tutor hema
Post on 30-Jul-2015
268 Views
Preview:
TRANSCRIPT
PEMERIKSAAN STATUS BESI TUBUH
PENDAHULUAN
Besi mempunyai banyak fungsi penting dalam tubuh, terutama perannya dalam hemoglobin
sebagai alat transport oksigen. Kandungan besi dalam tubuh orang normal berkisar antara 3-5
gram atau pada pria sekitar 50 mg/kg BB dan pada wanita sekitar 35 mg/kg BB. Dalam tubuh
besi terdapat dalam dua bentuk, yaitu ferro (Fe 2+) dan ferri (Fe3+). Pada suasana netral atau
alkali besi berbentuk Fe3+ dan dalam suasana asam besi berbentuk Fe2+. Dalam tubuh besi
tidak pernah dalam bentuk bebas (free iron), tetapi selalu berikatan dengan protein tertentu.
Besi bebas akan merusak jaringan karena memiliki sifat sebagai radikal bebas. Metabolisme
besi dimulai sejak dari penyediaan besi dalam diet, absorpsi, transportasi serta distribusinya
dalam tubuh.
ABSORBSI BESI
Absorbsi besi tergantung dari jumlah besi dalam diet dan kebutuhan tubuh. Pada makanan
sehari-hari umumnya mengandung kira-kira 15 mg besi dan hanya sekitar 1 mg besi (5-10%)
akan ditransfer masuk dalam darah. Besi diserap di duodenum proximal, dan sebagian kecil
di jejunum. Umumnya besi dalam makanan terdapat dalam bentuk non heme (dalam bentuk
Fe3+). Ferri ini harus diubah menjadi bentuk ferro supaya bisa diabsorbsi dalam usus. Besi
dalam bentuk ferri (Fe3+) direduksi menjadi bentuk ferro (Fe2+). Kemudian besi Fe2+ diangkut
kedalam enterosit. Besi dalam enterosit, kemudian sebagian disimpan dalam bentuk feritin
dan sisanya dibawa menembus membran basolateral. Didalam plasma, bentuk Fe2+ diubah
menjadi Fe3+ yang kemudian berikatan dengan transferin yang merupakan protein pengangkut
besi dalam plasma darah. Cairan lambung meningkatkan absorbsi besi, sedangkan cairan
pankreas menurunkan absorbsi besi. Beberapa bahan dapat mempengaruhi absorbsi besi.
Vitamin C dan daging dapat meningkatkan absorbsi besi, sedangkan phytate dan tannin
menghambat absorbsi besi.
SIKLUS BESI
Sebanyak 75% dari kompleks transferrin-besi diangkut ke prekursor eritrosit di sumsum
tulang yang memiliki banyak reseptor untuk transferin. Sebanyak 80–90% molekul besi yang
masuk ke dalam prekursor eritrosit akan dibebaskan, sedangkan transferin akan kembali ke
dalam sirkulasi. Besi yang telah dibebaskan akan masuk ke dalam mitokondria untuk
1
diproses bergabung dengan protoporfirin menjadi heme, sisanya tersimpan dalam bentuk
feritin. Eritrosit yang matang akan masuk ke sirkulasi darah dan sesudah 120 hari eritrosit
ditelan oleh makrofag dalam RES. Metabolisme besi terutama bersumber dari hemoglobin
eritrosit tua yang dihancurkan oleh makrofag sistem RES. Pada RES besi dikeluarkan dari
hemoglobin dan kembali ke plasma, kemudian diikat oleh transferrin. Kecepatan pelepasan
besi ke dalam sirkulasi oleh makrofag lebih cepat terjadi pada pagi hari, sehingga kadar besi
plasma menunjukkan variasi diurnal.
Pada keadaan normal tubuh akan kehilangan 1 mg besi perhari dan akan digantikan melalui
absorpsi. Besi dari sumber makanan yang diserap duodenum berkisar 1–2 mg, sebanyak itu
pula yang dapat hilang karena deskuamasi kulit, keringat, urin dan tinja.
PENGUKURAN KANDUNGAN BESI PADA TUBUH
Pemeriksaan kadar besi dalam serum meliputi pemeriksaan serum iron (SI), Total Iron
Binding Capacity (TIBC), saturasi transferrin, ferritin serum, transferrin serum dan
hemosiderin dari hapusan sumsum tulang.
Persiapan untuk tes SI dan TIBC :
1. Sampel tes
Pasien disarankan untuk menghentikan obat oral yang mengandung besi
minimal 12 jam sebelum pengambilan sampel
Sampel yang bisa dipakai dalam pengambilan sampel adalah serum atau
plasma heparin. EDTA, oksalat dan sitrat bisa mengganggu uji ini.
2. Peralatan Glassware
Untuk menghindari kontaminasi dengan besi, sebaiknya digunakan tabung plastik
disposable , ukuran 12x75 mm. Jika menggunakan glassware, maka harus dicuci
dengan detergent, kemudian rendam dalam HCl 2 mol/L selama 6-12 jam, selanjutnya
bilas dengan iron-free water.
2
3. Iron-free water.
Biasanya memakai deionized water. Dikatakan bebas besi dimana air harus
mengandung minimal 0,2 µmol besi/liter.
SERUM IRON
I. Pemeriksaan Serum Iron yang direkomendasikan ICSH (International Council for
Standardization in Haematology)
Prinsip :
Besi dilepaskan dari ikatannya dengan transferrin, direduksi dari bentuk Fe3+ menjadi
Fe2+ dan serum protein dipresipitasi dengan menggunakan reagen asam campuran
(mixed acid reagent). Besi ferro dalam supernatan direaksikan dengan larutan
kromogen akan membentuk komplek warna (pink solution) dan dibaca dengan
fotometer pada panjang gelombang 562 nm.
Reagen :
1. Protein precipitant
100 g/L trichloracetic acid (0,61 M) dan 30 ml/L thioglycollic acid dalam 1
mol/L HCl.
Larutan ini stabil selama 2 bulan dalam gelap. Karena pertimbangan masalah
kesehatan dan keamanan pada penggunaan thioglycollic acid, maka ascorbic
acid digunakan sebagai alternatif agen reduktor, meskipun mungkin lebih
dipengaruhi oleh adanya copper.
Dalam 45 ml HCl 1 mol/L ditambahkan 5 ml larutan trichloracetic acid 6,1
mol/L, kemudian ditambahkan lagi dengan 200 mg ascorbic acid kemudian
dicampur.
2. Larutan kromogen
25 mg ferrozine dilarutkan dalam 100 ml sodium acetate 1,5 mol/L
Larutan ini dapat stabil hingga 4 minggu bila disimpan dalam gelap.
3. Larutan standar besi (80 μmol/l)
a. Tambahkan 200 μL HCl 2 mol/L dalam 22,1 ml deionized water, dan
campur.
b. Tambahkan 100 μL larutan standar besi (1000 μg Fe/mL dalam 1 % HCl)
dan campur.
c. Stabil hingga 2 bulan pada suhu ruangan
3
Cara kerja :
1. Masukkan ke dalam tabung, masing-masing 0,5 ml serum, 0,5 ml larutan kerja
standar besi, dan 0,5 ml iron-free water sebagai blanko.
2. Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 0,5 ml protein precipitant,
kemudian campur, selanjutnya diamkan selama 5 menit
3. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada 13.000 rpm
selama 4 menit. untuk mengendapkan protein dan mendapatkan supernatan.
Ambil 0,5 ml supernatan dan 0,5 ml campuran pada tabung lainnya. Kemudian
pada masing-masing tabung ditambahkan 0,5 ml larutan kromogen dan
campur dengan baik.
4. Tunggu selama 10 menit
5. Ukur absorbans pada panjang gelombang 562 nm.
6. Penghitungan :
Serum iron = Atest-Ablanko x 80
Astandar-A blanko
Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen dan serum dalam tabung
3 ml dan sentrifus pada 1500 g selama 15 menit
Terbentuknya komplek warna akan terlambat, bila menggunakan plasma EDTA, dan
harus ditunggu selama 15 menit sebelum diukur absorbansnya.
Nilai rujukan SI : 10-30 μmol/L
II. Pemeriksaan Serum Iron di Laboratorium Patologi Klinik RSU Dr. Soetomo
Metode yang digunakan : Colorimetric-Ferrozine
Prinsip :
Ikatan antara ferri (Fe3+) dan transferin dilepaskan oleh guanidine dalam suasana pH
4,8. Selanjutnya asam askorbat akan mereduksi ion ferri (Fe3+) menjadi ferro (Fe2+),
kemudian Fe2+ akan bereaksi dengan ferrozine membentuk komplek berwarna.
Reagen :
Reagen 1 : R1
o Acetate buffer, pH 4,8 100 mmol/L
o Guanidine hydrochloride 5 mol/L
o Thiourea 52,5 mmol/L
Reagen 2 : R2
o Ascorbic acid
4
Reagen 3 : R3
o Ferrozine 41 mmol/L
Standar : Std
o Iron 100 μg/dL
1 mg/L
17,9 μmol/L
Sampel : serum atau plasma heparin
Cara kerja :
1. Larutan kerja (Working reagent) : Larutkan 1 sendok takar R2 dalam 50 ml R1.
Tunggu hingga tercampur dengan baik. Larutan ini stabil selama 2 minggu pada suhu
2-8o C, dan 3 hari pada suhu 20-25o C.
2. Kemudian lakukan sesuai tabel dibawah ini :
Blanko Standar Sampel
Larutan kerja 500 μL 500 μL 500 μL
Akuades 150 μL - -
Standar - 150 μL -
Sampel - - 150 μL
3. Campurkan dan baca absorbans (A) pada panjang gelombang 560 nm setelah 50 detik
Blanko Standar Sampel
- A1 A2
4. Kemudian tambahkan :
Blanko Standar Sampel
Reagen 3 (R3) 25 μL 25 μL 25 μL
5. Campurkan dan baca absorbance (A) pada panjang gelombang 560 nm setelah 325
detik
Blanko Standar Sampel
- A3 A4
6. Penghitungan :
A4-A2
A3-A1
5
X konsentrasi standar
Nilai rujukan :
a. Bayi baru lahir : 1 - 2,5 mg/L (17,9 – 44,8 μmol/L)
b. Bayi : 0,4 – 1 mg/L (7,2 – 17,9 μmol/L)
c. Anak-anak : 0,5 – 1,2 mg/L (9,0 – 21,5 μmol/L)
d. Wanita dewasa : 0,5 – 1,7 mg/L (9,0 – 30,4 μmol/L)
e. Laki-laki dewasa : 0,65 – 1,75 mg/L (11,6 – 31,3 μmol/L)
Metode ini linier sampai dengan konsentrasi 500 μg/L (5 mg/L atau 89,5 μmol/L)
TOTAL IRON BINDING CAPACITY (TIBC)
I. Pemeriksaan TIBC yang direkomendasikan ICSH
Dalam plasma, besi terikat pada tranferin, dan TIBC adalah mengukur protein
tersebut.
TIBC = serum iron + UIBC (Unsaturated Iron Binding Capacity)
Nilai rujukan : 47- 70 μmol/L
Prinsip :
Pada serum ditambahkan besi yang berlebih (ferri klorid). Besi yang tidak
terikat transferin akan diabsorbsi oleh magnesium carbonate, kemudian kadar
besi serum diukur.
Reagen :
1. Basic magnesium carbonate
2. Saturating solution (100 μmol Fe/L).
Tambahkan 17,7 ml deionized water, 100 μL HCl 1 mol/L, 100 μL
larutan standar. (Saturating iron solution mengandung 5,6 μg Fe/mL)
Campur
Stabil dalam 2 bulan pada suhu ruangan.
Cara kerja :
1. Masukkan 0,5 ml serum ke dalam tabung
2. Kemudian tambahkan 0,5 ml saturating iron solution, campur dengan hati-
hati, dan diamkan selama 15 menit pada suhu ruangan.
3. Tambahkan 100 mg light magnesium carbonate, tutup tabung dan bolak-balik
tabung, diamkan selama 30 menit dengan sekali-kali diaduk.
4. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada 13.000 rpm
selama 4 menit. untuk mengendapkan protein dan mendapatkan supernatan.
6
5. Periksa supernatan, jika masih sisa magnesium carbonate harus disentrifus
ulang.
6. Ambil supernatannya sebanyak 0,5 ml dan perlakukan seperti pada
pemeriksaan serum iron.
7. Hasil akhir dikalikan 2
Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen dan serum dalam tabung
3 ml dan sentrifus pada 1500 g selama 15 menit
II. Pemeriksaan TIBC di Laboratorium Patologi Klinik RSU Dr. Soetomo
Metode yang digunakan : saturasi
Prinsip :
TIBC dievaluasi setelah saturasi transferin oleh larutan besi, dan kelebihan besi akan
diabsorbsi oleh magnesium hydroxide carbonate. Setelah disentrifus, konsentrasi besi
dalam supernatan diukur.
Reagen :
Reagen 1 : R1
o Iron saturating solution 500 μg/dL
5 mg/L
89,5 μmol/L
Reagen 2 : R2
o Magnesium hydroxide carbonate (1 sendok takar = 100 mg)
Sampel : Serum, plasma heparin
Cara kerja :
1. Sampel 0,5 ml dicampurkan dengan 1 ml reagen R1, diinkubasi selama 5 menit
2. Kemudian tambahkan 1 sendok takar ( kira-kira 100 mg) reagen R2, dan
diinkubasi selama 20 menit, dengan sekali-kali dikocok.
3. Sentrifus selama 10 menit dengan 3000 rpm
4. Ambil supernatannya.
5. Periksa supernatan seperti pada penentuan SI.
Dengan 1 bagian supernatan : 3 bagian reagen R1 (pada SI).
Nilai rujukan :
Laki-laki dewasa : 2,6 – 3,9 mg/L ( 46,5 – 69,8 μmol/L)
Wanita dewasa : 2,1 – 3,4 mg/L (37,6 – 60,9 μmol/L)
7
SATURASI TRANSFERIN
Saturasi transferin ditentukan dengan rumus sebagai berikut :
SI (μg/dL)
TIBC (μg/dL)
Harga normal : 20 - 45%
FERITIN SERUM
Metode ELISA Double Sandwich
Prinsip : pemeriksaan feritin serum memakai metode ELISA dengan cara double sandwich.
Antibodi dengan high affinity terhadap feritin (antiferitin Ig G) akan berikatan dengan feritin
serum dan selanjutnya dilabel dengan enzim horseradish peroxidase dan dibaca absorbannya
pada panjang gelombang 492 nm.
Reagen :
1. Preparat antiferitin Ig G yang dikonjugasi dengan horseradish peroxidase
2. Larutan standar feritin.
Dibuat dengan cara :
Encerkan human ferritin 200 µg/ml ke dalam air. Encerkan larutan feritin 200
µg/ml ke dalam 10 µl/ml dalam 0,05 mol/l larutan sodium barbitone (yang terdiri
dari 0,1 mol/l NaCl, 0,02% NaN dan BSA 5 gr/dl), pH disesuaikan sampai pH 8
dengan menambah HCl 5 mol/l.
Bagi dalam 200 tabung kecil, masing-masing berisi 200 µl, tutup rapat dan tahan
sampai 1 tahun pada suhu 40C
Jika akan dipakai, encerkan dengan buffer B sampai 1000 µg/l dan siapkan larutan
dalam range 0,2 – 25 µg/l (bandingkan dengan standar WHO untuk uji serum
ferritin 94/572)
3. Buffer A : Phosphate-buffered saline pH 7,2
4. Buffer B : 5 gram BSA (Bovine Serum Albumin) dalam 1 liter buffer A
5. Buffer C : Carbonate buffer pH 9,6
6. Buffer D : Citrate phosphate buffer pH 5.
7. Larutan substrat
8
x 100 %
Cara kerja :
1. Lapisi microtitre plate, dengan cara :
Preparat antiferitin Ig G diencerkan dengan 2 µg/ml buffer C, tambahkan 200 µl
ke dalam tiap-tiap sumuran.
Tutup dan inkubasi semalam pada suhu 40C. Kosongkan sumuran dengan cara
dibalik dan di-tapping pada handuk kering.
Tambahkan 200 µl 0,05% BSA dalam buffer C, diamkan 30 menit dalam suhu
ruangan.
Cuci tiap sumuran dengan buffer A sampai 3x. plate dapat disimpan sampai 1
minggu pada tempat kering dan suhu 40C
2. Encerkan 50 µl serum pasien dengan 1 ml buffer B.
3. Tambahkan 200 µl larutan standard dan serum pasien ke dalam tiap sumuran dalam
waktu 20 menit.
4. Tutup dan diamkan selama 20 menit pada suhu kamar dan jauhkan dari sinar matahari
5. Kosongkan sumuran dan cuci 3x dengan buffer A.
6. Tambahkan 200 µl preparat konjugasi antiferitin Ig G dengan horseradish peroxidase
yang sudah diencerkan, tutup dan diamkan selama 2 jam pada suhu kamar.
7. Cuci 3x dengan buffer A
8. Tambahkan 200 µl larutan substrat pada tiap-tiap sumuran, inkubasi selama 30 menit.
9. Tambahkan 50 µl asam sulfur 4M pada tiap-tiap sumuran untuk menghentikan reaksi
10. Tunggu 30 menit dan baca absorbannya pada 492 nm dengan microtitre plate reader,
atau ambil 200 µl larutan dari tiap sumuran dan masukkan dalam 800 µl air, baca
dengan fotometer.
Metode IRMA (Immunoradiometric Assay)
Prinsip : Antibodi yang dilabel dengan radioaktif yang berlebih direaksikan dengan ferritin.
Ferritin yang tidak berikatan dengan antibodi akan dihilangkan dengan immunoadsorbent.
Nilai rujukan : 35 – 300 µg/l (pria dewasa)
20 – 100 µg/l (wanita dewasa)
Perlu pertimbangan yang hati-hati untuk menentukan kadar serum ferritin yang tinggi,
primer disebabkan karena kenaikan besi atau karena kerusakan jaringan. Ferritin merupakan
suatu protein fase akut dimana ferritin akan dilepaskan oleh hati ke sirkulasi pada keadaan
penyakit hepatoseluler, tumor/keganasan hati, alkoholisme dan pemakaian kontrasepsi oral.
9
HEMOSIDERIN
Penilaian besi secara langsung dari dua depot besi yaitu sumsum tulang dan hati, lebih
disukai dari sumsum tulang. Penilaianhemosiderin dapat memakai metode Prussian Blue
(tampak berwarna biru) atau membuat hapusan tebal tanpa pengecatan (tampak berwarna
keemasan).
Prinsip : reagen Prussian blue akan mewarnai besi menjadi berwarna biru terang atau hijau,
sedangkan inti dan eritrosit tercat warna merah atau merah muda oleh neutral red.
Bahan dan alat :
1. Gelas obyek dan bahan sampel, dibuat hapusan darah
2. Metanol untuk fiksasi
3. Larutan potassium ferrocyanide 10 g/l dalam 0,1 mol/l HCl
4. Larutan neutral red atau eosin
5. Larutan HCl 3 mol/l
Cara kerja :
1. Hapusan darah difiksasi dengan metanol, tunggu 10 – 20 menit
2. Masukkan hapusan dalam larutan potassium ferrocyanide selama 10 menit pada suhu
200C.
3. Cuci dengan air kran selama kira-kira 20 menit, kemudian bilas dengan distilled
water.
4. Cat dengan neutral red atau eosin selama 10-15 detik
5. Tuangi dengan HCl 3 mol/l dan cuci dengan air kran.
10
Nilai rujukan :
Kriteria gradasi pengecatan besi (Prussian blue) pada aspirasi sumsum tulang
GRADASI KRITERIA KANDUNGAN BESI
0 Tak tampak granula besi 43 ± 23
1 Granula-granula kecil pada sel retikulum tampak
hanya dengan minyak emersi
130 ± 50±
2 Sedikit granula-granula kecil yang dapat dilihat
dengan lensa kekuatan lemah
223 ± 75
3 Sejumlah granula-granula kecil dalam semua partikel
sumsum tulang
406 ± 131
4 Granula-granula besar dalam kelompok kecil 762 ± 247
5 Granula-granula besar dalam kelompok besar 1618 ± 464
6 Deposit yang sangat besar yang mengaburkan
gambaran sumsum tulang secara rinci
3681 ± 1400
INTERPRETASI HASIL
Konsentrasi serum iron pada kedaan normal memperlihatkan fluktuasi yang lebar dari
hari ke hari dan variasi diurnal. Kadar tertinggi pada pagi hari dan terendah pada malam hari.
Namun pada keadaan patologis, baik pada defisiensi besi ataupun kelebihan besi, fluktuasi
ini cenderung menghilang. Serum iron (SI) dan terutama saturasi transferin, mencerminkan
suplai besi ke jaringan pada saat sampling, dan tidak memberikan banyak informasi tentang
status besi tubuh. Misalnya pada perjalanan yang progresif defisiensi besi, kadar serum iron
tidak terpengaruh hingga pada tahap cadangan besi tubuh habis. Sebaliknya, peningkatan
cadangan besi tubuh pada anemia penyakit kronik, biasanya disertai dengan penurunan kadar
serum iron.
11
Tabel. Interpretasi SI dan TIBC
Measurement Increased DecreasedSerum Iron (SI) Iron overload Iron deficiency
Liver disease Infection/inflamationChronic alcoholism Anaemia of chronic disorderHypoplastic anaemiaHaemolysis/ineffective
erythropoiesisSerum TIBC Iron deficiency Iron overloadPregnancy Infection/inflamationOral contraceptive Anaemia of chronic disorder
Berbeda dengan anemia defisiensi besi, pada anemia karena penyakit sistemik
ditemukan penurunan serum iron dan serum TIBC, disertai persen saturasi transferin sangat
menurun dibanding pada anemia defisiensi besi. Peningkatan kadar serum iron dan persen
saturasi transferin sebagian besar disebabkan penyakit hati atau kegagalan sumsum tulang
menggunakan besi secara efektif. Meskipun demikian, peningkatan persisten dari persen
saturasi TIBC kemungkinan merupakan indikasi awal dari peningkatan risiko uptake besi
oleh jaringan dan perkembangan dari kelebihan besi.
Pada anemia defisiensi besi, SI menurun, TIBC/ transferrin meningkat, saturasi transferrin
menurun dan ferritin menurun. Pada anemia karena penyakit kronis, SI menurun, TIBC
normal atau menurun, saturasi transferin bisa normalatau menurun dan ferritin normal atau
meningkat. Pada keadaan kelebihan besi, SI dan TIBC meningkat, saturasi transferrin
meningkat dan ferritin meningkat. Sedangkan untuk pemeriksaan hemosiderin dengan
pengecatan Prussian blue jarang dilakukan karena bersifat invasif.
Nilai SI normal mempunyai fluktuasi yang lebar dan memperlihatkan variasi diurnal serta
tidak terpengaruh sampai cadangan besi habis. Penurunan SI terjadi pada anemia defisiensi
besi, penyakit kronis dan selama respon fase akut. Sedangkan TIBC meningkat pada anemia
defisiensi besi dan kehamilan dan menurun pada infeksi dan keganasan.
12
DAFTAR PUSTAKA
Bakta IM, Hematologi Klinik Ringkas. EGC. Edisi 1. 2007; 3:26-44
Chanarin, Laboratory Haematology An Account of Laboratory Techniques. Churchill Livingstone. 1989; 4:83-86
Greer John P et al, Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott Williams & Wilkins. 11th edition. 2004 ; 28: 980-987
Joseph J. Mazza, Manual of Clinical Hematology. Lippincott Williams & Wilkins. Third edition. 2002;2: 17-21
Lewis Bain Bates, Dacie and Lewis Pratical Haematology. Churchill Livingstone Elsevier. 2006 ; 7:131-153
Lea and Febiger, Wintrobe Clinical Hematology. 8th edition. 1981 ; 152-160, 605-41, 646-52, 654-9, 667-74.
Rolf H. Iron Metabolism, Iron Deficiency and anaemia. J Sysmex Int. 2003;13:65-74
13
top related