PEMERIKSAAN STATUS BESI TUBUH

PENDAHULUAN

Besi mempunyai banyak fungsi penting dalam tubuh, terutama perannya dalam hemoglobin

sebagai alat transport oksigen. Kandungan besi dalam tubuh orang normal berkisar antara 3-5

gram atau pada pria sekitar 50 mg/kg BB dan pada wanita sekitar 35 mg/kg BB. Dalam tubuh

besi terdapat dalam dua bentuk, yaitu ferro (Fe 2+) dan ferri (Fe3+). Pada suasana netral atau

alkali besi berbentuk Fe3+ dan dalam suasana asam besi berbentuk Fe2+. Dalam tubuh besi

tidak pernah dalam bentuk bebas (free iron), tetapi selalu berikatan dengan protein tertentu.

Besi bebas akan merusak jaringan karena memiliki sifat sebagai radikal bebas. Metabolisme

besi dimulai sejak dari penyediaan besi dalam diet, absorpsi, transportasi serta distribusinya

dalam tubuh.

ABSORBSI BESI

Absorbsi besi tergantung dari jumlah besi dalam diet dan kebutuhan tubuh. Pada makanan

sehari-hari umumnya mengandung kira-kira 15 mg besi dan hanya sekitar 1 mg besi (5-10%)

akan ditransfer masuk dalam darah. Besi diserap di duodenum proximal, dan sebagian kecil

di jejunum. Umumnya besi dalam makanan terdapat dalam bentuk non heme (dalam bentuk

Fe3+). Ferri ini harus diubah menjadi bentuk ferro supaya bisa diabsorbsi dalam usus. Besi

dalam bentuk ferri (Fe3+) direduksi menjadi bentuk ferro (Fe2+). Kemudian besi Fe2+ diangkut

kedalam enterosit. Besi dalam enterosit, kemudian sebagian disimpan dalam bentuk feritin

dan sisanya dibawa menembus membran basolateral. Didalam plasma, bentuk Fe2+ diubah

menjadi Fe3+ yang kemudian berikatan dengan transferin yang merupakan protein pengangkut

besi dalam plasma darah. Cairan lambung meningkatkan absorbsi besi, sedangkan cairan

pankreas menurunkan absorbsi besi. Beberapa bahan dapat mempengaruhi absorbsi besi.

Vitamin C dan daging dapat meningkatkan absorbsi besi, sedangkan phytate dan tannin

menghambat absorbsi besi.

SIKLUS BESI

Sebanyak 75% dari kompleks transferrin-besi diangkut ke prekursor eritrosit di sumsum

tulang yang memiliki banyak reseptor untuk transferin. Sebanyak 80–90% molekul besi yang

masuk ke dalam prekursor eritrosit akan dibebaskan, sedangkan transferin akan kembali ke

dalam sirkulasi. Besi yang telah dibebaskan akan masuk ke dalam mitokondria untuk

1

diproses bergabung dengan protoporfirin menjadi heme, sisanya tersimpan dalam bentuk

feritin. Eritrosit yang matang akan masuk ke sirkulasi darah dan sesudah 120 hari eritrosit

ditelan oleh makrofag dalam RES. Metabolisme besi terutama bersumber dari hemoglobin

eritrosit tua yang dihancurkan oleh makrofag sistem RES. Pada RES besi dikeluarkan dari

hemoglobin dan kembali ke plasma, kemudian diikat oleh transferrin. Kecepatan pelepasan

besi ke dalam sirkulasi oleh makrofag lebih cepat terjadi pada pagi hari, sehingga kadar besi

plasma menunjukkan variasi diurnal.

Pada keadaan normal tubuh akan kehilangan 1 mg besi perhari dan akan digantikan melalui

absorpsi. Besi dari sumber makanan yang diserap duodenum berkisar 1–2 mg, sebanyak itu

pula yang dapat hilang karena deskuamasi kulit, keringat, urin dan tinja.

PENGUKURAN KANDUNGAN BESI PADA TUBUH

Pemeriksaan kadar besi dalam serum meliputi pemeriksaan serum iron (SI), Total Iron

Binding Capacity (TIBC), saturasi transferrin, ferritin serum, transferrin serum dan

hemosiderin dari hapusan sumsum tulang.

Persiapan untuk tes SI dan TIBC :

1. Sampel tes

Pasien disarankan untuk menghentikan obat oral yang mengandung besi

minimal 12 jam sebelum pengambilan sampel

Sampel yang bisa dipakai dalam pengambilan sampel adalah serum atau

plasma heparin. EDTA, oksalat dan sitrat bisa mengganggu uji ini.

2. Peralatan Glassware

Untuk menghindari kontaminasi dengan besi, sebaiknya digunakan tabung plastik

disposable , ukuran 12x75 mm. Jika menggunakan glassware, maka harus dicuci

dengan detergent, kemudian rendam dalam HCl 2 mol/L selama 6-12 jam, selanjutnya

bilas dengan iron-free water.

2

3. Iron-free water.

Biasanya memakai deionized water. Dikatakan bebas besi dimana air harus

mengandung minimal 0,2 µmol besi/liter.

SERUM IRON

I. Pemeriksaan Serum Iron yang direkomendasikan ICSH (International Council for

Standardization in Haematology)

Prinsip :

Besi dilepaskan dari ikatannya dengan transferrin, direduksi dari bentuk Fe3+ menjadi

Fe2+ dan serum protein dipresipitasi dengan menggunakan reagen asam campuran

(mixed acid reagent). Besi ferro dalam supernatan direaksikan dengan larutan

kromogen akan membentuk komplek warna (pink solution) dan dibaca dengan

fotometer pada panjang gelombang 562 nm.

Reagen :

1. Protein precipitant

100 g/L trichloracetic acid (0,61 M) dan 30 ml/L thioglycollic acid dalam 1

mol/L HCl.

Larutan ini stabil selama 2 bulan dalam gelap. Karena pertimbangan masalah

kesehatan dan keamanan pada penggunaan thioglycollic acid, maka ascorbic

acid digunakan sebagai alternatif agen reduktor, meskipun mungkin lebih

dipengaruhi oleh adanya copper.

Dalam 45 ml HCl 1 mol/L ditambahkan 5 ml larutan trichloracetic acid 6,1

mol/L, kemudian ditambahkan lagi dengan 200 mg ascorbic acid kemudian

dicampur.

2. Larutan kromogen

25 mg ferrozine dilarutkan dalam 100 ml sodium acetate 1,5 mol/L

Larutan ini dapat stabil hingga 4 minggu bila disimpan dalam gelap.

3. Larutan standar besi (80 μmol/l)

a. Tambahkan 200 μL HCl 2 mol/L dalam 22,1 ml deionized water, dan

campur.

b. Tambahkan 100 μL larutan standar besi (1000 μg Fe/mL dalam 1 % HCl)

dan campur.

c. Stabil hingga 2 bulan pada suhu ruangan

3

Cara kerja :

1. Masukkan ke dalam tabung, masing-masing 0,5 ml serum, 0,5 ml larutan kerja

standar besi, dan 0,5 ml iron-free water sebagai blanko.

2. Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 0,5 ml protein precipitant,

kemudian campur, selanjutnya diamkan selama 5 menit

3. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada 13.000 rpm

selama 4 menit. untuk mengendapkan protein dan mendapatkan supernatan.

Ambil 0,5 ml supernatan dan 0,5 ml campuran pada tabung lainnya. Kemudian

pada masing-masing tabung ditambahkan 0,5 ml larutan kromogen dan

campur dengan baik.

4. Tunggu selama 10 menit

5. Ukur absorbans pada panjang gelombang 562 nm.

6. Penghitungan :

Serum iron = Atest-Ablanko x 80

Astandar-A blanko

Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen dan serum dalam tabung

3 ml dan sentrifus pada 1500 g selama 15 menit

Terbentuknya komplek warna akan terlambat, bila menggunakan plasma EDTA, dan

harus ditunggu selama 15 menit sebelum diukur absorbansnya.

Nilai rujukan SI : 10-30 μmol/L

II. Pemeriksaan Serum Iron di Laboratorium Patologi Klinik RSU Dr. Soetomo

Metode yang digunakan : Colorimetric-Ferrozine

Prinsip :

Ikatan antara ferri (Fe3+) dan transferin dilepaskan oleh guanidine dalam suasana pH

4,8. Selanjutnya asam askorbat akan mereduksi ion ferri (Fe3+) menjadi ferro (Fe2+),

kemudian Fe2+ akan bereaksi dengan ferrozine membentuk komplek berwarna.

Reagen :

Reagen 1 : R1

o Acetate buffer, pH 4,8 100 mmol/L

o Guanidine hydrochloride 5 mol/L

o Thiourea 52,5 mmol/L

Reagen 2 : R2

o Ascorbic acid

4

Reagen 3 : R3

o Ferrozine 41 mmol/L

Standar : Std

o Iron 100 μg/dL

1 mg/L

17,9 μmol/L

Sampel : serum atau plasma heparin

Cara kerja :

1. Larutan kerja (Working reagent) : Larutkan 1 sendok takar R2 dalam 50 ml R1.

Tunggu hingga tercampur dengan baik. Larutan ini stabil selama 2 minggu pada suhu

2-8o C, dan 3 hari pada suhu 20-25o C.

2. Kemudian lakukan sesuai tabel dibawah ini :

Blanko Standar Sampel

Larutan kerja 500 μL 500 μL 500 μL

Akuades 150 μL - -

Standar - 150 μL -

Sampel - - 150 μL

3. Campurkan dan baca absorbans (A) pada panjang gelombang 560 nm setelah 50 detik

Blanko Standar Sampel

- A1 A2

4. Kemudian tambahkan :

Blanko Standar Sampel

Reagen 3 (R3) 25 μL 25 μL 25 μL

5. Campurkan dan baca absorbance (A) pada panjang gelombang 560 nm setelah 325

detik

Blanko Standar Sampel

- A3 A4

6. Penghitungan :

A4-A2

A3-A1

5

X konsentrasi standar

Nilai rujukan :

a. Bayi baru lahir : 1 - 2,5 mg/L (17,9 – 44,8 μmol/L)

b. Bayi : 0,4 – 1 mg/L (7,2 – 17,9 μmol/L)

c. Anak-anak : 0,5 – 1,2 mg/L (9,0 – 21,5 μmol/L)

d. Wanita dewasa : 0,5 – 1,7 mg/L (9,0 – 30,4 μmol/L)

e. Laki-laki dewasa : 0,65 – 1,75 mg/L (11,6 – 31,3 μmol/L)

Metode ini linier sampai dengan konsentrasi 500 μg/L (5 mg/L atau 89,5 μmol/L)

TOTAL IRON BINDING CAPACITY (TIBC)

I. Pemeriksaan TIBC yang direkomendasikan ICSH

Dalam plasma, besi terikat pada tranferin, dan TIBC adalah mengukur protein

tersebut.

TIBC = serum iron + UIBC (Unsaturated Iron Binding Capacity)

Nilai rujukan : 47- 70 μmol/L

Prinsip :

Pada serum ditambahkan besi yang berlebih (ferri klorid). Besi yang tidak

terikat transferin akan diabsorbsi oleh magnesium carbonate, kemudian kadar

besi serum diukur.

Reagen :

1. Basic magnesium carbonate

2. Saturating solution (100 μmol Fe/L).

Tambahkan 17,7 ml deionized water, 100 μL HCl 1 mol/L, 100 μL

larutan standar. (Saturating iron solution mengandung 5,6 μg Fe/mL)

Campur

Stabil dalam 2 bulan pada suhu ruangan.

Cara kerja :

1. Masukkan 0,5 ml serum ke dalam tabung

2. Kemudian tambahkan 0,5 ml saturating iron solution, campur dengan hati-

hati, dan diamkan selama 15 menit pada suhu ruangan.

3. Tambahkan 100 mg light magnesium carbonate, tutup tabung dan bolak-balik

tabung, diamkan selama 30 menit dengan sekali-kali diaduk.

4. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada 13.000 rpm

selama 4 menit. untuk mengendapkan protein dan mendapatkan supernatan.

6

5. Periksa supernatan, jika masih sisa magnesium carbonate harus disentrifus

ulang.

6. Ambil supernatannya sebanyak 0,5 ml dan perlakukan seperti pada

pemeriksaan serum iron.

7. Hasil akhir dikalikan 2

Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen dan serum dalam tabung

3 ml dan sentrifus pada 1500 g selama 15 menit

II. Pemeriksaan TIBC di Laboratorium Patologi Klinik RSU Dr. Soetomo

Metode yang digunakan : saturasi

Prinsip :

TIBC dievaluasi setelah saturasi transferin oleh larutan besi, dan kelebihan besi akan

diabsorbsi oleh magnesium hydroxide carbonate. Setelah disentrifus, konsentrasi besi

dalam supernatan diukur.

Reagen :

Reagen 1 : R1

o Iron saturating solution 500 μg/dL

5 mg/L

89,5 μmol/L

Reagen 2 : R2

o Magnesium hydroxide carbonate (1 sendok takar = 100 mg)

Sampel : Serum, plasma heparin

Cara kerja :

1. Sampel 0,5 ml dicampurkan dengan 1 ml reagen R1, diinkubasi selama 5 menit

2. Kemudian tambahkan 1 sendok takar ( kira-kira 100 mg) reagen R2, dan

diinkubasi selama 20 menit, dengan sekali-kali dikocok.

3. Sentrifus selama 10 menit dengan 3000 rpm

4. Ambil supernatannya.

5. Periksa supernatan seperti pada penentuan SI.

Dengan 1 bagian supernatan : 3 bagian reagen R1 (pada SI).

Nilai rujukan :

Laki-laki dewasa : 2,6 – 3,9 mg/L ( 46,5 – 69,8 μmol/L)

Wanita dewasa : 2,1 – 3,4 mg/L (37,6 – 60,9 μmol/L)

7

SATURASI TRANSFERIN

Saturasi transferin ditentukan dengan rumus sebagai berikut :

SI (μg/dL)

TIBC (μg/dL)

Harga normal : 20 - 45%

FERITIN SERUM

Metode ELISA Double Sandwich

Prinsip : pemeriksaan feritin serum memakai metode ELISA dengan cara double sandwich.

Antibodi dengan high affinity terhadap feritin (antiferitin Ig G) akan berikatan dengan feritin

serum dan selanjutnya dilabel dengan enzim horseradish peroxidase dan dibaca absorbannya

pada panjang gelombang 492 nm.

Reagen :

1. Preparat antiferitin Ig G yang dikonjugasi dengan horseradish peroxidase

2. Larutan standar feritin.

Dibuat dengan cara :

Encerkan human ferritin 200 µg/ml ke dalam air. Encerkan larutan feritin 200

µg/ml ke dalam 10 µl/ml dalam 0,05 mol/l larutan sodium barbitone (yang terdiri

dari 0,1 mol/l NaCl, 0,02% NaN dan BSA 5 gr/dl), pH disesuaikan sampai pH 8

dengan menambah HCl 5 mol/l.

Bagi dalam 200 tabung kecil, masing-masing berisi 200 µl, tutup rapat dan tahan

sampai 1 tahun pada suhu 40C

Jika akan dipakai, encerkan dengan buffer B sampai 1000 µg/l dan siapkan larutan

dalam range 0,2 – 25 µg/l (bandingkan dengan standar WHO untuk uji serum

ferritin 94/572)

3. Buffer A : Phosphate-buffered saline pH 7,2

4. Buffer B : 5 gram BSA (Bovine Serum Albumin) dalam 1 liter buffer A

5. Buffer C : Carbonate buffer pH 9,6

6. Buffer D : Citrate phosphate buffer pH 5.

7. Larutan substrat

8

x 100 %

Cara kerja :

1. Lapisi microtitre plate, dengan cara :

Preparat antiferitin Ig G diencerkan dengan 2 µg/ml buffer C, tambahkan 200 µl

ke dalam tiap-tiap sumuran.

Tutup dan inkubasi semalam pada suhu 40C. Kosongkan sumuran dengan cara

dibalik dan di-tapping pada handuk kering.

Tambahkan 200 µl 0,05% BSA dalam buffer C, diamkan 30 menit dalam suhu

ruangan.

Cuci tiap sumuran dengan buffer A sampai 3x. plate dapat disimpan sampai 1

minggu pada tempat kering dan suhu 40C

2. Encerkan 50 µl serum pasien dengan 1 ml buffer B.

3. Tambahkan 200 µl larutan standard dan serum pasien ke dalam tiap sumuran dalam

waktu 20 menit.

4. Tutup dan diamkan selama 20 menit pada suhu kamar dan jauhkan dari sinar matahari

5. Kosongkan sumuran dan cuci 3x dengan buffer A.

6. Tambahkan 200 µl preparat konjugasi antiferitin Ig G dengan horseradish peroxidase

yang sudah diencerkan, tutup dan diamkan selama 2 jam pada suhu kamar.

7. Cuci 3x dengan buffer A

8. Tambahkan 200 µl larutan substrat pada tiap-tiap sumuran, inkubasi selama 30 menit.

9. Tambahkan 50 µl asam sulfur 4M pada tiap-tiap sumuran untuk menghentikan reaksi

10. Tunggu 30 menit dan baca absorbannya pada 492 nm dengan microtitre plate reader,

atau ambil 200 µl larutan dari tiap sumuran dan masukkan dalam 800 µl air, baca

dengan fotometer.

Metode IRMA (Immunoradiometric Assay)

Prinsip : Antibodi yang dilabel dengan radioaktif yang berlebih direaksikan dengan ferritin.

Ferritin yang tidak berikatan dengan antibodi akan dihilangkan dengan immunoadsorbent.

Nilai rujukan : 35 – 300 µg/l (pria dewasa)

20 – 100 µg/l (wanita dewasa)

Perlu pertimbangan yang hati-hati untuk menentukan kadar serum ferritin yang tinggi,

primer disebabkan karena kenaikan besi atau karena kerusakan jaringan. Ferritin merupakan

suatu protein fase akut dimana ferritin akan dilepaskan oleh hati ke sirkulasi pada keadaan

penyakit hepatoseluler, tumor/keganasan hati, alkoholisme dan pemakaian kontrasepsi oral.

9

HEMOSIDERIN

Penilaian besi secara langsung dari dua depot besi yaitu sumsum tulang dan hati, lebih

disukai dari sumsum tulang. Penilaianhemosiderin dapat memakai metode Prussian Blue

(tampak berwarna biru) atau membuat hapusan tebal tanpa pengecatan (tampak berwarna

keemasan).

Prinsip : reagen Prussian blue akan mewarnai besi menjadi berwarna biru terang atau hijau,

sedangkan inti dan eritrosit tercat warna merah atau merah muda oleh neutral red.

Bahan dan alat :

1. Gelas obyek dan bahan sampel, dibuat hapusan darah

2. Metanol untuk fiksasi

3. Larutan potassium ferrocyanide 10 g/l dalam 0,1 mol/l HCl

4. Larutan neutral red atau eosin

5. Larutan HCl 3 mol/l

Cara kerja :

1. Hapusan darah difiksasi dengan metanol, tunggu 10 – 20 menit

2. Masukkan hapusan dalam larutan potassium ferrocyanide selama 10 menit pada suhu

200C.

3. Cuci dengan air kran selama kira-kira 20 menit, kemudian bilas dengan distilled

water.

4. Cat dengan neutral red atau eosin selama 10-15 detik

5. Tuangi dengan HCl 3 mol/l dan cuci dengan air kran.

10

Nilai rujukan :

Kriteria gradasi pengecatan besi (Prussian blue) pada aspirasi sumsum tulang

GRADASI KRITERIA KANDUNGAN BESI

0 Tak tampak granula besi 43 ± 23

1 Granula-granula kecil pada sel retikulum tampak

hanya dengan minyak emersi

130 ± 50±

2 Sedikit granula-granula kecil yang dapat dilihat

dengan lensa kekuatan lemah

223 ± 75

3 Sejumlah granula-granula kecil dalam semua partikel

sumsum tulang

406 ± 131

4 Granula-granula besar dalam kelompok kecil 762 ± 247

5 Granula-granula besar dalam kelompok besar 1618 ± 464

6 Deposit yang sangat besar yang mengaburkan

gambaran sumsum tulang secara rinci

3681 ± 1400

INTERPRETASI HASIL

Konsentrasi serum iron pada kedaan normal memperlihatkan fluktuasi yang lebar dari

hari ke hari dan variasi diurnal. Kadar tertinggi pada pagi hari dan terendah pada malam hari.

Namun pada keadaan patologis, baik pada defisiensi besi ataupun kelebihan besi, fluktuasi

ini cenderung menghilang. Serum iron (SI) dan terutama saturasi transferin, mencerminkan

suplai besi ke jaringan pada saat sampling, dan tidak memberikan banyak informasi tentang

status besi tubuh. Misalnya pada perjalanan yang progresif defisiensi besi, kadar serum iron

tidak terpengaruh hingga pada tahap cadangan besi tubuh habis. Sebaliknya, peningkatan

cadangan besi tubuh pada anemia penyakit kronik, biasanya disertai dengan penurunan kadar

serum iron.

11

Tabel. Interpretasi SI dan TIBC

Measurement Increased DecreasedSerum Iron (SI) Iron overload Iron deficiency

Liver disease Infection/inflamationChronic alcoholism Anaemia of chronic disorderHypoplastic anaemiaHaemolysis/ineffective

erythropoiesisSerum TIBC Iron deficiency Iron overloadPregnancy Infection/inflamationOral contraceptive Anaemia of chronic disorder

Berbeda dengan anemia defisiensi besi, pada anemia karena penyakit sistemik

ditemukan penurunan serum iron dan serum TIBC, disertai persen saturasi transferin sangat

menurun dibanding pada anemia defisiensi besi. Peningkatan kadar serum iron dan persen

saturasi transferin sebagian besar disebabkan penyakit hati atau kegagalan sumsum tulang

menggunakan besi secara efektif. Meskipun demikian, peningkatan persisten dari persen

saturasi TIBC kemungkinan merupakan indikasi awal dari peningkatan risiko uptake besi

oleh jaringan dan perkembangan dari kelebihan besi.

Pada anemia defisiensi besi, SI menurun, TIBC/ transferrin meningkat, saturasi transferrin

menurun dan ferritin menurun. Pada anemia karena penyakit kronis, SI menurun, TIBC

normal atau menurun, saturasi transferin bisa normalatau menurun dan ferritin normal atau

meningkat. Pada keadaan kelebihan besi, SI dan TIBC meningkat, saturasi transferrin

meningkat dan ferritin meningkat. Sedangkan untuk pemeriksaan hemosiderin dengan

pengecatan Prussian blue jarang dilakukan karena bersifat invasif.

Nilai SI normal mempunyai fluktuasi yang lebar dan memperlihatkan variasi diurnal serta

tidak terpengaruh sampai cadangan besi habis. Penurunan SI terjadi pada anemia defisiensi

besi, penyakit kronis dan selama respon fase akut. Sedangkan TIBC meningkat pada anemia

defisiensi besi dan kehamilan dan menurun pada infeksi dan keganasan.

12

DAFTAR PUSTAKA

Bakta IM, Hematologi Klinik Ringkas. EGC. Edisi 1. 2007; 3:26-44

Chanarin, Laboratory Haematology An Account of Laboratory Techniques. Churchill Livingstone. 1989; 4:83-86

Greer John P et al, Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott Williams & Wilkins. 11th edition. 2004 ; 28: 980-987

Joseph J. Mazza, Manual of Clinical Hematology. Lippincott Williams & Wilkins. Third edition. 2002;2: 17-21

Lewis Bain Bates, Dacie and Lewis Pratical Haematology. Churchill Livingstone Elsevier. 2006 ; 7:131-153

Lea and Febiger, Wintrobe Clinical Hematology. 8th edition. 1981 ; 152-160, 605-41, 646-52, 654-9, 667-74.

Rolf H. Iron Metabolism, Iron Deficiency and anaemia. J Sysmex Int. 2003;13:65-74

13