histoteknik dasar

ZULHAMDEPARTEMEN HISTOLOGI FKUSU

DISAMPAIKAN PADAKULIAH PASCASARJANA ILMU BIOMEDIK FKUSU

8 OKTOBER 2009

Histoteknik Dasar

histologi.usu.ac.id

Tujuan Pertemuan

Setelah mengikuti pertemuan ini, peserta diharapkan:

Mampu melaksanakan tissue processing;Mampu melaksanakan pewarnaan HE.

Histoteknik adalah metoda membuat sajian histologi dari spesimen tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap untuk dianalisis.

Sumber Jaringan:

3.Manusia

4.Hewan

Rangkaian Proses

• Pengawetan (Fixation);• Dehidrasi (Dehydration);• Pembeningan (Clearing);• Pembenaman (Infiltration/Impregnation/Embedding);• Pengecoran (Blocking/Casting);• Pengirisan Jaringan (Sectioning);• Pewarnaan (Staining);• Perekatan (Mounting);• Pelabelan (Labelling)

1. Pengawetan

Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses:2. Menghambat proses pembusukan dan autolisis3. Pengawetan jaringan4. Pengerasan jaringan5. Pemadatan koloid6. Differensiasi optik 7. Pengaruh terhadap pewarnaan

Cara melakukan fiksasi:10.Supravital/intravital;11.Merendam dalam larutan fiksatif.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam fiksasi jaringan histologi adalah:2.Tebal irisan. 3.Volume larutan pengawet. 4.Jenis larutan pengawet.

Kelompok Zat Pengawet

Formaldehyde Formaldehyde (Formalin), Paraformaldehyde, Glutaraldehyde,

Picrates Picric Acid → Bouin’s Solution

Mercurials Helly ‘s Fluid (Zenker Formol)

Oxidizing Agents Osmium tetroxide

Alcohol Methanol, Alcohol (etanol)

Potassium Dichromate Muller

JENIS CAIRAN FIKSATIF

FORMALIN MULLER BOUIN CARNOY ZENKER FORMAL (CAIRAN HELLY) ETANOL ASAM ASETAT-ALKOHOL-FORMALIN

(TELLYESNICZKY) dll

FORMALIN

Yg digunakan adalah bentuk monomer: dibuat dengan menetralkan/alkalis larutan

Mengakibatkan crosslink protein Formal saline, formal calcium, 10% neutral buffered

formalin, buffer formalin sukrosa Kelebihan dan kekurangan

Human, 10% Formalin, HE 612x

BOUIN

Mengandung asam pikrat, meledak kalau kering Mudah dikenali saat pemotongan → warna kuning Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata Jaringan mengalami pengerutan

Rat, Bouin’s Solution,HE, Testis 400x

Zenker Formol (Cairan Helly)

Mengandung merkuri klorida Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan

penetrasinya berkurang setelah meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang melebihi ketebalan 5 mm pada umumnya cenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di bagian pinggir sementara di bagian tengah menjadi lunak karena underfixed

Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan limpa, mitochondria.

Rat, Helly Fluid, HE 162x

Etanol

Cytological fixatives Etanol 95% Digunakan untuk Pap test, swab Mempertahankan antigenisitas → cocok IHC

LARUTAN CARNOY

mengawetkan substansia Nissl dan glikogen daya penetrasi yang cepat Fiksasi ini sering digunakan apabila suatu

diagnosis perlu ditegakkan dengan cepat, misalnya untuk diagnosis kanker pada saat pembedahan. Fiksasi umumnya selesai setelah 1-2 jam,sedangkan potongan kecil selesai difiksasi dalam 15 menit.

efek pengerutan: kuat

Mus musculus, Carnoy, Liver

Pasca fiksasi, jaringan yang keras mendapat perlakuan khusus•Tulang: dekalsifikasi → formic acid 8%•Kulit: teknik lendrum

• Cuci dengan air kran mengalir/alkohol 90%• Fenol 4% dalam akuades (v/v) selama 1 -3 hari

dehidrasi

Tahapan dehidrasi Cara I

Alkohol 70% 3 hari ( 3x ganti) Alkohol 95% 3 hari ( 3x ganti) Alkohol 100% 3 hari ( 3x ganti)

Cara II Alkohol 70%, 80%, 90%, masing-masing 1 hari; Alkohol 95% 2 hari ( 2x ganti); Alkohol 100 % 2 hari ( 2x ganti).

Sukrosa 20% (untuk cryostat): Sukrosa 20% selama 2 hari; Metanol: jarang digunakan tetapi dapat digunakan seperti etanol; Aseton : 3 x 20 menit.

PEMBENINGAN (CLEARING)

Bahan yang digunakan : Cedar wood oil; Chloroform; Benzene/benzol; Benzyl benzoat; Methyl benzoat; Xylene/xylol; Toluene

Cedar Wood Oil

Keuntungan Sifat clearing-nya paling baik. Tak mengeraskan jaringan

Jaringan yang halus sangat baik. Kadang digunakan untuk jaringan keras (kulit dan jaringan

ikat padat)

Dapat disimpan dalam waktu lama (berbulan-bulan)

Chloroform

Keuntungan : Paling sering dipakai

Bersifat toleran (dapat disimpan semalaman tanpa menjadi keras)

Kerugian Titik akhir tak dapat dilihat dengan mata

Saat menjadi bening dan transparan tak jelas Cara mengatasi : waktu pembeningan diperpanjang

Lebih mahal dari xylene dan benzene tetapi lebih murah dari cedar wood oil.

Benzyl Benzoate

Metoda : Benzyl benzoat I selama 24 jam hingga jaringan

tenggelam. Jaringan menjadi bening dan transparan. Benzyl benzoat II selama 2-3 jam. Benzol-Paraffin selama ½ - 1 jam. Campuran benzol

dan paraffin cair dengan perbandingan sama. Masukkan ke dalam paraffin cair.

Methyl Benzoate

Metode : Methyl benzoat I sampai jaringan tenggelam.

Daya penetrasi lebih cepat dari benzol benzoat; Jaringan mudah rapuh.

Methyl benzoat II selama 1-2 jam. Benzol-Paraffin. Campuran benzol dan paraffin

dengan perbandingan sama. Masukkan ke dalam paraffin cair.

Benzene dan Xylene

Keuntungan Waktu clearing cepat : ½ - 1 jam. Benzene lebih lambat dari xylene tetapi kerapuhan jaringan lebih

berkurang dibanding xylene Kerugian

Karsinogenik Metode

Direndam dalam xylol 2 kali @ 1 menit hingga bening dan transparan Volume 50 – 1000 kali volume jaringan Setelah itu masukkan ke dalam paraffin cair

Toluene

Sama dgn xylene tetapi lebih lambat Menimbulkan sedikit pengerasan dan distorsi

jaringan Mudah menguap

PEMBENAMAN

Impregnasi adalah proses pengeluaran cairan pembening (clearing agent) dari jaringan dan menggantikannya dengan paraffin.

Dilakukan dengan menggunakan paraffin oven Clearing agent yang tersisa dapat mengkristal dalam

jaringan sehingga saat dipotong dengan mikrotom jaringan akan robek.

Teknik Pembenaman Paraffin/ paraplast I selama 2 jam; Paraffin/ paraplast II selama 1 jam; Paraffin/ paraplast III selama 2 jam.

Setelah pembenaman, proses dilanjutkan dengan pengecoran (blocking).

PENGECORAN (BLOCKING/CASTING)

Alat Cetak : Besi potongan berbentuk L (Leuckhart) Susun 2 buah potongan besi si atas lembaran logam sehingga

membentuk ruang kubus; Tuangkan sedikit paraffin cair di bagian pinggir agar tidak bocor; Letakkan jaringan sesuai dengan keinginan saat jaringan diiris; Tuangkan paraffin secukupnya agar menutupi jaringan seluruhnya; Hindarkan terbentuknya air bubble. Histoplate dari plastik (casette) dan piringan logam (mold). Spatula untuk melekatkan blok paraffin. Beri label identitas jaringan saat blocking.

PENGIRISAN JARINGAN (SECTIONING)

Persiapan:- Microtome knive vs Microtome blade (disposable)Letakkan pisau pada mikrotom dengan sudut tertentu. Rekatkan blok paraffin yang akan dipotong pada holder dengan menggunakan spatula atau scalpel blade yang panas. Letakkan holder berikut blok preparat pada tempatnya di mikrotom.- Siapkan coated slides:

Albumin (putih telur);Gelatin;SuperFrostPoly-L-Lysine

- Waterbath berisi air hangat 55oC;- Sengkelit.

Teknik Pemotongan ketebalan + 5 – 10 µm (disesuaikan kebutuhan) Atur jarak preparat yang dipegang oleh holder ke arah

pisau sedekat mungkin; Gerakkan rotor (putaran) pada mikrotom secara ritmis, Buang pita-pita paraffin awal yang tanpa jaringan; Setelah potongan mengenai jaringan, potong blok preparat

secara hati-hati; pindahkan secara hati-hati dengan sengkelit ke atas air di

dalam waterbath yang diatur pada suhu 55oC; Setelah pita paraffin terkembang dengan baik, tempelkan

paraffin ke kaca objek; Simpan kaca objek berisi potongan paraffin dan jaringan

sampai saatnya untuk diwarnai.

Pewarnaan (Staining)

Pertimbangan Pewarnaan

Unsur yang akan didemonstrasikan Pigmen pengganggu

Mis: melanin → bleaching

Fixing fluid/fixatives Muller fluid → jaringan dicuci dgn air mengalir selama 24 jam Zenker → lugol’s iodine → larutan hypo

Jenis Pewarnaan

Hematoxylin & Eosin (Rutin) Khusus

PAS, PTAH, Impregnasi perak Sudan → lipid

Sitologik Pap test Blood smear Swab mucosa

Imunohistokimia

Hematoxylin dan Eosin

Paling banyak digunakan → rutin HE dapat menunjukkan sebagian besar struktur

histologi Demonstrasi nuklei adalah penting Variasi dalam hasil

Hematein (oxidized hematoxylin) adalah zat warna Nucleus mengandung RNA dan DNA (bersifat asam) Hematoxylin mewarnai nuclei Afinitas hematein thd nuclei adalah jelek bila tanpa mordant.

Mordant adalah penghubung haematoxyllin dan DNA Logam: Al, Fe, tungsten, molybdenum, lead Tipe mordant mempengaruhi tipe jaringan yang terwarnai dan hasil akhir

pewarnaan Klasifikasi didasarkan jenis mordant yg digunakan

Al; Iron; Tungsten haematoxyllin, etc & tanpa mordant

Natural ripening vs artificial ripening Artificial ripening: penggunaan mordant (Al, Fe, atau

Pb) Warna pertama adalah merah gelap, menjadi biru

(blueing) bila diperlakukan dgn alkali lemah (air kran atau lithium carbonate)

Methods are regressive Progressive causing pale nuclei or colour cytoplasm Counterstain (IHC)

Hematoxylin

Penggunaan Pewarnaan Nuclei Struktur selain nuclei

Jenis formula hematoxylin untuk pewarnaan nuclei

1. Dellafield (1885)2. Ehrlich (1886)3. Heidenhains (1896)4. Harris (1900)5. Mayer (1903)6. Weigert (1904) 7. Carazzi (1911)8. Cole (1943)

Haematoxyllin Mixtures

Connective tissue Mallory phosphotungstic acid haematoxyllin

Elastic fibers Verhoeff’s method

Myelin Kultschitzky Loyez Spielmeyer Weigert

Copper and lead Mallory Parker

Mucin Mayer’s mucihematein

PEWARNAAN (STAINING)

Formula Hematoxylin Mayer Haematoxylin kristal 1 gr Akuades 1000 ml Sodium Iodate 0,2 gr Ammonium/potassium alum 50 gr Citric acid 1 gr Chloral hydrate 50 gr

Cara pembuatan Hematoxylin Mayer Larutkan ammonium/potassium alum di dalam akuades. Tambahkan hematoxylin dan campurkan secara baik (aduk). Tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya.

Eosin

Zat warna xanthene Ikatan Van der Waals Paling cocok dikombinasikan dgn alum haematoxyllin Memiliki nilai kemampuan differensiasi sendiri untuk

membedakan antara sitoplasma dari tipe sel dan serabut jaringan ikat yang berbeda

Differensiasi terjadi selama dehidrasi oleh alkohol Jenis eosin

Eosin Y (yellowish), water soluble Eosin B (Bluish) Ethyl Eosin (eosin S, eosin alkohol absolut)

Eosin Y

water soluble Paling banyak digunakan Zat warna asam sehingga berikatan dgn protein (basa) Dapat berpenetrasi pada struktur padat dan bersifat

metakromatik Terdapat dalam 2 bentuk

Monomer: merah Dimer : oranye-merah

Hasil pewarnaan Sitoplasma: merah Eritrosit : oranye-merah Nukleus piknotik: ungu Nucleolus: merah

Eosin

Formula Eosin Eosin-alkohol Stok 1% Eosin y ws 1 gr Distilled water 20 ml Larutkan dan tambahkan alkohol 95% 80 ml

Working Eosin Solution Eosin-alkohol stok 1 bagian Alkohol 80% 3 bagian Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat glasial

0,5 ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik.

Mewarnai Preparat

Deparafinisasi dengan xylol (2 x 2 menit); Hidrasi dengan alkohol 100% (2x2 menit) – 95% (2 menit) – 90%(2 menit)

– 80% (2 menit) – 70% (2 menit) – air kran (3 menit); Jaringan yang difiksasi dengan larutan yang mengandung merkuri klorida

mengandung presipitat merkuri yang berwarna hitam. Deposit merkuri dapat dihilangkan sebelum pewarnaan. Irisan diinkubasi dalam larutan iodine 0,5% dalam etanol 70% selama 5 – 10 menit. Irisan dibilas dengan air lalu diinkubasi dalam sodium thiosulphate 5% selama 5 menit dan dicuci dengan air kran mengalir.

Inkubasi dalam larutan hematoxylin Mayer selama beberapa menit; Cuci dalam air mengalir selama 15-20 menit; Observasi di bawah mikroskop, Counterstaining dengan eosin working

solution selama beberapa menit. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat

Inkubasi dalam xylol 2x2 menit. mounting dengan entelan/balsam kanada. labelling

Acid Alcohol Rinse

Mengurangi warna biru hematoxyllin (to differentiate nuclear staining)

0.25 % acid rinse Akuades 975 ml HCl 25 ml

HCl 1% dalam alkohol 70% (v/v)

Blueing

Air kran (yang alkalis) Jakarta: pH air kran adalah 7.8

Lithium carbonate Lithium carbonate……………….... 0,5 gr Akuades……………………………… 1000 ml Campurkan dengan baik.

TERIMA KASIH

PRAKTIKUM HISTOTEKNIK DASAR14 DAN 15 OKTOBER 2009