kolesterol
Post on 10-Feb-2016
575 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
A. METODE NON ENZIMATIK (SAMPEL : DARAH)
B. METODE NON ENZIMATIK (SAMPEL : KUNING TELUR)
C. METODE ENZIMATIK (CHOD–PAP) (SAMPEL : DARAH)
2
DASAR TEORI
HO
• Kolesterol : senyawa sterol tak jenuh• Merupakan konstituen dari batu empedu dan kuning telur, terdapat sebagai deposit pada dinding pembuluh darah. • Banyak terdapat dalam organ tubuh lainnya.• Kolesterol terdapat dalam jaringan hewan dan tidak terdapat pada tumbuhan.
• Kegunaan kolesterol : - Prekursor hormon steroid (testosteron, progesteron, estrogen) - Prekursor pembentukan asam folat. - Diperlukan dalam perkembangan embrio.• Kelebihan kolesterol : aterosklerosis• Pengetahuan kadar kolesterol : menegakkan diagnosis genetik - Kadar kolesterol naik, trigliserida normal kenaikan LDL - Kadar trigliserida naik, kolesterol normal kenaikan VLDL
3
ANALISA KUALITATIF(SAMPEL : KUNING TELUR / DARAH)
1. Uji Salkowski :
HO
H2SO4
- H2O
SO3Hkolesterol 3,5-kolastadienaAsam 3,5-kolastadiena sulfonat
- H2O
H2SO4
HO HO
Sesuai sampel pada uji kuantitatif
4
Bahan Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3Kuning telor 5 tetes - -Kolesterol 0,5% - - 2 mLKloroform 2 ml 2 ml 2 mLAsam asetat anhidrat 10 tetes 10 tetes 10 tetesH2SO4 pekat 2 tetes 2 tetes 2 tetes
Prosedur :1. Diambil bahan seperti pada tabel :
2. Kocok tabung perlahan-lahan
Lapisan kloroform : merahLapisan asam :kuning, flouresensi : hijau
3. Catat hasilnya ! Bandingkan dengan standard !
5
2. Uji Liberman Burchard :
HO
(CH3COO)2O
- CH3COOHH2SO4
-H2Okolesterol
3-asetokolesterolAsam 3-aseto-5-kolesterol sulfonat
H3CCOO H3CCOOSO3H
6
Prosedur :1. Diambil bahan seperti pada tabel :
Bahan Tabung 1 Tabung 2
Tabung 3
Kuning telur 5 tetes - -Kolesterol 0,5% - - 2 mLKloroform 2 ml 2 ml 2 mLAsam asetat anhidrat 10 tetes 10 tetes 10 tetesH2SO4 pekat 2 tetes 2 tetes 2 tetes
2. terjadi warna merah (cepat)
berubah menjadi biru
Hijau
3. Catat hasilnya ! Bandingkan dengan standard !
7
ANALISA KUANTITATIFMETODE NON ENZIMATIK (Sampel : kuning telur)
Dasar Metode
Intensitas warna hijau : berbanding lurus dengan kadar dapat diukur secara kuantitatif
HO
(CH3COO)2O
- CH3COOH
H2SO4
-H2O
kolesterol
3-asetokolesterol
Asam 3-aseto-5-kolesterol sulfonat
OS OO
OH
Gugus kromofor yang dapat diukur secara spektrofotometri visibel
OC
OCH3 C
OH3C
8
Langkah2 penentuan kadar
1. Penentuan waktu operasi (OT)
- Tujuan dilakukan penentuan OT : untuk mencari waktu pembacaan serapan yang stabil
Prosedur : - Salah satu larutan baku kolesterol (misalnya 0,3 mg/mL) - Diambil 2,0 mL + 2 mL pereaksi Liberman-Burchard - Dibaca absorbansinya pada λ maks yang sudah dicari sebelumnya)
Contoh :
0 10 30 50 70 100 120 140 160 180 200 220 2400
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
Waktu (detik)
Absorbansi
OT : 100 – 200 detik waktu pengukuran sampel & standard antara 100 – 200 detik setelah pereaksi ditambahkan
9
2. Penentuan panjang gelombang maksimum (λ maks)
- Tujuan dicari λ maks: untuk mencari panjang gelombang yang menghasilkan serapan maksimum.
Prosedur : - Salah satu larutan baku kolesterol (misalnya 0,3 mg/mL) - Diambil 2,0 mL + 2 mL pereaksi Liberman-Burchard - Dibaca absorbansinya pada λ antara 661 – 680 nm
Contoh :
660 662 664 666 668 670 672 674 678 680 6820
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
(λ nm)
Absorbansi
λ maks : 670 nm
10
3. Pembuatan kurva baku
- Kegunaan kurva baku: untuk menghitung kadar
- Buat baku kolesterol 1 mg/mL (dalam dikloroetana). - Buat seri larutan baku kolesterol, misal : 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5
mg/mL (dalam dikloroetana). - @ diambil 2,0 mL + 2 ml pereaksi Liberman-Burchard. - Tempatkan dalam ruang gelap ad warna hijau (sesuai hasil OT). - Baca serapannya dengan spektrofotometer visibel pada λ maks
Contoh
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.70
0.050.1
0.150.2
0.250.3
0.350.4
0.45
C (mg/mL)
Absorbansi
LRy = 0,4216 x + 0,09183R : 0,9844
4. Preparasi dan penentuan kadar sampel
1 butir telur ditimbangcangkangKuningPutih
ditimbang
1 g kuning telur10 mL aseton: alkohol (1:1)
w. b
disentrigugasi 15' pd 2500 rpm
dinginkan
diambil & diuapkan
Residu + 1 mL dikloroetana + 2 mL pereaksi Liberman-Burchard
di Ruang gelap sesuai OTDibaca abs pd lambda maks
12
5. Perhitungan kadar sampel
y = 0,4216 x + 0,09183 y : Absorbansi sampel x : kadar sampel (mg/mL)
W = x mg/ mL X 2 mL W = .... mg g
Kandungan kolesterol =berat kolesterol (W)
berat bahanX 100%
13
Sampel : darah1. Penentuan λ maks (seperti sampel kuning telur)
2. Penentuan OT (seperti sampel kuning telur)
3. Penentuan kadar kolesterol
a. Diambil reagen seperti pada tabel : preparasi darah = metode enzimatik
b. Ditempatkan ruang gelap sesuai OT dan dibaca serapannya pd λ maks
c. Hitung kadar kolesterol
blanko Larutan sample/standard
Supernatan darah/ standard - 200 µlAquadest 200 µl -Pereaksi Liberman-Burchard 2000 µl 2000 µl
Kadar kolesterol =AsAb
x Kadar standard (mg/dL)
14
METODE ENZIMATIK Cholesterol Oxidase Phenol Aminoantipyrin (CHOD-PAP)
Dasar Metode :
• Penguraian kolesterol dan esternya menjadi peroksida dengan hidrolisa dan oksidasi enzimatik. • Perooksida kemudian bereaksi dengan 4-aminoantipyrin dan fenol Quinoneimine
Reaksi :
H2OCholesterol ester Cholesterol Fatty acid
Cholesterol O2CHO
Cholesterol teroksidasi H2O2
2 H2O2 4-Aminoantipyrin Phenol POD Quinoneimine 4 H2O
CHE
15
1. Penentuan lambda maks
2. Preparasi sampel darah
Darah disentrifugasi 20' pd 3200 rpm
200 mikro L + reagen pengendapdiamkan pd T kamar
disentrigugasi 15' pd 2500 rpm, diamkan 2 jam
diambil
16
2. Penentuan kadar kolesterol a. Diambil reagen seperti pada tabel :
b. Diinkubasi 20’ suhu 20–25°C atau 10’ suhu 37°C, serapan dibaca 60’ terhadap blanko pd λ maks
c. Hitung kadar kolesterol :
Kadar kolesterol =AsAb
x Kadar standard (mg/dL)
blanko Larutan sample/standardSupernatan / standard - 10 µlAquadest 10 µl -Reagen CHOD-PAP 1000 µl 1000 µl
17
SEKIAN
TERIMA KASIH
top related