warna dari


- : kontrol negatif (biakan murni S. aureus ATCC 25923) terjadi perubahan warna dari


B : sampel es batu II terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning

M : kontrol media tidak terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning

Hasil uji fermentasi gula-gula pada (Gambar 16 dan 17), menunjukkan

bahwa sampel I dan II menghasilkan perubahan warna indikator dari merah

menjadi kuning. Perubahan warna indikator tersebut menandakan bakteri uji

mampu menguraikan gula-gula. Hasil uji ini dilanjutkan dengan uji sitrat untuk

melengkapi data identitas bakteri uji.

Uji sitrat bertujuan untuk mengetahui penggunaan sitrat sebagai satu-

satunya sumber karbon dan energi oleh bakteri. Media yang digunakan adalah

Simmon’s Citrate Agar yang merupakan medium sintetik dengan Na sitrat

sebagai satu-satunya sumber karbon, NH4 sebagai sumber N dan Brom Thymol

Blue sebagai indikator pH. Mikroba yang menggunakan sitrat akan

-

+ B

M


66

menghilangkan asam dari medium biakan, sehingga terjadi peningkatan pH dan

mengubah warna medium dari hijau menjadi biru (Lay, 1994). Menurut Finegold

dan Baron (1996), kandungan sitrat dalam media yang digunakan adalah 2% yang

merupakan jumlah optimal dalam satu kali pengujian.

Oksaloasetat + asetil-CoA + H2O Sitrat + CoA + H+

Gambar 18. Reaksi pembentukan sitrat oleh bakteri E.coli (Cohen, 2011)

Pertumbuhan bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon

dilihat dari timbulnya kekeruhan dan perubahan warna media. Bakteri E. coli

dapat menggunakan asetat sebagai sumber karbon, tetapi tidak dapat

menggunakan sitrat. Hasil uji positif ditunjukkan dengan perubahan warna media

dari hijau menjadi biru, sedangkan hasil uji negatif ditunjukkan dengan tidak

adanya pertumbuhan dan media tetap berwarna hijau (Supardi dan Sukamto,

1999).

Gambar 19. Hasil uji sitrat pada sampel I, kontrol positif, kontrol media dan kontrol negatif

Keterangan :

+ : kontrol positif (biakan murni E.coli ATCC 25922) tidak terjadi perubahan warna dari

hijau menjadi biru

- : kontrol negatif (biakan murni Staphylococcus aureus ATCC 25923) tidak terjadi

perubahan warna dari hijau menjadi biru

A : sampel es batu I tidak terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru

M : kontrol media tidak terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru

+ - A M


67

Gambar 20. Hasil uji sitrat pada sampel II, kontrol positif, kontrol media dan kontrol

negatif

Keterangan :

+ : kontrol positif (biakan murni E.coli ATCC 25922) tidak terjadi perubahan warna dari

hijau menjadi biru

- : kontrol negatif (biakan murni Staphylococcus aureus ATCC 25923) tidak terjadi

perubahan warna dari hijau menjadi biru

B : sampel es batu II tidak terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru

M : kontrol media tidak terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru

Uji sitrat terkait dengan kemampuan bakteri menghasilkan asam piruvat

dan CO2 dalam proses metabolismenya. Asam piruvat dan CO2 akan berinteraksi

dengan Na sitrat menjadi Na karbonat. Pembentukan Na karbonat menyebabkan

pH media menjadi lebih basa yang menyebabkan indikator Brom Thymol Blue

berubah warna dari hijau menjadi biru yang dapat diamati pada media SIM

(Lennette, 1995).

Hasil uji sitrat menunjukkan bahwa tidak terjadi perubahan warna dan

tidak terbentuk kekeruhan media uji pada sampel I dan II yang berarti bakteri uji

tidak menghilangkan asam-asam dalam medium uji dan tidak mampu tumbuh.

Hasil tersebut mengindikasikan bahwa bakteri uji tidak menggunakan sitrat

sebagai sumber karbon dan energi (Gambar 19 dan 20).

+ - B M


68

Dari berbagai pengujian dengan pereaksi biokimia diperoleh rangkuman

hasil seperti pada (tabel VI).

Tabel VI. Hasil uji biokimia E. coli sampel I dan II

Mikroba Glu Lac Man Mal Suc H2S Ind Mot Cit

E.coli tipe I + gas - + + - - + - -

E.coli tipe II + gas + + + +/- - + +/- -

Sampel I + gas + + + + - + + -

Sampel II + gas + + + + - + + -

Keterangan tabel : Glu (Glukosa), Lac (Lactosa), Man (Manitol), Mal (Maltosa), Suc

(Sucrosa), H2S (Uji sulfur), Ind (Indol), Mot (Motilitas), Cit (Citrate), + (positif),

- (negatif), +/- (dapat positif atau negatif)

Berdasarkan persyaratan Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 dan

PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990 tentang kualitas es batu dinyatakan

bahwa jumlah total Coliform tidak melebihi 0 bakteri/100ml dan Coliform fekal

tidak melebihi 0 bakteri/100ml. Hasil penelitian es batu produksi skala mikro di

Kecamatan Danurejan Yogyakarta tidak seluruhnya memenuhi

persyaratan.Variasi hasil tersebut tidak lepas dari beragamnya cara pembuatan es

batu yang dilakukan.

Rangkaian pengujian sampel es batu kemasan hasil produksi skala mikro

di Kecamatan Danurejan dari total 49 populasi menunjukkan hasil bahwa

sampel I, II, dan III berdasarkan metode MPN mengandung bakteri golongan

Coliform masing-masing sebanyak 4.300 bakteri/100ml, 9.300 bakteri/100ml,

dan 400 bakteri/100ml. Hasil uji konfirmasi bakteri Coliform fekal berdasarkan

metode MPN diperoleh hasil sampel I dan II positif mengandung cemaran

Coliform fekal sebanyak masing-masing 2.300 bakteri/100ml dan 4.300


69

bakteri/100ml. Sedangkan pada identifikasi E.coli diperoleh hasil sampel I dan

II positif mengandung cemaran E.coli. Sampel IV dan V tidak menunjukkan

adanya kandungan bakteri Coliform, Coliform fekal atau E.coli.

Hasil pengujian tersebut tersebut menunjukkan bahwa kualitas beberapa

es batu produksi skala mikro di Kecamatan Danurejan Yogyakarta tidak

memenuhi persyaratan baku mutu mikrobiologis es batu berdasarkan Standar

Nasional Indonesia 01-3839-1995 dan PerMenKes RI No.

416/MenKes/Per/IX/1990. Kesimpulan ini diperoleh karena tiga sampel es batu

mengandung total Coliform melebihi 0 bakteri/100ml dan Coliform fekal

melebihi 0 bakteri/100ml.

Tingginya cemaran bakteri Coliform, Coliform fekal, dan E.coli dapat

menyebabkan timbulnya beberapa penyakit di antaranya diare, infeksi saluran

pencernaan, infeksi saluran kemih, gastroenteritis, meningitis, peritonitis, dan

infeksi luka. Berbagai infeksi tersebut dapat merugikan konsumen yang

mengkonsumsi es batu dari daerah tersebut. Potensi resiko tersebut perlu dicegah

dengan melakukan edukasi yang dapat meningkatkan pengetahuan para produsen

dalam proses pembuatan es batu sehingga produk yang dihasilkan memenuhi baku

mutu kesehatan yang ditetapkan.

Bakteri Coliform memiliki habitat alami di lingkungan alam, kecuali

E.coli yang habitat alaminya berada di saluran pencernaan. Menurut World Health

Organization (2004), adanya kandungan bakteri Coliform dan E.coli pada sampel

es batu dapat disebabkan oleh dua hal, yaitu kondisi lingkungan yang

mempengaruhi kualitas sumber air yang digunakan untuk pembuatan es batu dan


70

higienitas proses pengolahan, pendistribusian, serta penyimpanan es batu terkait

dengan sumber daya manusianya.

Jumlah bakteri Coliform sumber air yang layak digunakan untuk produk

pangan adalah 0 bakteri/ml, maka seharusnya bahan air pada es batu juga harus

bebas dari bakteri Coliform. Sumber air yang sudah tidak sesuai dengan standar

kualitas mikrobiologis tersebut menyebabkan bahan air tersebut tidak layak

diproses menjadi es batu untuk kebutuhan pangan (World Health Organization,

2004). Proses pencemaran pada sumber air tersebut dapat terjadi akibat

lingkungan sekitar sumber air yang kurang sehat. Salah satu contohnya adalah

terlalu dekatnya tempat pembuangan feses/septic tank atau sumber pencemar lain

dengan lokasi sumber air. Bakteri Coliform dan E.coli dalam air dari septic tank

dapat meresap melalui pori-pori tanah menuju sumber air.

Proses pembuatan es batu juga menjadi faktor resiko tercemarnya bahan

pangan tersebut. Proses pembuatan es batu menurut World Health Organization

(2004) adalah terjaminnya kualitas sumber air yang akan digunakan, alat dan

sarana yang digunakan harus terjamin sterilitasnya (perawatan lemari es sesuai

dengan pedoman perawatan pabrik lemari es), selama proses pembuatan tidak

boleh ada kontak langsung tangan/bagian tubuh pembuat es batu dengan bahan

air, proses pendistribusian dan penyimpanannya selalu diawali dengan

membersihkan container es dengan bersih, dan jangan menyimpan barang selain

es batu di lemari es yang digunakan.

Berbagai prosedur pembuatan es batu yang higienis tersebut umumnya

kurang diperhatikan oleh produsen es batu terutama produsen skala mikro.


71

Langkah-langkah tersebut sering tidak dihiraukan dengan alasan membutuhkan

waktu yang lama dan proses yang rumit. Selain itu, pertimbangan untung rugi

menjadi faktor penentu produsen es batu melaksanakan prosedur standar

pembuatan es batu. Sumber bahan baku air yang sudah memenuhi standar mutu

mikrobiologis tidak menjamin bahwa es batu yang diproduksi benar-benar aman,

jika prosedur pembuatan es batu tidak dilaksanakan dengan tepat.

Edukasi kepada para produsen sangat diperlukan terkait dengan hasil

wawancara peneliti kepada produsen yang seluruhnya tidak mengetahui standar

pembuatan es batu yang sehat. Para produsen hanya mengetahui bahwa es batu

yang sehat dibuat dengan cara memasak bahan dasarnya saja, yaitu air. Menurut

DepKes RI (2004), perlu adanya pengawasan lain yang meliputi kualitas bahan

dasar air, kualitas higienitas pengolahan, pengemasan, pendistribusian, dan

penyimpanan untuk menjamin kualitas keamanan produk es batu.


72

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Jumlah bakteri total Coliform dan Coliform fekal pada es batu kemasan dari

lima usaha mikro es batu di Kecamatan Danurejan Yogyakarta pada sampel I

adalah 4.300 Coliform /100ml, sampel II adalah 9.300 Coliform /100ml,

sampel III adalah 400 Coliform /100ml, sampel IV dan sampel V adalah 0

Coliform /100ml. Jumlah bakteri Coliform fekal pada sampel I adalah 2.300

Coliform /100ml, sampel II adalah 4.300 Coliform /100ml, sampel III, sampel

IV, dan sampel V adalah 0 Coliform /100ml.

2. Berdasarkan persyaratan Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 dan

PerMenKes RI No. 416/Men.Kes/Per/IX/1990 tentang kualitas es batu, sampel

I, II, dan III tidak memenuhi persyaratan mikrobiologis karena jumlah total

Coliform dan Coliform fekal lebih dari 0 bakteri/100 ml.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut pada es batu kemasan di Kecamatan

Danurejan Yogyakarta, meliputi pengujian parameter kimia, fisika, dan

radioaktif untuk melengkapi data dari penelitian ini.

2. Perlu dilakukan suatu usaha edukasi dan pembinaan kepada produsen es batu

skala mikro di Kecamatan Danurejan tentang cara pembuatan, pengemasan,

pendistribusian, dan penyimpanan es batu sesuai dengan Standar Nasional

Indonesia demi menjamin kualitas produk dan kesehatan masyarakat.


73

DAFTAR PUSTAKA

Adams, G. K, dan Moss, T., 2008, Enteroaggregative Escherichia coli associated

with a food borne out break of gastroenteritis. Journal of Medical

Microbiology,57:1141-6.

American Public Health Association, 2005, Standard methods for the examination

of water and wastewater, 16th

ed, APHA Inc. Washington D.C

1268pp, 23-30

Atlas, M. R., 1997, Principles of Microbiology 2nd

ed, Wm. C. Brown Publisher,

lowa, 98-99, 152-157.

Arrannilewa, S.T., Salawu, S.O., Sorungbe, A.A., dan Olasalawu, B.B. 2005.

Effect of Frozen Period on the Chemical, Microbiological and

Sensory Quality of Frozen Tilapia Fish (Sarotherodun galiaenus). J.

of Biotechnology: Vol. 4(8):852-855

Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2008, Pengujian

Mikrobiologi Pangan, Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan

Makanan, Jakarta, ISSN 1829-9334, Vol. 9(2) : 5-9

Badan Standarisasi Nasional Indonesia, 1992, tentang Standar Definisi, Syarat

Mutu, Pengambilan Contoh, Cara Uji, Syarat Penandaan, dan Cara

Pengemasan Air, Jakarta, 3-6

Badan Standarisasi Nasional Indonesia, 1995, tentang Standar Definisi, Syarat

Mutu, Pengambilan Contoh, Cara Uji, Syarat Penandaan, dan Cara

Pengemasan Es Batu, Jakarta, 2-3

Bonang, G., dan Koeswardono, E.S., 1982, Mikrobiologi Kedokteran untuk

Laboratorium dan Klinik, Penerbit PT Gramedia, Jakarta, 9-12

Brooker, C., 2008, Ensiklopedia Keperawatan, Penerbit Buku Kedokteran EGC,

Jakarta, 214, 215, 219

Chandra, B., 2007, Pengantar Kesehatan Lingkungan, Penerbit Buku Kedokteran

EGC, Jakarta, 40-42,62

Cohen, G.N., 2011, Microbial Biochemistry 2nd

ed, Springer Dordrecht

Heidelberg London, New York, 83

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1992, Tentang Syarat-syarat dan

Pengawasan Kualitas Air, Jakarta, 9-17


74

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995, SNI 01-3839-1995 tentang

Standar Definisi, Syarat Mutu, Pengambilan Contoh, Cara Uji,

Syarat Penandaan, dan Cara Pengemasan Es Batu, Jakarta, 6-10

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000, Peran Pemerintah Daerah

dalam Pembangunan Kesehatan, Jakarta, 10

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2004, Peraturan Menteri Kesehatan

Nomor : 416/MEN.KES/PER/IX/1990, Tentang Syarat-syarat dan

Pengawasan Kualitas Air, Jakarta, 12

Dwiari, S.R., 2008, Teknologi Hasil Pangan, Departemen Pendidikan Indonesia,

Jakarta, 198

Effendi, H., 2007, Telaah Kualitas Air, Bagi Pengelolaan Sumber Daya dan

Lingkungan Perairan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, 14-15,20, 22-

23

Eliandra, W., 2008, Analisa Kandungan Bakteri Coliform pada 5 Sumber Air

yang Berada di Desa Jabung, Kecamatan Gantiwarno, Klaten,

Skripsi, 37-56, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Fardiaz, S., 1993, Analisis Mikrobiologi Pangan, PAU, Institut Pertanian Bogor,

Bandung, 557,559, 608

Finegold, S.M, dan E.J. Baron, 1996, Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology

7th

ed, CV Mostby, Saint Louis, 110-113

Gay, L.r., dan Diehl P.L., 1992, Research Methods for Business and Management,

Macmillan Coll Div, New York, 67-99

Hadioetomo, R.S., 1985, Mikrobiologi Dasar dan Praktek-teknik dan Prosedur

Dasar Dalam Laboratorium, 42-46, Gramedia, Jakarta

Hadyana A. P. dan Qodratillah, M.T., 2002, Kamus Kimia, Pusat Bahasa

Departemen Pendidikan Nasional, Balai Pustaka, Jakarta,119

Holt. J.G., Krieg.N.R., Sneath.P.H.A., Staley.J.T., dan Williams.S.T., 2000,

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th

ed, William and

Wilkins, Baltiore, Maryland, USA, 175-181, 209-210, 532-536, 544-

551

Institut Teknologi Bandung, 2011, Ada Coliform di Water Tab ITB?,

http://www.itb.ac.id/news/557.xhtml, diakses tanggal 6 September

2011.


http://www.itb.ac.id/news/557.xhtml

75

Lay, B.W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, Ed. I, PT Raja Grafindo

Persada, Jakarta, 15-22

Lennette, E. H., 1995, Manual of Clinical Microbiology, 4th

ed., American Society

for Microbiology, Washington, D. C., 223-230

Macfaddin, J.F., 1990, Biochemical Test for Identification of Medical Bacteria 2nd

ed, Williams and Wilkins, Baltimore, 203-209

Nugraheni, R., 2010, Pengujian Mikrobiologi Balai Besar Pengawasan Obat dan

Makanan Yogyakarta, Universitas Sebelas Maret, Surakarta, 44

Nuria, Cut. M, Rosyid A, dan Sumantri. 2009. Uji Kandungan Bakteri Esherichia

coli pada Air Minum Isi Ulang dari Depot Air Minum Isi Ulang di

Kabupaten Rembang. Mediagro Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian Vol. 5.

No. 2, 27-35

Prastiwi, A., 2006, Jenis Bakteri Laktosa Fermenter Cepat pada Es Batu Balok

yang Dijual di Jalan Wonodri Baru Semarang, Tesis, 47, Universitas

Muhammadiyah Semarang, Semarang, 34

Primasentra, A., 2010, Usaha Untuk Ibu Rumah Tangga, Modal 1 juta,Percetakan

Galang Press, Yogyakarta, 45-47

Purnawijayanti, A. H, 2001, Sanitasi, Higiene, dan Keselamatan Kerja Dalam

Pengolahan Makanan, Percetakan Kanisius, Yogyakarta, 51-59.

Slamet, J.S., 1994, Kesehatan Lingkungan, Gadjah Mada University Press,

Yogyakarta, 3-4

Todar,K, 1998. Analytical Method of Bacteriology at UW-Madison,

http://www.bact.wisc.edu/Bact330/lecturestaph, diakses tanggal 11

Januari 2012

Soemarmo, 2000, Analisis dan Pengujian Mikrobiologi, Akademi Analisis

Depertemen Kesehatan Indonesia, Yogyakrta, 45-67

Supardi dan Sukamto, 1999, Mikroorganisme Penyebab Penyakit Menular.

dalam : Mikrobiologi dalam Pengolahan dan Keamanan Pangan,

Edisi Pertama, Yayasan Adikarya IKAPI dengan The Ford

Foundation, 157-173

Suriawiria, U., 1995, Pengantar Mikrobiologi Umum, Penerbit Angkasa,

Bandung, 34-49


http://www.bact.wisc.edu/Bact330/lecturestaph

76

Underwood, J.C.E, 1999, Patologi Umum dan Sistematik, Edisi II, Penerbit Buku

Kedokteran EGC, Jakarta, 442-447

Universitas Gadjah Mada, 1993, Dasar-dasar Pemeriksaan Mikrobiologi,

Fakultas Kedokteran Bagian Mikrobiologi, Yogyakarta, 15-25, 27-

54,127-134

Widiyanti, N.L.P.M., dan Ristianti, N.P., 2004, Analisa Kualitatif Bakteri

Coliform pada Depo Air Isi Ulang di Kota Singaraja Bali, Penelitian

dan Pengembangan Departemen Kesehatan Indonesia, Jurnal

Ekologi Kesehatan Vol.3. No 1, 64-70

World Health Organization, 1996, Guidelines for Drinking-water Quality, Vol. 1.,

Geneva, 4-19

World Health Organization, 2004, Guidelines for Drinking-water Quality, 2nd

ed ,

vol. 2, Health Criteria and Other Supporting Information, Geneva,

229-230

Wijayanti, S., 2009, Identifikasi dan Pemeriksaan Jumlah Total Bakteri Susu Sapi

Segar dari Koperasi Unit Desa di Kabupaten Boyolali, Tesis, 21-

22, Universitas Muhammadiyah Semarang


LAMPIRAN


77

Lampiran 1. Tabel Most Probable Number (MPN) Deret 3 Tabung (Badan Standar

Nasional Indonesia No.01-3839-1995)


78

Lampiran 2. Baku Mutu Es Batu Berdasarkan Standar Nasional Indonesia 01-3839-

1995


79


80


81

Lampiran 3. Hasil Uji Konfirmasi Coliform dengan media Brilliant Green Lactose

Bile Broth 2% es batu sampel II dan III inkubasi 48 jam pada suhu 36o±1

oC

Sampel II

Keterangan gambar :

Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pembentukan gas pada tabung Durham

A : konsentrasi sampel II es batu 10-1

B : konsentrasi sampel II es batu 10-2

C : konsentrasi sampel II es batu 10-3

Sampel III

Hasil uji konfirmasi bakteri coliform sampel III dengan media BGLB

Keterangan gambar :

Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pembentukan gas pada tabung Durham

A : konsentrasi sampel III es batu 10-1

B : konsentrasi sampel III es batu 10-2

C : konsentrasi sampel III es batu 10-3


82

Lampiran 4. Hasil Uji Most Probable Number dan Identifikasi Eschericia coli pada

Sampel Es Batu kemasan di Kecamatan Danurejan Yogyakarta


83

Lampiran 5. Surat ijin melakukan penelitian di Balai Laboratorium Kesehatan

Yogyakarta


84

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Analisa Bakteri

Coliform dalam Produk Es batu Kemasan dari 5 Usaha

Mikro dengan Metode Most Probable Number (MPN) di

Kecamatan Danurejan, Yogyakarta” memiliki nama

lengkap Adityawarman. Penulis dilahirkan di Yogyakarta, 8

Juni 1990 atas karunia Tuhan Yang Maha Esa sebagai putra pertama dari dua

bersaudara dari pasangan Bambang Santoso dan Sri Sukarsih. Pendidikan formal

yang telah ditempuh penulis yaitu di Taman kanak-kanak Kanisius Karitas pada

tahun 1994-1996, dilanjutkan sekolah tingkat dasar di SD Kanisius Karitas pada

tahun 1996-2002, pendidikan tingkat menengah pertama di SMP Negeri II Mlati

tahun 2002-2005, pendidikan tingkat menengah di SMA Negeri I Sleman tahun

2005-2008. Penulis kemudian melanjutkan pendidikan tingkat perguruan tinggi di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dari tahun 2008-2012. Selama masa

pendidikan penulis pernah menjadi pelajar teladan tingkat SMP tahun 2004 dan

peraih medali emas Pekan Ilmiah Nasional tahun 2011 dan aktif dalam kegiatan

masyarakat, keagamaan, dan kepanitiaan baik disekolah maupun kampus.


analisis bakteri coliform dalam produk es batu … · melati k, primaboti n, eureka gracia l, wiria...

Documents