4. teknologi gena

Teknologi GenaBioteknologi

Binar Asrining Dhiani, M.Sc., Apt

Teknologi Gena

• Kegiatan untuk:

– Mengetahui ekspresi gen

– Mengambil manfaat dari variasi genetik

– Memodifikasi gen

– Memindahkan gen ke inang baru

Langkah-langkah dalam Teknologi Gena

I. Persiapan DNA atau gen tertentu

II. Seleksi dan identifikasiklon yang benar

III. Produksi massalIII. Penerapan di bidang

kedokteran dan pertanian

Introduction ke dalam inang

DNA

Central DogmaAlur Informasi Genetik (dari DNA ke Protein)

Replikasi DNA

• DNA Polimerase:– Mensintesis DNA

hanya dari arah 5’ ke3’, menambah dNTPke gugus hidroksil 3’

– Hanya menambahdeoksiribonukleotidabaru pada primer strand yang berikatanhidrogen dengantemplate strand

Transkripsi RNA

• RNA polimerase

Translasi

• tRNA

• Elongation factor

Kloning DNA

Vektor Rekombinan DNA

• Molekul DNA yang dapat berpindah dan bereplikasidalam suatu organisme

• Contoh:Vektor Ukuran yang dapat disisipkan (kb)

– Plasmid sampai 15

– Bakteriofage sampai 90

– Bacterial Artificial Chromosome (BAC) 100-500

– Yeast Artificial Chromosome (YAC) 250-2000

• Ciri utama:– Origin of replication: untuk membantu multiplikasi di inang

– Cloning site: untuk dipotong oleh enzim untuk menyisipkanDNA

– Drug resistance marker: untuk seleksi

Metode Transfer GenProkariot

• Elektroporasi

• Perlakuan kimia– Kalsium klorida

– Rubidium klorida

– DMSO

Eukariot

• Elektroporasi– Pembentukan pori oleh arus listrik tegangan

tinggi

• Ko-presipitasi dengan kalsium fosfat– Presipitasi DNA dengan kalsium fosfat

– Absorb ke dalam membran sel

– Masuk ke dalam sel melalui proses kalsium-dependen

• Liposom enkapsulasi– Meng-enkapsulasi DNA pada vesikle liposom

– Peleburan liposom dengan membran sel

• Mikroinjeksi– Injeksi DNA dalam mikropipet gelas kapiler

langsung ke inti sel melalui tekanan udara

• Infeksi retrovirus– DNA rekombinan disambungkan ke genom

retrovirus

– Sel diinfeksi virus

Seleksi DNA Rekombinan

• Sel yang di-introduce molekul DNA kedalam sel bakteri:

– Sel tidak ada plasmidnya

– Sel mengandung plasmid yang tidakmengandung gen asing

– Sel mengandung plasmid yang mengandunggen asing

Seleksi DNA Rekombinan

• Menggunakanobat/antibiotik

• Menggunakan warna– Koloni biru/putih– Vektor mengandung

gen LacZ• Vektor tanpa insert

gene, gen lacz tetaptranskripsi

– Adanya substrat X-Gal akanmenghasilkan warnabiru

• Vektor dengan insert gene, gen Lacz pecah, dipisahkan oleh sisipanDNA asing tidak adaproduk warna

Koloni bakteri resisten terhadap ampisilin

Media kultur mengandung ampisilin

Isolasi koloni

Bakteri mengandungplasmid rekombinan

GENE DELETION vs GENE SILENCING

• Gene Deletion (penghilangan gen)

– Mutasi (perubahan genetik) akibat hilangnyasebagian dari kromosom atau sekuen DNA

• Gene Silencing

– Ekspresi suatu gen di-”switch off” olehmesin-mesin di dalam sel.

– Terjadi ketika RNA tidak dapat menghasilkanprotein saat translasi

GENE DELETION : PrincipleConstruction of KanMX4 deletion cassette

1128 bp1331 bp

SNQ2_L1 SNQ2_L3

SNQ2_L2 SNQ2_L4

SNQ2

First step PCR

Second step PCR

SNQ2_up SNQ2_dw

218bp 294bp

SNQ2_L1

SNQ2_L4

1.5 kb of NotI digested pFA6-KanMX4

KanA_R

KanA_F

SNQ2

Rekombinasi

GENE SILENCING: RNAi (RNA interference)

TEKNOLOGI GENA DALAMPRODUKSI INSULIN

Insulin

• Molekul kecil yang terdiri dari dua rantai protein:– Rantai A: terdiri dari 21 asam amino

– Rantai B: terdiri dari 30 asam amino

• Mengatur kadar gula dalam darah

• Dihasilkan oleh sel beta di pankreas (islet Langerhans)

• Dihasilkan terus menerus dalam jumlah sedikit, namun diproduksi dalam jumlah banyak dalamrangka merespon kenaikan kadar gula dalam darah

Insulin Synthesis

Insulin Synthesis

Insulin Synthesis

• Signal sequence:24 aa

• Chain C: 35 aa

Peptidase

Protease

Insulin Production (History)

• 1920 ekstraksi insulin dari anjing sapi dan babidipurifikasi

• 1950 struktur kimia insulin dan lokasi gen insulin pada kromosom 11 ditemukan

• 1977 gen insulin tikus untuk produksi insulin

• 1980 rekayasa genetik untuk produksi insulin

• 1982 produk insulin manusia melalui rekayasagenetika dari Eli Lilly Corp. di setujui (produk obat hasilrekayasa genetika pertama)

• 2001 95% pengguna insulin menggunakan human insulin (Eli Lilly Corp.)

Porcine dan Bovine Insulin

Mengubah porcine menjadihuman insulin

• Porcine + tripsinmemecah alanin, menambahkanthreonin ester, + water hidrolisis ester danmemecah butanol human insulin

Ala

Thr Ester

Ala

Thr Ester

Thr Ester+

Porcine insulin

Human insulin

Produksi Insulin Rekombinan

Produksi Insulin Rekombinan

• Gen proinsulin

Insulin Purification

• Kromatografiafinitasmenggunakanantibodi spesifikterhadap insulin